DE19824230A1

DE19824230A1 - Neues Endometriose-assoziiertes Gen

Info

Publication number: DE19824230A1
Application number: DE19824230A
Authority: DE
Inventors: Anna Starzinski-Powitz; Silvia Kotzian; Heike Handrow-Metzmacher
Original assignee: STARZINSKI POWITZ ANNA
Current assignee: STARZINSKI POWITZ ANNA
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 1999-12-02
Also published as: AU765515B2; US20030109018A1; NZ508439A; WO1999063079A1; CA2329527A1; EP1080195A1; JP2002517193A; AU4502499A; US6586569B1; CN1307636A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mit invasiven Prozessen, z. B. Endometriose assoziertes Gen, ein davon kodiertes Polypeptid, einen gegen das Polypeptid gerichteten Antikörper sowie die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäure, des Polypeptids und des Antikörpers.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mit invasiven Prozessen, z. B. Endome triose assoziiertes Gen, ein davon kodiertes Polypeptid, einen gegen das Polypeptid gerichteten Antikörper sowie die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäure, des Polypeptids und des Antikörpers.

Die Endometriose ist die zweithäufigste Frauenkrankheit und wird als das Vorkommen von Gebärmutterschleimhautzellen außerhalb der Gebärmutter definiert. Von der Endometriose ist etwa jede fünfte Frau im reproduktions fähigen Alter betroffen, bei Frauen mit Fruchtbarkeitsproblemen sogar jede zweite.

Unter normalen Umständen findet sich Gebärmutterschleimhaut (Endometri um) ausschließlich in der Gebärmutter. Bei der Endometriose-Erkrankung findet man außerhalb der Gebärmutter Gewebe, das histologisch wie Gebärmutterschleimhaut aussieht, beispielsweise außen an der Gebärmutter, am Darm oder sogar in der Bauchspeicheldrüse oder Lunge. Obwohl diese Endometriose-Herde außerhalb der Gebärmutter lokalisiert sind, bluten sie ebenfalls während der Menstruation, werden also durch die Hormone des weiblichen Zyklus beeinflußt. Da die Endometriose-Herde ebenso wie die Gebärmutterschleimhaut im Zyklus Volumenänderungen durchlaufen, können je nach Lokalisation durch diese Veränderungen Schmerzen verursacht werden. Darüber hinaus reagiert der Körper mit einer Entzün dungsreaktion auf die Endometriose-Zellen, was wiederum Schmerzen auslöst. Weiterhin führt die Entzündung zu Verwachsungen im Bereich der Eierstöcke und Eileiter und ist hierdurch verantwortlich für eine sog. mechanische Sterilität der betroffenen Frauen. Offenbar werden bei der Endometriose jedoch auch Botenstoffe (z. B. Zytokine, Prostaglandine) freigesetzt, die selbst bei nichtvorhandenen Verwachsungen die Fertilität der betroffenen Frauen mindern können.

Aufgrund ihrer patho-biologischen Eigenschaften könnte man Endometriose- Zellen zwischen normale Zellen und Tumorzellen einordnen: Einerseits zeigen sie kein neoplastisches Verhalten, andererseits haben sie jedoch wie metastasierende Tumorzellen die Fähigkeit, sich organgrenzüberschreitend im Organismus zu bewegen und in andere Organe einzuwachsen, d. h. sie zeigen invasives Verhalten. Aus diesem Grunde werden Endometriose-Zellen in der Literatur als "gutartige Tumorzellen" definiert, obwohl in derartigen Zellen bisher keine tumorspezifischen Mutationen in Proto-Onkogenen gefunden wurden.

Da bis heute die Pathogenese der Endometriose noch völlig ungeklärt ist, gibt es bisher noch keine wirksame Therapie- oder Präventionsmöglichkeiten von Endometriose-assoziierten Krankheiten.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Gene zu identifizieren, die bei invasiven Prozessen eine Rolle spielen und die mit dem pathophysiologi schen Phänotyp der Endometriose assoziiert sein können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung eines Gens, das als Endometriose assoziertes Gen bezeichnet wird und für ein Polypeptid kodiert. Diese Gensequenz wurde mit Hilfe der Differential-Display-RT-PCR (Liang und Pardee, Science 257 (1992), 957-971) entdeckt. Hierzu wurden invasive und nichtinvasive Varianten einer Endometriosezellinie miteinander ver glichen. Dabei stieß man auf eine cDNA-Sequenz, welche spezifisch für die invasive Variante der Endometriose-Zellen ist. Man fand eine zugehörige RNA von 4 kb Länge. Eine entsprechende aus einer cDNA-Phagenbank isolierte cDNA weist einen offenen Leserahmen (ORF) von 302 Aminosäuren auf.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, welche

(a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Protein kodierenden Abschnitt davon,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des geneti schen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

Diese Nukleinsäure kodiert vorzugsweise für ein Polypeptid, das mit invasiven Prozessen assoziiert ist, oder einen Abschnitt davon.

In der EMBL-EST-Datenbank sind die folgenden Nukleotidsequenzen mit den folgenden Zugriffsnummern abgelegt: Z98886, Ac003017, Aa452993, Aa452856. Diese Sequenzen stellen keine erfindungsgemäßen Nukleinsäu ren dar. Die ersten beiden dieser Sequenzen sind DNAs, die aus Menschen hirn isoliert wurden und jeweils mit den Abschnitten von Nukleotid 970 bis ca. 2000 und von 760 bis ca. 1450 eine über 90%ige Basenidentität zeigen mit SEQ ID NO. 1.

Die Sequenzen Aa452993 und Aa452856 stammen aus Mausembryonen und zeigen Basenidentität mit den Nukleotiden von ca. 1060 bis ca. 1450 bzw. von ca. 24 bis 440 von SEQ ID NO. 1. Keiner dieser 4 Sequenzen ist bisher ein Leseraster oder eine Funktion zugeordnet worden.

Die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nukleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen, welcher einem Polypeptid mit einer Länge von 302 Aminosäu ren entspricht (SEQ ID NO. 2). Dieses Polypeptid ist in der SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz angegeben. SEQ ID NO. 2 stellt einen Abschnitt des C-terminalen Endes des nativen Polypeptids dar.

Neben der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nukleotidsequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspre chende Nukleotidsequenz umfaßt die vorliegende Erfindung auch Nukleotid sequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach dem Waschen für eine Stunde mit 1×SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h in 0,2×SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nukleotid sequenz oder einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Nukleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, wie etwa eine peptidische Nukleinsäure, umfassen. Besonders bevorzugt umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure einen Protein-kodierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90% und besonders bevorzugt mehr als 95% zu der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleotidse quenz oder einen vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide (nt) und besonders bevorzugt mindestens 50 nt langen Abschnitt davon aufweist.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind vorzugsweise aus Säugern und insbesondere aus dem Menschen erhältlich. Sie können nach bekannten Techniken unter Verwendungen kurzer Abschnitte der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nukleotidsequenz als Hybridisierungssonden und/oder als Amplifikationsprimer isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen Nukleotidbausteine gegebenenfalls modifizierte Nukleotidbausteine, z. B. 2'-O-alkylierte Nukleotidbausteine eingesetzt werden können.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die von einer wie oben definierten Nukleinsäure kodierten Polypeptide. Diese Polypeptide enthalten vorzugsweise

(a) die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder
(b) eine Homologie von mehr als 70%, vorzugsweise von mehr als 80% und besonders bevorzugt von mehr als 90% zu der Aminosäu resequenz gemäß (a).

Neben den in SEQ ID NO. 2 dargestellten Polypeptiden betrifft die Erfindung auch Muteine, Varianten und Fragmente davon. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von den in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen unterscheiden.

Unter den Begriff "Variante" fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen oder Spleißvariationen des Endometrioseproteins, sowie durch rekombinante DNA-Technologie (insbesondere in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden) erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunolgischen Aktivität den in SEQ IN NO. 2 dargestellten Proteinen im wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung, z. B. Acetylierung oder Amidierung, modifiziert sind. Zu den erfindungsgemäßen Aminosäurese quenzen gehören auch Polypeptidfragmente (Peptide), die einen mindestens 10 Aminosäuren langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 2 gezeigten Aminosäu resequenz darstellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegender Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA-Sequenz vorzugs weise in Verbindung mit Expressionssignalen, wie etwa Promotor, Operator, Enhancer etc. befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen, und extrachromosomale Vektoren, wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al., supra, Kapitel 1-4, beschrieben. Besonders bevorzugt ist der erfindungsgemäße Vektor ein eukaryontischer Vektor, z. B. ein Hefevektor, oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor, z. B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor oder Pflanzenvektor. Derartige Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig, so daß hier nicht näher darauf eingegangen werden muß. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Sambrook et al., supra, Kapitel 16, verwiesen.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der einen mindestens 21 Nukleo tide langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz erhält. Vorzugsweise besitzt dieser Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Nukleotid-kodierenden Bereich der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz oder einem für die Expression des Proteins wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren eignen sich besonders zur Herstellung von therapeu tisch einsetzbaren Antisense-Nukleinsäuren, die vorzugsweise bis zu 50 Nukleotide lang sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine prokaryontische Zelle sein. Verfahren zur Transformation von Zellen mit Nukleinsäuren sind allgemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden. Beispiele für bevorzugte Zellen sind eukaryon tische Zellen, insbesondere tierische und besonders bevorzugt Säugerzellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper gegen das vom Endometriosegen kodierte Protein oder Varianten davon. Besonders bevorzugt sind derartige Antikörper gegen die gesamten Polypeptide oder gegen eine Peptidsequenz gerichtet, die den Aminosäuren 1-302 der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.

Die Identifizierung, Isolierung und Expression eines erfindungsgemäßen Gens, das speziell mit invasiven Prozessen und insbesondere mit der Endometriose assoziiert ist, liefert die Voraussetzungen für die Diagnostik, Therapie und Prävention von Erkrankungen, die auf derartigen oben genannten Störungen beruhen.

Mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen wird es möglich, Antikörper gegen derartige Polypeptide herzustellen. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem voll ständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach der Methode von Köhler und Milstein und deren Weiterentwicklungen können aus den Antikörper-produzierenden Zellen der Versuchstiere auf bekannte Weise durch Zellfusion monoklonale Antikörper erhalten werden. Ebenso können nach bekannten Methoden humane monoklonale Antikörper hergestellt werden. Derartige Antikörper könnten dann sowohl für diagnostische Tests, insbesondere von Endometriosezellgewebe, oder auch für die Therapie verwendet werden. Diagnostische Untersuchungen können auch mit Hilfe spezifischer Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z. B. auf Gen- oder Transkriptebene, durchgeführt werden.

Weiterhin ermöglicht die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen eine gezielte Suche nach Effektoren der Polypeptide/Proteine. Effektoren sind Stoffe, die auf das erfindungsgemäße Polypeptid inhibitorisch oder aktivierend wirken, und die in der Lage sind, die durch die Polypeptide gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beein flussen. Diese können dann bei der Therapie von entsprechenden Krank heitsbildern, wie etwa solchen, die auf invasiven Prozessen beruhen, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der Endometrioseproteine, wobei man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiedenen potentiel len Effektorsubstanzen, z. B. niedermolekularen Stoffen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen, z. B. zellaktivierende, zellinhibierende, zellproliferative und/oder zellgenetische Veränderungen, analysiert. Auf diese Weise lassen sich auch Bindetargets der Endometrioseproteine identifizieren.

Da viele Tumorerkrankungen mit invasiven Prozessen einhergehen, liefert die Entdeckung des Gens gemäß der Erfindung zusätzlich Möglichkeiten für die Diagnose, Prävention und Therapie von krebsartigen Krankheiten.

Die Entdeckung eines Gens, welches für invasive Prozesse mit verantwort lich ist, eröffnet nicht nur Möglichkeiten zur Behandlung von Krankheiten, die auf derartigen Zellveränderungen beruhen, sondern es können die erfindungsgemäßen Sequenzen auch verwendet werden, um sich derartige Prozesse nutzbar zu machen. Dies könnte beispielsweise bei der Im plantation von Embryonen von Bedeutung sein.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponenten Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Peptide und/oder Antikörper, wie zuvor angegeben, umfaßt.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe, sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen eingesetzt werden, die mit invasiven Prozessen assoziiert sind. Weiterhin kann die erfindungsgemäße Zusammen setzung auch zur Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen eingesetzt werden, insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Endometriose.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Sequenzprotokolle näher erläutert.
SEQ ID NO. 1:
stellt eine Nukleotidsequenz dar, die für das Endome triose-assoziierte Gen kodierende genetische Information enthält, wobei ein offener Leserahmen von Nukleotid 3 bis 911 reicht, und
SEQ ID NO. 2:
stellt die Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens der in SEQ ID NO. 1 gezeigte Nukleotidsequenz dar, wobei die Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens von Aminosäure 1 bis 302 reicht.

Beispiele Beispiel 1 Kultivierung von Zellen

Zur Identifizierung eines Endometriose-assoziierten Gens wurden invasive und nicht-invasive Zellen der epithelialen Endometriosezellinie EEC145T⁺ verwendet. Die Zellen wurden in Dulbecco-Medium (DMEM) mit 10% fetalem Kälberserum kultiviert und 2× pro Woche 1 : 5 verdünnt (Passage). Für den Vergleich der Expressionsmuster mittels DDRT-PCR (siehe unten) wurden invasive Zellen der Passage 17 und nicht invasive Zellen der Passage 33 verwendet. Die Zellen wurden mit SV40 transformiert und durch Differential Display Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) analysiert.

Beispiel 2 DDRT-PCR

Bei dieser von Liang und Pardee entwickelten Methode handelt es sich um ein Verfahren zur Unterscheidung der Expressionsmuster verschiedener Zellarten oder des wechselnden Expressionsmusters einer Zellart unter verschiedenen Lebensbedingungen oder während wechselnder Entwick lungsstadien (Liang und Pardee (1992), Science 257, 967-971). Die Grundlage der DDRT-PCR-Technik basiert auf der Überlegung, daß in jeder Zelle etwa 15 000 Gene exprimiert werden und prinzipiell jedes einzelne mRNA-Molekül mittels reverser Transkription und Amplifikation mit zufälligen Primern dargestellt werden kann.

In diesem Beispiel wurde die zelluläre PolyA⁺-RNA zunächst mit Hilfe mehrerer verschiedener dT₁₁VX-Primer (Downstream-Primer, Ankerprimer) in cDNA umgeschrieben. Die resultierenden cDNA-Populationen wurden dann mit 4 Downstream- und 20 Upstream-Primern aus dem RNA-Map™-Kit der Firma Genhunter, Nashville (1994), unter Zugabe eines radioaktiv markierten Nukleotids PCR-amplifiziert. Nach der Amplifikation wurden die Reaktionsansätze im Vakuum eingeengt und die erhaltenen cDNA-Fragmente in einem sechsprozentigen nativen PAA-Gel (Polyacrylamid) aufgetrennt. Die DNA-Detektion erfolgte durch Autoradiographie. PCR-Ansätze, die für die beiden zu untersuchenden Zellvarianten deutliche Unterschiede im Bandenmuster zeigten, wurden zweifach wiederholt, um die Reproduzier barkeit zu überprüfen. Bestätigten sich die zuvor gefundenen Unterschiede, wurden die Banden nach bekannten Verfahren aus dem Gel eluiert, reamplifiziert, kloniert und sequenziert.

Durch diese Methode fand man ein 394 bp langes Fragment (Fragment 1, Nukleotide 1235 bis 1628 der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz), welches für die invasive Zellvariante spezifisch war. Dieses Fragment 1 wurde in der Northern Blot Analyse (siehe unten) als Sonde verwendet.

Beispiel 3 Northern Blot Analysen

Zur Überprüfung des Expressionsmusters für das DDRT-PCR-Fragment 1 wurden Northern Blot Analysen durchgeführt. Dazu wurden 20 µg Gesamt- RNA bzw. 4 µg PolyA⁺-RNA in 1%igen denaturierenden Agarosegelen aufgetrennt und über Nacht auf eine Nylonmembran übertragen. Die RNA wurde durch Bestrahlung mit UV-Licht auf der Membran fixiert. Die Hybridisierung mit ³²P-markierten Sonden (Markierung mittels RPL-Kit der Firma Amersham) erfolgte über Nacht in einer formamidhaltigen Hybridi sierungslösung bei 42°C. Anschließend wurde die Membran mit steigender Stringenz gewaschen, bis eine punktuelle Intensität der radioaktiven Strahlung meßbar war. Die Darstellung des Hybridisierungsmusters erfolgte durch Auflegen eines Röntgenfilms (NEF-NEN: Firma DuPont) und Exposition über mehrere Tage. Zur Bestimmung des Expressionsmusters für DDRT-PCR-Frag ment 1 wurden Northern Blot Analysen mit RNA aus folgenden Zellen bzw. Geweben durchgeführt:

- invasive Zellen der epithelialen Endometriosezellinie EEC145T⁺ (Passage 17)
- nicht invasive Zellen der epithelialen Endometriosezellinie EEC145T⁺ (Passage 33)
- Zellen der peritonealen Zellinie EEC143T⁺
- Endometriumgewebe
- Zellen der invasiven humanen Blasenkarzinomzellinie EJ28
- Zellen der nichtinvasiven humanen Blasenkarzinomzellinie RT112.

Nach Hybridisierung mit der Sonde für DDRT-PCR-Fragment 1 konnte eine etwa 4 kb große mRNA detektiert werden, die ausschließlich in der invasiven Variante der Endometriosezellinie EEC145T⁺ nachgewiesen werden konnte. Es wurden weitere humane Gewebe getestet. In der Milz fand sich eine mRNA von 4 kb Länge, die mit Fragment 1 eindeutig hybridisierte, und in Hirn mRNAs von jeweils 4 kb und < 9 kb Länge.

Beispiel 4 RT-PCR

Eine sensible Methode zur Überprüfung des Expressionsmusters bietet die RT-PCR (Reverse Transcription PCR).

Dazu wurden 1 µg der jeweiligen PolyA⁺-RNA mit Hilfe von 400 U M-MLV Reverse Transkriptase (Firma Gibco-BRL) in einem Gesamtvolumen von 30 µl in cDNA umgeschrieben. 1 µl davon wurde zur anschließenden PCR mit unterschiedlichen Primerkombinationen eingesetzt.

Die verwendeten PCR-Primer P1 bis P7 sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Es wurden mit PolyA⁺-RNA aus verschiedenen Zellinien und Geweben RT-PCR-Ex perimente unter Verwendung verschiedener Primerkombinationen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Die RT-PCR Ergebnisse bestätigten die für Fragment 1 spezifische Ex pression in den frühen Passagen (Passage 17, Passage 20) der Endometrio sezellinie EEC145T⁺. Abweichend zu den Northern Blot Analysen konnte zusätzlich eine schwache Expression im Endometrium gezeigt werden.

Beispiel 5 Herstellung der cDNA-Phagenbank EEC14

Die cDNA-Phagenbank EEC14 wurde nach der Methode von Short, J.M. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7583-7600, hergestellt.

Zunächst erfolgte die Reverse Transkription von PolyA⁺-RNA invasiver Zellen (Passage 17) der epithelialen Endometriosezellinie EEC145T⁺. Der hierzu verwendete Primer setzt sich aus einer Xhol-Schnittstelle sowie einer 18 Nukleotide langen poly(dT)-Sequenz zusammen. Ein Adaptor, der eine EcoRI-Schnittstelle beinhaltet, wurde an die entstandenen cDNA-Fragmente ligiert. Die beiden Restriktionsschnittstellen erlauben eine gerichtete Insertion der cDNA-Fragmente in den ZAP Express™ Vektor. Inserts können in Form eines Kanamycin-resistenten pBK CMV Phagemids aus dem Phagen herausgeschnitten werden.

Beispiel 6 Phagenbankscreening

Das DDRT-PCR-Fragment 1 (394 bp) wurde als Sonde verwendet, um 10⁶ pfu (plaque forming units) der cDNA-Phagenbank EEC14 laut Hersteller protokoll (Firma Stratagene) zu durchmustern. Die Markierung der Sonde mit Digoxigenin (Firma Boehringer Mannheim) erfolgte mit Hilfe der PCR. Die nach Infektion des Bakterienstamms XL1 blue MRF' entstandenen Plaques wurden auf eine Nylonmembran übertragen und auf dieser mit der o.g. Sonde hybridisiert. Der Nachweis der hybridisierten, Digoxigenin-markierten Sonde erfolgte nach dem Chemilumineszenz-Protokoll der Firma Boehringer Mannheim.

Positive Plaques wurden ausgewählt und einem Rescreening unterzogen. Die im Rescreening positiven Plaques wurden zur Excision eingesetzt. Durch Herausschneiden des Vektoranteils aus dem Phage mittels ExAssist Helferphagen entstanden Kanamycin-resistente pBK CMV Phagemide, die nach Vermehrung im Bakterienstamm XLOLR™ isoliert und sequenziert werden konnten. Der isolierte Phagemidklon Q2A enthielt mit einer Größe von 2,3 kb das längste Insert, dessen Sequenz bestimmt wurde und SEQ ID NO. 1 gezeigt ist. Die Sequenz des DDRT-PCR-Fragments 1 findet sich in den Nukleotiden 1235 bis 1628.

Beispiel 7 Southern blot Analyse

10 µg genomische DNA von weiblichen und männlichen Personen wurde mit unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen geschnitten. Die Fragmente wurden im Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen. Auf dieser Membran erfolgte die Hybridisierung mit dem Digoxigenin markierten DDRT-PCR-Fragment 1.

Die Hybridisierung konnte durch Chemilumineszenz laut Protokoll der Firma Boehringer nachgewiesen werden. Bei Verwendung unterschiedlicher Restriktionsendonukleasen wurde sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen DNA-Proben nur jeweils eine Bande detektiert. Dieses Ergebnis spricht dafür, daß das dem Fragment 1 zu Grunde liegende Gen ein singuläres, geschlechtsunspezifisches Gen ist. Mittlerweile wurden mit dem DDRT-PCR-Fragment 1 zwei genomische Klone PAC J1472 und PAC N1977 isoliert.

Beispiel 8 Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH)

Die in Beispiel 7 gewonnen genomischen Klone wurden mittels der Fluorescenz- in situ-Hybridisierung auf Chromosom 1 (1p36) lokalisiert (Lichter et al. (1990), Science 247: 64-69).

Beispiel 9 Herstellung Fragment 1-spezifischer Antikörper

Die Nukleotide 584 bis 909 der o.g. cDNA-Sequenz wurden über geeignete Restriktionsschnittstellen in den Expressionsvektor pMAL cRI kloniert. Zur Expression der Sequenz wurde das Konstrukt in E.coli DHS α-Zellen trans formiert. Das translatierte Proteinfragment wurde aus dem SDS-Poly acrylamid-Gel ausgeschnitten und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.

Claims

1. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Protein-kodierenden Abschnitt davon,
(b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt,

mit der Maßgabe, daß die Nukleinsäure verschieden ist von den mit den Zugangsnummern Z98886, Ac003017, Aa452993 und Aa452856 in der Datenbank EMBL EST angegebenen Sequenzen.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Protein-kodierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz umfaßt.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Homologie von mehr als 80% zu der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleotidsequenz oder einem Abschnitt davon aufweist.

4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein mit invasiven Prozessen assoziiertes Polypeptid oder einen Abschnitt davon kodiert.

5. Modifizierte Nukleinsäure oder Nukleinsäureanalogon, die/das eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.

6. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert ist, wobei die Maßgabe von Anspruch 1 nicht zu berücksichti gen ist.

7. Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es

(a) die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder
(b) eine Homologie von mehr als 70% zu der Aminosäuresequenz gemäß (a) aufweist.

8. Modifiziertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 6 oder 7 umfaßt.

9. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es einen mindestens 10 Aminosäuren langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz darstellt.

10. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einen Abschnitt davon aufweist.

11. Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression der Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.

12. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 10 oder 11 transformiert ist.

13. Antikörper gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder gegen ein Peptid nach Anspruch 9.

14. Antikörper nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen das gesamte Polypeptid oder gegen ein Fragment davon ausgewählt aus einem Abschnitt der Aminosäuren 1 bis 302 aus SEQ ID NO. 2 gerichtet ist.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktive Komponente umfaßt:

(a) eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Maßgabe von Anspruch 1 nicht zu berücksichtigen ist,
(b) einen Vektor nach Anspruch 10 oder 11,
(c) eine Zelle nach Anspruch 12,
(d) ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 8,
(e) ein Peptid nach Anspruch 9 und/oder
(f) einen Antikörper nach Anspruch 13 oder 14.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.

17. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder von Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Her stellung von Antikörpern.

18. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit invasiven Prozessen zu sammenhängen.

19. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 zur Diagnostik einer Prädisposition für Erkrankungen, die mit invasiven Prozessen zusammenhängen.

20. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit invasiven Prozessen zusammenhängen.

21. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Endometriose.

22. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Tumorerkrankungen.

23. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 als Mittel für die Gentherapie.

24. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 als Antisense-Inhibitor.

25. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 bei der Implantation von Embryonen.

26. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 zur Identifizierung von Inhibitoren von einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 8 und/oder von Inhibitoren von Molekülen, welche in der Lage sind, an das Polypeptid zu binden.