DE60310532T2

DE60310532T2 - Bestimmung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60310532T2
Application number: DE60310532T
Authority: DE
Inventors: Helen Braven; Russell Keay
Original assignee: Atlas Genetics Ltd
Current assignee: Binx Health Ltd
Priority date: 2002-03-07
Filing date: 2003-02-11
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2023-02-12
Also published as: US20050221315A1; US9127308B2; ES2279092T3; DK1481083T3; AU2003205870A1; GB0205455D0; JP2005518810A; WO2003074731A2; ES2324488T3; WO2003074731A3; JP2009148284A; US20160025703A1; EP1808494A1; EP1808494B1; JP4934159B2; DE60310532D1; EP1481083A2; ATE427313T1; US10094800B2; ATE348896T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sondieren einer Nukleinsäure, wobei die Sonde mit einem elektrochemisch aktiven Marker markiert ist, sowie eine an dieses Verfahren angepasste Apparatur.
Hintergrund der Erfindung
Der Nachweis spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen ist in einem breiten Bereich von Anwendungen in der Nahrungsmittel- und Umweltindustrie und in der klinischen Diagnostik sowie in der genomischen, akademischen, pharmazeutischen und pharmakogenetischen Forschung von Wichtigkeit. Idealerweise sollten die Nachweismethoden empfindlich, sequenzspezifisch, relativ schnell, billig, genau und für Routineuntersuchungen und/oder eine Automatisierung geeignet sein. Ferner sollten sie idealerweise in der Lage sein, in bestehende DNA-Amplifikationsmethoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und andere Amplifikationsmethoden für Nucleinsäuren integriert werden zu können.
Zusätzlich zu den Nachweisverfahren von Nucleinsäuren, die auf Amplifikationstechniken wie der PCR basieren oder in sie integriert sind, gibt es auch bekannte Techniken für einen sequenzspezifischen Nucleinsäurenachweis, der auf einer spezifischen Bindung einer Sonde an ein Zielobjekt basiert, das nicht unbedingt vorher amplifiziert worden sein muss. Beispielsweise sind das Southern- und Northern-Blotting bekannte Beispiele für derartige Techniken. Techniken ohne Amplifikationsstufe müssen gewöhnlich sehr empfindlich sein, um eine Signal nachzuweisen. Typischerweise werden auf der Autoradiographie oder der Chemolumineszenz beruhende Techniken eingesetzt, um die benötigte Empfindlichkeit zu erzeugen.
Das Southern- und Northern-Blotting erfordert die Bindung der Ziel-Nucleinsäure an ein Membran-Substrat. Diese Erfordernis ist nachteilig, das sie zeitaufwändig und kaum für eine Automatisierung geeignet ist.
In den auf einer Amplifikation beruhenden DNA-Nachweisverfahren wird ein breites Spektrum fluoreszenzmarkierter oder radioaktiver Sonden verwendet. Häufig wird zu analysierende Ziel-DNA enzymatisch amplifiziert, z.B. mit der PCR, und dann unter Einsatz eines fluoreszierenden an DNA bindenden Farbstoffs zum Anfärben der DNA, die nach ihrer Größe mittels Gelelektrophorese aufgetrennt wurde, sichtbar gemacht. Es sind alternative Verfahren entwickelt worden, in denen keine Gelelektrophorese benötigt wird. Mit diesen lässt sich häufig mit nicht sequenzspezifischen fluoreszierenden Farbstoffen wie z.B. SYBR-Grün oder Ethidiumbromid ein Echtzeit-Nachweis einer DNA-Amplifikation durchführen Es sind auch Assays entwickelt worden, in welchen eine DNA-Amplifikation mittels PCR mit einem auf Fluoreszenz basierenden Nachweis integriert wurden, indem eine wachsende Zahl von fluoreszenzmarkierten Oligonucleotid-Sonden eingesetzt werden, welche an spezifische DNA-Sequenzen hybridisieren. Es wurde eine Anzahl von Assays entwickelt, in welchen die Nuclease-Aktivität einer DNA-Polymerase ausgenutzt wird. Beispiele für im Handel erhältliche Nuclease-Assays sind Invader (Handelsname — Third Wave Technologies), Readit (Handelsname — Promega) und TaqMan (Handelsname — Applied Biosystems). Beispielsweise wird in den in den US-Patenten 5,487,972; 5,538,848 und 5,804,375 beschriebenen TaqMan-Assays ein Hybridisierungs-Oligonucleotid durch die inhärente 5'-Nuclease-Aktivität der Taq-Polymerase gleichzeitig mit der Primer Extension durch die Taq-Polymerase-Aktivität verdaut.
Die Anwendung der Elektrochemie bei einem DNA-Nachweis bietet im Hinblick auf Empfindlichkeit und Einfachheit potentielle Vorteile gegenüber anderen Nachweissystemen. Seine Eigenschaften, tragbar, robust, leicht miniaturisierbar zu sein und die Möglichkeit für eine Massenfertigung macht das Gerät für elektrochemische Methoden für die klinische, Nahrungsmittel- und Umwelt-Diagnostik besonders geeignet.
Der Hauptbrennpunkt für auf elektrochemischen Prinzipien basierende Gensonden waren elektrodengebundene Hybridisierungstechniken. Typischerweise wird eine Fangsonde (Oligonucleotid oder Peptid-Nucleinsäure) auf einer Elektrodenoberfläche immobilisiert und zieht die komplementäre Ziel-Nucleinsäure aus einer komplexen Mischung von Nucleinsäuren heraus. Das Hybridisierungsereignis wird in ein messbares elektronisches Signal überführt, indem entweder ein Redox-aktiver Hybridisierungsindikator (z.B. ein Ruthenium- oder Kobaltsalz) oder ein mit Hilfe einer Sekundärsonde in Kontakt mit dem Ziel gebrachter Redox-aktiver Indikator eingesetzt werden oder durch die direkte Messung von Änderungen der Elektrodenkapazität, welche durch Änderungen der physikalischen Eigenschaften der Grenzfläche zwischen der Elektrode und der Lösung als Ergebnis der Hybridisierung hervorgerufen wurden. Diese Systeme erfordern häufig eine vorherige Amplifikation der Zielsequenz, z.B. mittels der PCR, um eine ausreichende Empfindlichkeit zu erzielen.
Die Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäure-bindenden Proteinen enthalten Nuclease Protection Assays. In solchen Assays wird eine Nucleinsäure-Sonde in Lösung mit einem möglichen Nucleinsäure-bindenden Protein vermischt. unter geeigneten Bedingungen können Nucleinsäure-bindenden Proteine dazu gebracht werden, die in der Sonde vorkommende Nucleinsäuresequenz zu binden. Nach einer möglichen Bindung kann jede nicht gebundene Sonde oder jeder nicht gebundene Sondenabschnitt von einer geeigneten Nuclease verdaut werden. Eine gebundene Nucleinsäuresonde ist vor einem Nucleaseverdau geschützt, da das gebundene Protein die Nuclease sterisch hindert. Die verdaute und die nicht verdaute Nucleinsäuresonde werden sodann getrennt, z.B. mittels Gelfiltration, Gelelektrophorese oder indem man nicht verdaute Nucleinsäure dazu bringt. sich an eine Membran oder ein anderes Substrat zu binden, und quantitativ gemessen. Typischerweise wird die Sonde mit einem radioaktiven Isotop markiert, damit sie und ihre Abbauprodukte quantitativ bestimmt werden können. Bei Verwendung von Radioisotopen gibt es Nachteile sowohl was die Probleme beim radioaktiven Zerfall angeht, welcher die Lagerbeständigkeit der Reagenzien verringert als auch mit der beruflichen Gesundheit und den Umweltproblemen.
Zum Nachweis von Nucleinsäure-bindenden Proteinen geeignete Nucleinsäuresonden sind Nucleinsäuren von im Wesentlichen der Sequenz, von der bekannt ist, dass sie in vivo Nucleinsäure-bindende Proteine bindet. Zusätzlich enthalten geeignete Sonden zum Nachweis von Nucleinsäure-bindenden Proteinen Aptamere, welche in vitro entstandene Nucleinsäuren zur Durchführung spezifischer Funktionen sind (siehe z.B. Brody und Gold, Reviews in Molecular Biology 9, (1999) 324—329, Jäschke et al., Synlett 6 (1999) 825— 833 und Griffith & Tawfik, Current Opinion in Biotechnology 11 (2000) 338—353 für genauere Angaben). Aptamere lassen sich herstellen, um potentiell an jedes spezifische Protein zu binden und nicht nur an Proteine, die gewöhnlich für Nucleinsäure-bindende Proteine gehalten werden.
Der im Kontext dieser Beschreibung verwendete Ausdruck "hybridisieren" ist so zu verstehen, dass damit eine spezifische Bindung einer ersten Nucleinsäure an eine zweite Nucleinsäure mit komplementärer Sequenz gemeint ist. Damit eine Hybridisierung eintritt, ist es auch selbstverständlich, dass die Komplementarität der Nucleinsäuresequenz nicht vollständig sein muss. Eine Hybridisierung umfasst eine komplementäre Bindung mit einer fehlerhaften Paarung bis zu dem Ausmaß, dass eine solche fehlerhafte Paarung die Effizienz der beschriebenen Verfahren nicht wesentlich verringert.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Sondieren einer Nukleinsäure zur Verfügung, bei welchem man eine Nukleinsäurelösung mit einer Oligonukleotidsonde in Berührung bringt, die mit einem elektrochemisch aktiven Marker markiert ist, Bedingungen schafft, bei denen die Sonde in der Lage ist, wenigstens teilweise mit jeglicher komplementärer (Ziel-)Sequenz zu hybridisieren, die in der Nukleinsäurelösung vorhanden sein kann, entweder hybridisierte oder nicht hybridisierte Nukleinsäuresonde selektiv abbaut und elektrochemisch Informationen nachweist, die sich auf den elektrochemisch aktiven Marker beziehen. Die Information, die sich auf den Marker beziehen, wird zweckmäßigerweise eingesetzt, um eine Information betreffend die Gegenwart oder Abwesenheit wenigstens einer Nukleinsäurespezies zu erhalten. Vorzugsweise werden die elektrochemischen Techniken eingesetzt, um die relativen Anteile von abgebauter und nicht abgebauter Sonde zu quantifizieren. Der hier verwendete Ausdruck abbauen umfasst den Abbau als Ergebnis einer Enzymaktivität, z.B. durch einen Verdau.
Es sind eine Anzahl von Verfahren zum selektiven Abbau entweder von hybridisierten oder von nicht hybridisierten Nucleinsäuresonden verfügbar. Diese umfassen enzymatische Verfahren oder chemische Behandlungen. Enzyme lassen sich einsetzen, um eine Nucleinsäuresonde mittels eines Verdaus abzubauen, der zur Spaltung einer Phosphoresterbindung oder zur Spaltung einer Saccharidbindung oder einer glykosidischen Bindung führt.
Eine aus Aspergillus oryzae oder einer anderen geeigneten Quelle isolierte SI Nuclease oder ein Enzym mit einer ähnlichen Spezifität kann eingesetzt werden, um eine nicht hybridisierte Nucleinsäure selektiv zu verdauen. Die 5'-Nuclease-Aktivität der Taq-Polymerase oder ein anderes Enzym lassen sich einsetzen, um eine Nucleinsäuresonde zu verdauen, die sich auf dem Target an einer Position zwischen einem Paar von PCR-Primern hybridisiert hat. In diesem Fall würde die Sonde zusammen mit der Extension der Primer verdaut.
Das Invader (Handelsname)-System von Third Wave Technologies Inc. (siehe US-Patente 5,846,717; 5,837,450; 5,795,763 und 5,614,402) stellt ein fluorogenes Nucleinsäure-Nachweissystem zur Verfügung, das zur Verwendung in einer alternativen Ausführungsform des in 14a veranschaulichten elektrochemischen Nachweissystems der vorliegenden Erfindung angepasst werden kann. Kurz gesagt lässt man kurze Oligonucleotidsonden an die Zielnucleinsäure hybridisieren. Die Sonden werden so konzipiert, dass, während beide in der Lage sind, mit zumindest einem teil ihrer Länge zur Bildung eines Nucleinsäure-Duplex zu hybridisieren, es zwischen den beiden Sonden einen Abschnitt von Sequenzüberlappung gibt. Dies führt zu einer spezifischen Struktur, welche von einem Enzym erkannt, das eine der Sonden spaltet, um aus dem überlappenden Abschnitt einen "5'-Flap" freizusetzen. Ein geeignetes Enzym ist die Flap-Endonuclease (FEN1) aus Archaeoglobus fulgidus, die unter dem Markenzeichen "Cleavase VIII" vertrieben wurde. Ein elektochemisch aktiver Marker kann mit dem Primer verbunden werden, was zu dem 5'-Flap führt, vorzugsweise am oder zum 5'Ende dieses Primers hin. Das Vorkommen des 5'Flaps in der Reaktionsmischung lässt sich mittels elektrochemischer Techniken nachweisen. Insbesondere kann der elektrochemisch markierte 5'-Flap auf Grund der unterschiedlich langen Oligonucleotidabschnitte eines jeden jeweiligen Moleküls vom elektrochemisch markierten Primer abgetrennt werden. Alternativ muss, wie in 14b dargestellt, der 5'-Flap nicht an einen elektrochemisch aktiven Marker gebunden werden. Die Freisetzung fes 5'-Flaps wird von einer Oligonucleotid-Erkennungskassette nachgewiesen, welche einen Nucleinsäure-Triplex-Abschnitt bildet, der auch von dem Cleavase-Enzym erkannt und gespalten wird. An die Erkennungskassette kann ein elektrochemisch aktiver Marker gebunden sein, so dass die Spaltung der Erkennungskassette zu einem elektrochemisch aktiven Marker führt, der im Gegensatz zur Bindung an die Erkennungskassette in voller Länge an ein Fragment der Erkennungskassette gebunden ist. Das elektrochemisch markierte Fragment der Erkennungskassette kann auf Grund der unterschiedlich langen Oligonucleotidabschnitte eines jeden jeweiligen Moleküls von der elektrochemisch markierten Erkennungskassette mit voller Länge abgetrennt werden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass ein elektrochemisch aktiver Marker wie z.B. ein Metallocen unterschiedliche electrochemische Eigenschaften in Abhängigkeit davon zeigt, ob er an ein Nucleotid angeheftet ist oder nicht, ob dieses Nucleotid in ein Oligonucleotid eingebaut ist oder nicht sowie von der Länge eines jeden solchen Nucleotids.
Die Größe und die Eigenschaften eines Moleküls, an welches ein elektrochemisch aktiver Marker angeheftet ist, können die wahrgenommenen Eigenschaften des elektrochemischen Markers beeinflussen, indem z.B. die Wanderungsgeschwindigkeit mittels Diffusion oder in Reaktion auf ein elektrisches Feld beeinflusst wird.
Die elektrochemische Aktivität eines Markers kann auch durch sterische Effekte beeinflusst werden, die von der Gegenwart des Moleküls herrühren, an welches er gebunden ist. Beispielsweise kann eine sterische Hinderung den Marker daran hindern, dass er sich einer Elektrode Nähert und Elektronen aufnimmt oder abgibt.
Ist der Marker an ein Oligonucleotid angeheftet, dann kann die Sekundärstruktur des Oligonucleotids (die größtenteils von der Primärsequenz bestimmt wird) die physikalischen Eigenschaften dieses Markers beeinflussen. Ist z.B. der Marker an ein Oligonucleotid angeheftet, das eine selbstkomplementäre Primarsequenz enthält, dann kann die erhaltene Sekundärstruktur mit ihren geraden Abschnitten und Schleifen den elektrochemisch aktiven Marker sterisch hindern und das voltamperemetrisch erhaltene Signal schwächen. Selbstverständlich kann ein Verdau des Oligonucleotids die Struktur mit ihren geraden Abschnitten und Schleifen zerstören oder freisetzen und ihren Einfluss auf den Marker abschwächen oder aufheben.
Da die Sekundärstruktur der Oligonucleotide von der Temperatur abhängt, liegt es auf der Hand, dass auch die Wirkungen, die ein Oligonucleotid auf einen elektrochemischen Marker ausübt, mit der Temperatur variieren.
Ein Fachmann ist in der Lage, eine geeignete Temperatur auszuwählen, bei welcher die elektrochemische Technik der Erfindung ausgeführt wird, um für die Technik ein optimales Verhältnis von Signal zu Hintergrundrauschen zu erzielen. Falls die Technik in eine PCR-Reaktion oder andere Techniken einbezogen ist, für welche eine thermische Zyklisierungsapparatur verwendet wird, kann die Messung bei einer gewünschten Temperatur einfach bei einem passenden Punkt im Temperaturablauf der PCR erfolgen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der 5'-Nuclease-Verdau der mit einem elektrochemisch aktiven Marker markierten Sonde gleichzeitig mit der PCR-Primerextension. Es liegt auf der Hand, dass eine derartige Methode ein PCR-Verfahren in Echtzeit umfasst, in welchem die elektrochemische Aktivität der Lösung während oder nach jedem PCR-Zyklus automatisch gemessen wird. Je mehr Target in der Probe enthalten ist, desto mehr Primerextension und Sondenverdau findet auch statt. Die akkumulierte verdaute Sonde lässt sich auf Grund ihrer unterschiedlichen elektrochemischen Aktivität von einer nicht verdauten Sonde unterscheiden. Wie oben beschrieben, kann die Temperatur (PCR-Phase), bei welcher die Messungen durchgeführt werden, die Qualität des empfangenen Signals beeinflussen.
Aus Gründen der Einfachheit ist die vorliegende Erfindung weitestgehend als Nachweis einer einzelnen Nucleinsäurespezies beschrieben worden. Es ist jedoch klar, dass die Erfindung ein "Multiplex"-System mit umfasst, in welchem die Methoden und die beschriebene Apparatur eingesetzt werden können, um mehr als eine Nucleinsäurespezies gleichzeitig nachzuweisen. Multiplex-Systeme weisen die allgemeinen Vorteile auf, dass sich mit ihnen gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen wie ein Testexperiment Kontrollexperimente durchführen lassen oder dass mit ihnen gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen einige Analysen durchgeführt werden können. Der Einsatz eines Multiplex-Systems bringt somit eine Einsparung an Reagenzien und Zeit mit sich. Ein Beispiel für ein derartiges Multiplexsystem ist der Einsatz von Oligonucleotidsonden, die komplementär zu zwei oder mehr unterschiedlichen Targets sind. Derartige Sonden könnten voneinander unterschieden werden, indem sie mit elektrochemisch aktiven Markern markiert werden, welche unterschiedliche Redox-Eigenschaften aufweisen und daher mit jeder geeigneten elektrochemischen Technik wie z.B. der Differential-Pulsvoltammetrie getrennt identifizierbar sind. Um für die Verwendung in einem Multiplex-Experiment geeignet zu sein, sollten zwei (oder mehr) der Marker über Redox- Eigenschaften verfügen, die sich ausreichend voneinander unterscheiden, damit die zwei (oder mehr) Marker unterscheidbar analysiert werden können. Soll z.B. eine Differential-Pulsvoltammetrie benutzt werden, sollten die Voltammogramm-Spuren für die zwei (oder mehr) Marker Peaks bei Potentialen aufweisen, welche voneinander unterscheidbar sind. Vorzugsweise werden zwei unterschiedliche Marker eingesetzt. Die Erfindung stellt neuartige elektrochemische Marker zur Verfügung, die in einem Multiplexsystem eingesetzt werden können. Das zur Verfügung Stellen neuer Marker vergrößert den Bereich der verfügbaren Marker und ermöglicht daher die Entwicklung von Multiplexsystemen.
Die entsprechend einem ersten Aspekt der Erfindung eingesetzten markierten Oligonucleotide sind in der lage, in Folge der Freisetzung von ferrocenyliertem Mononucleotid, Dinucleotid oder Oligonucleotid aus einem Hybridisierungs-Oligonucleotid in einem sequenzabhängigen Nuclease-Assay ein deutliches oder verstärktes elektrochemisches Signal zu erzeugen. Solche Assays hängen von einer Nuclease-Aktivität ab, um bei der Sonde eine Veränderung hervorzurufen, so dass ein neues oder verstärktes Signal über die Erkennung einer spezifischen Nucleinsäuresequenz erzeugt wird.
Falls erwünscht, kann der Schritt mit dem elektrochemischen Nachweis unter Verwendung von einer oder mehreren Elektroden erfolgen, welche von einer Membran bedeckt sind, die in der Lage ist, Moleküle auf der Grundlage von einer oder mehreren Eigenschaften selektiv auszuschließen, z.B. von Eigenschaften, die ausgewählt sind aus der Größe, der Ladung und der Hydrophobizität. Dies kann helfen bei der Eliminierung des Hintergrundstroms, der z.B. von der geladenen Nucleinsäure oder unverdautem markiertem Oligonucleotid herrührt.
Geeignete elektrochemisch aktive Marker sind solche, die carbocyclische Metall-Pi-Komplexe umfassen, das sind organische Komplexe mit teilweise oder vollständig delokalisierten Pi-Elektronen. Geeignete Marker sind solche, die Sandwich-Verbindungen umfassen, in denen zwei carbocyclische Ringe parallel zueinander angeordnet sind, und auch Bent-Sandwich-Komplexe (ringförmige Verbindungen) und Monocyclopentadienyle. Vorzugsweise sind die elektrochemisch aktiven Marker Metallocenyl-Marker. Mehr bevorzugt sind es Ferrocenyl-Marker.
Die in den erfindungsgemäßen Sonden verwendete Ferrocenyl- und Metallocenyl-Marker können vorteilhafterweise N-substituierte Ferrocen- oder Metallocen-Carboxamide sein. Der Ferrocen- oder Metallocenring, der den markierenden Anteil darstellt, kann unsubstituiert sein. Falls erwünscht, kann der Ferrocen- oder Metallocenring von einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, deren Natur und Lage so ausgewählt werden, dass sie die Redoxeigenschaften des Ferrocen- oder Metallocen-Anteils in gewünschter Weise beeinflussen. Der Ferrocen- oder Metallocenring kann zusätzlich oder stattdessen von jedem Ringsubstituenten substituiert sein, der die elektrochemische Empfindlichkeit des Markers materiell nicht verringert. Der Ferrocen- oder Metallocen-Carboxamid-Anteil kann über den Carboxamid-Stickstoff an das Nucleotid oder Oligonucleotid gebunden sein. Die Bindung an das Nucleotid oder Oligonucleotid erfolgt vorzugsweise über eine Phosphatgruppe oder die Base des Nucleotids. Mit beiden Bindungsmethoden lässt sich der anzuheftende Marker über jedes Nucleotid entlang der Länge des Oligonucleotids anheften. Erfolgt die Bindung jedoch über eine Phosphatgruppe, ist die Bindung über eine 3'- oder 5'-Endgruppe von Vorteil, damit die Wahrscheinlichkeit, dass eine solche Bindung die Watson-Crick-Hybridisierung des Oligonucleotids sterisch behindert oder die Nuclease-Aktivität beeinflusst möglichst klein gehalten wird. Es wird vorausgesagt, dass eine Bindung über einen Abschnitt der Base, der nicht an der Watson-Crick-Basenpaarung beteiligt ist, eine derartige Hasenpaarung weniger trennt. Eine Bindung über die Base ist daher für eine Markierung von nicht endständigen Oligonucleotidstellen besser geeignet. Das markierte Oligonucleotid kann zwischen dem Oligonucleotid- und dem Marker-Anteil einen Linker-Anteil aufweisen. Die markierten Oligonucleotide haben vorzugsweise einen Ferrocenyl- Marker-Anteil, der über einen Linker-Anteil an das Oligonucleotid gebunden ist.
Es kann jeder geeignete Linker-Anteil eingesetzt werden. Geeignete Linker-Anteile können eine aliphatische Kette umfassen, die linear oder verzweigt und gesättigt oder ungesättigt sein kann. Vorzugsweise ist der Linker-Anteil eine lineare oder verzweigte aliphatische Kette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mit 6 bis 16, besonders 8 bis 14 und speziell mit 12 Kohlenstoffatomen. Die Alkylen-Ketten können mit jedem Substituenten substituiert sein oder sie können von jedem Atom oder Rest unterbrochen sein, vorausgesetzt, dass jeder solche Substituent, jedes Atom und jeder Rest die elektrochemische Empfindlichkeit des Markers nicht vermindert. Veranschaulichende Beispiele für Ferrocenyl-Marker, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind solche, die in den Formeln I bis III wiedergegeben sind. Die Moleküle der Formeln Ia bis IIIa sind Oligonucleotide, die mit den entsprechenden Ferrocenyl-Markern markiert sind. Die Formel IV veranschaulicht einen Ferrocenyl-Marker, der über eine Nucleotid-Base angeheftet werden kann, wobei zur Veranschaulichung die aminmodifizierte Base Thymin in Formel IV enthalten ist.
Die Mit Ferrocen markierten Sonden lassen sich nach jedem geeigneten Verfahren herstellen. Das Oligonucleotid kann beispielsweise ein durch Einführung eines Restes mit einer endständigen Aminogruppe modifiziertes Oligonucleotid sein. In Formel V wird ein modifiziertes Nucleotid wiedergegeben, welches derartige aminomodifizierten Nucleotide veranschaulicht. Das Ferrocen kann dann durch Reaktion des aminomodifizierten Nucleotids mit dem N-Hydroxysuccinimidester der Ferrocen-Carbonsäure (Formel VI) eingeführt werden, um das ferrocenmarkierte Oligonucleotid zu erhalten.
In einem alternativen Verfahren können die mit Ferrocen markierten Oligonucleotide durch Zugabe des Ferrocen-Rests während der Festphasen-Synthese des Oligonucleotids hergestellt werden. Ferrocen-Marker lassen sich in ein Oligonucleotid während der Festphasen-Synthese nach zwei allgemeinen Verfahren einführen: Zunächst erfordert die Addition des Oligonucleotids am 3'-Ende des Oligonucleotids den Einsatz eines geeigneten Harzes. Ein solches Harz wird mit einem Ferrocen-Derivat markiert. Die Addition von Ferrocen an einer inneren Stelle oder am 5'-Ende eines Oligonucleotids erfordert den Einsatz eines Kopplungsmittels, das zum Koppeln mit einem an einen festen Träger gebundenen Oligonucleotid geeignet ist, z.B. ein Ferrocenylphosphoramid-Derivat, wie es beispielsweise in den Formeln IX oder X gezeigt wird.
Ferner wird ein alternativer elektrochemisch aktiver Marker oder markierter Anteil wie z.B. eine Verbindung der Formel IX beschrieben. Mc-NR'-C(=O)-X-(Ar)_n-(L)_m-R XIin welcher

– Mc eine Metallocenyl-Gruppe ist, in welcher jeder Ring unabhängig substituiert oder nicht substituiert sein kann,
– die Metallocenyl-Gruppe ein Metallion M umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe Eisen, Chrom, Kobalt, Osmium, Ruthenium, Nickel oder Titan,
– R'H oder ein Niederalkyl ist,
– X entweder NR' oder O ist, Ar eine substituierte oder nicht substituierte Arylgruppe ist,
– n 0 oder 1 ist,
– L eine Linker-Gruppe ist,
– m 0 oder 1 ist und
– R einen zu markierenden Rest darstellt oder R ein Rest mit einer Abgangsgruppe

Die Mc-Gruppe kann mit einer oder mehreren Gruppen substituiert sein, die ausgewählt sind aus Niederalkyl (z.B. C₁—C₄-Alkyl), mit einer Hydroxy- Halogen-, Cyano-, Oxo-, Amino-, Ester-, Amido- oder einer weiteren Metallocengruppe substituierter Niederalkyl, ein Niederalkenyl, ein mit einer Hydroxy- Halogen-, Cyano-, Oxo-, Amino-, Ester-, Amido- oder einer weiteren Metallocengruppe substituierter Niederalkenyl, Aryl, ein mit einer Hydroxy- Halogen-, Cyano-, Oxo-, Amino-, Ester-, Amido- oder einer weiteren Metallocengruppe substituierter Aryl. Die weitere Metallocengruppe kann auf die gleiche Weise substituiert sein wie die Mc-Gruppe, mit der Ausnahme, dass die Gesamtzahl der Mc-Gruppen in dem Molekül der Erfindung vorzugsweise vier nicht übersteigt. Die Mc-Gruppe ist vorzugsweise nicht substituiert.
M ist vorzugsweise ein unter Eisen, Osmium und Ruthenium ausgewähltes Ion. Am meisten bevorzugt ist M eine Eisenion. Wenn M ein Eisenion ist, ist Mc Ferrocen.
Der Niederalkyl ist vorzugsweise ein C₁-C₄-Alkyl. R' ist vorzugsweise H. Jedes R' hat eine von dem anderen R' getrennte Identität.
X ist vorzugsweise NH.
Die Ar-Gruppe kann mit einer oder mehreren Gruppen substituiert sein, die ausgewählt sind aus Niederalkyl (z.B. C₁—C₄-Alkyl), ein mit einer Hydroxy- Halogen-, Cyano-, Oxo-, Amino-, Ester-, Amido- substituierter Niederalkyl, Niederalkenyl, ein mit einer Hydroxy-Halogen-, Cyano-, Oxo-, Amino-, Ester-, Amido- substituierter Niederalkenyl, Aryl oder ein mit einer Hydroxy- Halogen-, Cyano-, Oxo-, Amino-, Ester-, Amido- substituierter Aryl. Die Ar-Gruppe ist vorzugsweise nicht substituiert.
Vorzugsweise ist n = 1. Vorzugsweise ist m = 1.
Geeignete Linker-Gruppen L können eine aliphatische Kette umfassen, die linear oder verzweigt und gesättigt oder ungesättigt sein kann. Vorzugsweise ist der Linker-Rest eine lineare oder verzweigte aliphatische Kette mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mit 6 bis 16, besonders 8 bis 14 und speziell mit 12 Kohlenstoffatomen. Die Alkylen-Ketten können mit jedem Substituenten substituiert sein oder sie können von jedem Atom oder Rest unterbrochen sein, vorausgesetzt, dass jeder solche Substituent, jedes Atom und jeder Rest die elektrochemische Empfindlichkeit des Markers nicht vermindert.
Die Verbindung kann mehr al seine Metallocengruppe umfassen. In der Verbindung der Erfindung kann die Metallocengruppe durch jede andere elektrochemisch aktive Markergruppe substituiert sein. Die Verbindung kann elektrochemisch aktiv sein oder nach einer teilweisen Spaltung elektrochemisch aktiv werden.
Vorzugsweise ist der zu markierende Rest eine Aminosäure, ein Nucleotid, ein Oligonucleotid, ein Polynucleotid, ein Nucleosid, ein Zucker, ein Kohlenhydrat, ein Peptid, ein Protein oder ein Derivat von jedem dieser Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R ein Nucleotid oder ein Oligonucleotid. Das Nucleotid kann ausgewählt sein aus Adenosin, Thymidin, Guanosin, Cytidin oder Uridin. Vorzugsweise ist das Nucleotid über eine Gruppe angeheftet, welche z.B. an der 2'-, 3'- oder 5'-Position an die Ribose- oder Desoxyribosegruppe des Nucleotids angeheftet ist. Am meisten bevorzugt ist das Nucleotid an der 3'- oder 5'-Position, z.B. an der 5'-Position angeheftet. Vorzugsweise erfolgt die Anheftung an der 2'-, 3'- oder 5'-Position über ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R eine Gruppe mit einer Abgangsgruppe, vorzugsweise eine Alkyl- oder Carbonylgruppe mit einer Abgangsgruppe. Unter den Alkylgruppen sind Niederalkylgruppen (z.B. C₁-C₄-Alkylgruppen) bevorzugt. Unter den Abgangsgruppen seien Hydroxyl, Halogenide, organische Säuren und N-Hydroxydiacylamine angeführt. Die Abgangsgruppe kann z.B. Chlorid, Bromid oder Iodid, Essigsäure, eine Benzoesäure, 2,6-Dichlorbenzoesäure, ein N-Hydroxysuccinamid, ein Maleimid, Iodacetamid oder Isothiocyanat sein. Vorzugsweise ist die Abgangsgruppe N-Hydroxysuccinamid. Die Abgangsgruppe kann eine aktivierbare Gruppe sein, die für die Verwendung in einer Reaktion zum Koppeln an einen an einen festen Träger gebundenen Rest. Die Abgangsgruppe kann z.B. eine Phosphoramiditgruppe sein.
Wenn R eine Gruppe mit einer Abgangsgruppe ist, ist die Verbindung ein Markerreagenz, das eingesetzt werden kann, um ein anderes Molekül elektrochemisch zu markieren. Das Markerreagenz ist zum Markieren von biologisch wichtigen Substanzen zur Verwendung in jedem bekannten Verfahren oder dem Verfahren der Erfindung von Nutzen. In Frage kommende Moleküle sind, jedoch nicht ausschließlich, Aminosäuren, Nucleotide, Nucleoside, Zucker, Peptide, Proteine, Oligonucleotide, Polynucleotide, Kohlenwasserstoffe und Derivate von jedem dieser Moleküle.
Das Markerreagenz kann direkt über einen Linker angeheftet sein. Der Linker kann zuerst an das Markerreagenz oder an das zu markierende Molekül angeheftet werden. Wird der Linker zuerst an das zu markierende Molekül angeheftet, kann er eine Gruppe wie z.B. eine Amino- oder Thiolgruppe umfassen, die bei der Markierungsreaktion hilft. Eine Aminogruppe ist bevorzugt.
Falls das zu markierende Molekül ein Nucleotid oder ein Oligonucleotid ist, erfolgt die Markierung vorzugsweise am 3'- oder 5'-Ende. Das Oligonucleotid kann aminomodifiziert sein, um bei der Markierungsreaktion zu helfen. aminomodifizierte Oligonucleotide lassen sich mit Hilfe von Standardtechniken synthetisieren und sind breit gefächert im Handel erhältlich, z.B. von Oswel Scientific (Southampton, UK). Das Amino-modifizierte Oligonucleotid kann auch eine Linkerstruktur einbauen, z.B. kann die Modifikation die Addition einer 5'-Aminohexyl- oder 3'-Aminohexyl- oder einer 5'-Aminogruppe sein. Ein in Frage kommendes markiertes Molekül umfasst vorzugsweise einen Linker.
Im Falle eines Oligonucleotids ist die Sequenz des Oligonucleotidabschnitts des Moleküls vorzugsweise so, dass das Molekül in der Lage ist, mit einer komplementären Zielsequenz zu hybridisieren und somit als Sonde in einer molekularbiologischen Technik, z.B. eine der in dieser Beschreibung offenbarten Techniken zum Nucleisäurenachweis oder Eignungstest eingesetzt zu werden.
Markierte biologische Moleküle zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren können entweder im verdauten oder unverdauten Zustand elektrochemisch aktiv sein. Idealerweise variiert das Ausmaß der elektrochemischen Aktivität in Abhängigkeit vom Ausmaß des Verdaus.
In Formel VIII wird eine mögliche Art des Anheftens des neuartigen elektrochemisch aktiven Markers an ein Oligonucleotid veranschaulicht. Das Molekül der Formel VIII lässt sich erhalten, wenn ein 5'-Aminohexyl-modifiziertes Oligonucleotid mit dem in Formel VII gezeigten Molekül reagieren gelassen wird.
Nähere Angaben zum N-Hydroxysuccinimidester der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure und zu der Verwendung dieser Verbindung zur Markierung von Olignucleotiden stehen in den Beispielen 7 und 8. Der Fachmann kann jedoch erkennen, dass ein derartiger Marker an ein Oligonucleotid an jeder geeigneten Position angeheftet werden kann und dass die Anheftung nicht auf das 5'-Ende des Oligonucleotids beschränkt ist. Er wird auch erkennen, dass die Anheftung des neuartigen Markers nicht über einen Aminohexyl-Linker zu erfolgen braucht noch dass der Marker notwendigerweise an einem Oligonucleotid angeheftet werden muss. Für den neuartigen Marker besteht die Möglichkeit, dass er auch zur Markierung anderer in Frage kommender Moleküle eingesetzt werden kann, insbesondere von Molekülen von biologischem Interesse wie z.B. Proteinen, Kohlenhydraten und Antikörpern.
Die beschriebenen Moleküle sind in den erfindungsgemäßen Verfahren von besonderem Nutzen. Unter den in Tabelle 3 wiedergegebenen Bedingungen weist eine mit substituierten Ferrocencarbonsäuren beschichtete Elektrode ein Elektrodenpotential im Bereich von 400 mV auf. Andererseits weisen die erfindungsgemäßen substituierten Metallocen-Moleküle ein Elektrodenpotential im Bereich von 150 mV auf. Das niedrigere Potential ist ein Potential, bei welchem die Neigung der Verunreinigungen im Hintergrund, die Datenerfassung zu stören, viel geringer ist. Demzufolge lassen sich mit den Molekülen viel empfindlichere Ablesungen durchführen. In 23 werden Voltammogramme gezeigt, welche die unterschiedlichen Elektrodenpotentiale eines herkömmlichen Ferrocenderivats (Ferrocen-Carbonsäure XII) in den 23(a) und (b) und der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure, einem Ferrocenderivat mit einem in Molekülen der Erfindung gefundenen Ferrocenrest, in den 23(c) und (d) veranschaulicht. Wie aus einem Vergleich der 23(b) und 23(d) zu ersehen ist, kommt der Peak für das Ferrocenderivat mit einem beschriebenen Ferrocenrest in einem Teil des Scanning-Voltammogramms, in welchem das Hintergrundsignal schwach ist, was einen empfindlicheren Nachweis dieses Moleküls zulässt.
Die Erfindung stellt auch Vorrichtungen zur Verfügung, die so angeordnet sind, dass sie ein oder mehrere der hier beschriebenen Verfahren ausführen. Diese Vorrichtungen umfassen sowohl einen Thermozykler als auch ein Gerät für die Voltammetrie. Eine derartige Vorrichtung kann geeignete Elektroden, elektrochemische Zellen, Wegwerfartikel aus Kunststoff sowie ein Gerät zum Nachweis, zur Aufzeichnung, zur Manipulation und zur Anzeige der Ergebnisse enthalten und im Falle der PCR-Verfahren geeignete programmierte oder programmierbare Thermozykler. Derartige Vorrichtungen können auch Geräte für das optimale Konzipieren von Primern, Sonden und Zyklisierungsbedingungen enthalten.
Die Erfindung stellt auch eine Vorrichtung mit einem oder mehreren Probeaufnahmebereichen für die Aufnahme von einer oder mehreren Proben, mit Mitteln zur Überwachung der Temperatur dieser Probeaufnahmebereiche sowie mit Mitteln zur Messung der elektrochemischen Eigenschaften der Probe zur Verfügung. Gemäß einer Ausfürungsform der Erfindung ist ein Thermozykler vorgesehen, in welchem herkömmliche Mittel zur Überwachung der Probentemperatur verwendet werden können, in welchen aber ein Mittel für elektrochemische Messungen der Proben integriert ist. Eine derartige Vorrichtung kann so hergestellt sein, dass herkömmliche Elektrodenzellen (wie z.B. die hier in den Beispielen verwendeten) zum Einsatz kommen können.
Bestimmte veranschaulichende Ausführungsbeispiele werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher beschrieben.
1 ist eine schematische Darstellung einer in den Messungen der Differential-Pulsvoltammetrie verwendeten elektrochemischen Zelle;
Die 2a, 2b, 2c und 2d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einem wie in Beispiel 4(a) unten beschriebenen Ferrocen-markierten BAPR-Oligonucleotid;
Die 3a, 3b, 3c und 3d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einem wie in Beispiel 4(b) unten beschriebenen Ferrocen-markierten BAPR-Oligonucleotid;
Die 4a, 4b, 4c und 4d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einem wie in Beispiel 4(c) unten beschriebenen Ferrocen-markierten TIBAPR-Oligonucleotid;
Die 5a, 5b, 5c und 5d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einem wie in Beispiel 4(d) unten beschriebenen Ferrocen-markierten BAPR-Oligonucleotid;
Die 6a, 6b, 6c und 6d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einem wie in Beispiel 4(e) unten beschriebenen Ferrocen-markierten GSDPR-Oligonucleotid;
Die 7a, 7b, 7c und 7d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einem wie in Beispiel 4(f) unten beschriebenen Ferrocen-markierten MC11PR-Oligonucleotid;
Die 8a und 8b sind Differential-Puls-Voltammogramme von einem wie in Beispiel 4(g) unten beschriebenen unmarkierten BAFR-Oligonucleotid;
Die 9a und 9b sind Differential-Puls-Voltammogramme von Kontrollreaktionen für ein in Beispiel 4(h) unten beschriebenes Ferrocen-markiertes TIBAPR-Oligonucleotid;
Die 10a, 10b, 10c und 10d sind Differential-Puls-Voltammogramme einer wie in Beispiel 5(a) unten beschriebenen PCR-Mischung mit markiertem BAPR-Oligonucleotid;
Die 11a, 11b und 11c sind Differential-Puls-Voltammogramme eines wie in Beispiel 5(b) unten beschriebenen anderen Ferrocen-markierten MC11PR-Oligonucleotids;
Die 12a, 12b, 12c und 12d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einer wie in Beispiel 5(c) unten beschriebenen PCR-Mischung mit Ferrocen-markiertem TIBAPR-Oligonucleotid;
Die 13a, 13b, 13c und 13d sind Differential-Puls-Voltammogramme von einer wie in Beispiel 5(d) unten beschriebenen PCR-Mischung mit Ferrocen-markiertem GSDPR-Oligonucleotid;
Die 14a und 14b sind schematische Wiedergaben des für die Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren angepassten fluorogenen Nucleinsäure-Nachweissystems Invader;
15a zeigt den Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren in einem T7-Exonuclease-Assay;
15b den Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren in einem Assay, der den T7-Exonuclease-Verdau einer an PCR-Produkte hybridisierten markierten Oligonucleotid-Sonde einbaut;
16a und 16b sind Differential-Puls-Voltammogramme, welche die Substratspezifität der T7-Exonuclease veranschaulichen (Beispiel 9);
17a und 17b sind Differential-Puls-Voltammogramme, welche den T7-Exonuclease-Verdau eines mit einem ferrocenylierten Primer markierten PCR-Produkts veranschaulichen (Beispiel 10(a));
18a bis 20b sind Differential-Puls-Voltammogramme, welche den T7-Exonuclease-Verdau der an ein PCR-Produkt hybridisierten Taqman (Handelsname — Applied Systems)-Sonde veranschaulichen (Beispiel 10(b));
21a und 21b sind Differential-Puls-Voltammogramme, welche die PCR-Amplifikation mit dem Stoffel-Fragment veranschaulichen (Beispiel 10(c)) und
22a und 22b sind Differential-Puls-Voltammogramme, welche die Versuche ohne eine T7-Exonuclease veranschaulichen (Beispiel 10(d)).
23a und 23b sind Differential-Puls-Voltammogramme, welche das Elektrodenpotential der Ferrocen-Carbonsäure bei einer Konzentration von 10 μM bzw. 1 μM veranschaulichen und 23a und 23b sind Differential-Puls-Voltammogramme, welche das Elektrodenpotential der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-Benzoesäure bei einer Konzentration von 10 μM bzw. 1 μM veranschaulichen.
24 zeigt Differential-Puls-Voltammogramme der Produkte aus den Reaktionen des Nuclease-Verdaus, in welchen die Substrate (a) das am 5'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 12 Kohlenstoffatomen (2,5 μM) markierte BAPR-Oligonucleotid und das am 5'-Ende mit 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-Benzoesäure mit einem Spacer von 12 Kohlenstoffatomen (1,5 μM) markierte MC11w-Oligonucleotid waren, (b) nur das am 5'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 12 Kohlenstoffatomen (2,5 μM) markierte BAPR-Oligonucleotid und (c) nur das am 5'-Ende mit 4-(3'-Ferrocenylureido)-1- Benzoesäure mit einem Spacer von 12 Kohlenstoffatomen (1,5 μM) markierte MC11w-Oligonucleotid waren.
In 1 umfasst eine elektrochemische Zelle 1, die für die Verwendung in Versuchen mit der hier beschriebenen zyklischen Voltametrie geeignet ist, ein Gefäß 2, das als Hintergrund eine Elektrolytlösung enthält, die eine wässrige Lösung 3 aus 100 mM Ammoniumacetat ist. In die Lösung 3 ist eine Kammer 4 eingetaucht, welche sowohl die Probe als auch die darin eingetauchte Arbeitselektrode 5 aus glasigem Kohlenstoff aufnimmt. Alternativ kann eine Elektrode aus Gold verwendet werden. Ebenfalls in die Lösung 3 eingetaucht ist eine Gegenelektrode 6 aus Platin und eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode 7 ist in eine 4M Kaliumchloridlösung eingetaucht, welche Lösungen mit anderen über eine Sinterscheibe in Verbindung stehen.
In den 15a und 15b ist die T7 Exonuclease (manchmal auch als T7 Gen 6 Exonuclease bezeichnet) eine Duplexspezifische '5'-3'-Exonuclease. Das Enzym verdaut an einen Zielabschnitt der DNA hybridisierte Oligonucleotide, um Mononucleotide, Dinucleotide und kürzere Oligonucleotid-Fragmente zu erzeugen. Die Substratspezifität des Enzyms ist so, dass mit einem elektrochemischen Marker am 5'-Ende markierte Oligonucleotidsonden verdaut werden können. Die verdauten ferrocenmarkierten Sonden lassen sich mit elektrochemischen Verfahren nachweisen, z.B. mittels der Differential-Puls-Voltametrie. Die T7 Exonuclease ist nicht thermostabil und ist daher unter den normalerweise bei einer PCR eingesetzten thermischen Zyklisierungsbedingungen nicht stabil.
Die T7 Exonuclease lässt sich bei einem auf einer PCR basierenden DNA-Nachweis auf zweierlei Weise einsetzen. Die am 5'-Ende mit einem Marker wie Ferrocen markierten PCR-Produkte können synthetisiert werden, indem ein am 5'-Ende markierter Primer eingesetzt wird. Die daraufhin der PCR-Mischung zugesetzte T7 Exonuclease verdau das markierte PCR-Produkt. Der nicht amplifizierte einsträngige Primer wird nicht verdaut (15a). Im zweiten Verfahren wird, um für einen sequenzspezifischen Nachweis des PCR-Produkts zu sorgen, an Stelle des markierten Primers eine elektrochemisch markierte Sonde ähnlich einer Taqman-Sonde (Handelsname — Applied Biosystems) eingesetzt, indem sie so konzipiert ist, dass sie an die Zielnucleinsäure zwischen den Primersequenzen hybridisiert. Die Probe wird dem PCR-Mix nach Durchlaufen der thermischen Zyklen zugesetzt und an das Target hybridisieren gelassen. Sodann wird die T7 Exonuclease zugegeben und die Sonde wird nur dann verdaut, wenn sie durch Hybridisierung mit einem komplementären PCR-Produkt eine Duplexstruktur gebildet hat.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
Material und Methoden – Herstellung der Oligonucleotide und Assays
Die Oligonucleotide wurden von Sigma Gensosys erhalten. Alle Oligonucleotide wurden in entsalztem Zustand erhalten und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Das N,N'-Dimethylformamid (DMF) (99,8% A.C.S-Reagenz) und das Zinkacetat-Dihydrat (99,999%) wurden von Aldrich bezogen.
Das Kaliumbicarbonat (A.C.S-Reagenz), das Kaliumcarbonat (mindestens 99%), das Ammoniumacetat (annähernd 89%), das Magnesiumacetat (mindestens 99%), das Ammoniumpersulfat (Elektrophorese-Reagenz), das N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und das Wasser für biologische Zwecke wurden von Sigma erhalten.
Die NAP10 Säulen (G25 DNA grade Sephadex, Handelsname) wurden von Amersham Biosciences erhalten.
Die Si Nuclease, die dNTPs und die humane genomische DNA wurden von Promega bezogen.
Mit 25 mM Magnesiumchlorid und GeneAmp (Handelsname) 10X PCR Gold-Puffer supplementiertes AmpliTaq Gold und das mit 10X Stoffel-Puffer und 25 mM Magnesiumchlorid supplementierte Stoffel-Fragment der Amplitaq-DNA-Polymerase wurden von Applied Biosystems erhalten.
Die T7 Exonuclease wurde von New England Biolabs erhalten.
Die Inkubationen wurden unter Einsatz eines PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research Inc.) durchgeführt. Die Messungen der Absorption bei 260 nm erfolgten unter Einsatz eines Cary 100 Bio-Spektrophotometers (Varian Inc.). Die Polyacrylamidgele wurden mit ProtoGel (National Doagnostics) hergestellt und mit SYBR Gold (Molecular Probes Inc.) angefärbt.
Die Agarosegele wurden mit SeaKem LE Agarose (BioWhittaker Molecular Applications) hergestellt und mit Ethidiumbromid (Aldrich) angefärbt. Die Gele wurden in 0,5X TrisBorat/EDTA (TBA)-Puffer (Sigma einer Elektrophorese unterzogen. Alle Lösungen wurden mit autoklaviertem entionisiertem Wasser (WaterPro system, Labconco) zubereitet.
Oligonucleotidsequenzen
Die Oligonucleotidsequenzen der Glucose-6-Phosphatase und der mittelkettigen Acyl-CoA-Dehydrogenase-Primer und —Sonden waren wie in Kunihior Fujii, Yoichi Matsubara, Jun Akanuma, Kazutoshi Takahashi, Shigeo Kure, Yoichi Suzuki, Masue Imiazumi, Kazuie Iinuma, Osamu Sakatsume, Piero Rinaldo, Kuniaki Narisawa; Human Mutation 15: 189—196; (2000) beschrieben.
Die Oliginucleotidsequenz des Beta-Actin-Primers und der Sonde waren wie in Agnetha M. Josefsson, Patrik K. E. Magnusson, Nathelie Ylitalo, Per Sorensn, Pernialla Qwarforth-Tubbin, Perkragh Andersen, Mads Melbye, Hans-Olov Adami, Ulf B. Gyllensten; Lancet, 355: 2189-2193, (2000) beschrieben.
Die Oligonucleotidsequenz des HFE-Gen-Primers und der Sonde waren wie in Luis A. Ugozzoli, David Chinn, Keith Hamby, Analytical Biochemistry; 307: 47—53 (2002) beschrieben.
ACTB (β-Actin)

Sonde BAPR: ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGC GT C9-TIBAPR: T(C9)G CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGC GT (T(C9) = aminomodifiziertes Thymin mit C9-Linker, Formel IV)
Primer BAF: CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G BAR: TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A BAFR; GAG GTC CCG GCC AGC CAG

1. C282Y (HFE-Gen, C282Y-Mutation)

Sonde C282YP: ATA TAC GTG CCA GGT GGA
Primer C282YF: CTG GAT AAC TTG GCT GTA C C2S2YR: TCA GTC ACA TAC CCC AGA T

2. H63D (HFE-Gen, H63F-Mutation)

Sonde H63DP: ATA TAC GTG CCA GGT GGA
Primer H63DF: CTT GGT CTT TCC TTG TTT GAA G H63DR: ACA TCT GGC TTG AAA TTC TAC T

CFTR (Zystische Fibrose Transmembran-Leitfähigkeits-Regulator)

Primer CFT01: AGG CCT AGT TGT CTT ACA GTC CT CFT03: TGC CCC CTA ATT TGT TAC TTC

G6PC (Glucose-6-phosphatase)

Sonde GSDPR: TGT GGA TGT GGC TGA AAG TTT CTG AAC
Primer GSDw: CCG ATG GCG AAG CTG AAC GSDcom: TGC TTT CTT CCA CTC AGG CA

6. ACADM (mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase)

Sonde MC11PR: CTA GAA TGA GTT ACC AGA GAG CAG CTT GG
Primer MC11w: GCT GGC TGA AAT GGC AAT GA MC11com: CTG CAC AGC ATC AGT AGC TAA CTG A

7. Hairpin-Oligonucleotid

reHP: CAG AAT ACA GCA GGT GCT CGC CCG GGC GAG CAC CTG TAT TCT G

8. Einsträngiges Ologonucleotid

reBAF: CAG AAT ACA GCA GGT TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A

Die Oliginucleotide zur Verwendung in den Beispielen 7 und 8 waren am 5'-Ende C12-aminomodifiziert. Die Oliginucleotide zur Verwendung in den anderen Beispielen waren nicht modifiziert.
Material und Methoden – Elektrochemischer Nachweis
Die folgenden Elektroden und kleinvolumigen Zellen wurden von BAS, Congleton, Cheshire, UK erhalten:
Eine Glassy-Carbon-Arbeitselektrode (Katalog-Nr. MF-2012) wurde in den Beispielen 4 und 5 eingesetzt. Eine Gold-Arbeitselektrode (Katalog-Nr. MF-2014) wurde in den Beispielen 8 bis 10 eingesetzt.
Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode (Katalog-Nr. MF-2079).
Gegen(Hilfs)-Elektrode aus Platindraht (Katalog-Nr. MW-4130).
Die kleinvolumige Zelle (Katalog-Nr. MF-2040) weist ein Glasgefäß für die Voltammetrie sowie eine Glskammer für die Probe mit austauschbarer Vycor-Spitze auf.
Eine elektrochemische AutoLab-Workstation (entweder eine PGSTAT30 mit einem Frequenzganganalysator oder eine von Eco Chemie B.V. hergestellte μAutoLab TypII) wurde von Windsor scientific Limited bezogen.
BEISPIEL I
Dieses Beispiel beschreibt das in den Beispielen 3 bis 5 und 8 bis 10 unten benutze zyklische Voltammetrieverfahren.
Die kleinvolumige Zelle der 1 wurde mit ungefähr 10 ml Ammoniumacetatlösung (100 mM) gefüllt.
Ein Aliquot von 200 μl der Probe für die Analyse wurden in die Glaskammer 4 für die Probe gegeben, welche dann zusammen mit der Referenzelektrode 7 und der Gegenelektrode 6 in die kleinvolumige Zelle gegeben wurde. Die Elektroden wurden an eine elektrochemische AutoLab-Workstation angeschlossen und unter Benutzung der unten beschriebenen Parameter wurde eine Differential-Pulsvoltammetrie durchgeführt. Vor der Analyse wurde die Arbeitselektrode poliert (unter Verwendung des BAS Polierkits Katalog-Nr. MF-2060) und dan konditioniert. Das Konditionieren der Elektrode bestand aus einer zyklischen Voltammetrie, wobei in dem passenden Hintergrundpuffer das Potential zwischen +/–1 Volt gewechselt wird. Parameter für die Differential-Pulsvoltammetrie Tabelle 1: In den Beispielen 4 und 5 benutzte Parameter
Tabelle 2: In Beispiel 8 benutzte Parameter
Tabelle 3: In den Beispielen 9 und 10 benutzte Parameter
BEISPIEL 2 – Synthese des N-Hydroxysuccinimidesters der Ferrocencarbonsäure
Ferrocencarbonsäure (303 mg, 1,32 mMol) und N-hydroxysuccinimid (170 mg, 1,47 mMol) wurden in Dioxan (15 ml) gelöst und unter Rühren zu einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (305 mg, 1,48 mMol) in Dioxan (3 ml) gegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, während welcher Zeit sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde mittels Filtration entfernt, das Lösungsmittel aus dem Filtrat im Vakuum abgezogen und der erhaltene Feststoff mittels Säulenchromatographie über Silicagel und einer Flution mit 8:2 Petrolether/Essigester gereinigt. Ausbeute 320 mg, 74%.
BEISPIEL 3 – Synthese der Ferrocenyloligonucleotide
Das lyophilisierte aminomodifizierte Oligonucleotid wurde in dem richtigen Volumen K2CO3/KHCO3-Puffer (500 mM, pH 9,0) wieder gelöst, um eine Oligonucleotidkonzentration von 0,5 nMol/μl zu erhalten. Das aminomodifizierte Oligonucleotid (40 μl, 0,5 nMol/μl) wurde langsam unter Vortexen zu einer Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters der Ferrocencarbonsäure in DMF (40 μl, 375 mMol) gegeben.
Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Sie wurde dann mit Ammoniumacetat (920 μl, 100 mM, pH 7,0) verdünnt und unter Einsatz von zwei NAP 10-Säulen gereinigt, wobei zunächst mit Ammoniumacetat (100 mM, pH 7,0) und dann mit autoklaviertem entionisiertem Wasser eluiert wurde. Die ferrocenylierten Oligonucleotide wurden teilweise mit einer NAP 10-Säule gereinigt, um Salz und Ferrocenspezies mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen und eine Mischung aus mit Ferrocen markierten und nicht markierten Oligonucleotiden zu erhalten. Vor Gebrauch wurde keine weitere Reinigung durchgeführt. In den Markierungsreaktionen wurden aminomodifizierte Oligonucleotide verwendet, welche die vier verschiedenen Linkerstrukturen aufwiesen: C7, C6, C12 und T(C9), welche in ihrer Struktur und dem Punkt ihrer Anheftung variierten. Die C6-, C12- und T(C9)-Linker wurden über den endständigen Phosphatester oder die Base an das 5'-Ende des Oligonucleotids angeheftet. Der C7-Linker wurde über den endständigen Phosphatester am 3'-Ende des Nucleotids angeheftet. Die Strukturen der Marker werden in den Formeln I bis IV wiedergegeben. Die Oligonucleotidkonzentration des Elutionsmittels wurde durch Messung seiner Absorption bei 260 nm bestimmt. Das Vorkommen des Ferrocen-Markers wurde mittels voltammetrischer Analyse bestätigt.
BEISPIEL 4
Si Nuclease-Verdau
In den Reaktionen des Oligonucleotidverdaus (100 μl) war Oligonucleotid 3,5—9 μM, genaue Konzentrationen weiter unten), Ammoniumacetat (250 mM, pH 6,5), Zinkacetat 4,5 mM) und Si Nuclease (0,4 E/μl) enthalten. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Der vollständige Verdau des Oligonucleotids wurde mittels Polyacrylamidgel-Analyse eines 10 μl Aliquots der rohen Reaktionsmischung bestätigt. Vor der valtammetrischen Analyse wurden mehrere Reaktionsansätze vereinigt und ergaben ein Endvolumen von 200 μl. Zum Vergleich wurden wie oben beschrieben Reaktionen mit "keinen Enzymen" durchgeführt, wobei die 51 Nuclease in den Reaktionen weggelassen wurde. Wie oben beschrieben, wurden Kontrollen mit erhitzten Enzymen durchgeführt, wobei S1 Nuclease eingesetzt wurde, welche zuvor durch Erhitzen auf 95°C über einen Zeitraum von 15 Minuten thermisch denaturiert worden war.
Im Folgenden sind die Recktanten und Bedingungen wie oben beschrieben und die Bedingungen bei der Valtammetrie sind, außer wenn anders angegeben, wie in Tabelle 1 beschrieben.
Beispiel 4(a):

Oligonucleotid: am 3'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 7 Kohlenstoffatomen (Formel I) markiertes BAPR-Oligonucleotid.
Konzentration des Oligonucleotids: 7,0 μM
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1, außer dass die Intervallzeit 0,09s betrug und die Modulationszeit 0,5s.

Die Ergebnisse sind in 2a (kathodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym"), 2b (kathodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease), 2c (anodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym") und 2d (anodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease) wiedergegeben. Die gemessenen Peak-Werte, Peak-Positionen und die prozentuale Erhöhung des Peaks für die Lösung mit S1 Nuclease (d.h. mit verdautem Oligonucleotid) im Vergleich mit der Kontrolle mit "keinem Enzym" sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 4(b):

Oligonucleotid: am 5'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 6 Kohlenstoffatomen (Formel II) markiertes BAPR-Oligonucleotid.
Konzentration des Oligonucleotids: 7,0 μM
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1, außer dass die Intervallzeit 0,09s betrug und die Modulationszeit 0,5s.

Die Ergebnisse sind in 3a (kathodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym"), 3b (kathodisches Umkehrpotential von Lösung mit Si Nuclease), 3c (anodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym") und 3d (anodisches Umkehrpotential von Lösung mit Si Nuclease) wiedergegeben. Die gemessenen Peak-Werte, Peak-Positionen und die prozentuale Erhöhung des Peaks für die Lösung mit S1 Nuclease (d.h. mit verdautem Oligonucleotid) im Vergleich mit der Kontrolle mit "keinem Enzym" sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 4(c):

Oligonucleotid: am 3'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 9 Kohlenstoffatomen (Formel IV) markiertes TIBAPR-Oligonucleotid.
Konzentration des Oligonucleotids: 8,8 μM
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1.

Die Ergebnisse sind in 4a (kathodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym"), 4b (kathodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease), 4c (anodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym") und 4d (anodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease) wiedergegeben. Die gemessenen Peak-Werte, Peak-Positionen und die prozentuale Erhöhung des Peaks für die Lösung mit S1 Nuclease (d.h. mit verdautem Oligonucleotid) im Vergleich mit der Kontrolle mit "keinem Enzym" sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 4(d):

Oligonucleotid: am 5'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 12 Kohlenstoffatomen (Formel III) markiertes BAPR-Oligonucleotid.
Konzentration des Oligonucleotids: 7,0 μM
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1, außer dass die Intervallzeit 0,09s betrug und die Modulationszeit 0,5 s.

Die Ergebnisse sind in 5a (kathodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym"), 5b (kathodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease), 5c (anodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym") und 5d (anodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease) wiedergegeben. Die gemessenen Peak-Werte, Peak-Positionen und die prozentuale Erhöhung des Peaks für die Lösung mit S1 Nuclease (d.h. mit verdautem Oligonucleotid) im Vergleich mit der Kontrolle mit "keinem Enzym" sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 4(e):

Oligonucleotid: am 5'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 12 Kohlenstoffatomen (Formel III) markiertes GSDPR-Oligonucleotid.
Konzentration des Oligonucleotids: 3,5 μM
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1.

Die Ergebnisse sind in 6a (kathodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym"), 6b (kathodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease), 6c (anodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym") und 6d (anodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease) wiedergegeben. Die gemessenen Peak-Werte, Peak-Positionen und die prozentuale Erhöhung des Peaks für die Lösung mit Si Nuclease (d.h. mit verdautem Oligonucleotid) im Vergleich mit der Kontrolle mit "keinem Enzym" sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 4(f):

Oligonucleotid: am 5'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 12 Kohlenstoffatomen (Formel III) markiertes MCl1PR-Oligonucleotid.
Konzentration des Oligonucleotids: 3,5 μM
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1.

Die Ergebnisse sind in 7a (kathodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym"), 7b (kathodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease), 7c (anodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym") und 7d (anodisches Umkehrpotential von Lösung mit S1 Nuclease) wiedergegeben. Die gemessenen Peak-Werte, Peak-Positionen und die prozentuale Erhöhung des Peaks für die Lösung mit Si Nuclease (d.h. mit verdautem Oligonucleotid) im Vergleich mit der Kontrolle mit "keinem Enzym" sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 4(g) (Vergleich):

Oligonucleotid: BAFR, nicht markiert.
Konzentration des Oligonucleotids: 8,8 μM.
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1

Die Ergebnisse sind in 8a (kathodisches Umkehrpotential) und 8b (anodisches Umkehrpotential) wiedergegeben. Bei keinem der Umkehrsignale wurde ein Peak beobachtet.
Beispiel 4(h) (Vergleich):

Oligonucleotid: am 5'-Ende mit Ferrocen mit einem Spacer von 9 Kohlenstoffatomen (Formel IV) markiertes TIBAPR-Oligonucleotid.
Konzentration des Oligonucleotids: 8,8 μM.
Bedingungen bei der Voltammetrie: Wie in Tabelle 1

Die Ergebnisse sind in 9a (kathodisches Umkehrpotential der Kontrolle mit "keinem Enzym") und 9b (anodisches Umkehrpotential einer erhitzten Enzym-Kontrolle mit S1 Nuclease) wiedergegeben. In 9a wurde eine Peakhöhe von 60,6 [A (Position des Peaks bei 424 mV) aufgezeichnet, während in 9b eine Peakhöhe von 39,9 μA (Position des Peaks bei 409 mV) aufgezeichnet wurde.
Mit dem Ferrocen in Zusammenhang stehende Peaks wurden bei 300—500 mV beobachtet. Keine Peaks wurden in diesem Bereich beobachtet, wenn keine mit Ferrocen markierten Oligonucleotide untersucht wurden (8a und 8b). Ein Vergleich der verdauten mit Ferrocen markierten Oligonucleotide mit den Kontrollen mit keinem Enzym zeigte, dass nach einem Verdau der Oliginucleotide eine Zunahme in der Peakhöhe erreicht wurde (Tabelle 4).
Um sicher zu gehen, dass die beobachteten Veränderungen nicht auf das Vorkommen eines Enzyms oder auf Komponenten im Lagerpuffer des Enzyms zurückzuführen waren, wurden auch Verdau-Versuche unter Einsatz eines hitzedenaturierten Enzyms (Beispiel 4(h)) durchgeführt. Am Ferrocen-Signal waren keine signifikanten Veränderungen zu beobachten, wenn die Kontrollen mit dem hitzedenaturierten Enzym und mit keinem Enzym miteinander verglichen wurden.
Es wurden Verdau-Versuche von zwei zusätzlichen Oligonucleotidsequenzen mit dem C12-Ferrocen-Oligonucleotid-Linker durchgeführt; Ferrocen-C12-MC11PR und Ferrocen-C12-GSDPR (6 und 10). Es wurde für jede Sequenz eine Zunahme in der Peakhöhe des mit Ferrocen in Zusammenhang stehenden Signals des verdauten Oligonucleotids beobachtet. Tabelle 4: Positionen und Höhen der mit Ferrocen in Zusammenhang stehenden Peaks bei anodischen und kathodischen Differntial-Pulsvoltagrammen Kathodische Umkehrpotentiale
Anodische Umkehrpotentiale
BEISPIEL 5 - PCR
Die PCR-Amplifikation erfolgte aus humaner genomischer DNA (40 ng pro 100 μl Reaktion) oder aus gelgereinigten PCR-Amplikons. Die für die folgenden Amplifikationen eingesetzten Amplikons wurden mit Agarosegel mit Nucleospin-Extract-Kits (Machery- Nagel) nach der mitgelieferten Vorschrift gereinigt. Alle Ferrocenyl-Oligonucleotid-Sonden waren am 3'-Ende phosphoryliert.
Die für die einzelnen Reaktionen verwendeten Primer, die Matrize und die Sonde sind oben genauer angegeben.
Die 100 μl Reaktionen enthielten Tris-HCL (15 mM, pH 8,0), Kaliumchlorid (50 mM), Magnesiumchlorid (3,5 mM), dARP, TTP, dCTP, dGTP (jeweils 200 μM), Vorwärts-Primer (1,0 μM), Rückwärts-Primer (1,0 μM), Ferrocenyl-Oligonucleotid-Sonde 0,9 μM), AmpliTaq Gold (0,04 E/μl). Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 95°C inkubiert (anfängliche Denaturierung und Enzymaktivierung), gefolgt von 40 Zyklen einer Denaturierung bei 95°C über 15 s und Primer-Hybridisierung und Extension bei 60°C über 1 Minute.
Es wurden fünfzehn 100 μl Reaktionen erzeugt und vereinigt. Die rohe Reaktionsmischung wurde dann vor der voltammetrischen Bestimmung auf ein Gesamtvolumen von 200 μl aufkonzentriert.
Im Folgenden waren die Reaktionsteilnehmer und Bedingungen wie oben angegeben und die Bedingungen für die Voltammetrie sind, falls nicht anders angegeben, wie in Tabelle 1 beschrieben.
Beispiel 5(a):

Oligonucleotid: Am 5'-Ende mit einem Spacer mit 12 Kohlenstoffatomen (Formel III) markiertes BAPR Oligonucleotid.
Positive Reaktion: (β-Actin) Matrize: β-Actin-PCR-Amplikon; Primer: BAF, BAR.
Negative Reaktion: (Zystische Fibrose Transmembran Leitfähigkeits-Regulator) Matrize: Zystische Fibrose-PCR-Amplikon; Primer: CFT 01; CFT 03.
Bedingungen bei Voltammetrie: wie in Tabelle 1.

Die Ergebnisse waren wie folgt:

10a positive Reaktion, kathodisches Umkehrpotential, kein Peak beobachtet
10b negative Reaktion, kathodisches Umkehrpotential, Peak-Position: 493 mV, Peakhöhe: –19,4 nA.
10c negative Reaktion, anodisches Umkehrpotential, kein Peak beobachtet
10d positive Reaktion, anodisches Umkehrpotential, Peak-Position: 373 mV, Peakhöhe: 27,3 nA.

Beispiel 5(b):

Oligonucleotid: Am 5'-Ende mit einem Spacer mit 12 Kohlenstoffatomen (Formel III) markiertes MC11PR Oligonucleotid.
Positive Reaktion: (mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase) Matrize: MCAD-PCR-Amplikon; Primer: MC11w, MC11com;
Negative Reaktion: (Glucose-6-Phosphatase) Matrize: Glucose-6-Phosphatase PCR-Amplikon; Primer: GSDw, GSDcom.

11a positive Reaktion, anodisches Umkehrpotential, Peak-Position: 429 mV, Peakhöhe: 1,84 nA.
11b positive Reaktion (PCR-Amplikon-Matrize), anodisches Umkehrpotential, Peak-Position: 388 mV, Peakhöhe: 7,62 nA.
11c positive Reaktion (genomische Matrize), anodisches Umkehrpotential, Peak- Position: 409 mV, Peakhöhe: 8,11 nA.

Beispiel 5(c):

Oligonucleotid: Am 5'-Ende mit einem Spacer mit 9 Kohlenstoffatomen markiertes TIBAPR Oligonucleotid.
Positive Reaktion: (β-Actin) Matrize: humane genomische DNA; Primer: BAF, BAR.
Negative Reaktion: (Glucose-6-Phosphatase) Matrize: humane genomische DNA; Primer: GSDw, GSDcom.
Bedingungen bei Voltammetrie: wie in Tabelle 1.

Die Ergebnisse waren wie folgt:

12a; negative Reaktion, anodisches Umkehrpotential.
12b; positive Reaktion, anodisches Umkehrpotential, Peak-Position: 429 mV, Peakhöhe: 36 nA.
12c; negative Reaktion, kathodisches Umkehrpotential.
12d; positive Reaktion, kathodisches Umkehrpotential, Peak-Position: 498 mV, Peakhöhe: 14 nA.

Beispiel 5(d):

Am 5'-Ende mit einem Spacer mit 12 Kohlenstoffatomen markiertes GSDPR Oligonucleotid.
Positive Reaktion: (Glucose-6-Phosphatase) Matrize: humane genomische DNA; Primer: GSDw, GSDcom.
Negative Reaktion: (β-Actin) Matrize: humane genomische DNA; Primer: BAF, BAR.

13a; negative Reaktion, anodisches Umkehrpotential.
13b; positive Reaktion, anodisches Umkehrpotential, Peak-Position: 439 mV, Peakhöhe: 23 nA.
13c; negative Reaktion, kathodisches Umkehrpotential.
13d; positive Reaktion, kathodisches Umkehrpotential.

Um den sequenzspezifischen Nachweis der PCR-Produkte mit ferrocenylierten Oligonucleotid-Sonden zu zeigen, wurden in diesem Beispiel die Sonden- und Primersequenzen von zuvor optimierten fluorogenen 5'-Nuclease-Assays verwendet. Die PCR-Amplifikation von Beta-Actin-, Glucose-6-phosphat- und mittelkettigen ACyl-CoA-Dehydrogenase-Genen erfolgte entweder unter Verwendung eines gereinigten Amplikons oder einer humanen genomischen DNA-Matrize. In allen PCR-Versuchen wurden Sonden mit am 5'-Ende angehefteten C12-Ferrocen-Linkern verwendet. Die 3'-Enden von allen Sonden im PCR-Experiment waren mittels Phosphorylierung extensionsblockiert.
Die Ferrocenyl-Oligonucleotid-Sonden wurden PCR-Gemischen zugesetzt, welche komplementäre Targets (positive Reaktion) und nicht komplementäre Targets (negative Reaktion) amplifizierten. Um den Nachweise der Ferrocen-Spezies zu verbessern, wurden die Reaktionen vereint und vor der voltammetrischen Analyse aufkonzentriert.
Die voltammetrischen Analyse erfolgte mit den rohen PCR-Gemischen (10 und 11). In jedem Falle wird bei positiven Reaktionen (enthalten verdaute Sonde) ein mit Ferrocen in Zusammenhang stehendes Signal beobachtet. Bei negativen Reaktionen (enthalten nicht verdaute Sonde) wird kein Signal beobachtet.
BEISPIEL 6a – Synthese von Ferrocencarbonylazid
Ferrocencarbonylazid wurde aus Ferrocencarbonsäure über die Reaktion mit Oxalylchlorid und Natriumazid hergestellt. BEISPIEL 6b – Synthese des N-Hydroxysuccinimidesters der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure.
In einen mit Stickstoff durchblasenen Rundkolben wurden unter Stickstoffatmosphäre Ferrocencarbonylazid (300 mg, 1,18 mMol, 1,00 Äquiv.), 4-Aminobenzoesäure (244 mg, 1,78 mMol, 1,50 Äquiv.) und 1,4-Dioxan (40 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff in einem Bad von 100°C 2 Stunden und 50 Minuten lang gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 2M HCl (100 ml) gegeben und das Produkt in Ethylacetat (150 ml) extrahiert. Diese Phase wurde mit 2M HC1 (100 ml) gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum aufkonzentriert, um das Produkt zu erhalten. Weiteres Trocknen in einem Vakuumofen ergaben orangefarbene Kristalle (413 mg, 96%). ¹H-NMR δ (300 MHz, d₆-DMSO) 3,96 (2H, b, Hc), 4,14 (5H, s, Ha), 4,53 (2H, b, Hb), 7,54 (2H, m, Hf), 7,85 (2H, m, Hg), 7,98 (1H, d, Hd), 8,87 (1H, s, He), 12,57 (1H, s, Hh), ¹³C-NMR δ (75,5 MHz, d₆-DMSO) 61,0; 64,1; 66,7; 68,1 (Ca, d), 117,2 (Cg), 123,5 (Cj), 130,9 (Ch), 144,6 (Cf), 152,8 (Ce).
BEISPIEL 6c – Synthese des N.Hydroxysuccinimidesters der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure
Es wurde Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (194 mg, 0,939 mMol, 1,14 Äquiv.) in wasserfreiem 1,4-Dioxan (2 ml) gelöst und in einen mit Stickstoff durchblasenen Rundkolben gegeben. N-Hydroxysuccinimid (108 mg, 0,939 mMol, 1,14 Äquiv.) wurde zugesetzt. 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure (300 mg, 0,823 mMol, 1,0 Äquiv.) wurde in wasserfreiem 1,4-Dioxan (13 ml) gelöst und tropfenweise in den Kolben gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 23 Stunden lang gerührt. Eine kleine Menge des leicht bräunlichen Feststoffs wurde aus dem rot/orangefarbigen Reaktionsgemisch mit einem Büchner-Filter entfernt. Dem Reaktionsgemisch wurden Wasser (100 ml) und Ethylacetat (50 ml) zugesetzt. Die Ethylacetat-Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Ethylacetat (10 ml) extrahiert. Die Ethylacetat-Phasen wurden vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um das Rohprodukt als ein orangefarbenes Öl zu erhalten, das unter Einsatz der Silica-Flash-Chromatographie mit einem Gradientensystem von Ethylacetat 60/Petrolether (Kp. 40–60) 40 zu Ethylacetat gereinigt. Das Trocknen im Vakuum ergab den N-Hydroxysuccinimidester der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure als feine orangefarbene Kristalle (237 mg, 66%). Rf (5:1 Ethylacetat/Petrolether (Kp. 40°–60°C) 0,41. ¹H-NMR δ (300 MHz, d₆-DMSO) 2,88 (4H, s, Hh), 3,98 (2H, t, J = 1,8 Hz, Hc), 4,16 (6H, s, Ha), 4,55 (2H, t, J = 1,8 Hz, Hb), 7,68 (2H, m, Hf), 8,00 (2H, m, Hg), 8,11 (1H, s, Hd), 9,16 (1H, s, He), ¹³C-NMR δ (75,5 MHz, d₆-DMSO) 25,9 (Cl); 61,1; 64,2 (Cb und Cc), 69,1 (Ca), 117,7 (Cg), 131,9 (Ch), 170,9 (Ck). MS (FAB⁺ m/z) 462,07 [M + H]. BEISPIEL 6d – Synthese der 3,5-Di(3'-ferrocenylureido)-1-benzoesäure
In einen mit Stickstoff durchblasenen Rundkolben wurden unter Stickstoffatmosphäre Ferrocencarbonylazid (800 mg, 3,14 mMol, 2,5 Äquiv.), 3,5-Diaminobenzoesäure (194 mg, 1,25 mMol, 1,00 Äquiv.) und 1,4-Dioxan (60 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoff in einem Bad von 100°C 1 Stunde lang gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden Wasser (300 ml) und Ethylacetat (150 ml) gegeben. Um die Abtrennung zu verbessern, wurde die wässrige Phase mit HCl angesäuert. Die Ethylacetat-Phase wurde mit Wasser (100 ml) gewaschen und beim Stehen begann ein Feststoff auszufallen. Die Lösung wurde im Vakuum aufkonzentriert, um das Rohprodukt als orangefarbenes Öl zu erhalten, welches mit der Silica-Flash-Chromatographie unter Einsatz eines Grradientensystems von DCM 90/MeOH 10 bis DCM 50/MeOH 50 gereinigt wurde. Das Trocknen in einem Vakuumofen ergab (19) als orangefarbene Kristalle (205 mg, 27%). ¹H-NMR δ (300 MHz, d₆-DMSO) 7,69 (4H, b, Hc), 4,14 (10H, s, Ha), 4,54 (4H, b, Hb), 7,69 (2H, st, Hf), 7,81 (1H, s, Hg), 8,08 (2H, s, Hd), 8,94 (2H, s, He). MS (FAB⁺ m/z) 607,07 [M + H].
BEISPIEL 7 – Synthese der 4-(3'-Ferrocenoylureido)-1-benzoesäure-Oligonucleotide
Lyophilisierte aminomodifizierte Oligonucleotide wurden im richtigen Volumen von K2CO3/KHCO3-Puffer (500 ml, pH 9,0) rehydratisiert und ergaben eine Oligonucleotid-Konzentration von 0,5 nMol/μl. Unter Vortexen wurde das aminomodifizierte Oligonucleotid (40 μl, 0,5 nMol/μl) langsam zu einer Lösung des ferrocenaktivierten Esters in DMSO (40 μl, 375 mM) gegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt, sodann mit Ammoniumacetat (920 μl, 100 mM, pH 7,0) verdünnt und unter Einsatz von zwei NAP 10-Säulen (nach der mitgelieferten Vorschrift) gereinigt, indem zunächst mit Ammoniumacetat (100 mM, pH 7,0) und dann mit autoklaviertem entionisiertem Wasser eluiert wurde. Die Oligonucleotid-Konzentration im Elutionsmittel wurde durch Messen der Absorption bei 260 nm ermittelt. Das Vorkommen des Ferrocen-Markers wurde mittels voltammetrischer Analyse bestätigt.
BEISPIEL 8 – Si Nuclease und PCR mit 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure-markierten Substraten/Sonden
Unter Einsatz der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure- markierten Substraten/Sonden und der in Tabelle 2 wiedergegebenen Parameter für die Voltammetrie wurden die Beispiel 4 und 5 mit den wie in diesen Beispielen angegebenen Konzentrationen aller Reagenzien wiederholt. Das Peakpotential der 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure-Nucleotide ist niedriger als das der Ferrocen-markierten Nucleotide. Dies steigert die Empfindlichkeit, mit welcher der elektrochemische Marker nachgewiesen werden kann. Entsprechend war es in den Versuchen des Beispiels 8 nicht nötig, den in den Beispielen 4 und 5 eingesetzten Schritt mit dem Aufkonzentrieren der Proben durchzuführen und die Verfahrensvorschrift war signifikant einfacher. Die (nicht gezeigten) Ergebnisse des Beispiels 8 zeigen, dass ohne den Schritt mit dem Aufkonzentrieren der Proben eine gute Empfindlichkeit beobachtet wird.
BEISPIEL 9 – Substratspezifität der T7 Exonuclease
200 μl eines Oligonucleotids mit Haamadelschleifen und 200 μl eines einsträngigen Oligonucleotids wurden mit einer Konzentration von 7 μM in 1 × T7-Reaktionspuffer in getrennte Reaktionsröhrchen gegeben. Jedem Röhrchen wurde T7 Enzym zugesetzt (5 μl, 2 E/μl) und die Gemische 1 Stunde lang bei 25°C inkubiert. Beide Oligos waren zuvor über einen C12-Linker mit Ferrocen markiert worden.
Die Ergebnisse waren wie folgt:

16a: Kurve A — Verdau von einem Hairpin-Oligonucleotid-Duplex.
16a: Kurve B – Hairpin-Oligonucleotid-Duplex, keine Enzym-Kontrolle.
16b: Kurve A — Verdau eines einsträngigen Oligonucleotids.
16b: Kurve B — Einsträngiges Oligonucleotid, keine Enzym-Kontrolle.

BEISPIEL 10 – PCR-Amplifikation mit T7 Exonuclease-Verdau
Beispiel 10(a)
Mit humaner genomischer DNA (40 ng pro 100 μl Reaktionslösung) wurde mit 5'-ferrocenyliertem Primer und einem T7 Exonuclease-Verdau eine PCR-Amplifikation durchgeführt. Die für die einzelnen Reaktionen verwendeten Primer, Matrize und Sonde werden genau in dem Abschnitt mit den Ergebnissen angegeben. Die 100 μl Reaktionsansätze enthielten Tris HCl (15 mM, pH 8,0), Kaliumchlorid (50 mM), Magnesiumchlorid (3,5 mM), dATP, TTP, dCTP, dGTP (jeweils 200 μM), einen 5'-ferrocenylierten Vorwärts-Primer (0,5 μM) einen Rückwärts-Primer (0,5 μM), Amplitaq Gold DNA-Polymerase (0,1 E/μl), BSA (0,1 mg/μl). Die Proben wurden bei 95°C 10 Minuten lang inkubiert (anfängliche Denaturierung und Enzymaktivierung), gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95°C über 15 Sekunden sowie der Primer-Hybridisierung und der Extension bei 60°C über 1 Minute. Die Proben wurden unmittelbar auf 25°C abgekühlt und bei 25°C 5 Minuten lang inkubiert. Zu dem rohen PCR-Gemisch wurde T7 Exonuclease (5 μl, 2 E/μl) gegeben und die Proben für weitere 20 Minuten inkubiert.
Vor der voltammetrischen Analyse wurden zwei 100 μl Reaktionen zubereitet und vereinigt.
Die Ergebnisse waren wie folgt:

Vorwärts-Primer: Über einen C12-Linker ferrocenylierter MW11w
Rückwärts-Primer: MC11com
17a: Kurve A — MCAD-PCR-Amplifikation positive PCR
17a: Kurve B — MACD-PCR. kein Taq, negative Kontrolle
17b: Kurven A und B — wie 17a, aber ohne Baseline-korrigierte daren.

Beispiel 10(b)
PCR-Amplifikation mit unmodifizierten Primern, Endpunkts-Sondenhybridisierung und T7 Exonuclease-Verdau
Die PCR-Amplifikation wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Nach Ender der PCR wurden die Proben 2 Minuten lang auf 95°C erhitzt und während dieser Zeit wurde die ferrocenylierte Oligonucleotid-Sonde zugegeben (0,5 μM Endkonzentration). Die Proben wurden auf 25°C abgekühlt und 5 Minuten lang bei 25°C inkubiert. Zu dem rohen PCR-Mix wurde T7 Exonuclease gegeben (5 μl, 2E/μ1) und die Proben weitere 20 Minuten inkubiert.
Vor der voltammetrischen Analyse wurden zwei 100 μl Reaktionen zubereitet und vereinigt.
Die Ergebnisse waren wie folgt:

Beta-Actin-PCR-Amplifikation: Kurve A zeigt eine positive PCR-Target-Amplifikationsreaktion und Kurve B zeigt durchwegs die Kontrolle mit Non-Target-Amplifikation
Sonde: Über einen C12-Linker ferrocenylierte BAPR
Vorwärts-Primer der Target-Amplifikation: BAF
Rückwärts- Primer der Target-Amplifikation: BAR
Vorwärts-Primer der Non-Target-Amplifikation: GSDF
Rückwärts- Primer der Non-Target-Amplifikation: GSDR
18a: normale Daten, anodisches Umkehrpotential
18b: Baseline-korrigierte Daten, anodisches Umkehrpotential

PCR-Amplifikation des HFE-Gens: Kurve A zeigt eine positive PCR-Target-Amplifikationsreaktion und Kurve B zeigt durchwegs die Kontrolle mit Non-Target-Amplifikation
Sonde: Über einen C12-Linker ferrocenylierte H63DP
Vorwärts-Primer der Target-Amplifikation: H63DF
Rückwärts- Primer der Target-Amplifikation: H63DR
Vorwärts-Primer der Non-Target-Amplifikation: C282YF
Rückwärts- Primer der Non-Target-Amplifikation: C282YR
19a: normale Daten, anodisches Umkehrpotential
19b: Baseline-korrigierte Daten, anodisches Umkehrpotential

PCR-C282Y-Mutations-Amplifikation des HFE-Gens: Kurve A zeigt eine positive PCR-Target-Amplifikationsreaktion und Kurve B zeigt durchwegs die Kontrolle mit Non-Target-Amplifikation
Sonde: Über einen C12-Linker ferrocenylierte C282YP
Vorwärts-Primer der Target-Amplifikation: C282YF
Rückwärts- Primer der Target-Amplifikation: C282YR
Vorwärts-Primer der Non-Target-Amplifikation: H63DF
Rückwärts- Primer der Non-Target-Amplifikation: H63DR
20a: normale Daten, anodisches Umkehrpotential
20b: Baseline-korrigierte Daten, anodisches Umkehrpotential

Beispiel 10(c)

PCR-Amplifikation mit unmodifizierten Primern, Endpunkts-Sondenhybridisierung und T7 Exonuclease-Verdau: Stoffel-Fragment

Die PCR, die Hybridisierung der Sonden und der T7 Exonuclease-Verdau wurden wie im obigen Abschnitt beschrieben durchgeführt, indem die Amplitaq Gold DNA-Polymerase und der Versorgungspuffer durch das Amplitaq DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment und Versorgungspuffer ersetzt wurden.
Die Ergebnisse waren wie folgt:

PCR-Amplifikation des HFE-Gens: Kurve A zeigt eine positive PCR-Target-Amplifikationsreaktion und Kurve B zeigt durchwegs die Kontrolle mit Non-Target-Amplifikation
Sonde: Über einen C12-Linker ferrocenylierte C282YP
Vorwärts-Primer der Target-Amplifikation: C282YF
Rückwärts- Primer der Target-Amplifikation: C282YR
Vorwärts-Primer der Non-Target-Amplifikation: H63DF
Rückwärts- Primer der Non-Target-Amplifikation: H63DR
21a: normale Daten, anodisches Umkehrpotential
21b: Baseline-korrigierte Daten, anodisches Umkehrpotential

Beispiel 10(d)

PCR-Amplifikation mit unmodifizierten Primern, Endpunkts-Sondenhybridisierung und T7 Exonuclease-Verdau: Keine T7 Exonuclease-Kontrolle

Die PCR und die Sondenhybridisierung wurden wie in Beispiel 9(c) beschrieben unter Einsatz der Amplitaq Gold DNA-Polymerase durchgeführt. Dem PCR-Gemisch wurde keine T7 Exonuclease zugesetzt.
Die Ergebnisse waren wie folgt:

PCR-Amplifikation des HFE-Gens: Kurve A zeigt eine positive PCR-Target-Amplifikationsreaktion und Kurve B zeigt durchwegs die Kontrolle mit Non-Target-Amplifikation
Sonde: Über einen C12-Linker ferrocenylierte C282YP
Vorwärts-Primer der Target-Amplifikation: C282YE
Rückwärts- Primer der Target-Amplifikation: C282YR
Vorwärts-Primer der Non-Target-Amplifikation: H63DF
Rückwärts- Primer der Non-Target-Amplifikation: H63DR
22a: normale Daten, anodisches Umkehrpotential
22b: Baseline-korrigierte Daten, anodisches Umkehrpotential

BEISPIEL 11 – Differnetial-Puls-Voltagramm-Analyse von Ferrocencarbonsäure und 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure
Es wurden Lösungen von Ferrocencarbonsäure und 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure mit Konzentrationen von 10 μM und 1 μM in 100 mM wässrigem Natriumchlorid in 10% DMSO hergestellt. Für die Differential-Pulsanalyse wurden Proben mit einem Volumen von 200 μl in einer wie in Bespiel 1 beschriebenen Apparatur mit einer Gold-Arbeitselektrode verwendet. Die Differential-Puls-Bedingungen waren wie in Tabelle 3 angegeben. Die Voltagramme werden in 23 gezeigt, in denen die 23(a) und (b) die Voltagramme für Ferrocencarbonsäure bei 10 μM bzw. 1 μM und die 23(a) und (b) die Voltagramme für 4-(3'-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure bei 10 μM bzw. 1 μM zeigen.
BEISPIEL 12 – Differential-Puls-Voltammogramm-Analyse des S1 Nuclease-Verdaus einer Mischung von ferrocenylierten Oligonucleotiden
Wie oben in Beispiel 4 genauer beschrieben, werden drei Oligonucleotid-Verdau-Reaktionen durchgeführt. In Reaktion (a) waren die Substrate ein am 5'-Ende über einen C12-Spacer mit Ferrocen (2,5 μM) markiertes BAPR-Oligonucleotid und ein am 5'-Ende über einen C12-Spacer mit 4-(3-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure (1,5 μM) markiertes MCllw-Oligonucleotid. In Reaktion (b) war das Substrat nur ein über einen C12-Spacer am 5'-Ende mit Ferrocen (2,5 μM) markiertes BAPR-Oligonucleotid. In Reaktion (c) war das Substrat nur ein am 5'-Ende über einen C12-Spacer mit 4-(3-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure (1,5 μM) markiertes MC11w-Oligonucleotid.
Nach dem Ende von jeder Verdau-Reaktion wurden die Reaktionsgemische mit einer Differential-Puls-Voltammetrie unter den in Tabelle genauer angegebenen Bedingungen, mit der Ausnahme, dass das Endpotential 0,5V betrug, analysiert. Es wurde eine Gold- Arbeitselektrode eingesetzt. Die Voltammogramme sind jeweils in den 24(a), (b) und (c) wiedergegeben. Die Daten sind mit einer Baseline-Korrektur angegeben. Wie aus den Figuren ersichtlich, hat die 4-(3-Ferrocenylureido)-1-benzoesäure-Markierung im Differential-Puls-Voltammogramm einen Peak um 130 mV, während die Ferrocen-Markierung einen Peak um 370 mV aufweist. Die Peaks sind ausreichend weit voneinander entfernt, um, wie aus 24(a) ersichtlich, in einer Mischung aufgelöst werden zu können. Die Auflösbarkeit der zwei Peaks macht die beiden Markierungen für die Verwendung in einem Multiplex-Experiment geeignet, in welchem zwei unterschiedliche Zielsequenzen gleichzeitig in demselben Reaktionsgemisch sondiert werden.

Claims

Verfahren zum Sondieren einer Nukleinsäure, bei welchem man: eine Nukleinsäurelösung mit einer Oligonukleotidsonde in Berührung bringt, die mit einem elektrochemisch aktiven Marker markiert ist, Bedingungen schafft, bei denen die Sonde in der Lage ist, wenigstens teilweise mit jeglicher komplementärer Target Sequenz zu hybridisieren, die in der Nukleinsäurelösung vorhanden sein kann, entweder hybridisierte, partiell hybridisierte oder nicht hybridisierte Nukleinsäuresonde selektiv abbaut, und elektrochemisch Informationen nachweist, die sich auf den elektrochemisch aktiven Marker beziehen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Informationen, die sich auf den Marker beziehen, eingesetzt werden, um Informationen betreffend die Gegenwart oder Abwesenheit wenigstens einer Nukleinsäurespezies abzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die elektrochemische Technik eingesetzt wird, um die relativen Anteile von abgebauter und nicht abgebauter Sonde zu quantifizieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Nukleinsäuresonde, welche nicht erfolgreich hybridisierte, mittels eines Enzyms abgebaut wird, das so ausgewählt wurde, dass einsträngige nicht hybridisierte Nukleinsäure selektiv abgebaut wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Nukleinsäuresonde welche erfolgreich hybridisiert wurde, mittels eines Enzyms abgebaut wird, das so ausgewählt worden ist, dass es wenigstens einen Strang von doppelsträngiger hybridisierter Nukleinsäure selektiv abbaut.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Enzym eine 5' Nuklease ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die 5' Nuklease auch eine DNA-Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die 5' Nuklease/DNA-Polymerase ein thermostabiles Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das thermostabile Enzym Taq-Polymerase ist
Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei die Reaktionsmischung ebenfalls ein Paar von Primern aufweist, die zur Verlängerung mittels der DNA-Polymerase geeignet sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Reaktionsbedingungen und Temperatur geeignet sind, dass eine Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction – PCR) zugleich mit dem 5' Nukleaseabbau der Sonde stattfinden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem eine erste Oligonukleotidsonde, die mit einem elektrochemisch aktiven Marker markiert ist, vor vollständige Hybridisierung durch Wettbewerb eines zweiten Oligonukleotids geschützt ist, und das resultierende partiell hybridisierte Oligonukleotid, das mit einem elektrochemischen Marker markiert ist, mittels eines Enzyms gespalten wird, das spezifisch die Konfiguration der zwei Oligonukleotide erkennt, die auf die Zielnukleinsäure (Targetnukleinsäure) hybridisiert sind, wobei die Spaltung den Oligonukleotidabschnitt wirksam kürzt, an welchen der elektrochemisch aktive Marker gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem eine erste Oligonukleotidsonde vor vollständiger Hybridisierung, durch Wettbewerb eines zweiten Oligonukleotids geschützt wird, und die resultierende partielle hybridisierte erste Oligonukleodidsonde durch ein Enzym gespalten wird, das spezifisch die Konfiguration der zwei Oligonukleotide erkennt, die auf die Zielnukleinsäure (Targetnukleinsäure) hybridisiert sind, wobei das Spaltprodukt durch eine Erkennungskassette erkannt wird, welche wenigstens ein Oligonukleotid umfasst und in der Lage ist, an das erste Spaltprodukt zu hybridisieren, um eine Oligonukleotidkonfiguration herzustellen, die durch ein Enzym erkennbar ist, welches eine Region der Erkennungskassette spaltet, die mit einem elektrochemisch aktiven Marker markiert ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Detektion von Nukleinsäurepolymorphismen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Quantifizierung von Nukleinsäurespezies.
Verfahren zum Detekieren eines spezifischen Proteins oder Gruppe von Proteinen, bei welchem man: eine Proteinlösung mit einer Oligonukleotidsonde in Berührung bringt, die mit einem elektrochemisch aktiven Marker markiert ist, Bedingungen schafft, bei denen die Sonde in der Lage ist, an ein spezifisches Protein oder Gruppe von Proteinen zu binden, die in der Lösung vorhanden sein können, selektiv nicht hybridisierte Nukleinsäuresonde abbaut, und Information elektrochemisch nachweist, die sich auf den elektrochemisch aktiven Marker bezieht, um Informationen über die Anwesenheit, Abwesenheit oder relative oder absolute Menge des spezifischen Zielproteins (Targetproteins) oder Gruppe von Zielproteinen (Targetproteinen), die in der Lösung vorhanden sind, bereit zu stellen.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die nicht hybridisierte Nukleinsäure mittels eines Enzyms abgebaut wird.
Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17 zur Detektion von Proteinpolymorphismen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18 zur Quantifizierung der Proteinexpression.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das elektrochemische Verfahren Voltametrie ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die elektrochemische Technik eine amperometrische Technik ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Verfahren, das eingesetzt wird, die differentielle Pulsvoltametrie ist.
Verwendung eines Verfahrens, wie in einem vorhergehenden Anspruch beansprucht bei der Detektion eines genetischen Krankheit oder einer genetischen Krankheitsträgerstatus oder einer genetischen Prädispositon zur Erkrankung.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Detektion oder Identifikation eines Pathogens in einer Probe.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22, zur Vorhersage der Resonanz eines Organismus auf ein therapeutisches oder toxisches Mittel.
Verwendung eines Nukleinsäuresondenmoleküls umfassend ein Oligonukleotid mit spezifischer Sequenz, das covalent an ein oder mehrere elektrochemisch aktive Markerreste gebunden ist, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei ein elektrochemisch aktiver Marker an das 3' Ende der Oligonukleotidsonde gebunden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 27, wobei ein elektrochemisch aktiver Marker an das 5' Ende der Oligonukleotidsonde gebunden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei multiple elektrochemisch aktive Marker entlang der Länge der Oligonukleotidsonde gebunden sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei ein elektrochemisch aktiver Marker an im Wesentlichen alle der Nukleotidreste der Oligonukleotidsonde gebunden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei einer von mehreren elektrochemisch aktiven Markerresten den Formeln I, II, III, IV, VII oder VIII entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei die Oligonukleotidkomponente sowohl am 3' und als auch 5' Ende phosphoryliert ist.
Vorrichtung, die angeordnet ist, um ein oder mehrere Verfahrensansprüche 1 bis 22 auszuführen, aufweisend ein oder mehrere Proben aufnehmende Regionen zur Aufnahme ein oder mehrerer Proben, wobei die Vorrichtung einen Thermozykler aufweist und die Vorrichtung eine Vorrichtung für die Voltammetrie umfasst.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, bei welchem zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden eingesetzt werden, wobei jede Sonde mit einem unterschiedlichen elektrochemisch aktiven Marker markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die zwei oder mehr elektrochemisch aktive Marker Peaks in ihrem Voltammogramspuren aufweisen, die voneinander auflösbar sind.