JP5518428B2 - リアルタイム核酸検出法と組成物 - Google Patents
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Description
本発明に関する分野の技術の現状をより詳細に説明するために、本出願で引用または特定される特許、特許出願、特許刊行物、科学論文などは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、標題「標識試薬と標識された標的、標的標識法、および核酸の測定と分析におけるこれらの使用のための他の方法」でラッバニ(Rabbani)らにより2002年3月12日に、同時出願された米国特許出願第10/096,075号に関する。前記の第10/096,075号の内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
構成のために、背景は以下の7つの部分に分割されている。
(1)標識試薬の反応性基
(2)標識物を標的に連結するためのリンカーアーム
(3)標識物としてのポルフィリン蛍光色素
(4)蛍光性の改変
(5)蛍光性インターカレーター
(6)化学発光
(6)蛍光によるリアルタイム検出
(7)アナライト中のプライマー結合配列
生化学と分子生物学における非放射性標識物の使用は、近年指数的に増加した。非放射性標識物として使用された種々の化合物のうちで、蛍光又は発光シグナルを生成する芳香族色素が特に有用である。このような化合物の重要な例には、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよびシアニン色素(例えば、Cy3とCy5)がある。複合色素もまた、2つの異なる色素を融合して合成されている(リー(Lee)ら、(1992) Nucleic Acids Res. 20:2471-2488;リー(Lee)ら、米国特許第5,945,526号、およびワッゴナー(Waggoner)ら、米国特許第6,008,373号、これらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる)。
標識ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ標識、ニック(nick)トランスレーション法、ランダムプライミング、逆転写、RNA転写、およびプライマー伸長を含む多くの酵素法で、DNAとRNAのプローブの合成のために使用されている。これらのヌクレオチドの標識ホスホラミダイト(phosphoramidite)物も、標識オリゴヌクレオチドを調製するために自動合成機と共に用いられている。生じる標識プローブは、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、インサイチュー(in situ)ハイブリダイゼーション、RNAse保護分析、DNA配列決定反応、DNAおよびRNAマイクロアレイ分析、および染色体染色のような標準的方法で広く使用される。
蛍光標識されたプローブを使用する測定法は、ある特定の波長での照射と別の波長での発光の検出(ストークスシフト(the Stokes shift))に依存する。そのような測定法に適した種々の吸収/発光スペクトル特性を有する種々の化合物について、広範な文献がある。比較発現分析のために蛍光化合物が使用される時、各標識物について同時にシグナル検出を行う能力は、標識物間の差がどれだけ大きいかに依存する。すなわち、Cy3やCy5のような蛍光物質は、それぞれ570と667に発光ピークを有するため、発現分析に一般的に使用されている。この分析のために有効に使用されていない1つのクラスの化合物は、ポルフィリンである。
先行技術において、フェニルアセチレン基のアントラセンへの付加が、発光極大を72nm上昇させることが証明されている(モールディング(Maulding)とロバーツ(Roberts)、1968 J Org Chem)。さらに、ストークスシフト(吸収極大と発光極大の差)もまた、アントラセン色素へのフェニルアセチレン基の付加により上昇した。具体的には、2つのフェニルアセチレン基の付加後に、6nmの差が31nmに上昇した。フェニルアセチレン基をナフタセンに付加すると、吸収極大と発光極大の差は、7nmから32nmに上昇した。さらに、アントラセンとナフタセンの量子収率は、これらにフェニルアセチレン基を付加することにより、有意に上昇した。
挿入結合性色素(intercalating dyes)は、電気泳動ゲル中のDNAの検出、インサイチューハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、および増幅のリアルタイム検出を含む多くの方法で、DNAの検出と視覚化のために使用されている。一般的に使用されてきた長い歴史のある挿入結合性色素は、臭化エチジウムである。臭化エチジウムは、核酸に対する高親和性と、結合後に蛍光が上昇するという有用な性質を示す。蛍光のこの増強は、1本鎖核酸と2本鎖核酸の両方で起き、2本鎖DNAがはるかに顕著な作用(一般に約30倍)を示す。核酸に結合すると蛍光シグナルの上昇を示す他の色素が、近年開発されており、アクリジンオレンジ、SYBRグリーン、およびピコグリーンなどの化合物がある。しかし、特にリアルタイム増幅のような方法で使用するために、核酸との結合または挿入結合後のシグナル生成の上昇に対する、継続したニーズが存在する。
シグナル検出のための化学発光試薬は、近年、広く使用されるようになった。1,2−ジオキセタンとルミノールを含む、発光シグナルを生成することができるいくつかの異なるクラスの化合物がある。1,2−ジオキセタンは、2つの隣接酸素を含有する4員環である。これらの化合物のいくつかの型は、非常に不安定であり、分解すると発光する。一方、アダマンチル基の存在により、半減期が数年という非常に安定な型となることができる(ウィエリンガ(Wieringa)ら(1972)Tetrahedron Letters 169-172、参照することにより本明細書に組み込まれる)。安定な型の1,2−ジオキセタンを酵素結合測定法において基質として使用することができ、ここで、酵素の存在が、基質を不安定な型に変換し、こうして、シグナル生成のために化学発光を使用する。酵素切断の基質である追加の基を用いて、アダマンチルジオキセタンが合成された、化学発光シグナルの酵素的誘導が記載されている(米国特許第5,707,559号、シャープ(Shaap)ら(1987)Tetrahedron Letters 28:935-938;シャープ(Shaap)ら(1987)Tetrahedron Letters 28:1159-1163、これらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる)。適切な酵素の存在下では、切断が起き、不安定な化合物が形成され、これは分解すると発光する。
臨床試料からの核酸の増幅は、広く使用される技術となっている。この方法の最初の技術であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ムリス(Mullis)らの米国特許第4,683,202号に記載された(参照することにより本明細書に組み込まれる)。それ以来、他の方法、例えば結合連鎖反応(LCR)(米国特許第5,494,810号)、GAP−LCR(米国特許第6,004,286号)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)(米国特許第5,130,238号)、鎖置換増幅(SDA)(米国特許第5,270,184号と米国特許第5,455,166号)、およびループ介在増幅(米国特許出願09/104,067号;ヨーロッパ特許出願EP0971039A)が記載されている(これらはすべて、参照することにより本明細書に組み込まれる)。適切な標的から得られた増幅産物の検出は、多くの方法により行われている。ムリス(Mullis)らが記載した初期の方法は、別個の核酸種の存在を検出するために、ゲル分析を使用した。目的の標的の存在を示すこの分子種の同定は、サイズの評価と、標的配列が欠如した陰性対照の使用により測定された。増幅に使用されるプライマーを含めると、適切な標的配列からの生成物の特定のサイズを決定した。非標的配列から生成される擬増幅産物は、標的から得られる配列と同じサイズの生成物を有する可能性は低い。あるいは、増幅産物中に存在する配列の特定の性質を調べるのに、より複雑な方法が使用されている。例えば、特異的な配列の存在、欠如、または空間的位置を測定するのに、制限酵素消化が使用されている。適切な配列の存在はまた、ハイブリダイゼーション実験により確立されている。この方法では、増幅産物は、標的またはプローブとして使用することができる。
真核細胞mRNAの特徴の1つは、3’末端におけるポリAテイルの存在である。この特徴は、ポリAセグメントが、真核生物mRNAのcDNAコピーの合成のための普遍的な結合部位として使用することができるため、mRNAを扱う場合の大きな利点を提供する。しかし、mRNAの3’末端は容易に得られかつ充分に研究されているが、5’末端はそのような共通配列は欠如しているため、これはまた、RNA研究においていくつかの偏見を与える。すなわち、その主要な目的が、元々の5’末端配列を完全に示すクローンを作成することである多数の系が、記載されている。これはまた、比較転写研究のためのアレイ分析に引き継がれている。この目的に使用される実質的にすべての系は、mRNAの3’末端でのオリゴTプライミングにより開始されるため、下流の配列は、3’開始点から離れる合成の継続に依存する。しかし、特定の数の塩基の合成後にポリメラーゼがしばしば鋳型から離れるため、重合の減衰作用があることは公知である。別の作用は、多くの逆転写酵素の成分であるRNaseHの存在により形成される。いったん停止したDNA鎖は、DNAの3’末端の近くでRNAの消化を可能にし、こうして、RNA鋳型のコピーされない部分を、成長するDNA鎖から分離する。この作用はまた、cDNAの合成中にランダムに起きる。従って、配列の表示は、3’ポリAプライマー部位からのその距離に反比例する。
本発明は、少なくとも2つの部分を含む組成物であって、第1の部分は、(i)少なくとも1つの第1のエネルギー移動要素と(ii)目的の核酸の少なくとも一部の配列に相補的な核酸配列とを含む、少なくとも1つの第1の核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、第2の部分は、(i)少なくとも1つの第2のエネルギー移動要素と(ii)目的の核酸の少なくとも一部の核酸配列と同一である核酸配列とを含む、少なくとも1つの第2の核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、ここで、第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は第2のエネルギー移動要素を含まず、第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は第1のエネルギー移動要素を含まない、上記組成物を提供する。
(N)n
(式中、Nは独立に、G、A、TまたはCであり、nは1〜8の整数である)を含む、上記組成物が提供される。
(N)n
(式中、Nは独立に、G、A、TまたはCであり、nは1〜8の整数である)をからなる、上記セット;および(iii)ハイブリダイゼーションと鋳型依存性鎖伸長を実施するための試薬、を提供する工程;(b)キメラ核酸構築体(ii)をアナライトまたはアナライトのライブラリー(i)に結合またはハイブリダイズさせる工程;および(c)アナライトまたはアナライトのライブラリーの3’末端を伸長させる工程とを含み、第2のセグメントがアナライトまたはアナライトのライブラリーの3’末端にハイブリダイズしている時、第3のセグメントは伸長工程(c)の鋳型である、上記方法を提供する。
本発明は、リガンドや色素で標識された化合物の調製のための新規方法と組成物を開示する。本開示には、本発明の新規試薬を合成するのに使用できる、新規標識試薬、新規色素、および新規方法が含まれる。本発明の新規方法はまた、既に記載されている化合物の合成にも応用される。
本発明の1つの態様は、マーカーまたは標識物と所望の標的分子の間で炭素−炭素結合を作成することができる反応性基を含む新規標識試薬を開示する。これは、アミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基と、適切な反応性基の間の結合形成が関与する、タンパク質由来の化学を利用した先行技術の標識試薬とは異なる。本発明の新規標識試薬は、シグナル残基を所望の標的分子に結合させる非常に効率的な手段を与える。すなわち、本発明の新規標識試薬は、炭素−炭素結合を作成することができるリガンドまたは色素部分と反応性基とを含む。さらに、反応性基から、リガンドまたは色素部分を分離させるリンカーアームを挿入することが好ましい。これは、新規標識試薬と目的の標的分子との、より効率的な結合を提供する。リンカーアームの存在と性質はまた、標識標的分子の生物活性または化学活性を上昇させることがある。本発明の新規試薬は、標識試薬の反応性基との結合形成に参加することができる任意の標的分子を標識するのに使用することができる。標的分子は、未変性の状態でも、または新規標識試薬との炭素−炭素結合の形成に参加するように修飾されていてもよい。
新規標識試薬の重要な用途はまた、タンパク質にシグナル基を結合させることである。この具体的なケースでは、タンパク質が、前記の核酸標的に似るように、タンパク質を修飾することができる。例えば、標的タンパク質を酢酸水銀(II)と反応させて、タンパク質のチロシン、トリプトファンまたはフェニルアラニン残基で、化合物を水銀化することができる。これで、タンパク質は、2重結合反応性基を有する新規標識試薬との反応に使用することができ、水銀が置換されて標識が結合する。所望であれば、2,2’−ジピリジルジスルフィドで処理してタンパク質中のチオール基を保護した後、水銀化工程を行うことができる。
炭素−炭素結合に参加するのに適したマーカーへの基の結合は、マーカーの修飾により行うことができる。一方、結合は、特定のマーカーを合成するのに使用される中間体を用いて、行うことができる。例えば、シアニン色素標識試薬は以下の構造を有する:
(式中、n=1、2または3である;X1とX2は、S、O、N、CH2 またはC(CH3)2であり、R1 〜R8 は、シアニン色素を所望の標的分子に結合するのに使用される反応性基を含む)。シアニン色素は、2つのインドレニン前駆体単位を介在不飽和鎖と連結することにより、調製できる。鎖を構成する単位の具体的な数は、シアニン色素の具体的な吸収スペクトルと発光スペクトルを決定する。
本発明の別の態様において、新しい色素およびその合成手段が開示される。先行技術において、ローダミンの誘導体は、一般的には色素と、ローダミンを所望の分子に結合するのに使用される反応性基との間に、芳香族基を有する。本発明において、色素をヌクレオチド上の塩基に結合させるリンカーアームが、通常ローダミン上に存在する芳香族基が欠く、ローダミン類似体を含む安定なヌクレオチドを合成することができることが開示される。そのようなヌクレオチドの取り込みは、ポリメラーゼにより許容されるものになり、従って修飾ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドと混合することなく使用できることは、驚くべき結果である。従って、本発明は、以下の新規ローダミン類似体を開示する:
(式中、Rは反応性基である)。
本発明の別の態様において、酵素的および化学的合成手段において、修飾ヌクレオチドをより効率的に使用することを可能にし、および/または、これらがポリヌクレオチドの一部である時、より効率的に機能することを可能にする方法と組成物が開示される。本発明のある実施態様において、標的分子と、マーカーまたは標識物を提供するために加えられる基との間で、向上した指向性の分離が行われる。本発明において、以下の式を有する新規組成物が開示される:
T----L----M および R----L----M
前記の略図において、Tはマーカーまたは標識物の結合の標的であり、Rは、標的への結合のために使用される反応性基であり、Mはマーカーまたは標識物である。
本発明において、2つの残基が連続として記載される時、残基は近接しているかまたは直接隣にある。さらに、2つの連続的残基は、1つ以下の原子(すなわち、単一の原子)により分離することができる。
本発明において、剛性単位は、基本的に同じ型の原子を含む時、非極性である。非極性剛性単位の例は、アルケン、アルキン、不飽和環、部分飽和環、および炭素と水素のみを含む完全に飽和した環である。
本発明の別の態様において、非ピロール位に反応性基を有する非金属性ポルフィリンを含む新規標識試薬が開示される。蛍光色素としての非金属性アルキル化ポルフィリンのスペクトル性質は、ヘンドリックス(Hendrix)の米国特許第4,707,454号(参照することにより本明細書に組み込まれる)に記載されており、ここで150nmを超えるストークスシフトが開示された。しかし、ポルフィリンの反応性基を記載する時、開示された唯一の教示は、ピロール位の化学基を利用した。従って、8個のピロール位のいずれかまたはすべてに、水素、脂肪族、不飽和脂肪族、環状、複素環、芳香族、複素環式芳香族、荷電または極性基を独立に含み、反応性基を結合するための部位として非ピロール位置の1つを使用する非金属性ポルフィリンを得ることができることが、本発明の主題である。この組成物は以下の構造を有する:
(式中、R0 は、ポルフィリンの非ピロール位置(すなわち、α、β、γ、またはδ位)に、直接または間接に結合した反応性基を含み、R1 〜R8 は、前記で定義したものである)。
本発明の他の実施態様において、中間体中にケトン基が存在する必要無く、フルオレセイン色素に付加された2つ以上の不飽和化合物を含む新規組成物の合成法が開示される。本発明においてこれらの不飽和化合物は、不飽和脂肪族基、不飽和環状化合物、不飽和複素環式化合物、芳香族基、またはこれらの任意の組合せでもよい。そのような基の結合は、これらが、色素の結合および/または電子非局在化系(モールディング(Maulding)とロバーツ(Roberts)、前述、参照することにより本明細書に組み込まれる)に参加することを可能にし、色素のスペクトル特性に変化を与える。これらの変化には、励起ピークと発光ピークの幅の変化、励起ピークと発光ピークの位置の移動、および量子収率の上昇がある。
R−Dye
(式中、Dyeは蛍光色素であり、Rは、Dyeに共有結合し、Rは、不飽和脂肪族基、不飽和環状化合物、不飽和複素環式化合物、芳香族基、またはこれらの組合せでよい2つ以上の不飽和化合物を含む)。さらに、Rの1つ以上のメンバーは、Dyeの結合および/または電子非局在化系に参加する。不飽和化合物は、置換されても非置換でもよい。不飽和脂肪族基は、アルケンまたはアルキンを含むことができる。芳香族基は、フェニル基、アリール基、または芳香族複素環を含むことができる。基が置換される時、置換基は、特に限定されないが、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、フェノキシ基、ヒドロキシル基、アミン、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、スルホン酸塩、スルフヒドリル基、ニトロ基、リン酸塩、または色素の性質を改良できる任意の基を含む。芳香族基の場合、これは、縮合環構造の一部であることにより、置換されてもよい。そのような縮合環の例は、特に限定されないが、ナフタレン、アントラセン、およびフェナントレンを含む。
(式中、RとDyeは前記したものであり、R1 は、R、Dye、またはRとDyeの両方に共有結合している)。R1 はさらに、1つ以上の荷電または極性基を有して、さらなる溶解性を与える。これは、色素またはR修飾を有する色素の水への溶解度が限定されているか、または非特異的疎水性相互作用に問題がある時、有用であろう。
(式中、R、DyeおよびR1は前記したものであり、R2 は、R、Dye、R1 またはこれらの任意の組合せに共有結合しており、R2 はさらに、色素を適当な標的分子に結合するのに使用できる反応性基を含む)。R2 は、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、およびアミン基を含む前記した反応性基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、およびアミン基と反応することができる基、および炭素−炭素結合を形成することができる基の任意のものを含む。R2 はさらに、色素から反応性基を分離するリンカーアームを含む。リンカーアームは、任意の所望の長さであり、炭素ならびに非炭素原子の骨格を含む。使用可能な非炭素原子には、特に限定されないが、イオウ、酸素、および窒素がある。リンカーアームは、飽和、不飽和、または芳香族基を含み、また前記の剛性アームを含んでよい。
(式中、RとDyeは前記したものである)。本発明で使用される標的には、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、受容体、天然のもしくは合成薬剤、合成オリゴマー、合成ポリマー、ホルモン、リンフォカイン、サイトカイン、トキシン、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、炭水化物、糖、またはオリゴ−もしくは多糖がある。標識された標的はまた、R、DyeまたはRとDyeの両方に共有結合したR1 を含むことができる。R1 はさらに、溶解性を与えるための1つ以上の荷電または極性基を含む。これは、標識された標的または標識された標的を作成するために使用される中間体の水への溶解度が限定されているか、または非特異的疎水性相互作用に問題がある時、有用であろう。標識された標的はまた、前記リンカーアームをさらに含むことができ、色素を標的から分離する。
本発明の別の態様において、結合しないままの色素と比較して標的に結合した挿入結合性色素の区別を増強する新規方法が開示される。前記したように、臭化エチジウムは、多くのフォーマットにおいてDNAの検出と視覚化のための一般的な試薬である。核酸への親和性に対する第2のフェナントリジニウム環系の作用を調べるために、ホモダイマー型の臭化エチジウムを合成し、試験した(クールマン(Kuhlmann)ら、(1978) Nucleic Acids Research 5:2629-2633)。この化合物N,N−ビス[3−(3,8−ジアミノ−5−メチルフェナントリジニウム−6−イル)ベンゾイル]1,5−ジアミノペンタンジクロリド(メタ−EthD)は、核酸に対してモノマー型よりはるかに高い親和性を示した。しかし、493nmの標準的波長で蛍光を測定すると、核酸への結合後の蛍光発光の上昇は、基本的にすでに臭化エチジウムモノマーで見られたものと同じであった。
本発明の他の実施態様において、新規1,2−ジオキセタン化合物が開示され、これは選択された酵素の基質として使用されると、芳香環の異なる部位に結合した2つの基の間の分子内反応が起き、化学発光シグナルが生成する。本発明の別の態様において、新規1,2−ジオキセタン化合物が開示され、これは、分解性酵素より修飾酵素の基質であり、修飾により化学発光シグナルが生成する。
本発明の別の態様において、環の異なる部位に結合した2つの基を含む新規1,2−ジオキセタンが開示され、ここで、適切な酵素による触媒後に、試薬は分子内反応を受け、化学発光シグナルが生成する。本発明のこの態様の試薬は以下の構造を有する:
(式中、Qは、ジオキセタンの片側に位置するシクロアルキルまたはポリシクロアルキル基であり、R1 とR2 は、1,2−ジオキセタンの反対側に結合した環の異なる部位に位置する)。Zは、水素、アルキル、アリール、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはシクロへテロアルキル基を含んでよい。好適な実施態様においてQは、アダマンチル基を含む。別の好適な実施態様において、R1 とR2 が結合した2つの部位は、芳香環上で互いに隣接している。R1 は、酵素活性の基質である化学基を含む。適切な酵素の存在下で、R1 は、R1 *(これは、化学的反応性基G1を含む)に触媒的に変換される。R2 は、酸素原子を介して環に結合し、R1 からR1 *への変換により産生されるG1基と相互作用できる化学基G2を含む。環により付与される剛性のために、G1はG2に極めて近接しており、従って好ましい速度で相互作用を引き起こす。この相互作用により、不安定なジオキセタンが生成され、こうして化学発光が発生する。
本発明の別の態様において、化学発光シグナルの分解と産生に開始させる作用は、構造の特異的な基の酵素修飾である、新規1,2−ジオキセタン誘導体が開示される。これは、開始作用が置換基の切断である以前の例とは正反対である。好適なモードにおいて、置換基の修飾は、酵素反応に依存する。そのような組成物の例は、以下により与えられる:
本発明は、別個の核酸または複数の配列のライブラリーを標識するために使用可能な、シグナル生成法を開示する。本発明は、目的のアナライトを他の核酸配列の存在下で、特異的に標識するための方法と組成物を提供する。本発明はまた、さらなる核酸合成のためにそのような核酸を使用する過程で、目的の核酸の存在および/または量の検出に使用してもよい。これは、合成後分析、またはそのような合成過程のリアルタイム分析により行われる。本発明において、エネルギー移動対の少なくとも1つの第1の要素と、エネルギー移動対の少なくとも1つの第2の要素とを含む核酸が合成される。第1のエネルギー移動要素がエネルギードナーとして作用することができる時、第2のエネルギー移動要素はエネルギー移動アクセプターとして作用することができる。逆に、第1の要素がエネルギー移動アクセプターであり、第2の要素がエネルギードナーでもよい。この第2の要素は、第1の要素を含む同じ核酸鎖中に取り込まれるか、または核酸鎖に結合することにより、第1の要素と結合する。核酸合成または結合が無い時、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動はほとんどまたはまったく無い。しかし適切な設計により、本発明は、核酸合成中または合成後の、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を可能にする。
本発明のある実施態様において、第1と第2のエネルギー移動要素は、適切な核酸の存在下で伸長できる、少なくとも2つのプライマーまたは核酸構築体の成分である。これらのプライマーまたは核酸構築体の少なくとも1つは、目的の核酸の一部に存在する配列に相補的な配列を含むであろう。少なくとも1つの他のプライマーまたは核酸構築体は、目的の核酸の別の一部に存在する配列と同一の配列を含むであろう。こうして、目的の核酸を、プライマーまたは核酸構築体の結合と伸長のための鋳型として使用することができる。伸長したプライマーの標的からの分離または排除は、標的鎖が別のプライマー結合/伸長に使用されることを可能にする。さらに、その伸長したプライマー自体は、プライマー結合/伸長に使用することができる。従って、互いにハイブリダイズした2つの伸長したプライマーを含む生成物が作成されるであろう。本発明のこの態様において、前記の連続的プライマー結合/伸長に使用されるプライマーは、第1のエネルギー移動要素または第2のエネルギー移動要素を含む。各鎖のプライマーが互いに充分近いなら、これらは、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を可能にするであろう。この工程は、2本鎖標識核酸を作成するのに使用することができる。診断目的で特に有用なことは、この工程により発生するシグナルの程度を使用して、鋳型として使用される特定の核酸を存在と量を同定できることである。
本発明の別の実施態様において、第1のエネルギー移動要素を含む1つ以上のプライマーまたは核酸構築体は、第2のエネルギー移動要素を含む少なくとも1つのヌクレオチドとともに使用される。プライマーまたは核酸構築体への、標的鋳型に従うヌクレオチドの付加後に、1つのプライマーまたは核酸構築体中の第1のエネルギー移動要素と、取り込まれたヌクレオチド中の第2のエネルギー移動要素との相互作用により、エネルギー移動が可能である。プライマー伸長中に単一のプライマーまたは核酸構築体のみが使用されるなら、標識プライマーまたは核酸構築体と標識ヌクレオチドは、同じ鎖の上にあってもよい。結合/伸長の連続的ラウンドで、プライマーまたは核酸構築体が使用されるなら、線形増幅を行うことができる。
本発明の別の実施態様において、標識ヌクレオチドのみを用いる合成中に、シグナル生成が可能であることが開示される。この具体例において、合成は、第1のおよび第2のエネルギー移動要素を含む少なくとも1つのヌクレオチドの存在下で行われる。第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素を含むヌクレオチドは、例えばdUTPの混合物を使用して、同じヌクレオチドでもよく、一部はエネルギー移動ドナーで標識され、一部はエネルギー移動アクセプターで標識される。一方、これらは、例えばエネルギー移動ドナーで標識されたdUTPと、エネルギー移動アクセプターで標識されたdCTPを有する混合物を使用して、異なるヌクレオチドでもよい。
本発明の前記の実施態様は、プライマーとヌクレオチドをエネルギー移動要素として使用した。本発明の別の実施態様は、核酸結合物質が、鎖伸長後のエネルギー移動要素として使用できることを開示する。米国特許第4,868,103号には、標識タンパク質とインターカレーターとが関与するハイブリダイゼーション測定法で、エネルギー移動を使用できることを既に記載している。この技術に対して、第1のエネルギー移動要素を有する標識プライマーまたは核酸構築体は伸長されて、第2のエネルギー移動要素を含み実質的に配列非依存性である核酸結合物質により結合される核酸を合成する。伸長鎖がその鋳型と塩基対合していてもまたは鋳型からの分離後でも、結合は起き、すなわち、伸長鎖は、2本鎖型でも1本鎖型でもよい。核酸結合物質は、核酸に対して高親和性を有するタンパク質でも化学物質でもよい。本発明で使用されるタンパク質の例には、特に限定されないが、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストンおよび抗体がある。T4遺伝子32タンパク質とSSBタンパク質は、1本鎖核酸に対する親和性を有し、ヒストンは2本鎖核酸に対する親和性を有する。核酸およびRNA/DNAハイブリッドに対して特異的な抗体が、文献に記載されている(米国特許第6,221,581号と米国特許第6,228,578号)。蛍光標識物をタンパク質に結合させる方法は、当該分野で広く開示されている。1本鎖核酸に対して優先的な親和性を有する化学物質には、特に限定されないが、SYBR(登録商標)グリーンIIがある。2本鎖核酸に対して優先的な親和性を有する化学物質の例には、特に限定されないが、インターカレーターがある。本発明で使用されるインターカレーターの例には、特に限定されないが、アクリジン、臭化エチジウム、臭化エチジウムホモダイマー、SYBR(登録商標)グリーンI、TOTO(登録商標)、YOYO(登録商標)、BOBO(登録商標)およびPOPO(登録商標)がある。結合物質は、エネルギー移動要素を直接または間接に含むことができる。エネルギー移動要素で標識されたタンパク質は、間接的手段の例である。上記で列挙したインターカレーターは、直接手段の例である。
核酸タンパク質が与える特異性が好ましい場合がある。すなわち、本発明の別の態様は、第1のエネルギー移動要素を含む少なくとも1つの核酸プローブが、第2のエネルギー移動要素を含むヌクレオチドとともに使用される、シグナル生成の新規手段を開示する。先行技術は、エネルギー移動標識プライマーとエネルギー移動標識配列特異的タンパク質の使用を記載している(ウィトワー(Wittwer)ら、米国特許第6,174,670号)。この技術に対して、本方法は、プライマーのみの近傍にあるプローブの使用に限定されず、所望の核酸鎖上の任意の位置にアニーリングするように設計されたプローブの使用を可能にする。さらに本発明は、伸長核酸の種々のセグメントをプローブ標的として使用することにより、複数のエネルギー移動プローブを使用する能力を付与する。すなわち、エネルギー移動要素を含むヌクレオチドを使用する時、標識核酸鎖への標識プローブのハイブリダイゼーション後にシグナル生成が起きる。
さらに固体支持体は、受動的な役割に甘んじてはいない。本発明の別の実施態様において、固体支持体は第1のエネルギー移動要素を含む。支持体への核酸の固定は、第2のエネルギー移動要素を、シグナルを生成するのに充分な近傍に持ってくることができる。本発明のこの実施態様において、第2のエネルギー移動要素は、ヌクレオチド、プライマー、プローブまたは核酸結合物質の一部でもよい。例として、アレイ上に核酸プローブを選択してマトリックスが作成される。次にマトリックスは、第1のエネルギー移動要素も表面に固定されるように処理される。適切な鋳型またはアナライトの存在下では、前記したように、第2のエネルギー移動要素を用いて一群の核酸が合成される。標識核酸をアレイにハイブリダイズさせることにより、第2のエネルギー移動要素が、表面に結合した第1のエネルギー移動要素の近傍にくる。次に、アレイ上の特定の遺伝子座に結合した核酸の量に対応するエネルギー移動によりシグナルが生成する。この原理ならびに前記の他の実施態様の一部の例を、図6に記載する。捕捉要素を有する固体支持体はまた、伸長反応の必要の無い方法で使用することができる。例えば、固体支持体、核酸に特異的な捕捉オリゴまたは抗体は、第1の要素を含有することができる。次に、1本鎖または2本鎖型の非標識アナライトが支持体に結合した後にシグナルが生成され、ここで第2の要素の存在は、支持体に結合されるアナライトの存在と量により決定される。例えば、第2の要素は、プローブまたは核酸結合物質の形の複合体の一部でもよい。
標的依存性の鎖合成後の第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素からのシグナル生成は、試料中の目的の核酸の存在または量を検出するために使用することができる。シグナル生成がプライミングの特異性に依存する時、標的非依存性プライマー伸長が最小になる条件下で操作が行われるか、または前記したように、標的由来核酸と突発的な鎖伸長産物とを区別できる方法を含める。一方、核酸ハイブリダイゼーションの鑑別能力を利用する工程を含めることは、プライマー特異性の必要性を制限するかまたは不要にすることができる。例えば、ポリA mRNA配列の完全なライブラリーは、普遍的なポリTプライマーの使用によりcDNAコピーのライブラリーに変換することができる。次に、cDNA鎖のライブラリーは、第2の鎖の合成のための鋳型として無差別に使用することができる。第1の鎖プライマー(米国特許第5,891,636号)または第2の鎖プライマー(ラッバニ(Rabbani)ら、米国特許出願第09/896,897号(2001年6月30日出願)(参照することにより本明細書に組み込まれる)は、個々の元々のmRNAの複数のRNAのコピーを合成することを可能にする。この生成物またはcDNAコピーのいずれかを標識する時、核酸のマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを使用して、元々の試料中の特定の分子種の量を決定することができる。本発明は、第1のおよび第2のエネルギー移動要素を、プライマー、ヌクレオチド、プローブ、核酸結合物質またはマトリックス自体に含めることにより、そのような方法とともに使用することができる。
目的の核酸または目的の核酸のコピーもまた、末端トランスフェラーゼ付加、結合、またはプライマーとして作用させることにより、鎖伸長により直接使用することができる。例えば、個々の核酸または核酸ライブラリーの3’末端への、第1のエネルギー移動要素の鋳型非依存性付加により、末端トランスフェラーゼを使用することができる。次に、第2のエネルギー移動要素を、末端付加反応の一部として含めるか、またはこれらは、プライマー、プローブ、核酸結合物質、または固体支持体を含むことができる。別の例において、DNAの制限消化後に、第1のおよび第2のエネルギー移動要素を用いてヌクレオチド混合物の末端付加を行う。次に、核酸の個々の分子種を、アレイ上の別個の遺伝子座上の種々の捕捉配列にハイブリダイズさせて、個々の標識配列の存在または量を測定する。
a.アナライトの末端への所望の核酸配列の鋳型依存性付加
本発明の別の態様は、アナライトまたは標的核酸への所望の核酸配列の鋳型依存性付加のための、新規組成物と方法を提供することである。先行技術において、mRNA操作のための多くの方法の基礎として、ポリA配列が使用されている。さらに、mRNAの有用性は、そのような操作のいずれかおよびすべてを行うための鋳型としてのその使用に由来する。例えば、ポリAは、cDNAコピーを作成し、mRNAの線形または指数的増幅を行うためのプライマー結合部位として使用されている。しかし、前記したように、この特徴は、すべてのRNA標的で普遍的に共有されている訳ではない。さらに、これはmRNAの3’末端の選択的特徴である。先行技術に対して本発明は、アナライトまたは標的核酸を鋳型としてではなく、鎖伸長の基質(すなわち、プライマー)と見なして使用することにより、核酸分析の限定された範囲を克服する。従って、これらの方法で提供される核酸構築体は、プライマーとしては使用されず、ユーザーが所望する任意の配列を、アナライトまたは標的核酸が取り込むことを可能にする鋳型として作用する。そのような配列には、プロモーター、プライマー結合部位、またはシグナル生成残基を含む。
複雑さを増すことなく安定性を提供するユニバーサル塩基の有用性は、他のプロセスでも応用される。本発明の別の態様は、アナライトまたはアナライトのライブラリーの制御断片化のための組成物と方法を開示する。2つのセグメント(非特異結合を提供するためのユニバーサルヌクレオチドを含む第1のセグメント、およびエンドヌクレアーゼ性消化を提供する複合体を形成する、分かれた選択された配列を有する第2のセグメント)を含む、新規CNACが開示される。適切なハイブリダイゼーション条件下で、CNACは、CNACの第2のセグメントに充分に相補的な、アナライト中の各位置でエンドヌクレアーゼ感受性部位を形成する。選択された配列のサイズと性質は、エンドヌクレアーゼ部位間の平均間隔を決定し、従って、断片の具体的な平均サイズを決定する。例えば、4つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを有する第2のセグメントは、RNaseHの基質である複合体を形成するはずである。これにより、第2のセグメントに相補的なアナライト中の各部位が切断される。平均して、特定の4塩基配列が、約250塩基毎に現れるはずである。2つ以上のCNACを使用することによりより小さいサイズの分布も得られ、こうして、可能な消化部位の数が増える。所望であれば、より大きな第2のセグメントが使用でき、より少ない間隔で複合体が形成されるようにハイブリダイゼーション/消化条件が適用され、こうして断片サイズのより大きな平均分布が得られる。第1のまたは第2のセグメントに別個の塩基を付加し、これらの塩基の正しい塩基対合により生成する安定性で、安定なハイブリッドのみが形成される条件を使用して、特異性を上昇させてもよい。
本発明の別の態様において、第1のセグメントが第1のアナライト核酸配列に相補的で、第2のセグメントが第2のアナライト核酸配列に相補的な、少なくとも2つのセグメントを含む新規CNACsが開示される。アナライト核酸と混合後、第1のアナライト核酸配列への第1のセグメントのハイブリダイゼーションが、特定のエンドヌクレアーゼに対して耐性の第1の複合体を形成し、第2のアナライト核酸配列への第2のセグメントのハイブリダイゼーションが、エンドヌクレアーゼの基質である第2の複合体を形成するように、CNACは設計される。さらに、第2の複合体は、アナライト鎖のみが、ニッキングまたはエンドヌクレアーゼによるヌクレオチドの除去を受けるように、不斉切断をすることができる。この処理により、アナライト鎖中に新しい3’末端が生成し、これは次に、アナライト鎖へのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの鋳型依存性付加のために使用することができる。
本発明の別の態様は、ホモポリマー配列の部分的除去のための新規組成物と方法を開示する。ホモポリマー配列は、ポリAメッセンジャーRNA中に自然に存在し、クローニングに使用される多くの方法で人工的に存在する。後者の例は、2本鎖cDNA分子のポリCとポリGテイリングである(オカヤマ(Okayama)とバーグ(Berg)、1982, Mol. Cell. Biol. 2:161)。これらのホモポリマー部分の存在は、ユニバーサルプライマー結合とクローニングのための有利な作用を提供するが、通常必要なのはそのほんの一部であり、大きなセグメントの存在は実際には問題になる。例えば、mRNAのcDNAコピーから作成される転写鋳型では、長いホモポリマーセグメントは、早期の停止を誘導することがある。
以下の例は、例示のためであり、決して本発明を限定するものではない。
(a)化合物I(2,3,3−トリメチルインドリニウム5−スルホン)の調製
p−ヒドラジノベンゼンスルホン酸(250g)を氷酢酸(750ml)および3−メチル−2−ブタノン(420ml)と混合し、3時間加熱還流した。溶液を、2Lのビーカーに注ぎ、一晩冷却した。生じる懸濁液をろ過し、酢酸で洗浄し、凍結乾燥して、残存酢酸を除去した。生じた固体をメタノール(1.5L)に溶解し、2−プロパノール(900ml)中の水酸化カリウム飽和溶液をゆっくり加えた。溶液の色が徐々に薄くなり、2,3,3−トリメチルインドリニウム5−スルホンのカリウム塩が沈殿した。沈殿物を吸引ろ過し、2−プロパノールで洗浄し、凍結乾燥により乾燥して238gの化合物Iを得た。
工程(a)で合成した化合物Iの一部(78g)を1,2−ジクロロベンゼン(700ml)に懸濁した。ヨウ化エチル(250ml)を加え、混合物を、攪拌しながら90〜100℃で12時間加熱した。混合物を3Lの酢酸エチル/エーテルの1:1混合物中に注ぎ、2時間攪拌した。生じた沈殿物をろ過し、1:1の酢酸エチル/エーテルで洗浄し、風乾して68gの生成物(化合物II)を得た。
6−ブロモヘキサン酸(20g)とN−ヒドロキシスクシンイミド(15g)を、200mlの無水ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。無水DMF(50ml)中のジシクロヘキシルカルボジイミド(22g)を加え、混合物を室温で一晩放置した。沈殿した尿素をろ過して除去し、生成物(N−ヒドロキシスクシンイミド−6−ブロモヘキサノエート)を含有するDMF溶液を、−10〜−20℃に冷却した。H2O (11ml)中の等モル量のアリルアミンを、まず氷酢酸でpH8〜9にし、次にゆっくり攪拌して活性エステルにした。固体重炭酸ナトリウム(10g)をゆっくり加えて過度の発泡を避け、混合物を2時間で温度が−10℃に上がるまで、カバーをせずに放置した。混合物をH2O (1L)中に注ぎ、生成物をクロロホルム(300ml)で2回抽出した。抽出物を、1N塩酸で1回、5%NaHCO3 (300ml)で1回、そして10%NaClで3回洗浄した。固体MgSO4 を加えてクロロホルム相を乾燥し、攪拌しながら一晩放置した。真空下で蒸発させてクロロホルムを除去すると、液体が残り、これを、さらに精製することなく次の工程に使用した。
工程(a)からの化合物I(11g)と工程(c)からの化合物III(15g)を一緒に、1,2−ジクロロベンゼン(100ml)に溶解し、アルゴン下で攪拌しながら110℃で12時間加熱した。混合物を酢酸エチル/エーテルの1:1混合物(700ml)中にゆっくり注ぎ、30分後、固体沈殿物をろ過し、酢酸エチル/エーテルの1:1混合物で洗浄し、風乾し、取って置いた。フラスコの底に生成したガラス状固体を、乳鉢で砕き、酢酸エチル/エーテルの1:1混合物で粉砕し、ろ過し、2−プロパノールで洗浄し、真空下で乾燥し、上記からの沈殿物と組合せて、化合物IVを得て、これをさらに精製することなく使用した。
酢酸(60ml)中の工程(b)からの化合物II(12g)の一部とN,N’−ジメチルホルムアミジン(10g)を、攪拌しながら100〜110℃で90分加熱した。反応中、286nmと415nmの吸光度を測定した。最初の60分中に415/286の比が増加し、次の20分間に2.2で一定に維持された。90分後、ホット混合物を700mlの酢酸エチル/エーテルの1:1混合物にゆっくり注いだ。生じた固体沈殿物をロートで加圧して集め、酢酸エチル/エーテルの1:1混合物で洗浄し、ケーキにアルゴンを通過させて乾燥した。加圧フィルターロート沈殿物を集め、工程(d)からの化合物IVの6.5g、50mlのピリジンおよび50mlの無水酢酸の混合物に、ゆっくり加えた。385nmの吸光度の減少と550nmの吸光度の上昇とにより、反応の進行を追跡した。反応は、室温で攪拌しながら一晩行った。550nmの吸光度は経時的に上昇し、溶液から生成物が沈殿すると、吸光度が急に低下した。反応の最後に、褐色の沈殿物を集め、取って置いた。液体部分に、7倍量の酢酸エチルを加えて処理した。生成した沈殿物を集め、最初の沈殿物と一緒にした。ピリジンは、後のパラジウム触媒工程を妨害するため、一緒にした沈殿物を100mlの0.5M炭酸トリエチルアンモニウム(pH8.0)(TEAC)に溶解して、残存するピリジンを除去した。次に、真空下で蒸発させてTEACを除去し、固体ペレットを残した。この生成物(化合物V)を次に、H2O に溶解し、使用するまで−70℃に保存した。
例1の工程(b)からの化合物II(8g)と塩酸マロニルアルデヒドジアニル(10g)を、氷酢酸と無水酢酸の1:1混合物100mlに溶解し、次に110℃で2時間加熱した。この混合物を、酢酸エチル/エーテルの1:1混合物500mlにゆっくり注ぎ、沈殿物をろ過し、酢酸エチル/エーテルの1:1混合物で洗浄し、上記のようにアルゴンで乾燥した。次に沈殿物を、ピリジン/無水酢酸の1:1混合物150mlに溶解した化合物IVの12gの混合物に、攪拌しながらゆっくり加えた。混合物を、90〜100℃に維持した浴に攪拌を続けながら30分間移した。所望であれば、この工程は90分まで延長することができた。次に反応混合物を室温まで冷却し、沈殿物を、例1のCy3標識試薬について前記したように処理した。
米国特許第5,449,767号に記載のように調製した水銀化dUTP(30μmol)を、1mlの1M酢酸リチウムに溶解し、例1(化合物V)で調製したCy3標識試薬(60μmol、0.6ml)を攪拌しながら加えた。アルゴン下でカリウムテトラクロロパラデート(0.5mlのH2O 中の30μmol)を加えた。HPLCにより反応を追跡し、40℃で1時間後完了した。一晩インキュベートしても、収率は増加しなかった。反応混合物に4倍量のアセトンを加え、−20℃に一晩放置した。翌日、遠心分離して沈殿物を集めた。
(a)化合物VII(3,6−ビス−(ジメチルアミノ)−キサンテン−9−プロピオン酸)の調製
3−(ジメチルアミノ)フェノール(5.8g)を無水コハク酸(2.1g)と混合し、アルゴン下で攪拌しながら120℃で90分加熱した。混合物を冷却し、H2O (80ml)を加え、混合物を10分間加熱還流した。水相を捨て、暗褐色のゴム状の物質が残った。H2O を加えてこの物質を溶解し、次に攪拌しながら1M NaOHでpH10に調整した。次に1M塩酸を加えて、清澄な溶液のpHを2に下げた。最終濃度2.5MまでNaClを添加して、色素を塩析した。沈殿物をろ過し、NaCl(2.5M)で洗浄し、凍結乾燥により乾燥して、1.2gの化合物VIIを得た。化合物VIIの蛍光スペクトルを図7に示す。
工程(a)からの化合物VIIをクロロホルム(200ml)に溶解し、攪拌しながらN−ヒドロキシスクシンイミド(1.5g)を加えた。N−ヒドロキシスクシンイミドが溶解後、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(2g)を加え、混合物を暗所で一晩攪拌した。混合物をH2O (80ml)で抽出し、化合物VIIIを含有するクロロホルム相を、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、−20℃で保存した。
13gのグリシルグリシンを、300mlの無水メタノール中の等モルのトリエチルアミンの混合物に懸濁し、1.5モル過剰のメチルトリフルオロ酢酸エステルと混合した。懸濁液を、均一な溶液が得られるまで還流した。ロータリーエバポレーターでメタノールを除去し、残渣を100mlのH2O に懸濁した。次にpHを10.0に調整して、トリフルオログリセリルグリシンを溶液にした。次に、塩酸でpHを1〜2に下げると、トリフルオログリセリルグリシンが溶液から沈殿した。この混合物を4℃で一晩放置して、生成物を完全に沈殿させた。翌日、沈殿物(化合物IX)をろ過して集め、次に乾燥した。
工程(c)からの15gの化合物IXを100mlのDMFに溶解し、2倍モル過剰のN−ヒドロキシスクシンイミドを攪拌しながら加えた。次に、10mlのDMFに溶解した1.1倍モル過剰のジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、混合物を室温で一晩放置して、NHSエステル(化合物X)を得た。
10μmolのアリルアミンdUTPを、0.5mlの0.3M NaHCO3 に溶解し、次に工程(d)からの15μmolの化合物Xを加え、室温で2時間インキュベートして、化合物XIを得た。次に、最終濃度0.5MまでLiAcを加え、5倍量のエタノールを加え、溶液を−20℃に一晩放置して、ヌクレオチド生成物(化合物XI)を沈殿させた。室温で1時間、1MのLiOH中の沈殿物を溶解して、アミンを脱保護した。冷所で溶液を氷酢酸で中和し、上記のようにエタノールで三リン酸を沈殿させた。
工程(e)を繰り返して追加のグリシルグリシンリンカー単位を加えることにより、工程(e)からの化合物XIをさらに処理し、5’−アリルアミド−(テトラグリシル)アミンdUTP(化合物XII)が生成した。アミンを脱保護し、工程(e)で前記したように三リン酸を沈殿させた。
工程(f)からの20μmolの化合物XIIを2mlのNaHCO3(0.3M)とLiCl(0.7M)に溶解し、氷上で冷却した。工程(b)からのクロロホルム中の色素活性エステル(40μmol)(化合物VIII)を真空下で乾燥し、DMF(2ml)中に溶解した。次に、この溶液を氷冷dUTP溶液に加え、混合物を暗所で室温で一晩攪拌した。混合物を20mlの水で希釈し、4℃でDEAEセファデックスA24(20ml)カラムにのせた。カラムをTEAC(0.1M、pH7.8、50ml)で洗浄し、生成物を、0.1〜0.8M TEAC(pH7.8)の線形勾配により、溶出させた。HPLCにより純粋な画分を一緒にした。吸引を繰り返して真空下でTEACを除去し、次に水を加えた。残渣を酢酸リチウム(4M)に溶解し、4倍量の無水エタノールで沈殿させ、次に水に溶解し、−70℃で保存して13.6mgの化合物XIIIを得た。
(a)化合物XIV(3,6−ビス−ジュロリジノキサンテン(Julolidinoxanthen)−9−プロピオン酸)の調製
8−ヒドロキシジュロリジン(Hydroxyjulolidine)(10g)と無水コハク酸(2.6g)をアルゴン下で一緒にし、攪拌しながら130℃で2時間加熱した。混合物を冷却し、H2O (150ml)を加え、混合物を15分間還流し、次に冷却した。水層を捨て、H2O を加えてガラス状の暗褐色の残渣を溶解し、次に攪拌しながら1M NaOHでpH10に調整した。次に1M塩酸を加えて、溶液のpHを2に下げ、ここで再度生成物が沈殿した。混合物を遠心分離し、上清を捨て、ペレットを水に懸濁し、再遠心分離して洗浄した。次に、ペレットを凍結乾燥して3.6gの生成物(化合物XIV)を得た。化合物XIVの蛍光スペクトルを図8に示す。
化合物XIVの活性エステルの調製と、剛性リンカーアームを有するdUTPの結合のための以後の工程は、例4に記載のように行った。
(a)化合物XV[(2,3,3,トリメチル−3−H−インドール−5−イル)酢酸]の調製
110gの4−ヒドラジノ安息香酸を、攪拌しながら450mlの氷酢酸および250mlの3−メチル−2−ブタノンと混合した。混合物を128℃〜130℃で6時間加熱し、室温で一晩放置して冷却させた。氷酢酸と3−メチル−2−ブタノンを真空下で除去し、固体を300mlのH2O で粉砕し、ろ過し、300mlのH2O で再洗浄した。次に、ケーキを真空下で乾燥した。次に、固体を酢酸エチルから再結晶化して化合物XVを得た。
例4の工程(d)からの化合物Xを、DMF/H2O の50:50混合物中の1.2倍過剰の酢酸アリルアミンと反応させた。トリエチルアミンを加えて、溶液をpH8で維持し、室温で4時間反応を行った。溶液を真空下で乾燥し、混合物をH2O で粉砕して、トリエチルアミン塩を除去した。スラリーをろ過し、冷H2O で洗浄し、凍結乾燥し、乾燥して化合物XVIを得た。
例7で調製した20.6gの化合物XVを、100mlのDMFで溶解し、次に攪拌しながら20gのN−ヒドロキシスクシンイミドを加えた。次に、30mlのDMFに溶解した22gのジシクロヘキシルカルボジイミドの混合物を加えた。混合物を室温で一晩放置し、翌日、ろ過して尿素を除去した。工程(a)からの30gの化合物XVIを、エタノールとH2O 中の1M LiOHの50:50混合液100mlに溶解して、アミンを放出させた。この溶液を酢酸でpH8に中和し、前記ろ液に加えた。この溶液に等量のトリエタノールアミンをゆっくり1時間かけて加えた。混合物を室温で一晩放置し、生じた沈殿物をろ過し、500mlのクロロホルムで抽出して、化合物XVIIを得た。
真空により化合物XVIIからクロロホルムを除去した。ガラス状の残渣を200mlのDMFに溶解し、次に真空でDMFを除去した。残渣を150mlのジクロロベンゼンおよび100mlのヨウ化エチルと混合して、100℃で16時間還流した。冷却後、デカントして溶媒を除去した。ガラス状の残渣をエーテルで粉砕して化合物XVIIIを得た。
さらに精製することなく化合物XVIIIを使用して、例1と2に記載のシアニン色素を合成した。化合物XVIIIで作成したCy3類似体の構造を以下に示す。
a)メタ−EthDの合成
クールマン((Kuhlmann)ら、前述)により記載された方法に従って、メタ−EthDの合成を行った。合成工程の略図を図9に示す。この方法では、2−アミノ−ジフェニル−化合物(1)を酸塩化物(2)と縮合させて、アミド(3)を得て、次にこれを環状型に変換してフェナントリジン(4)を得た。この化合物(4)を加水分解して、酸(5)を得て、酸塩化物(6)に変換し、次に1,5−ジアミノ−ペンタンと縮合させて、ホモダイマーを得た。このホモダイマーをメチル化して(7)を得て、これを還元して、最終生成物(8)メタ−EthD(この構造を図2に示す)を得た。
メタ−EthDを493nmで励起して、617nmで1×105 カウント/秒の発光を得た(図10A)。2本鎖DNAを加えると、発光は6×105 に増加した(図10B)。これに対して、350nmの波長で励起すると、600nmでの発光は2×104 カウント/秒であり、これは、DNAを添加すると、3.25×106 カウント/秒に上昇した(図11)。
HIVアンチセンス構築体から作成することができるアンプリコンの配列を図12に示す。この構築体の誘導の説明は、リウ(Liu)ら(1997)J. Virol 71:4079-4085に記載されている。試料中の標的アナライトのPCRは、エネルギードナーとしてフルオレセインで標識したdUTPとエネルギーアクセプターとして例4からの化合物XIIIで標識したdUTPの混合物の存在下で、図12に示すプライマーを使用して行うことができる。増幅の最中に、これらの標識物のそれぞれを取り込む核酸鎖が合成される。フルオレセインに適した波長で照射し、次に化合物XIIIの発光に適した波長で照射すると、ドナーヌクレオチドとアクセプターヌクレオチドが充分な近傍にあるといつもシグナルが生成する。この目的のために、1本鎖または2本鎖のいずれも分析することができる。
例8で使用したものと同じプライマーを使用して、PCRが行われる。しかしこの例では、SYBRグリーンと例7からの標識dUTPの存在下で、反応が行われる。取り込みが進行すると、化合物XVIIIで標識したヌクレオチドを取り込んだ2本鎖DNAが蓄積し始める。前記したように、SYBRグリーンは521nmで最大に発光し、化合物XVIIIは550nmで最大に吸収するため、SYBRグリーンドナーからアクセプターとしての化合物XVIIIへのエネルギー移動により、化合物XVIIIからの蛍光は、合成の進行とともに上昇し、こうして標的配列の増幅が成功していることを示している。
本例は、例9に記載のように行われるが、プライマーは以下の消光物質で標識される:
5'CAU*GATCCGGAU*GGGAGGTG 3’ および
5'GCACAU*CCGGAU*AGU*AGA 3’
ここで、U* は、約530nmで吸光する、シンガー(Singer)とホーグランド(Haugland)(米国特許第6,323,337号)が記載した非蛍光3−アミノキサンテンで修飾したウリジン残基である。PCRは、これらのプライマーを使用して、例7からの標識dUTPと前記のSYBRグリーンの存在下で行われる。挿入結合したSYBRグリーンからの蛍光は、化合物XVIIIまたは消光物質により吸収することができる。プライマー−ダイマーが形成されるなら、これらは、プライマーとこれらの相補体のみを含む。そのようなエネルギー移動は、消光物質で効率的に起き、こうしてプライマー−ダイマー合成からの突発的なシグナル生成を減少させる。一方、標的配列の増幅から得られるアンプリコンは、化合物XVIIIのみが、エネルギー移動が起きるためにSYBRに充分な近傍にあるセグメントを有し、合成が進むにつれて、標的依存性シグナルが生成される。
PCRは例8で使用したものと同じプライマーを用いて行うことができる。この反応混合物で、ドナー候補は、例7からの化合物XVIIIで標識したdUTPの形で供給される。反応混合物はまた、エネルギーアクセプターとして作用することができるテキサスレッド残基で標識したDNAプローブを含有する。プローブは以下の配列を有する
5’UFAATGGUFGAGTATCCCUFGCCTAACTCUF 3’
ここで、UF は、テキサスレッドで標識されたウリジンを示す。アンプリコン中のプローブの位置を図12に示す。プローブはまた、伸長できないように3’末端でブロックされる。増幅が行われると、標識されたアンプリコン鎖へのプローブのハイブリダイゼーションが、化合物XVIIIとテキサスレッドとの間でエネルギー移動が起きることを可能にし、これは、より多くのアンプリコン鎖が生成されると増加する。
この例の工程を図13に示す。3つのセグメントを有する以下の配列を有するCNACを合成することができる:
5’−UUUUUUUUUUTTTTQQQQQQQQ−3’
ここで、Uはウリジンリボヌクレオチドであり、Tはチミジンデオキシリボヌクレオチドであり、Qはイノシンリボヌクレオチドであり、3’末端は、伸長を防ぐために修飾されている。本例において、リボヌクレオチドは、シバハラ(Shibahara)ら(1987)Nucleic Acids Res. 15:4403-4415とバラノフ(Baranov)ら(1997)Nucleic Acids Res. 25:2266-2273(この両方とも参照することにより本明細書に組み込まれる)が記載したように2’−O−メチルである。CNACは、ポリA mRNAのライブラリーとハイブリダイズ(工程A)して、以下を形成する:
ポリAテイルの一部に結合したオリゴ−ウリジン第1のセグメントとの第1の複合体、
ポリAテイルの一部に結合したオリゴ−チミジン第2のセグメントとの第2の複合体、
ポリAテイルの一部に結合したオリゴ−イノシン第3のセグメントとの第3の複合体。
本例は、例12に記載のように行われるが、CNACの第3のセグメントは、非修飾リボヌクレオチドを含み、RNAプロモーターの配列を含有する。従って、工程(c)の鎖伸長後、新しい第3の複合体が形成され、ここで、伸長されたヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、CNAC第3のセグメントはリボヌクレオチドを含む。これはRNaseH消化の基質であり、RNAプロモーター配列に相補的なmRNAの3’末端で、1本鎖セグメントを形成するのに使用することができる。次に、プロモーター配列を有するプライマーをmRNAの伸長セグメントにハイブリダイズさせて、5’末端にプロモーターを有するcDNAを合成することができる。以後は、例12に記載のように行われる。CNACの残りの部分は、プライマーの結合前に除去されるか、またはプライマーの伸長は、鎖の除去を可能にする。
ジオキセタンの誘導のための中間体化合物を合成するのに使用できる工程の略図を、図14に示す。この略図に示す工程のシリーズは、標準的な化学法を使用して行うことができる。この方法の最後の工程で、化合物(e)はジオキセタン誘導体に結合される(ここで「Q」と「Z」の両方とも既に記載したものである)。このジオキセタン誘導体(f)は、本発明で開示し定義した環の隣接部位に結合したR1とR2基を含む。
アシラーゼIの存在下で、図15の化合物(g)に変換される化合物(f)により示される遊離の一級アミンを生成する切断が起きる。化合物(g)中のベンゾイル残基への放出される一級アミンの近接性と、遷移状態の6員環化合物(h)の以後の生成のために、化合物(i)を生成する内部転位は、非常に速い反応である。化合物(i)中のフェノキシ基の存在は、これを不安定なジオキセタンとし、これは分解する時光を生成する。アシル残基およびアシル基に結合した鎖の一級アミンまたはチオールで、同様の置換が起きることは、すでに文献に記載されている。これらの既に記載された反応は、本例に示す反応の好適な速度は持たない。
Claims (167)
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、少なくとも2つの部分を含み、
第1の部分は、少なくとも1つの第1の核酸プライマーまたは核酸構築体であって、
(i)少なくとも1つの第1のエネルギー移動要素であって、第1の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている、および
(ii)核酸の標的配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列、とを含む、
第2の部分は、少なくとも1つの第2の核酸プライマーまたは核酸構築体であって、
(i)少なくとも1つの第2のエネルギー移動要素であって、第2の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている、および
(ii)標的核酸配列の少なくとも一部中の核酸配列と同一である核酸配列、とを含む、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は第2のエネルギー移動要素を含まず、および第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は第1のエネルギー移動要素を含まず、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的核酸配列を含む標的鎖にハイブリダイズし、および第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的鎖の相補鎖にハイブリダイズし、
(a)第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的核酸配列を鋳型として用いて伸長され、第1の伸長産物を形成し、および
(b)第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1の伸長産物を鋳型として用いて伸長され、第2の伸長産物を形成すると、
エネルギー移動が、第1の伸長産物中の第1のエネルギー移動要素と第2の伸長産物中の第2のエネルギー移動要素との間で起こる、
ただし、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的依存性伸長工程の非存在下での第2の核酸プライマーまたは核酸構築体に相補的ではなく、
いずれの核酸プライマーまたは構築体も、固体支持体に固定または固定化されておらず、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1の核酸プライマーまたは構築体は、2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、請求項1の組成物。
- 第2の核酸プライマーまたは構築体は、2つ以上の第2のエネルギー移動要素を含む、請求項1の組成物。
- 第1の部分は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、第2の部分は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、または第1の部分と第2の部分の両方は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含む、請求項1の組成物。
- 2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体は、同一のまたは異なる核酸配列を含む、請求項4の組成物。
- 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項1の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項6の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、少なくとも2つの部分を含み、
第1の部分は、第1のセグメントおよび第2のセグメントを含み、
ここで、第1の部分の第1のセグメントは、第1の核酸プライマーまたは核酸構築体と、その第1の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている少なくとも1つの第1のエネルギー移動要素を含み、および第1の部分の第2のセグメントは、核酸の標的配列の少なくとも一部に相補的なプライマー伸長核酸配列を含み、そして
第2の部分は、第1のセグメントおよび第2のセグメントを含み、
ここで、第2の部分の第1のセグメントは、第2の核酸プライマーまたは核酸構築体と、その第2の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている少なくとも1つの第2のエネルギー移動要素を含み、および第2の部分の第2のセグメントは、核酸標的配列の少なくとも一部と同一のプライマー伸長核酸配列を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、
核酸の標的配列の少なくとも一部に相補的なプライマー伸長核酸配列が、核酸標的配列の少なくとも一部と同一のプライマー伸長核酸配列にハイブリダイズすると、エネルギー移動が、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間で起こる、
ただし、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は第2のエネルギー移動要素を含まず、第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は第1のエネルギー移動要素を含まず、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的依存性伸長工程の非存在下での第2の核酸プライマーまたは核酸構築体に相補的ではなく、
いずれの核酸プライマーまたは構築体も、固体支持体に固定または固定化されておらず、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1の核酸プライマーまたは構築体は、2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、請求項8の組成物。
- 第2の核酸プライマーまたは構築体は、2つ以上の第2のエネルギー移動要素を含む、請求項8の組成物。
- 第1の部分は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、第2の部分は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、または第1の部分と第2の部分の両方は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含む、請求項8の組成物。
- 2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体は、同一のまたは異なる核酸配列を含む、請求項11の組成物。
- 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項8の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項13の組成物。
- 核酸プライマーまたは構築体の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項8の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項15の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項8の組成物。
- プライマー伸長配列は、DNAポリメラーゼにより付加されるかまたは影響を受ける、請求項8の組成物。
- プライマー伸長配列は、リガーゼにより付加されるかまたは影響を受ける、請求項8の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、核酸鎖を含み、核酸鎖は第1のセグメントおよび第2のセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントは、核酸プライマーまたは核酸構築体の標的依存性伸長に由来する配列を含み、
ここで、
核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含み、
プライマー伸長配列は、
(i)第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第2のエネルギー移動要素、および
(ii)核酸の標的配列を鋳型として用いて、2つ以上の標識されたヌクレオチドを核酸プライマーまたは核酸構築体に酵素的に付加することに由来する配列であって、2つ以上の標識されたヌクレオチドの1つは、第2のエネルギー移動要素を含む、を含み、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 核酸プライマーまたは構築体は、2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、請求項20の組成物。
- 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項20の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項22の組成物。
- 第2の核酸鎖をさらに含む請求項20の組成物であって、第2の核酸鎖は2つのセグメントを含み、第2の核酸鎖の第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、第2の核酸鎖の第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、
ここで、
第2の核酸鎖の核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含み、
第2の核酸鎖のプライマー伸長配列は、第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第2のエネルギー移動要素を含み、
第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素と第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素との間でエネルギー移動が起こる、上記組成物。 - 核酸プライマーまたは構築体の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項20または24の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項25の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項25または26の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、核酸鎖を含み、核酸鎖は2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、
ここで、
プライマー伸長配列は、
(a)核酸の標的配列を鋳型として用いて、2つ以上のヌクレオチドを核酸プライマーまたは核酸構築体に酵素的に付加することに由来する配列、
(b)第2のセグメント中の2つ以上のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素、および
(c)第2のセグメント中の2つ以上のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第2のエネルギー移動要素、を含み、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項28の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項29の組成物。
- 第2の核酸鎖をさらに含む請求項28の組成物であって、第2の核酸鎖は2つのセグメントを含み、第2の核酸鎖の第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2の核酸鎖の第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、
ここで、
第2の核酸鎖の第2のセグメントのプライマー伸長配列は、
プライマー伸長配列中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素、および
プライマー伸長配列中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第2のエネルギー移動要素、を含み、
第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、
第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素と第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素との間でエネルギー移動が起こり、および、
核酸鎖は第2の核酸鎖にハイブリダイズされる、上記組成物。 - 核酸プライマーまたは構築体の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項28または31の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項32の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項32の組成物。
- 核酸プライマーまたは構築体の少なくとも1つは、消光物質をさらに含む、請求項28または31の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、2つ以上のリボヌクレオチドを含む核酸鎖を含み、
ここで、
少なくとも1つのリボヌクレオチドは第1のエネルギー移動要素に直接またはリンカーアームを介して共有結合され、第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、
少なくとも1つの他のリボヌクレオチドは第2のエネルギー移動要素に直接またはリンカーアームを介して共有結合され、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項36の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項37の組成物。
- 核酸鎖は、固体支持体に固定または間接的に固定化されている、請求項36の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項39の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、2つの部分を含み、
ここで、
第1の部分は2つのセグメントを含む核酸鎖であり、
第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、ここで、核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1の部分中の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の蛍光性の第1のエネルギー移動要素を含み、および
第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、および
第2の部分は、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質を含み、ここで、核酸結合物質は、核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項41の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項42の組成物。
- 核酸結合物質は、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質または抗体を含む、請求項41の組成物。
- 核酸結合物質は、1本鎖核酸結合色素を含む、請求項41の組成物。
- 核酸鎖は、固体支持体に固定または固定化されている、請求項41の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項46の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項46の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(a)2つの核酸鎖、
ここで、鎖の少なくとも1つは2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、
核酸プライマーまたは核酸構築体は、その核酸プライマーまたは核酸構築体に共有結合されている1つ以上の蛍光性の第1のエネルギー移動要素を含み、および
(b)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、
ここで、核酸結合物質は、2つの核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、
2つの核酸鎖は互いにハイブリダイズし、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項49の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項50の組成物。
- 第2の鎖は2つのセグメントを含み、第1のセグメントは第2の核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含む、請求項49の組成物。
- 第2のプライマーまたは核酸構築体は、1つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、請求項52の組成物。
- 核酸結合物質は、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項49の組成物。
- タンパク質またはポリペプチドは、ヒストンまたは抗体を含む、請求項54の組成物。
- タンパク質またはポリペプチドは、抗体を含む、請求項54の組成物。
- 核酸結合物質は、インターカレーターを含む、請求項49の組成物。
- インターカレーターは、SYBRグリーンI、臭化エチジウム、臭化エチジウムを含むホモダイマーまたはヘテロダイマー、またはそれらのいずれかの誘導体を含む、請求項57の組成物。
- 少なくとも1つの核酸鎖は、固体支持体に固定または固定化されている、請求項49の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項59の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項59の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(a)2つのセグメントを含む核酸鎖であって、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、ここで
プライマー伸長配列は、第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素を含み、および
(b)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、ここで、核酸結合物質は、核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項62の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項63の組成物。
- 核酸結合物質は、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項62の組成物。
- タンパク質またはポリペプチドは、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質または抗体を含む、請求項65の組成物。
- 核酸結合物質は、1本鎖核酸結合色素を含む、請求項62の組成物。
- 核酸鎖は、固体支持体に固定または固定化されている、請求項62の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項68の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項68の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(a)互いハイブリダイズした2つの核酸鎖、
ここで、鎖の少なくとも1つは2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、ここで
プライマー伸長配列は、第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素を含み、および
(b)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、ここで、核酸結合物質は、2つの核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項71の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項72の組成物。
- 核酸結合物質は、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項71の組成物。
- タンパク質またはポリペプチドは、ヒストンまたは抗体を含む、請求項74の組成物。
- 核酸結合物質は、インターカレーターを含む、請求項71の組成物。
- インターカレーターは、SYBRグリーンI、臭化エチジウム、臭化エチジウムを含むホモダイマーまたはヘテロダイマー、またはそれらのいずれかの誘導体を含む、請求項76の組成物。
- 両方の核酸鎖は2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含む、請求項71の組成物。
- 各核酸鎖中のプライマー伸長配列は第1のエネルギー移動要素を含む、請求項78の組成物。
- 核酸鎖(a)の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項71の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項80の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項80の組成物。
- 核酸プライマーまたは構築体は、消光物質をさらに含む、請求項71の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(i)1つ以上のリボヌクレオチドを含み、少なくとも1つのリボヌクレオチドは、そのリボヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含む、核酸鎖、および
(ii)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、ここで、核酸結合物質は、核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項84の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項85の組成物。
- 核酸結合物質は、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項84の組成物。
- タンパク質またはポリペプチドは、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質または抗体を含む、請求項84の組成物。
- 核酸結合物質は、1本鎖核酸結合色素を含む、請求項84の組成物。
- 核酸鎖は、固体支持体に固定または固定化されている、請求項84の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項90の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、ハイブリダイズした第1および第2の核酸鎖を含み、
第1の鎖はRNA転写体を含み、ここでRNA転写体の少なくとも1つのリボヌクレオチドは、そのリボヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含み、
第2の鎖は、第1の鎖またはその一部にハイブリダイズした核酸プローブを含み、ここで、核酸プローブは、その核酸プローブに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
核酸鎖の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化され、第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 核酸プローブは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項92の組成物。
- 核酸プローブは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこの両方を含む、請求項92の組成物。
- 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項92の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項95の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項92の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的にまたは定量的に検出するための組成物であって、2つの部分を含み、
ここで、
第1の部分は2つのセグメントを含む核酸鎖であり、
第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、ここで、核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1の部分中の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の蛍光性の第1のエネルギー移動要素を含み、および
第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、および
第2の部分は、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質を含み、ここで、核酸結合物質は、核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素およびタンパク質またはポリペプチドを含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(a)互いハイブリダイズした2つの核酸鎖、
ここで、鎖の少なくとも1つは2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、ここで、核酸プライマーまたは核酸構築体は、その核酸プライマーまたは核酸構築体に共有結合されている1つ以上の蛍光性の第1のエネルギー移動要素を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、および
(b)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、ここで、核酸結合物質は、2つの核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(i)1つ以上のリボヌクレオチドを含み、少なくとも1つのリボヌクレオチドは、そのリボヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含む、核酸鎖、および
(ii)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、ここで、核酸結合物質は、核酸鎖に非共有結合的に結合し、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストンまたは1本鎖核酸結合色素および1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、少なくとも2つの部分を含み、
第1の部分は、少なくとも1つの第1の核酸プライマーまたは核酸構築体であって、
(i)少なくとも1つの第1のエネルギー移動要素であって、第1の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている、および
(ii)核酸の標的配列の少なくとも一部の配列に相補的な核酸配列、とを含む、
第2の部分は、少なくとも1つの第2の核酸プライマーまたは核酸構築体であって、
(i)少なくとも1つの第2のエネルギー移動要素であって、第2の核酸プライマーまたは核酸構築体に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている、および
(ii)標的核酸配列の少なくとも一部中の核酸配列と同一である核酸配列、とを含む、
ここで、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は第2のエネルギー移動要素を含まず、および第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は第1のエネルギー移動要素を含まず、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的鎖にハイブリダイズし、および第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的鎖の相補鎖にハイブリダイズし、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含んでいるか、第2の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第2のエネルギー移動要素を含んでいるか、または第1の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含み、かつ第2の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
(a)第1の核酸プライマーまたは核酸構築体は、標的核酸配列を鋳型として用いて伸長され、第1の伸長産物を形成し、および
(b)第2の核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1の伸長産物を鋳型として用いて伸長され、第2の伸長産物を形成すると、
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1の部分は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、第2の部分は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含むか、または第1の部分と第2の部分の両方は、2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体を含む、請求項101の組成物。
- 2つ以上の核酸プライマーまたは核酸構築体は、同一のまたは異なる核酸配列を含む、請求項102の組成物。
- 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項101の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項104の組成物。
- 核酸プライマーまたは構築体の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項101の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項106の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項101の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、2つの核酸鎖を含み、
ここで、
2つの鎖の第1は、その第1の鎖に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている少なくとも1つの第1のエネルギー移動要素を含み、
2つの鎖の第2は、その第2の鎖に直接またはリンカーアームを介して共有結合されている少なくとも1つの第2のエネルギー移動要素を含み、
第1の鎖またはその一部は、第2の鎖またはその一部にハイブリダイズしており、第1の鎖は第2のエネルギー移動要素が欠如し、第2の鎖は第1のエネルギー移動要素が欠如しており、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、
第1の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含んでいるか、第2の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第2のエネルギー移動要素を含んでいるか、または第1の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含み、かつ第2の核酸プライマーまたは核酸構築体が2つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項109の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項110の組成物。
- 核酸鎖の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項109の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項112の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項109の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、核酸鎖を含み、核酸鎖は第1のセグメントおよび第2のセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントは、酵素的に付加された伸長配列を含み、
ここで、
核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含み、
プライマー伸長配列は、
(i)第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第2のエネルギー移動要素、および
(ii)核酸の標的配列を鋳型として用いて、2つ以上の標識されたヌクレオチドを核酸プライマーまたは核酸構築体に付加することに由来する配列、を含み、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 核酸プライマーまたは構築体は、2つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、請求項115の組成物。
- プライマー伸長配列は、2つ以上の第2のエネルギー移動要素を含む、請求項115の組成物。
- 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項115の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項118の組成物。
- 核酸鎖にハイブリダイズした第2の核酸鎖をさらに含む請求項115の組成物であって、第2の核酸鎖は2つのセグメントを含み、第2の核酸鎖の第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2の核酸鎖の第2のセグメントは酵素的に付加されたプライマー伸長配列を含み、
ここで、
第2の核酸鎖の核酸プライマーまたは核酸構築体は、第1のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含み、
第2の核酸鎖のプライマー伸長配列は、第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第2のエネルギー移動要素を含み、
第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 核酸プライマーまたは構築体の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項115または120の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む請求項121の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項121または122の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、核酸鎖を含み、核酸鎖は2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、
ここで、
プライマー伸長配列は、
(a)核酸の標的配列を鋳型として用いて、2つ以上のヌクレオチドを核酸プライマーまたは核酸構築体に酵素的に付加することに由来する配列、
(b)第1のセグメント上の2つ以上のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素、および
(c)第2のセグメント上の2つ以上のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第2のエネルギー移動要素、を含み、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項124の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項125の組成物。
- 核酸鎖にハイブリダイズした第2の核酸鎖をさらに含む請求項124の組成物であって、第2の核酸鎖は2つのセグメントを含み、第2の核酸鎖の第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、第2の核酸鎖の第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、
ここで、
第2のセグメントのプライマー伸長配列は、
プライマー伸長配列中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素、および
プライマー伸長配列中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第2のエネルギー移動要素、を含み、
第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
第2の核酸鎖の第1のエネルギー移動要素と第2の核酸鎖の第2のエネルギー移動要素との間でエネルギー移動が起こる、上記組成物。 - 核酸プライマーまたは構築体の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項124または127の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項128の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項128の組成物。
- 核酸プライマーまたは構築体は、消光物質をさらに含む、請求項124または127の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、RNA転写体を含み、RNA転写体の2つ以上のリボヌクレオチドは、エネルギー移動アクセプターである第1のエネルギー移動要素に直接またはリンカーアームを介して共有結合され、少なくとも1つの他のリボヌクレオチドは、エネルギー移動ドナーである第2のエネルギー移動要素に直接またはリンカーアームを介して共有結合されており、ここで、他のリボヌクレオチドの2つ以上が転写体中に存在する、および
エネルギー移動ドナーとエネルギー移動アクセプターとの間でエネルギー移動が起こる、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項132の組成物。
- シアニン色素または誘導体はCy3またはCy5を含む、請求項133の組成物。
- 核酸鎖は、固体支持体に固定または固定化されている、請求項133の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項135の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(a)2つのセグメントを含む核酸鎖であって、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、ここで、プライマー伸長配列は、第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、および
(b)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、ここで、核酸結合物質は、核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項137の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項138の組成物。
- 核酸結合物質は、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項138の組成物。
- タンパク質またはポリペプチドは、T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質または抗体を含む、請求項138の組成物。
- 核酸結合物質は1本鎖核酸結合色素を含む、請求項137の組成物。
- 核酸鎖は、固体支持体に固定または固定化されている、請求項137の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項143の組成物。
- 固定または固定化は直接または間接である、請求項144の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(a)互いハイブリダイズした2つの核酸鎖、
ここで、鎖の少なくとも1つは2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含み、ここで、プライマー伸長配列は、第2のセグメント中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、および
(b)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、ここで、核酸結合物質は、2つの核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項146の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項147の組成物。
- 核酸結合物質は、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項146の組成物。
- タンパク質またはポリペプチドは、ヒストンまたは抗体を含む、請求項149の組成物。
- 核酸結合物質は、インターカレーターを含む、請求項146の組成物。
- インターカレーターは、SYBRグリーンI、臭化エチジウム、臭化エチジウムを含むホモダイマーまたはヘテロダイマー、またはそれらのいずれかの誘導体を含む、請求項151の組成物。
- 両方の核酸鎖は2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントはプライマー伸長配列を含む、請求項146の組成物。
- プライマー伸長配列は、第1のエネルギー移動要素を含む、請求項153の組成物。
- 核酸鎖(a)の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化されている、請求項146の組成物。
- 固体支持体は、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、ガラススライド、プラスチックスライド、マイクロチップアレイ、ウェルまたはくぼみを含む、請求項155の組成物。
- 固定または固定化は、直接または間接である、請求項155の組成物。
- 核酸プライマーまたは核酸構築体は、消光物質をさらに含む、請求項146の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、以下を含み、
(i)1つ以上のリボヌクレオチドを含み、少なくとも1つのリボヌクレオチドは、そのリボヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含む、核酸鎖、および
(ii)T4遺伝子32タンパク質、SSBタンパク質、ヒストン、抗体、1本鎖核酸結合色素およびインターカレーターからなる群から選択される核酸結合物質、
ここで、核酸結合物質は、核酸鎖に非共有結合的に結合し、1つ以上の第2のエネルギー移動要素をさらに含む、
ここで、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、ハイブリダイズした第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含み、
第1の核酸鎖は2つのセグメントを含み、第1のセグメントは核酸プライマーまたは核酸構築体を含み、および第2のセグメントは酵素的に付加されたプライマー伸長配列を含み、ここで、プライマー伸長配列は、そのプライマー伸長配列中の2つ以上のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第1のエネルギー移動要素を含む、
第2の核酸鎖は、プライマー伸長配列またはその一部にハイブリダイズした核酸プローブを含み、
ここで、核酸プローブは、その核酸プローブ中のヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
核酸鎖の少なくとも1つは、固体支持体に固定または固定化され、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項160の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項161の組成物。
- サンプル中の目的の核酸の存在を定性的または定量的に検出するための組成物であって、ハイブリダイズした第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含み、
第1の核酸鎖はRNA転写体を含み、ここで、2つ以上のリボヌクレオチドは、そのリボヌクレオチドに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている第1のエネルギー移動要素を含み、
第2の核酸鎖は、第1の核酸鎖またはその一部にハイブリダイズした核酸プローブを含み、ここで、核酸プローブは、その核酸プローブに直接またはリンカーアームを介して共有結合されている1つ以上の第2のエネルギー移動要素を含み、
ここで、
第1の核酸鎖または核酸プローブは、固体支持体に間接的に固定または固定化され、
第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターであり、および第1のエネルギー移動要素がエネルギー移動アクセプターである場合は、第2のエネルギー移動要素がエネルギー移動ドナーであり、および
目的の核酸の存在または量の検出は、第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素との間のエネルギー移動によるものである、上記組成物。 - 核酸プローブは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項163の組成物。
- 核酸プローブは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこの両方を含む、請求項163の組成物。
- 第1のエネルギー移動要素と第2のエネルギー移動要素は独立に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミン6G、ローダミンX、ロドール、スルホローダミン101、テトラメチルローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、4,7−ジクロロローダミン、エオシン、エオシンイソチオシアネート(EITC)、ダンシル、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、またはp−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、シアニン色素、および前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項163の組成物。
- シアニン色素または誘導体は、Cy3またはCy5を含む、請求項166の組成物。
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