DE19811729C2 - Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis einer Nukleotidsequenz - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft außerdem eine Mikrotiterplatte und einem Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Aus der US 4,996,143 und der DE 195 81 489 T1 sind Verfahren bekannt, bei denen ein erster und ein zweiter Primer in einem Abstand von 2 bis 7 Nukleotiden an die nachzuweisende Nukleo­ tidsequenz gebunden werden. Der erste und der zweite Primer sind jeweils mit einem fluorophoren Molekül versehen. Im Bin­ dungszustand kommt es infolge des Förster-Effekts zu einem strahlungslosen Energieübergang vom einem fluorophoren Mole­ kül auf das andere. Das bewirkt eine spezifische Fluoreszenz. - Das bekannte Verfahren ist nicht besonders sensitiv.

Aus der US 5,607,834 ist es bekannt, zum Nachweis einer Nu­ kleotidsequenz einen Primer mit einer Haarnadelschleife zu verwenden. Dabei sind an den Schleifenabschnitten der Haarna­ delschleife gegenüberliegend ein fluorophores Molekül und ein Quencher vorgesehen. Der Abstand zwischen dem fluorophoren Molekül und dem Quencher ermöglichen einen strahlungslosen die Fluoreszenz löschenden Energieübergang. Wenn der Primer allerdings mit einem komplementären Gegenstrang hybridisiert, wird die Haarnadelschleife geöffnet. Die eine Fluoreszenz lö­ schende räumliche Beziehung zwischen dem fluorophoren Molekül und dem Quencher wird geändert. Damit ist eine Fluoreszenz beobachtbar.

Aus der WO 93/09250 ist ein Amplifizierungsverfahren bekannt, bei dem ein erster Primer an eine erste Phase gebunden ist. Ein zweiter Primer ist mit einem fluorophoren Farbstoff mar­ kiert. Bei Vorliegen einer nachzuweisenden Nukleotidsequenz reichert sich der markierte zweite Primer an der festen Phase an. - Um ein ausreichend diskriminierendes Signal an der fe­ sten Phase erkennen zu können, ist es notwendig, nach der PCR einen Waschschritt durchzuführen. Dieser Schritt erfordert einen zusätzlichen Arbeitsaufwand. Außerdem kann es dabei zu Kontaminationen kommen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein einfach und kostengünstig durchführbares Verfahren mit ver­ besserter Sensitivität und geringerer Kontaminationswahr­ scheinlichkeit angegeben werden. Ferner soll auf möglichst effiziente Weise die Konzentration der nachzuweisenden Nu­ kleotidsequenz bestimmbar sein.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 19 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18 und 20 bis 34.

Nach Maßgabe der Erfindung ist mindestens eines der fluoro­ phoren Moleküle an die Oberfläche einer festen Phase gebun­ den. Das Verfahren erlaubt eine qualitative und quantitative Bestimmung der nachzuweisenden Nukleotidsequenz. Durch die Bindung des mindestens einen fluorophoren Moleküls an eine feste Phase ist eine einfache Fluoreszenzmessung, insbesonde­ re eine Online-Detektion, möglich. Das Verfahren ist einfach und kostengünstig durchführbar, weil auf Waschschritte, wel­ che das Kontaminationsrisiko erhöhen, verzichtet werden kann.

Nach einer besonderen Ausgestaltung ist ein erster Primer an die feste Phase gebunden. Es kann sein, dass das erste fluo­ rophore Molekül über den ersten Primer an die feste Phase ge­ bunden ist. Dabei weist der erste Primer vorteilhafterweise eine Haarnadelschleife auf, und das erste fluorophore Molekül ist am einen Schleifenabschnitt und das zweite fluorophore Molekül gegenüberliegend am anderen Schleifenabschnitt in ei­ nem die Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden. Die Wechselwirkung wird zweckmäßigerweise durch Hybridisierung mit einem zum ersten Primer komplementären Gegenstrang oder durch eine am ersten Primer erfolgende Synthese beseitigt. Durch die vorgenannte Verfahrensführung wird die Wahrschein­ lichkeit einer Kontamination weiter gesenkt.

Nach einer weiteren Verfahrensausgestaltung kann das zweite fluorophore Molekül auch an einen zweiten Primer gebunden sein. Es ist aber auch möglich mit dem zweiten fluorophoren Molekül versehene Nukleotide oder eine weitere Nukleinsäure­ sequenz in einen Synthesestrang einzubauen. Der zweite Primer befindet sich in Lösung. Vorteilhafterweise werden der erste und der zweite Primer nach Amplifizierung und Denaturierung so hybridisiert, dass die Wechselwirkung erzeugt wird. Im hy­ bridisierten Zustand beträgt der Abstand zwischen dem ersten und zweiten fluorophoren Molekül vorzugsweise 2 bis 12 Nu­ kleotide. Die vorgenannte Verfahrensvariante ist besonderen sensitiv.

Die feste Phase kann einen, vorzugsweise elektrisch leitfähi­ gen, Kunststoff, z. B. ein Polycarbonat, Polycarben, Trime­ thylthiopen und/oder Triaminobenzol und/oder Kohlefasern ent­ halten. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, dass die feste Phase eine Mikrotiterplatte ist.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal ist das erste Mole­ kül eine Akzeptorgruppe und das zweite fluorophore Molekül eine Donorgruppe. Die Akzeptorgruppe kann ein 6-Carboxy- Tetramethyl-Rhodamin und die Donor-Gruppe ein 6-Carboxy- Fluorescein sein. Weitere geeignete Donor-/Akzeptor-Paare sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich:

Es ist selbstverständlich möglich, dass das erste und das zweite fluorophore Molekül gegeneinander ausgetauscht sind. Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal kann das erste oder zweite fluorophore Molekül durch einen, vorzugsweise aus 4- [4'-Dimethylaminophenylazo]benzolsäure gebildeten, Quencher ersetzt sein.

Geeignete Quencher/Fluorophor-Paare sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:

Zur Bestimmung der Konzentration der nachzuweisenden Nukleo­ tidsequenz kann die Fluoreszenz mittels eines mit einer Da­ tenverarbeitungseinrichtung verbundenen Fluorometers erfaßt werden, wobei aus der zeitlichen Änderung der Fluoreszenzin­ tensität die Konzentration der nachzuweisenden Nukleotidse­ quenz ermittelt wird. Als Referenzpunkt wird dabei vorzugs­ weise die zweite Ableitung der Fluoreszenzintensität über der Anzahl der durchgeführten Amplifikationszyklen verwendet.

Nach der vorrichtungsseitigen Lösung ist zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Mikrotiterplatte mit einer mehrere muldenförmige Vertiefungen aufweisenden Oberseite vorgesehen, an der das erste Molekül gebunden ist. An die Oberseite kann ein erster Primer gebunden sein, wobei das er­ ste Molekül vorteilhafterweise über den ersten Primer an die Oberfläche gebunden ist. Nach einem weiteren Ausgestaltungs­ merkmal weist der erste Primer eine Haarnadelschleife auf, und das erste Molekül ist an einem Schleifenabschnitt und das zweite Molekül gegenüberliegend an einem zweiten Schleifenab­ schnitt in einem die Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden.

Nach einer weiteren vorrichtungsseitigen Ausgestaltung ist ein Kit mit einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte sowie einem mit einer zweiten Molekül versehenen Primer vorgesehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der Zeichnung nä­ her erläutert. Hierin zeigen

Fig. 1 die Paarung des Strangs und des Gegenstrangs einer Ziel-DNA mit einem ersten und einem zweiten Primer,

Fig. 2 die Hybridisierung der synthetisierten Primer,

Fig. 3 die Anregung der fluorophoren Moleküle,

Fig. 4 die Paarung des Strangs und des Gegenstrangs einer Ziel-DNA bei einer weiteren Verfahrensvariante,

Fig. 5 die Anregung der fluorophoren Moleküle gemäß der Verfahrensvariante in Fig. 4,

Fig. 6 die Fluoreszenz eines Detektornukleotids mit und ohne Markierungsnukleotid,

Fig. 7a ein an einen zweiten Primer gebundenen Partikel nach der PCR mit Template-DNA in einer Dunkelfeld­ aufnahme,

Fig. 7b den Partikel gemäß Fig. 7a in einer fluoreszenzmi­ kroskopischen Aufnahme,

Fig. 7c ein an einen zweiten Primer gebundenen Partikel nach einer PCR ohne Template-DNA in einer Dunkel­ feldaufnahme und

Fig. 7d den Partikel gemäß Fig. 7c in einer fluoreszenzmi­ kroskopischen Aufnahme.

In Fig. 1 ist ein erster Primer P1 an die Oberseite innerhalb einer Kavität einer aus Polycarbonat oder Polypropylen herge­ stellten Mikrotiterplatte M gebunden. Die Mikrotiterplatte M kann eine geregelte Widerstandsheizung enthalten. Sie kann auch selbst ein Widerstandsheizelement sein. An den ersten Primer P1 ist ein erstes fluorophores Molekül F1 gebunden.

In die Kavitäten wird die in einer Ziel-DNA enthaltene nach­ zuweisende Nukleinsäuresequenz N und die weiteren zur Durch­ führung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Ligase- Ketten-Reaktion (LCR) notwendigen Komponenten pipettiert. Diese enthalten insbesondere einen zweiten Primer P2 mit ei­ nem daran gebundenen zweiten fluorophoren Molekül F2. Die Ziel-DNA wird durch Temperaturerhöhung denaturiert, d. h. in einen Strang S und einen Gegenstrang G getrennt.

Sodann wird die Temperatur auf 50 bis 60° zurückgenommen. Der Strang S bindet mit einem komplementären Sequenzabschnitt an den ersten Primer P1. Der Gegenstrang G bindet an den in der Flüssigkeit befindlichen zweiten Primer P2. Anschließend er­ folgt mittels einer Taq-DNA-Polymerase eine Synthese des je­ weils fehlenden Sequenzabschnitts. Dann wird die Temperatur auf 94°C erhöht, so dass die die fluorophoren Moleküle F1, F2 enthaltenden Synthesestränge als Einzelstränge, nämlich als Synthesestrang SS1 und als Synthesegegenstrang SG1, in der Flüssigkeit vorliegen. Statt über den zweiten Primer P2 kann das zweite fluorophore Molekül F2 auch gebunden an Nukleotide oder eine weitere Nukleinsäuresequenz in den Synthesestrang SS1 eingebaut werden. Die Temperatur wird auf 50 bis 60° zu­ rückgenommen. Der Synthesestrang SS1 und der Synthesege­ genstrang SG1 hybridisieren, so dass das erste F1 und das zweite fluorophore Molekül F2 in einem Abstand von 6 bis 12 Nukleotiden vorliegen. Fig. 2 zeigt das schematisch.

Bei Anregung des als Donor ausgebildeten ersten fluorophoren Moleküls F2 kommt es zu einem strahlungslosen Energieübergang auf das als Akzeptor wirkende zweite fluorophore Molekül F2. Dadurch wird am zweiten fluorophoren Molekül F2 eine ver­ stärkte Fluoreszenz beobachtet. Die Fluoreszenz wird mittels eines Fluorometers detektiert. Die detektierten Werte werden an ein Datenverarbeitungsystem weitergeleitet.

Der erste Primer P1 kann auch eine Haarnadelschleife aufwei­ sen, wobei an einem ersten Schleifenabschnitt das erste fluo­ rophore Molekül F1 und gegenüberliegend an einem Schleifenab­ schnitt ein Quencher in einem die Wechselwirkung ermöglichen­ den Abstand gebunden sind. Bei geschlossener Haarnadelschlei­ fe bewirkt die Wechselwirkung eine Löschung der Fluoreszenz. Durch Hybridisierung mit einem zum ersten Primer P1 komple­ mentären Gegenstrang G oder durch eine am ersten Primer P1 erfolgende Synthese wird die Haarnadelschleife geöffnet. Die Wechselwirkung zwischen dem fluorophoren Molekül und dem Quencher wird aufgehoben. Bei Anregung der fluorophoren Mole­ küle kommt es zur Fluoreszenz.

Sodann wird durch Temperaturerhöhung der nächste PCR-Zyklus eingeleitet. Dabei kommt es zu einer weiteren Vermehrung des Synthesestrangs SS1 und des Synthesegegenstrangs SG1 und in­ folge dessen zu einer Verstärkung der Fluoreszenzintensität.

Die Änderung der Fluoreszenzintensität über der Anzahl der PCR oder LCR-Zyklen ist ein Maß für die Ausgangskonzentration der Ziel-DNA: Je mehr Ziel-DNA in einer Probe enthalten ist, desto schneller nimmt die Fluoreszenzintensität zu.

Zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens wird eine aus Polycarbonat oder Polypropylen hergestellte Mikrotiterplatte M verwendet. An die Oberseite der Mikrotiterplatte M ist im Bereich der Näpfchen der erste Primer P1 mit seinem 5'-Ende über einen Linker, der vorzugsweise aus 6 CH₂-Gruppen be­ steht, an eine Polypropylen-Oberfläche gebunden. Die Bindung des ersten Primers P1 an die Polypropylen-Oberfläche erfolgt nach dem Verfahren von Weiler-J. und Hoheisel-JD. (Anal.- Biochem., 1996; 243 (2): 218-27).

In Fig. 4 ist eine weitere Verfahrensvariante gezeigt. Dabei ist das erste fluorophore Molekül F1 unmittelbar an die feste Phase, d. h. die Oberseite der Mikrotiterplatte M, gebunden. Der erste Primer P1 ist in der Nähe des ersten fluorophoren Moleküls F1 an die feste Phase gebunden. Nach einer Hybridi­ sierung der Synthesestränge SS1 bzw. der Synthesegegenstränge SG1 kommt es bei einer Anregung zum strahlungslosen Energie­ übergang vom ersten fluorophoren Molekül F1 (Donor) zum zwei­ ten fluorophoren Molekül F2 (Akzeptor) und dort zu einer Fluoreszenz (Fig. 5).

In Fig. 6 ist die Fluorezenz von PCR-Produkten der PCR mit 3'-fluorophortragenden Primern gezeigt. Die Fluoreszenz des PCR-Produkts ist bei einer Anregungswellenlänge von 496 nm und einer Emissionswellenlänge von 576 nm in relativen Fluo­ reszenz-Einheiten (RFU) gemessen worden. Bei der Probe "PCR ohne Template" handelt es sich um einen PCR-Ansatz ohne HGH- Template-DNA nach 25 Zyklen. Bei der Probe "PCR mit Template" handelt es sich um einen PCR-Ansatz mit HGH-Template-DNA nach 25 Zyklen. Die rechte Säule zeigt den PCR-Ansatz mit Templa­ te-DNA, jedoch ohne die Durchführung von Temperaturzyklen.

Aus Fig. 6 ist klar ersichtlich, dass mit Hilfe des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens das Template ohne weiteres, insbeson­ dere ohne das Erfordernis von Waschschritten, nachgewiesen werden kann.

Nachgereichte Beispiele: Beispiel 1: Fluoreszenz-Energie-Transfer in PCR-Produkten von 3'- fluorophor-tragenden Primern

Es werden zwei Primer synthetisiert, die im Bereich des 3'- Endes mit fluorophoren Gruppen markiert waren.

Ein erster Primer mit einer Länge von 23 Basen weist die fol­ gende Sequenz auf:

Das Thymidin in der Position 4 bezogen auf das 3'-Ende (in der Sequenz fett gedruckt) ist mit 6-Carboxyfluorescein (6- FAM) markiert. Die FAM-Gruppe ist über die Amino-Gruppe des, während der Oligonukleotid-Synthese eingebauten dT-C2-NH2, gebunden.

Ein zweiter Primer mit einer Länge von 19 Basen weist die folgende Sequenz auf:

Das Thymidin in der Position 3 bezogen auf das 3'-Ende (in der Sequenz fett gedruckt) ist mit Carboxymehtylrhodamin (TAMRA) markiert. Die TAMRA-Gruppe ist über die Amino-Gruppe des, während des Oligonukleotid-Synthese eingebauten dT-C2- NH2, gebunden. Der zweite Primer ist am 5'-Ende mit einer Biotin-Gruppe markiert.

Der Synthese-Maßstab beträgt 0,2 µmol. Die Primer werden über HPLC gereinigt. Die Sequenzen der Primer liegen unmittelbar benachbart auf einem Sequenzabschnitt des Humanen-Growth- Hormon-Gens (HGH-Gens).

Der erste und zweite Primer werden in einer PCR unter der Verwendung einer Template-DNA, die den Sequenzabschnitt des HGH-Gens abdeckt, umgesetzt. Die PCR wird in einem Gesamt- Volumen von 50 µl mit je 0,5 µM Primer, 2 Einheiten Taq-DNA- Polymerase und 1 µl HGH-Gen (10 ng) in den entsprechenden PCR- Puffern (alle Lösungen und Enzyme von Boehringer, Mannheim) durchgeführt. Es werden 25 Zyklen mit einer Annealing- Temperatur von 66°C (45 Sek.), Elongations-Temperatur von 72°C (45 Sek.) und einer Denaturierungs-Temperatur von 94°C (30 Sek.) durchgeführt.

Als negative Kontrolle werden die gleiche PCR unter Auslas­ sung der Template-DNA durchgeführt. Als weitere Kontrolle wird der PCR-Ansatz bei 4°C belassen.

Durch die PCR wird ein PCR-Produkt gebildet, in dem die Fluo­ rophore des ersten und zweiten Primer in einem Abstand von wenigen Basen auf den Strängen entgegengesetzter Polarität angeordnet sind:

Bei einer entsprechenden Anregung der 5-FAM-Gruppe bei 496 nm kommt es zu einem Fluoreszenz-Energie-Transfer auf die TAMRA- Gruppe im Gegenstrang, deren Emissionsmaximum bei 576 nm liegt.

Zum Nachweis der Bildung des PCR-Produkts und des Fluores­ zenz-Energie-Transfers wird die Fluoreszenz in einem Fluores­ zenz-Spektrometer bei einer Anregung von 496 nm (+/-10 nm) und einer Emission von 576 nm (+/-10 nm) bestimmt. Durch die PCR erhöht sich die Fluoreszenz der TAMRA-Gruppe (Fig. 6). Diese Erhöhung der Fluoreszenz zeigt die Bildung des erwarteten PCR-Produkts an.

Beispiel 2: PCR mit 3'-markierten und immobilisierten Primer

Für die PCR mit 3'-markierten und immobilisierten Primer wer­ den die gleichen Primer verwendet, die in Beispiel 1 be­ schrieben sind. Der 5'-biotinylierte zweite Primer gemäß Bei­ spiel 1 wird von der PCR an Streptavidin-beschichtete, super­ paramagnetische Partikel einer Größe von ca. 2,8 µm Durchmes­ ser (M-280 Dynabeads, Dynal, Hamburg) gebunden. Dazu werden die Partikel (10 ug/µl; 6,7 × 10⁸ Partikel/ml suspendiert in Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4 mit B/W-Puffer (10 mM Tris-C1, 1 mM EDTA, 2 M NaC1) ph 7,5 gewaschen und auf eine Konzentration von 5 µg/µl in B/W-Puffer gebracht. Zu 20 µl dieser Suspension wird das gleiche Volumen einer 50 µM-Lösung von Primer-2 in destilliertem Wasser gegeben. Die Suspension wird 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in­ kubiert. Ungebundenen Primer wird durch zweimaliges Waschen der Partikel zunächst mit 100 µl B/W-Puffer und darauf durch Waschen mit 10 mM TrisC1, 0,2 mM EDTA pH8 (TE) entfernt. Die Partikel werden in einer 10 µg/µl Suspension bei 4°C in TE ge­ lagert.

Mit dem an das supermagnetische Partikel gebundenen zweiten Primer wird die PCR gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Im Unter­ schied zu Beispiel 1 wird statt des freien zweiten Primers 1 µl der Suspension des Partikel gebundenen Primer-2 einge­ setzt. Nach der PCR werden die Partikel mehrfach in TE gewa­ schen und im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert. Es wird die Anlagerung des 6-FAM-markierten ersten Primers an die Parti­ kel untersucht. In Fig. 7A ist die Fluoreszenz der Partikel nach Abschluss nachgewiesen. In dem aus Fig. 7B ersichtlichen PCR-Ansatz ist eine Fluoreszenz der Partikel zu beobachten, die durch die Anlagerung des FAM-markierten ersten Primers an die Partikel zustande kommt. Diese Fluoreszenz ist in der Kontrolle ohne Template-DNA (Fig. 7D) nicht vorhanden.

SEQUENZPROTOKOLLE

Bezugszeichenliste

S Strang
G Gegenstrang
P1 erster Primer
P2 zweiter Primer
F1 erstes fluorophores Molekül
F2 zweites fluorophores Molekül
SS1 Synthesestrang
SG1 Synthesegegenstrang
M Mikrotiterplatte
N Nukleotidsequenz

Claims (34)

1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz (N) mittels Fluoreszenz, wobei bei Vorliegen der nachzuweisenden Nu­ kleotidsequenz (N) eine einen strahlungslosen oder direk­ ten Energieübergang ermöglichende Wechselwirkung zwischen einem ersten (F1) und einem zweiten fluorophoren Molekül (F2) erzeugt oder beseitigt wird, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der fluorophoren Moleküle (F1, F2) an eine festen Phase (M) gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein erster Primer (P1) an die feste Phase (M) gebunden ist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste fluorophore Molekül (F1) über den ersten Primer (P1) an die feste Phase (M) gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der erste Primer (P1) eine Haarnadelschleife aufweist, und das erste fluoropho­ re Molekül (F1) am einen Schleifenabschnitt und das zwei­ te fluorophore Molekül (F2) gegenüberliegend am anderen Schleifenabschnitt in einem die Wechselwirkung ermögli­ chenden Abstand gebunden sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Wechselwirkung durch Hybridisierung mit einem zum ersten Primer (P1) komple­ mentären Gegenstrang (G) oder durch eine am ersten Primer (P1) erfolgende Synthese beseitigt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zweite fluorophore Molekül (F2) an einen zweiten Pri­ mer (P2) gebunden ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mit dem zweiten fluorophoren Molekül (F2) versehene Nu­ kleotide oder eine weitere Nukleinsäuresequenz in einen Synthesestrang (SS1) eingebaut werden.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste (P1) und der zweite Primer (P2) nach Amplifi­ zierung und Denaturierung so hybridisiert werden, dass die Wechselwirkung erzeugt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im hybridisierten Zustand der Abstand zwischen dem ersten (F1) und zweiten fluorophoren Molekül (F2) 2 bis 12 Nu­ kleotide beträgt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase (M) einen, vorzugsweise elektrisch leit­ fähigen, Kunststoff enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Kunststoff ein Po­ lycarbonat, Trimethylthiophen, Triaminobenzol und/oder ein Polycarben, und/oder Kohlefasern enthält.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase eine Mikrotiterplatte (M) ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste (F1) oder zweite fluorophore Molekül (F2) durch einen, vorzugsweise aus 4-[4'Dimethylaminophenylazo]- benzoesäure gebildeten, Quencher ersetzt ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste fluorophore Molekül (F1) eine Donorgruppe und das zweite fluorophore Molekül (F2) eine korrespondieren­ de Akzeptorgruppe ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Akzeptorgruppe 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetra­ methylrhodamin, Fluorescein, DABCYL oder Bodipy Fl ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy-Fluorescein, Fluorescein, IADEANS, EDANS oder Bodipy Fl ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluoreszenz mittels eines mit einer Datenverarbei­ tungseinrichtung verbundenen Fluorometers erfaßt wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei aus der zeitlichen Änderung der Fluoreszenzintensität die Konzentration der nachzuweisenden Nukleotidsequenz (N) ermittelt wird.

19. Mikrotiterplatte zur Durchführung des Verfahrens nach ei­ nem der Ansprüche 1-18, mit einer mehrere muldenförmige Vertiefungen aufweisenden Oberseite an der das erste flu­ orophore Molekül (F1) gebunden ist.

20. Mikrotiterplatte nach Anspruch 19, wobei an die Oberseite ein erster Primer (P1) gebunden ist.

21. Mikrotiterplatte nach Anspruch 20, wobei das erste fluo­ rophore Molekül (F1) über den ersten Primer (P1) an die Oberseite gebunden ist.

22. Mikrotiterplatte nach Anspruch 21, wobei der erste Primer (P1) eine Haarnadelschleife aufweist, und das erste fluo­ rophore Molekül (F1) am einen Schleifenabschnitt und das zweite fluorophore Molekül (F2) gegenüberliegend am zwei­ ten Schleifenabschnitt in einem die Wechselwirkung ermög­ lichenden Abstand gebunden sind.

23. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wo­ bei das erste fluorophore Molekül (F1) eine Akzeptorgrup­ pe und das zweite fluorophore Molekül (F2) eine Donor­ gruppe ist.

24. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wo­ bei das erste fluorophore (F1) oder das zweite fluoropho­ re Molekül (F2) eine durch einen, vorzugsweise aus 4-[4'- Dimethylaminophenylazo]benzoesäure gebildeten, Quencher ersetzt ist.

25. Mikrotiterplatte nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Ak­ zeptorgruppe 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetrame­ thylrhodamin, Fluorescein, DABCYL oder Bodipy Fl ist.

26. Mikrotiterplatte nach einem der Anspruch 25, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy-Fluorescein, Fluorescein, IADEANS, EDANS oder Bodipy Fl ist.

27. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 26, wo­ bei die Mikrotiterplatte (M) einen, vorzugsweise elek­ trisch leitfähigen, Kunststoff enthält.

28. Mikrotiterplatte nach Anspruch 27, wobei der Kunststoff ein Polycarbonat, Trimethylthiophen, Triaminobenzol und/oder Polycarben und/oder Kohlefasern enthält.

29. Kit mit einer Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 28 sowie einem mit einem zweiten fluorophoren Mo­ lekül (F2) versehenen zweiten Primer (P2).

30. Kit nach Anspruch 29, wobei das erste fluorophore Molekül (F1) eine Akzeptorgruppe und das zweite fluorophore Mole­ kül (F2) eine Donorgruppe ist.

31. Kit nach Anspruch 29, wobei das erste (F1) oder und das zweite fluorophore Molekül (F2) durch einen, vorzugsweise aus 4-[4'-Dimethylaminophenylazo]benzoesäure gebildeten, Quencher ersetzt ist.

32. Kit nach Anspruch 30 oder 31, wobei die Akzeptorgruppe 6- Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Fluo­ rescein, DABCYL oder Bodipy Fl ist.

33. Kit nach Anspruch 32, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy- Fluorescein, Fluorescein, IADEANS, EDANS oder Bodipy Fl ist.

34. Kit nach einem Ansprüche 29 bis 33 umfassend zur Verviel­ fältigung mittels PCR oder LCR erforderliche Desoxi- Nukleotid-Triphosphate, Pufferkomponenten und Enzyme.