DE69333991T2

DE69333991T2 - Verfahren und Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69333991T2
Application number: DE69333991T
Authority: DE
Inventors: c/o Canon Kabushiki Kaisha Nobuko Ohta-ku Yamamoto; c/o Canon Kabushiki Kaisha Tadashi Ohta-ku Okamoto; c/o Canon Kabushiki Kaisha Yoshinori Ohta-ku Tomida; c/o Canon Kabushiki Kaisha Masahiro Ohta-ku Kawaguchi; c/o Canon Kabushiki Kaisha Keisuke Ohta-ku Makino; c/o Canon Kabushiki Kaisha Akira Ohta-ku Murakami
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1992-11-27
Filing date: 1993-11-26
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2013-11-27
Also published as: EP0599337A2; DE69333991D1; EP0599337A3; US5939256A; ATE319853T1; EP0599337B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiete der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für den Nachweis und die Identifizierung einer erwünschten spezifischen Basensequenz in einer Nucleinsäure (DNS oder RNS) von Viren, Tieren, Pflanzen und Menschen, oder dem Nachweis einer Mutation in einer Basensequenz. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine Sonde für das vorhergehende Verfahren.
Verwandter Stand der Technik
Als Ergebnissse des Fortschritts bei der Nucleinsäureanalysetechnik wurde eine Anzahl von mutierten Genen gefunden und eine Vielzahl von genetischen Erkrankungen, die durch mutierte Gene verursacht werden, wurden entdeckt. Es wurde gefunden, dass einige der genetischen Erkrankungen durch örtliche Fehler einer Base oder durch Punktmutation einer Base in einem Gen verursacht werden. Die Abnormität in dem Gen erzeugt eine Mutation eines Proteins, das verschiedene Symptome zeigt. Zur Zeit werden derartige genetische Erkrankungen hauptsächlich nach Ausprägung des Symptoms durch einen enzymatischen Assay oder durch ein immunologisches Verfahren unter Verwendung eines Antikörpers diagnostiziert. Jedoch wird es vom Standpunkt einer frühzeitigen Therapie als wichtig angesehen, die Mutation eines Gens vor der Ausprägung eines schwerwiegenden Symptoms zu finden.
Eines der wirkungsvollen Verfahren für die Diagnose ist die RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus; restriction fragment length polymorphism). In diesem Verfahren werden z.B. die gesamten Gene eines Menschen durch Restriktionsenzyme geschnitten und die resultierenden DNS-Fragmente werden durch Agarosegel-Elektrophorese entwickelt, auf einem Filter durch ein Southernblot-Verfahren fixiert und mit einer Sonde hybridisiert, die eine mit einem Isotop oder ähnlichem markierte DNS (oder RNS) umfasst. Aus dem Unterschied des Schnittmusters der DNS der Probe von der einer normalen DNS wird das Gen nachgewiesen, welches die Krankheit verursacht.
Die DNS-Diagnose ist nicht nur für Gene von Menschen geeignet, sondern ebenfalls für die Identifizierung von infektiösen Bakterien.
Bisher wurde die Art eines isolierten Bakteriums durch Ähnlichkeiten in seinen morphologischen Eigenschaften und biochemischen Eigenschaften identifiziert. Dieses Verfahren hat die Nachteile, dass die Inkubation des Bakteriums eine lange Zeit erfordert, die Entscheidung über die Eigenschaften hängt von dem Testverfahren ab, das Identifizierungsergebnis unterscheidet sich in Abhängigkeit von der Auswahl der zu untersuchenden Eigenschaften usw.
In den vergangenen Jahren wurde DNS-DNS-Hybridisierung oder DNS-RNS-Hybridisierung insbesondere für den Nachweis und die Identifikation von Bakterien untersucht, die eine mikrobielle Erkrankung verursachen. In diesem Verfahren wird Nucleinsäure (DNS oder RNS) aus einem Bakterium extrahiert und ein bestimmter Abschnitt einer Nucleinsäure des Bakteriums, welches eine Basensequenz mit Homologie zu der untersuchten Nucleinsäureprobe hat, wird durch Hybridisierung nachgewiesen, wobei die Anwesenheit des nachzuweisenden Bakteriums in der Probe bestätigt wird.
Die Hybridisierung, welche eine grundlegende Technik für den vorhergehenden Test ist, umfasst allgemein die folgenden Schritte.

(1) Zerschneiden von DNS in Fragmente und ihre Entwicklung durch Gel-Elektrophorese;
(2) Adsorption der entwickelten entsprechenden DNS-Fragmente auf einem Nitrocellulosefilter (Southern blotting);
(3) Ausbildung eines Hybrids durch Reaktion des DNS-Fragments auf dem Nitrocellulosefilter in dem vorhergehenden Schritt (2) mit einer Sonde; und
(4) Nachweis des DNS-Fragments, welches ein Hybrid gebildet hat.

Bei der Hybridisierung zwischen mehreren DNS bildet eine markierte Sonde aus DNS und eine Ziel-DNS durch Wasserstoffbindung ein Hybrid zwischen den entsprechenden komplementären Abschnitten.
Die in der Hybridisierungsreaktion eingesetzten Sonden ändern sich mit der Zeit. In den frühesten Forschungsstadien wurde ein langes DNS-Fragment mit einem radioaktiven Isotop durch „Nick Translation" markiert. Durch die Entwicklung von DNS-Synthesevorrichtungen, wird ein synthetisiertes Oligonucleotid anstelle einer langen DNS verwendet, und die markierende Substanz hat sich von einem gefährlichen radioaktiven Isotop zu einem sicheren Reagenz vom Biotin-Avidin-Typ hin verändert, und weiterhin zu einem Reagenz vom Chemilumineszenz-Typ verändert.
Für die genaue Hybridisierung zwischen komplementären Sequenzen sollte die Reaktionstemperatur und die Ionenstärke ausgewählt werden damit sie optimal ist. Bei einer höheren Temperatur kombiniert die Sonde nicht mit der Nucleinsäure mit einer komplementären Sequenz. Bei einer geringeren Temperatur kombiniert die Sonde unspezifisch mit der Nucleinsäure. Für höhere Genauigkeit ist es notwendig, instabile Wasserstoffbindungen durch Verringerung der Salzkonzentration der Lösung oder Erhörung der Temperatur der Lösung zu entfernen, und unspezifisch gebundene Sonden oder falsch gebundene Sonden wegzuwaschen. Demgemäß sind viele Versuch-und-Irrtum-Untersuchungen erforderlich, um die optimalen Bedingungen für die Reaktion und das Waschen auszuwählen.
Bei der genetischen Diagnose sollten für eine höhere Genauigkeit die Bedingungen der Hybridisierungsreaktion und des Waschens so streng ausgewählt werden, dass eine Fehlpaarung auf der Ebene eines Basenpaars ausgeschlossen wird.
Bei einer Hybridisierungsreaktion hat die Immobilisierung einer Zielnucleinsäure auf einem Träger wie Nitrocellulose den Vorteil der Leichtigkeit des Wegwaschens für die Eliminierung von unspezifischen Bindungen, usw. der Sonde, aber hat den Nachteil der Komplexität des Vorgehens, der Schwierigkeit den Test zu automatisieren und der für die Durchführung erforderlichen langen Zeit. Daher ist dieses Verfahren nicht für die Behandlung einer großen Anzahl von Proben geeignet.
Wenn ein Verfahren für den Nachweis eines Hybrids in einer Lösung ohne Immobilisierung einer Nucleinsäure gefunden wird, ermöglicht es die Automatisierung des Nachweises. Viele Versuche wurden dafür unternommen. Das wichtigste Problem bei der Eliminierung des Immobilisierungsschritts der Nucleinsäure ist, wie zwischen der mit der Zielnucleinsäure kombinierten Sonde und dem Überschuss an nicht kombinierter Sonde (nämlich B/F-Abtrennung) zu unterscheiden ist. In diesem Verfahren ist ebenfalls die Auswahl der Reaktionsbedingungen und der Waschbedingungen ähnlich wichtig wie in der vorher erwähnten Hybridisierung unter Verwendung von immobilisierter Nucleinsäure, um unspezifische Adsorption und Fehlpaarung von Sonden zu vermeiden.
Um ein Hybrid einer Zielnucleinsäure mit einer Sonde ohne B/F-Abtrennung nachzuweisen werden verschiedene Verfahren offenbart, welche Fluoreszenzdepolarisierung einsetzen (siehe Japanische Patentanmeldungen Offenlegungsschriften Nrn. 2-295496 und 2-75958). In diesen Verfahren wird eine fluoreszenzmarkierte einzelstängige DNS-Sonde in Kontakt mit einer DNS in einer Probe gebracht, um eine doppelsträngige DNS zu bilden und die Änderung der Fluoreszenzpolarisierung durch die Doppelstrangbildung wird gemessen. Dadurch wird die Anwesenheit einer Basensequenz in der DNS in der Probe nachgewiesen, die der Sonde entspricht. Ein derartiges Verfahren befußt auf dem Prinzip, dass eine an einen Einzelstrang gebundene fluoreszierende Substanz durch Bildung eines Doppelstranges weniger beweglich wird, um die Anisotropie ihrer Fluoreszenz zu erhöhen.
Jedoch ist in diesen Verfahren vorher eine komplizierte Vorgehensweise notwendig, um vollständig jede Verunreinigung, wie etwa Protein, aus der Probe zu entfernen, da eine Verunreinigung in der Probe unspezifisch mit der Sonden-DNS adsorbieren wird, um den Hintergrund beim Hybridnachweis zu erhöhen. Weiterhin muss unspezifisch adsorbierte Sonden-DNS und ein Pseudohybrid gebildet durch Fehlpaarung mit einer Base ähnlich wie bei dem Nachweis in anderen Lösungssystemen entfernt werden. Bei diesen Verfahren sollte, obwohl die B/F-Abtrennung nicht notwendig ist, die Sondenkonzentration bei der Messung der Änderung der Fluoreszenzpolarisierung auf dem gleichen Niveau wie das der Ziel-DNS sein.
Wie vorher beschrieben, ist der Nachweis einer Zielnucleinsäure durch eine Hybridisierungsreaktion mühsam, wenn die B/F-Abtrennung für den Nachweis erforderlich ist, da eine Anzahl von Vorgängen, wie etwa die B/F-Abtrennung (Entfernung des Überschusses an Sonde), Entfernung von unspezifisch adsorbiertem Material und fehlpaarenden Sonden usw., egal ob die Zielnucleinsäure immobilisiert ist oder nicht. Ferner variieren die optimalen Bedingungen der entsprechenden Arbeitsschritte in Abhängigkeit von der Sondenlänge und den entsprechenden Basensequenzen, so dass die Bedingungen der Arbeitsschritte für jeden der Fälle einzustellen ist. Insbesondere die Position der fehlpaarenden Base auf der Sonde beeinträchtigt signifikant die Stabilität des Hybrids, und in einigen Fällen ist das fehlgepaarte Hybrid aufgrund der Position der fehlpaarenden Base nicht entfernbar. Daher müssen die Bedingungen für die Hybridisierungsreaktion unter Berücksichtigung der Neigung der Fehlpaarung der Base eingestellt werden, was weitere mühsame Arbeitsschritte erfordert.
Die Nachweisverfahren durch Messung der Änderung der Fluoreszenz ohne B/F-Abtrennung erfordern ebenfalls eine komplizierte Behandlung, um unspezifische Adsorption und Fehlpaarung zu vermeiden, oder zur Entfernung unspezifischer adsorbierter Materialien oder fehlgepaarter Materialien. Über dies kann eine Verunreinigung die Empfindlichkeit der Messung beeinträchtigen und die Sondenkonzentration muss auf dem gleichen Niveau wie die Konzentration der Zielnucleinsäure sein. Daher erfordern diese Verfahren die Verwendung einer ausreichenden Menge an Probe und können nicht in der Mikroanalyse eingesetzt werden, was nachteilig ist.
Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, um die vorher erwähnten Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen.
Nucleic Acid Symp. Series No. 22, 8-10/11/90 offenbart, dass ein Spin-markiertes Oligonucleotid Hybride mit komplementären Oligonucleotiden ausbilden kann, wodurch die ESR-Linien verbreitert und die τ-Werte verglichen zu denen von Spin-markierten Sonden alleine erhöht werden. Dies bedeutet, dass der Nachweis von Sekundärstrukturen von RNS erzielt werden kann.
EP-A-0 439 036 offenbart Energie-Transfersysteme bestehend aus zwei organischen Verbindungen, eine von ihnen ist ein Chromophor vom Lumazintyp und die andere, die mit dem ersten interagiert, ist ein Rutheniumkomplex. Der Rutheniumkomplex wird an eine Nucleinsäuresequenz gebunden und die erste Verbindung, z.B. das Chromophor vom Lumazintyp, kann eine Base in der gegebenen Nucleinsäuresequenz ersetzen und anstelle des Nucleosids eingebaut werden.
EP-A-0 492 570 beschreibt den Nachweis eines Hybrids einer Nucleinsäure und einer Sonde durch Interkalation eines interkalierenden Moleküls unter Verwendung eines den Hintergrund reduzierenden Mittels.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleinsäure durch Nutzung der Hybridisierung durch einfachere Schritte ohne B/F-Abtrennung bei einer hohen Messempfindlichkeit zur Verfügung zu stellen, und eine Sonde dafür zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleinsäure zur Verfügung zu stellen, welches einen genauen Nachweis nur eines erwünschten Hybrids selbst in der Abwesenheit eines fehlgepaarten Hybrids erlaubt, und eine Sonde dafür zur Verfügung zu stellen.
Gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren definiert gemäß Anspruch 1 für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nucleinsäurehhybrids zur Verfügung gestellt. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren definiert gemäß Anspruch 9 für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nucleinsäurehybrids zur Verfügung gestellt.
Gemäß noch einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird eine gemäß Anspruch 32 definierte Sonde zur Verfügung gestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A ist eine grafische Darstellung, die eine Änderung des Signalintensitätsverhältnis über die Zeit in Beispiel 1 zeigt. Die 1B ist eine grafische Darstellung, die eine Änderung der Breite der ESR-Signallinie über die Zeit in Beispiel 1 zeigt. In den grafischen Darstellungen bezeichnet das Symbol ⧠ Daten, die aus dem Reaktionssystem erhalten werden, dass eine Sonde, eine Ziel-DNS und Fluorescein enthält, mit Lichtbestrahlung; das Symbol ∎ bezeichnet Daten, die aus einem Reaktionssystem erhalten werden, das eine Sonde, eine Ziel-DNS und Fluorescein enthält ohne Lichtbestrahlung; bzw. das Symbol ⧫ bezeichnet Daten, die aus einem Reaktionssystem erhalten werden, das eine Sonde und Fluorescein enthält mit Lichtbestrahlung.
Die 2 ist eine grafische Darstellung, die eine Änderung der Signalintensitätsverhältnisse über die Zeit in Beispiel 3 zeigt. Die Symbole ⧠, ∎ und ⧫ bezeichnen das gleiche wie in den 1A und 1B.
Die 3 ist eine grafische Darstellung, die die Abhängigkeit der Menge des gebildeten 8-Hydroxyguanosins (Verhältnis zu G) von der Menge der in Beispiel 5 verwendeten Sonde zeigt.
Die 4 ist eine grafische Darstellung, die die Abhängigkeit des gebildeten 8-Hydroxyguanosins (Farbreaktion durch ELISA-Verfahren) von der Menge der in Beispiel 6 verwendeten Sonde zeigt.
Die 5 ist eine grafische Darstellung, die die Interaktion der in Beispiel 7 erhaltenen Sonde mit einem Hybrid der Ziel-DNS zeigt.
Die 6 ist eine grafische Darstellung, die das in Beispiel 8 erzielte Auslöschen der Fluoreszenz von Acridin zeigt.
Die 7 ist eine grafische Darstellung, die die in Beispiel 8 erzielte Abnahme des Absorptions- bzw. Extinktionsverhältnisses von Acridin zeigt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis eines Hybrids auf der Grundlage eines neuartigen Prinzips zur Verfügung, das unterschiedlich zum Stand der Technik ist. Das erfindungsgemäße Verfahren weist die Bildung einer Doppelhelixstruktur als Resultat einer Hybridbildung ohne einen B/F-Abtrennungsschritt nach. Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung den Nachweis nur einer erwünschten normalen Doppelhelixstruktur mit erhöhter Genauigkeit, selbst wenn eine unspezifische Adsorbtion oder Fehlpaarung auftritt, durch Auswahl der Bedingungen für den Nachweis nur für eine normale Doppelhelixstruktur ohne eine zusätzliche Behandlung. Die vorliegende Erfindung ist in Fällen anwendbar, in denen die Nucleinsäure eine reguläre Doppelhelix, wie etwa in den Fällen der DNS-DNS-Hybridisierung und der DNS-RNS-Hybridisierung, ausbildet.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlich beschrieben.
Das Phänomen der Hybridisierung wurde bisher nur vom Gesichtspunkt der Wasserstoffbindung zwischen komplementären Nucleinsäurebasen verstanden. Daher wurde die Hybridisierung im Allgemeinen nach Immobilisierung der Nucleinsäure (DNS oder RNS) durchgeführt. Im Gegensatz dazu wird bei Hybridisierung in einer Lösung, wenn eine Nucleinsäure einen Doppelstrang einer bestimmten Länge bildet, erwartet, dass der Doppelstrang eine Doppelhelixstruktur bildet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bemerkten die Unterschiede einer einzelsträngigen Nucleinsäure von einer doppelsträngigen Nucleinsäure (Hybrid) in den Strukturen mit einer höheren Ordnung und den chemischen Eigenschaften und etablierten ein Nachweissystem, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Bei der Doppelhelixstruktur bildet der Nucleinsäurebasenanteil eine Basenpaarung durch Wasserstoffbindung mit den Phosphorsäureanteilen und den Zuckeranteilen, die nach außen weisen. Die Nucleinsäurebasen werden durch gegenseitiges Stapeln stabilisiert und nehmen ihre Position in der Mitte der Helixachse ein. Die Doppelhelixstruktur enthält eine A-Form, eine B-Form, eine C-Form, eine Z-Form und Variationen davon, welche nicht nur in der Basensequenz sondern in der Stufenlänge, der Helixsymmetrie, der Breite der Furche, der Tiefe der Furche usw. unterscheiden, in Abhängigkeit von den Ionenarten, der Salzkonzentration usw. beim Annealing (Oligonucleotid-Anlagerung). Selbst bei der gleichen Sequenz variiert die Doppelhelixstruktur in Abhängigkeit von den Bedingungen. Im Allgemeinen ist DNS in einer B-Formstruktur, in der eine Helixumdrehung (pitch) 33,8 Å hat und die Anzahl der Nucleinsäurebasen ist 10 Basen pro Helixumdrehung.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für den Nachweis einer Bildung einer Doppelhelixstruktur durch Messung einer chemischen Änderung eines zugegebenen Reagenz, welches eine nachweisbare Änderung durch eine Doppelhelixstruktur eines Hybrids verursacht.
Die verwendbaren Reagenzien enthalten zwei Arten:

(a) eines, welches eine nachweisbare Änderung durch Interaktion mit der Doppelhelix selbst verursacht, und
(b) eine Kombination von zwei oder mehr Reagenzien, welche in der Anwesenheit einer Doppelhelixstruktur interagieren, wodurch eine nachweisbare Änderung verursacht wird.

Zunächst wird das Verfahren, welches eine Reagenz vom Typ (a) nutzt, erläutert.
In dem Fall, wo ein Reagenz vom Typ (a) verwendet wird, reagiert eine Sonde mit einem daran gebundenen Reagenz mit einer Probenlösung, um ein Hybrid einer Sonde und einer Zielnucleinsäure zu bilden, und die Doppelhelixstruktur des Hybrids wird durch die Änderung der Bestandteile der Nucleinsäure nachgewiesen. Die Änderung verursacht durch die Reaktion des Reagenz gebunden an die Sonde mit der Doppelhelixstruktur kann durch eine direkte Messung der vorher erwähnten Änderung des Reagenz nachgewiesen werden, wenn diese Änderung selbst messbar ist, oder durch Induktion einer anderen Änderung, welche die Änderung des Reagenz nachweisbar macht, und durch Messung der resultierenden nachweisbaren Änderung. Ferner kann die Änderung der Bestandteile der Nucleinsäure durch Zersetzung in Nucleinsäure und Nucleotide und direkter Analyse durch HPLC oder unter Verwendung eines Antigens des veränderten Nucleosids nachgewiesen werden.
Das Reagenz, welches mit der Doppelhelixstruktur interagiert, enthält diejenigen, welche mit der Nucleinsäure usw. reagieren, die die Doppelhelixstruktur bilden, um durch sich selbst verändert zu werden; die, welche eine chemische oder strukturelle Änderung in der Doppelhelixstruktur verursachen; und die, welche eine nachweisbare Änderung durch die Anwesenheit der Doppelhelixstruktur durch Reaktion mit einer in das Reaktionssystem gegebenen dritten Substanz verursachen.
Diese Interaktion ist ein Ladungstransfer zwischen der Doppelhelixstruktur und dem Reagenz. Bei dem Ladungstransfer als der Interaktion wird ein Reagenz eingesetzt, welches als ein Elektronendonor oder ein Elektronenakzeptor dient. Die Interaktion ist z.B. als eine Änderung verursacht durch die Hybridformierung in der chemischen Struktur des Reagenz, der Doppelhelix oder einer dritten Substanz, die mit der vorhergehenden Substanz interagieren kann, als eine Änderung des Elektronenzustandes oder als eine Änderung in dem durch die geänderte Substanz gezeigten Signal nachweisbar.
Die auf Elektronentransfer basierende Interaktion enthält die Fälle von "Durch-den-Raum" und "Durch-die-Bindung" ähnlich wie in dem später gezeigten Reagenz von Typ (b). Diese Beispiele sind Ladungstransfers durch den Stapel der Nucleinsäurebasenpaare und Ladungstransfer verursacht durch den Annäherungseffekt zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor resultierend aus der Änderung der Struktur zu einer Doppelhelix.
In den Fällen, bei denen der Ladungstransfer mit geringer Wahrscheinlichkeit zwischen der Doppelhelixstruktur und dem Reagenz auftritt, kann ein Vermittler für den Ladungstransfer oder ein Mittel zur Erhöhung der Empfindlichkeit verwendet werden.
Die Änderung der Interaktion zwischen der Doppelhelixstruktur und dem Reagenz kann durch Messung der Änderung des Elektronenakzeptors nachgewiesen werden. Dieses Verfahren wird gemäß den Nachweismitteln klassifiziert.
Zum Beispiel wird die übertragene Ladung unter Verwendung eines Spin-markierenden Mittels (spin labeling agent) als eine Spektrumänderung im ESR durch Spin-Eliminierung oder ein ähnliches Verfahren nachgewiesen, oder durch Auftreten eines neuen Absorptionsspektrums wie einer Ladungstransferabsorptionsbande oder einer Änderung des Absorptionsspektrums nachgewiesen. In dem System, in welchem der Ladungstransfer eine Verfärbung oder Entfärbung der Lösung verursacht, kann die Änderung visuell bestätigt werden: dieses System ist als ein vereinfachtes System nützlich. Ein Licht-emittierendes System, wie Fluoreszenz und Phosphoreszenz, ist ebenfalls nützlich für die Reaktion, in welchem als das Ergebnis der Interaktion die Fluoreszenz oder die Phosphoreszenz auftritt oder verschwindet. Ein Elektronenakzeptor, welcher sich chemisch in eine andere Substanz durch den Ladungstransfer ändert kann für den Nachweis des Ladungstransfers verwendet werden, wobei die durch die Änderung gebildete Substanz durch Zugabe einer dritten Substanz zu dem System nachgewiesen werden kann, um Chemilumineszenz zu verursachen. Bei diesem Nachweis, wenn die dritte Substanz ein Enzym oder ein Antigen ist, kann sie durch Biolumineszenz nachgewiesen werden.
Die Interaktion kann durch die Änderung eines Elektrodendonors anstelle der vorher erwähnten Änderung eines Elektronenakzeptors nachgewiesen werden. Bei derartigen Nachweisverfahren sind die meisten der Nachweistechniken, wie sie für den Elektronenakzeptor beschrieben werden, ohne Modifikation anwendbar. Wenn der Elektronendonor eine fluoreszierende Substanz ist kann die Änderung wie, Fluoreszenzauslöschung bzw. -abschwächung, direkt durch eine Abnahme der Quantenausbeute der Fluoreszenz als die Folge des Ladungstransfers nachgewiesen werden, oder die resultierende Änderung kann auf andere Weise durch eine zusätzliche Reaktion sichtbar gemacht werden.
Wenn das Reagenz ein Elektronendonor für die Doppelhelixstruktur ist, kann eine dritte Substanz zugegeben werden, welche das Elektronendonor-Reagenz stimuliert, um Elektronen zu erzeugen, vorausgesetzt dass die dritte Substanz nicht aktiviert wird Elektronen abzugeben, um einen Ladungstransfer zu verursachen.
Wenn das Reagenz einen Elektronenakzeptor für die Doppelhelixstruktur ist kann es aktiviert werden und dadurch kann ein Elektron aus dem Elektronenakzeptor herausgezogen werden, wobei die Aktivierung durch Licht oder andere Initiationsmittel für den Fall des Elektronendonors verursacht werden kann.
Ein Vermittler für die Vermittlung des Ladungstransfers oder ein empfindlichkeitserhöhendes Mittel kann, wie vorher erwähnt, als eine dritte Substanz vorhanden sein. Eine derartige Substanz kann mit der Doppelhelix interagieren, um einen Ladungstransfer des Elektrodendoners oder des Elektrodenakzeptors zu fördern, welche nicht direkt an die Doppelhelix gebunden ist.
Das Reagenz vom Typ (a), welches mit der Sonde kombiniert, kann jede Substanz sein, welche ein Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Nähe des Oxidations-Reduktions-Potenzials der Nucleinsäure hat. Beispiele davon enthalten Reagenzien, die in der Lage sind, ein Elektron herauszuziehen, wie etwa Riboflavin; Oxidationsmittel, wie etwa N,N'-Dimethyl-2,7-Diazapyreniumionen; basische Farbstoffe, wie etwa Xanthenfarbstoffe, z.B. Bengalrosa, Floxin B, Eosin, usw., und Azinfarbstoffe, z.B. Methylenblau, Safranin T usw.
Als Nächstes wird das Verfahren, welches das vorher erwähnte Reagenz vom Typ (b) verwendet, erläutert.
Bei diesem Verfahren wird ein Hybrid durch Messung einer Änderung nachgewiesen, die sich durch Interaktion zwischen den zwei oder mehreren Reagenzien verursacht durch die strukturelle Änderung der Nucleinsäure von einer Einzelstrangform zu einer Doppelstrangform ergibt. Die Interaktion ist Ladungstransfer, wobei die "zwei oder mehr Reagenzien" wenigstens eine Kombination aus einem Elektronendonor und einem Elektronenakzeptor umfassen, und das Auftreten der Interaktion wird z.B. als eine Änderung der chemischen Struktur, eine Änderung des Elektronenzustands oder eine Änderung eines Signals der geänderten Substanz nachgewiesen, welche durch die Hybridbildung hervorgebracht wird.
Die Beziehung zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor hängt von dem Energiezuständen der beiden Substanzen ab. In der vorliegenden Erfindung wird der Elektronendonor oder der Elektronenakzeptor nicht notwendigerweise wie allgemein definiert verwendet. Bei der Kombination der zwei oder mehr Reagenzien werden der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor auf geeignete Weise ausgewählt. Wie gut bekannt istr, wird z.B. Anthracen als ein typischer Elektronendonor gemäß seinem Oxidations-Reduktions-Potenzial klassifiziert, aber hat gleichzeitig Eigenschaften als ein Elektronenakzeptor.
Die Interaktion des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors enthält die Fälle von "Durch-den-Raum" und "Durch-die-Bindung". Die Durch-den-Raum-Fälle enthalten eine Interaktion durch den Stapel der Nucleinsäurebasenpaare und eine Interaktion durch den Annäherungseffekt zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor als ein Resultat der Änderung der Struktur zu einer Doppelhelix verursacht. Die Durch-die-Bindung-Fälle enthalten einen Transfer von elektrischer Ladung durch Basen, Phosphorsäurereste und Zuckerreste, die die Nucleinsäure bilden. In jedem Fall ist die Art der Interaktion nicht begrenzt, vorausgesetzt, dass die Interaktion durch die Doppelhelix-Bildung verursacht wird.
Die Interaktion durch die Stapel der Nucleinsäurebasenpaare ist ein Phänomen, dass Elektronen, die von einem Elektronendonor abgegeben werden, durch die Elektronenwolke, die sich über die Nucleinsäurebasenpaare erstreckt, durch die benachbarten Nucleinsäurepaare nacheinander zu einem Elektronenakzeptor transferiert werden, wenn der Abstand zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor so groß ist, dass die Interaktion nicht primär verursacht werden kann, oder ist umgekehrt ein Phänomen, das ein Elektronenakzeptor ein Elektron aus einem Nucleinsäurebasenpaar herauszieht und ein Elektron wird schließlich nachfolgend aus einem Elektronendonor herausgezogen. Kurz gesagt, dienen die Nucleinsäurebasenpaare als ein Vermittler im Ladungstransfer.
Auf der anderen Seite tritt die durch den Annäherungseffekt verursachte Interaktion zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor auf, wenn die Ausbildung einer Doppelhelixstruktur einen Elektronendonor und einen Elektronenakzeptor nahe zueinander bringt, um die Interaktion zu ermöglichen. Zum Beispiel sind sowohl ein Elektronendonor als auch ein Elektronenakzeptor einen derartigen Abstand an eine Sonde gebunden, dass die Interaktion nicht auftritt, wenn die Sonde in einem Einzelstrangzustand ist, und dass die Interaktion auftritt, wenn die Sonde mit einer Zielnucleinsäure in eine Doppelhelixstruktur hybridisiert. Dadurch kann die Bildung einer Doppelhelixstruktur durch den Nachweis des Auftretens der Interaktion nachgewiesen werden. Wenn der Lagerungstransfer nicht leicht durch die Doppelhelixstruktur zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor auftritt, kann natürlich ein Vermittler, welcher den Ladungstransfer vermittelt, oder ein die Empfindlichkeit erhöhendes Mittel zugegeben werden.
Der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor sind notwendigerweise an derartigen Stellen positioniert, dass der Donor und der Akzeptor mit der Doppelhelixstruktur reagieren können, um die Interaktion wie vorher beschrieben in der vorliegenden Erfindung verursachen zu können. Das Reagenz ist so positioniert, um mit der Doppelhelixstruktur durch Einfügen zwischen einem Nucleinsäurebasenpaar, wie ein Interkalator, durch Einbetten in eine Furche der Doppelhelixstruktur, durch Anordnung nahe der Doppelhelixstruktur oder durch ein ähnliches Verfahren mit der Doppelhelixstruktur reagieren zu können. In jedem Fall wird in der vorliegenden Erfindung des Reagenz im Wesentlichen so positioniert, dass es spezifisch für die Doppelhelixstruktur eines Hybrids gebildet aus einer einzelsträngigen Sonde und einer Zielnucleinsäure ist.
Von den Verfahren der Positionierung des Reagenz ist die Verwendung eines Interkalators beim Ladungstransfer durch gestapelte Basenpaare am profitabelsten. Der Interkalator ist im Allgemeinen eine planare Verbindung mit ausgedehnten Elektronen. Der Intakalator wird angeordnet und orientiert in einer Richtung parallel zu den Nucleinsäurebasepaaren zwischen dem Basenpaaren im gleichen Abstand wie der zwischen den Basenpaaren. Wenn z.B. ein Interkalator als der Elektronendonor verwendet wird und ein Elektronenakzeptor an der gegenüberliegenden Seite der Doppelhelix angeordnet wird, kann ein von dem Elektronendonor abgegebenes Elektron durch das benachbarte Nucleinsäurebasenpaar gesendet werden und ferner durch die Elektronenwolke der Nucleinsäurebasenpaare in Richtung des Elektronenakzeptors. Umgekehrt, wenn ein Interkalator als der Elektronenakzeptor verwendet wird, und ein. Elektronendonor an der gegenüberliegenden Seite der Doppelhelix angeordnet wird, kann ein Elektron durch ein Elektronenloch des Elektronenakzeptors aus einem benachbarten Nucleinsäurepaar herausgezogen werden und ein weiteres Elektron wird nachfolgend zwischen den Nucleinsäurebasen herausgezogen und schließlich aus dem Elektronendonor, wodurch folglich ein Ladungstransfer verursacht wird. Unter Berücksichtigung der vorhergehenden Dinge ist beim Ladungstransfer durch gestapelte Basenpaare wenigstes einer des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors bevorzugt ein Interkalator. Bevorzugter sind beide von ihnen Interkalatoren zur Verbesserung der Effizienz des Ladungstransfers. Ferner ist bekannt dass ein Interkalator die Doppelhelixstruktur stabilisiert, und die Schmelztemperatur davon erhöht. Daher ist die Verwendung eines Interkalators als der Elektronendonor oder der Elektronenakzeptor vorteilhaft bei der Stabilisierung des Hybrids der Sonde und der Zielnucleinsäure.
Die Änderung der Interaktion zwischen zwei oder mehreren Reagenzien als Resultat aus der Bildung der Doppelhelix kann durch die Änderung des Elektronenakzeptors nachgewiesen werden. Dieses Verfahren wird gemäß dem Detektionsmittel klassifiziert.
Zum Beispiel wird die transferierte Ladung nachgewiesen durch die Verwendung eines Spin-Markierungsmittels. Als Spektrumänderung im ESR durch Spin-Elimination oder ein ähnliches Verfahren, oder nachgewiesen durch Auftreten eines neues Absorptionsspektrums wie eine Ladungstransferabsorptionsbande oder eine Änderung des Absorptionsspektrums. In dem System, in welchem der Ladungstransfer eine Färbung oder Entfärbung der Lösung verursacht, kann die Änderung visuell bestätigt werden: dieses System ist nützlich als ein vereinfachtes System. Ein Licht emittierendes System, wie Fluoreszenz und Phosphoreszenz, ist ebenfalls nützlich für die Reaktionen, in welchen die Fluoreszenz oder die Phosphoreszenz als das Ergebnis der Interaktion auftritt oder verschwindet. Ein Elektronenakzeptor, welcher sich chemisch in eine andere Substanz durch den Ladungstransfer verändert, kann für den Nachweis des Ladungstransfers verwendet werden, bei dem die durch die Änderung gebildete Substanz durch Zugabe einer dritten Substanz zu dem System nachgewiesen werden kann, um eine Chemilumineszenz durch die Reaktion der zwei Substanzen zu verursachen. Bei diesem Nachweis, wenn die dritte Substanz ein Enzym oder ein Antigen ist, kann sie durch Biolumineszenz nachgewiesen werden.
Bei einem anderen Verfahren kann die Interaktion durch die Änderung eines Elektronendonors anstelle der vorher erwähnten Änderung eines Elektronenakzeptors nachgewiesen werden. Bei diesem Nachweisverfahren sind die meisten der für den Elektronenakzeptor beschriebenen Nachweistechniken mit geringen Modifikationen anwendbar. Wenn der Elektronendonor eine fluoreszierende Substanz ist, kann die Änderung wie Fluoreszenzauslöschung direkt durch eine Abnahme der Quantenausbeute der Fluoreszenz als die Änderung des Ladungstransfers nachgewiesen werden, oder die resultierende Änderung kann durch eine zusätzliche Reaktion sichtbar gemacht werden.
Zusätzlich zu dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor kann eine dritte Substanz vorhanden sein, welche das Elektronendonor-Reagenz stimuliert, um ein Elektron zu erzeugen, außer in den Fällen, wo der Elektronenakzeptor durch Licht oder ähnliches aktiviert wird, um ein Elektron abzugeben und den Ladungstransfer zu initiieren.
Der Elektronenakzeptor kann aktiviert werden und dadurch wird ein Elektron aus dem Elektronenakzeptor herausgezogen, wobei die Aktivierung durch Licht oder ein anderes initiierendes Mittel wie in dem Fall des Elektornendonors verursacht werden kann.
Ein Vermittler für den Ladungstransfer oder ein die Empfindlichkeit erhöhendes Mittel kann wie vorher erwähnt als eine dritte Substanz vorhanden sein. Eine derartige Substanz kann mit der Doppelhelix interagieren, um den Ladungstransfer zu dem Elektronendonor oder dem Elektronenekzeptor zu fördern, welcher nicht direkt an die Doppelhelix gebunden ist.
Der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können, wenn sie beide im freien Zustand in dem Reaktionssystem sind, möglicherweise miteinander unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit der Doppelhelixstruktur interagieren, was den Hintergrund der Messung erhöht, und das S/N-Verhältnis senkt. Daher ist für einen präzisen Nachweis wenigstens einer von ihnen bevorzugt anfänglich an die Sonde gebunden. Das Binden des Elektronendonors oder des Elektronenakzeptors an die Sonde erfolgt wenn notwendig durch einen Linker, wie etwa -(CH₂)_n-. Die Verknüpfungsstelle ist so ausgewählt, um die Interaktion am wirkungsvollsten zu erhalten.
Am meisten bevorzugt ist der Fall, wo sowohl der Elektronendonor als auch der Elektronenakzeptor an die Sonde gebunden sind. In einem derartigen Fall sind entsprechende Stellen der interagierenden Reagenzien bekannt, so dass die Interaktion durch Auswahl der Stellen auf der Sonde vorteilhaft gesteuert werden kann. Der räumliche Abstand zwischen dem Elektronendonor und dem Elektrondenakzeptor auf der Sonde wird auf geeignete Weise in Abhängigkeit von ihren Arten ausgewählt. Zum Beispiel ist zur Ausnutzung des Annäherungseffekts der Abstand bevorzugt im Bereich von 20 bis 120 Å, bevorzugter von 50 bis 80 Å in dem ausgebildeten Hybrid, nämlich in der Doppelhelixstruktur. Zur Nutzung des Ladungstransfers durch die Doppelhelixstruktur wird der Abstand unter Berücksichtigung der Änderung der DNS-Struktur, wie etwa ein Entwinden, verursacht durch die entsprechenden Farbstoffe, ausgewählt, und ist bevorzugt im Bereich von 20 bis 120 Å. Der bevorzugte Abstand schwankt in Abhängigkeit davon, ob der Elektronendonor und der Elektrondenakzeptor beide ein Intakalator sind oder einer von ihnen in der primären Furche oder der sekundären Furche eingefügt ist. Daher ist der Abstand nicht auf den vorher erwähnten Bereich beschränkt. Wenn der Abstand zu gering ist, tritt der Ladungstransfer direkt zwischen dem Donor und dem Akzeptor auf, ohne Interaktion mit der Nucleinsäure. Daher ist der Abstand bevorzugter im Bereich von 50 bis 80 Å. Der Donor und der Akzeptor werden bevorzugt getrennt voneinander an den entsprechenden Enden der Sonde zur Vereinfachung der Bindung verknüpft, obwohl dies von der Länge der Sonde abhängt.
Die Länge der Sonde wird geeigneter Weise in einem Einzelfall so ausgewählt, um mit einer Zielnucleinsäure ausreichend zu hybridisieren und eine stabile Doppelhelixstruktur bilden zu können. In dem Fall, in dem sowohl der Elektronendonor als auch der Elektrondenakzeptor an die Sonde geknüpft sind, und der Donor und der Akzeptor miteinander in der Abwesenheit einer Doppelhelixstruktur interagieren werden, wird die Länge der Sonde unter Berücksichtigung des Abstandes des verknüpften Donor und Akzeptors ausgewählt, so dass der Abstand ausreichend ist, um die Interaktion zu verhindern. Die Länge ist gewöhnlich 8 Basen oder mehr bevorzugt 12 Basen oder mehr.
Jedoch wird die Stabilität der Doppelhelixstruktur nicht nur stark durch die Sondenlänge beeinträchtigt, sondern durch die Basensequenz selbst und die Salzkonzentration und die Ionenstärke des Reaktionssystems. Eine Sequenz mit mehr G-C-Basenpaaren wird eine stabilere Doppelhelixstruktur bilden, da die G-C-Basenpaare mehr Wasserstoffbindungen als die A-T-Basenpaare haben. Der Anstieg der molaren KCl-Konzentration von 0,01 M auf 1 M erhöht den Schmelzpunkt der DNS um 30 °C. Ferner trägt die Anwesenheit eines Intakalators signifikant zur Stabilität bei. Demgemäß kann eine Sonde mit einer Länge von weniger als 8 Basen möglicherweise durch geeignete Auswahl derartiger stabilisierender Faktoren nützlich sein.
In dem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, in dem nur eines von Elektronendonor und Elektrondenakzeptor an die Sonde gebunden ist, sind zwei Fälle eingeschlossen: (a) der andere Donor oder Akzeptor ist in dem Reaktionssystem während der Bildung der Doppelhelixstruktur durch Hybridisierung der Sonde und der Zielnucleinsäure vorhanden, und die Interaktion schreitet nach der Bildung der Doppelhelix voran; und (b) der andere Donor oder Akzeptor wird zu dem Reaktionssystem nach der Bildung der Doppelhelix durch Hybridisierung gegeben, um die Interaktion zu verursachen. In dem Ausführungsbeispiel, in dem sowohl der Donor als auch der Akzeptor an die Sonde gebunden sind, sind beide in dem Reaktionssystem während der Hybridisierung vorhanden, und die Interaktion wird nach der Bildung der Doppelhelix verursacht.
In dem vorher gezeigten Fall (b) enthalten die Reagenzien Spin-markierende Mittel, wie etwa 4,4-Dimethyloxazolidin-N-oxyl (DOXXL) und seine Derivate, 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin-N-oxyl (PROXL), und 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPO) und seine Derivate; fluoreszierende Interkalatoren ausgewählt aus Acridin, Anthrazin, Pyren, Ethidiumbromid, Pyrylium, Proflavin, Porphyrin, Thiazolorangedimer (TOTO), Oxazolegelb (YOYO), 4',6-Diamino-2-Phenylindoldihydrochlorid (DAPI), Propidiumiodid (PI) und ähnliche und ihren Derivaten; fluoreszierende Pigmente ausgewählt aus Cyanin, Azulen, dreikernigen Pigmenten, Dansyl, Fluorescein, Eosin, Rhodamin, Riboflavin und ihren Derivaten; und ähnliche. Diese Verbindungen werden geeigneterweise als ein Elektronendonor, ein Elektronenakzeptor oder ein Vermittler gemäß ihrem Oxidations-Reduktions-Potenzial verwendet. Von den Reagenzien wird ein Interkalator aus den vorher beschriebenen Gründen besonders bevorzugt.
Eine Veröffentlichung ist in J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3656-3660 zu finden, welche berichtet, dass ein Ladungstransfer zwischen zwei Sorten von Interkalatoren als Pigmente durch die Hilfe von DNS auftritt, wenn die Interkalatoren im freien Zustand zu einer doppelsträngigen DNS gegeben werden, aber schlägt überhaupt nicht die Anwendung der Interaktion zum spezifischen Nachweis der DNS-Hybridisierung vor. In dem Verfahren dieses Berichts werden zwei Sorten von Pigmente im freien Zustand zu der doppelsträngigen DNS gegeben. Daher kann dieses Verfahren nicht in der vorliegenden Erfindung angewendet werden, weil zwei Sorten der Farbstoffe als Interkalatoren miteinander zusätzlich zu der Interaktion verursacht durch den Ladungstransfer durch DNS interagieren, was den Hintergrund der Messung erhöht, und einen empfindlichen genauen Nachweis unmöglich macht.
Beispiel 1
[1] Herstellung einer 20-meren Oligonucleotidsonde verknüpft mit TEMPO (4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin) als ein Spin-markierendes Mittel:
(1) Synthese von 4-Aminohexylamino-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-oxyl (4-Aminohexylamino-TEMPO):
In 30 ml Methanol wurden 0,5 mmol 4-Oxo-TEMPO und 5 mmol Hexamethylendiamindihydrochlorid gelöst. Dazu wurden 0,4 mmol Natriumcyanoborhydrid und ein Molekularsieb 3A zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt, um die Reaktion ablaufen zu lassen. Die Reaktionslösung wurde durch ein Glasfilter filtriert, um das Molekularsieb zu entfernen, und das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat unter reduziertem Druck abgedampft. Der resultierende Rückstand wurde in 30 ml 1N Chlorwasserstoffsäure gelöst und die Lösung wurde mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wurde mit Wasser gewaschen und dann wurde das Chloroform unter einem reduzierten Druck abdestilliert. Wasser wurde zu dem Rückstand gegeben und wasserunlösliches Material durch Filtration entfernt. Das Wasser wurde aus dem Filtrat durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Auf diese Weise wurde ein rotes öliges Material erhalten.
(2) Synthese des Oligonucleotids:
Ein 20-meres Oligonucleotid, das eine teilweise komplementäre Basensequenz zu einer Ziel-DNS hat, M13mp18DNA (Einzelstrang), wurde mittels einer automatischen DNS-Synthesevorrichtung (Modell 381A, hergestellt von ABI Co.) synthetisiert. Die 5'-terminale Dimethoxytritylgruppe wurde in der automatischen Synthesevorrichtung eliminiert.
Die Basensequenz war wie folgt:
5'GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'
(3) Synthese der Spin-markierten Oligonucleotidsonde:
Das in dem vorhergehenden Schritt (2) synthetisierte Nucleotid (1 μmol) wurde zusammen mit seinem CGP-Träger in eine gasdichte Spritze überführt. Die nachfolgende Reaktion lief in dieser Spritze ab. Auf dem CPG-Träger wurde eine Lösung aus 50 mg Carbonyl-N,N'-Diimidazol (CDI) in 1 ml Dioxan gegeben. Es wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde stehengelassen. Nach Waschen mit Dioxan wurden 0,4 ml einer 0,2M 4-Aminohexylamino-TEMPO-Lösung in DMSO dazugegeben. Es wurde bei 55°C für 24 Stunden stehen gelassen und dann nacheinander mit DMSO, Dioxan und Methanol gewaschen und unter einem reduzierten Druck getrocknet.
Das Spin-markierte Oligonucleotid wurde durch wässrige konzentrierte Ammunoniaklösung abgetrennt, auf eine herkömmliche Art und Weise entschützt und durch RPLC in einer herkömmlichen Art und Weise gereinigt.
[2] Hybridbildung der TEMPO-Sonde mit M13mp18-DNS:
0,2 μM der Oligonucleotidsonde, hergestellt in dem vorhergehenden Verfahren [1] mit darin eingebrachtem TEMPO und 0,2 μM M13mp18-DNS (hergestellt von Takara Shuzo Co, Ltd.) wurde auf 80°C in 1 mM Phosphatpufferlösung/145mM NaCl/5mM KCl erwärmt. Es wurde schrittweise auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurde ein Hybrid aus Sonde-Ziel-DNS hergestellt. Zu der Reaktionslösung wurde Fluorescein (hergestellt von Kodak Co.) bis zu einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben. Die resultierende Lösung wurde einer ESR-Spektrummessung wie im Folgenden beschrieben unterzogen. Getrennt davon wurde dieselbe Vorgehensweise durchgeführt ohne Verwendung von M13mp18-DNS, um eine Probe zu erhalten (Sonde allein).
[3] Messung des ESR-Spektrums:
Bei der ESR-Messung wurde eine Probe in Intervallen von 20 Minuten für 100 Minuten untersucht und die Änderung des Intensitätsverhältnisses und der Absorptionlinienbreite über die Zeit wurde gemessen. Die verwendete ESR-Vorrichtung wurde von JEOL Ltd. hergestellt und die Zelle war eine Flachzelle aus künstlichem Quarz. Die Bedingungen des ESR und der Lichtbestrahlung waren wie folgt: ESR

Frequenz: 9,42 GHz

Modulation: 100 kHz, 0,1 mT

Feld: 335 mT

Zeitkonstante: 0,3 sec

Leistung: 10 mW

Messzeit: 8 min

Empfängervorgehen: 1,25 × 1000

Lichtbestrahlung

Monochometer: 490 nm

Stromzufuhr: 88,5 V – 89 V/22A
Die 1A zeigt die Änderung des Signalintensitätsverhältnisses über die Zeit, und die 1B ze igt die Änderung der Breite der ESR-Signallinie über die Zeit. In dem Fall der Sonde allein verursachte die Lichtbestrahlung weder die Änderung des Intensitätsverhältnisses noch die Änderung der Linienbreite. In dem Fall von Fluorescein/Sonde/M13mp18-DNS ohne Lichtbestrahlung wurde ebenfalls keine Änderung in dem Intensitätsverhältnis und der Linienbreite beobachtet.
Im Gegensatz dazu nahm in dem Fall von Fluorescein/Sonde/M13mp18-DNS mit Lichtbestrahlung (490 nm) das ESR-Signalintensitätsverhältnis über die Zeit ab. In diesem Fall änderte sich die ESR-Signallinienbreite nicht, was zeigt, dass die Änderung des ESR-Signalintensitätsverhältnisses nicht durch eine chemische Änderung verursacht wurde. Dadurch wurde bestätigt, dass der Spin von TEMPO als ein Ergebnis des Ladungstransfers von Fluorescein zu dem an die Sonde gebundenen TEMPO durch die Doppelhelix gebildet aus der Sonde und der M13mp18-DNS verschwand. Mit anderen Worten wurde das Hybrid aus Sonde-Ziel-DNS ohne B/F-Abtrennung nachgewiesen.
Beispiel 2
Das gleiche Experiment wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer dass die Basensequenz der Probe wie folgt war.
5'-GTTGTAAAAGGACGGCCAGT-3'
Die Sequenz in dieser Sonde ist darin unterschiedlich zu der in Beispiel 1, dass die zehnte Base vom 5'-Ende G anstelle von C ist, was bedeutet, das eine Base unterschiedlich von der Sequenz in Beispiel 1 ist, wodurch diese Sonde mit M13mp18-DNS eine Fehlpaarung aufweist.
Zu 0,2 μM der Sonde mit einer Fehlpaarungssequenz wurden 0,2 μM M13mp18-DNS zugegeben und die Mischung wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 annealed. Dann, nach Zugabe von Fluorescein, wurde die Änderung des Intensitätsverhältnisses und der Linienbreite des ESR-Signals über die Zeit beobachtet.
In der Folge wurde eine Änderung des Intensitätsverhältnisses nicht beobachtet, was unterschiedlich von dem Ergebnis in Beispiel 1 ist, und die Intensität war die gleiche wie in dem Fall der Sonde allein. Das bedeutet, dass die fehlpaarende Oligonucleotidsonde keinen genauen Doppelstrang bildet, wodurch ein Ladungstransfer nicht auftritt.
Beispiel 3
Synthese einer Oligonucleotidsonde mit Markierung an beiden Enden (5'-TEMPO, 3'-FITC):
(1) Synthese des 3'-Amino-Oligonucleotids:
Ein 20-meres Oligonucleotid mit einer Sequenz, die teilweise komplementär zu einer einzelsträngigen DNS ist, M13mp18-DNS, als die Ziel-DNS in Beispiel 1 wurde auf einem 3'-Aminomodifizierer CPG (1 μmol), hergestellt durch Gren Research Co. als dem Träger, mittels einer automatischen DNS-Synthesevorrichtung 381A, hergestellt durch ABI Co., synthetisiert. Die 5'-terminale Dimethoxytritylgruppe wurde in der automatischen Synthesevorrichtung entfernt.
(2) Synthese der Spin-markierten Oligonucleotidsonde:
Das in dem vorhergehenden Schritt (1) synthetisierte Nucleotid (1 μmol) wurde zusammen mit dem CGP-Träger davon in eine gasdichte Spritze überführt. Die nachfolgende Reaktion lief in dieser Spritze ab. Auf dem CGP-Träger wurde eine Lösung aus 50 mg Carbonyl-N,N'-Diimidazol (CDI) in 1 ml Dioxan gegeben. Es wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde lang stehen gelassen. Nach Waschen mit Dioxan wurden dazu 0,4 ml einer 0,2 M 4-Aminohexylamino-TEMPO-Lösung in DMSO, wie in Beispiel 1 verwendet, gegeben. Es wurde bei 55 °C für 24 Stunden stehengelassen und dann nacheinander mit DMSO, Dioxan und Methanol gewaschen und unter einem reduzierten Druck getrocknet.
Das Spin-markierte Oligonucleotid wurde durch wässriges konzentriertes Ammoniak abgetrennt, auf eine herkömmliche Art und Weise entschützt und durch RPLC in einer herkömmlichen Art und Weise gereinigt. Auf diese Weise wurde ein Spin-markiertes Oligonucleotid, das am 5'-Ende mit TEMPO markiert war, erhalten.
(3) Synthese eines Oligonucleotids mit Markierungen an beiden Enden:
Das in dem vorhergehenden Schritt (2) synthetisierte Spin-markierte Oligonucleotid hat eine 3-Amino-2-Hydroxygruppe an dem 3'-terminalen Zuckerrest. Diese Aminogruppe wurde an FITC (Fluoresceinisothiocyanat, hergestellt von Sigma Co.) durch den folgenden Schritt gebunden.
Eine Lösung von 0,2 μmol des in dem vorhergehenden Schritt (2) synthetisierten Spin-markierten Oligonucleotids in 700 μl Wasser wurde mit 100 μl 1M Natriumcarbonatpufferlösung (pH: 9) gemischt. Zu der resultierenden Lösung wurde eine Lösung aus 2 mg FITC in DMF zugegeben und bei 35 °C für 24 Stunden reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde durch eine Gelfiltrationssäule (NAP-25, hergestellt von Pharmacia Co.) behandelt, um einen großen Überschuss an FITC zu entfernen und dann durch RPLC gereinigt, um eine Sonde zu erhalten, die am 5'-Ende TEMPO und am 3'-Ende FITC gebunden hat.
(4) Messung des ESR-Spektrums:
Die in dem vorhergehenden Schritt (3) erhaltene Sonde und die M13mp18-DNS jeweils einer Menge von 0,2 μM wurden in einer herkömmlichen Art und Weise annealed. Die Änderung des Intensitätsverhältnisses und der Linienbreite des ESR-Signals wurden in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Die Sonde allein und das lichbestrahlte Sonde-Ziel-DNS-Hybrid wiesen keine Änderungen des Intensitätsverhältnisses auf, während das Hybrid der Sonde-Ziel-DNS, wenn es mit Licht von 490 nm bestrahlt wurde, welches die Anregungswellenlänge von Fluorescein ist, wies eine Abnahme des Signals über die Zeit auf (siehe 2), wodurch ein Auftreten eines Ladungstransfers bestätigt wurde. Über dies war der Grad der Abnahme des Spins höher als der in Beispiel 1, wo Fluorescein nicht an die Sonde gebunden war. Dadurch wurde bestätigt, dass der Elektronentransfer effizienter erfolgt, wenn ein Elektronendonor an das eine Ende und ein Elektronenakzeptor an das andere Ende gebunden ist.
Beispiel 4
Ein Oligonucleotid mit der gleichen Basensequenz wie die des Beispiels 2, welche an einer Base im Mittelteil unterschiedlich zu der M13mp18-DNS ist, wurde synthetisiert, und TEMPO und Fluorescein wurden an beiden Enden des Oligonucleotids in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 3 gebunden.
Die resultierende Sonde und die M13mp18-DNS wurden jeweils in einer Menge von 0,2 μM auf eine herkömmliche Art und Weise annealed. Die Änderung des Intensitätsverhältnisses und der Linienbreite des ESR-Signals wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Das Hybrid aus Sonde-Ziel-DNS wies, wenn es mit Licht der Anregungswellenlänge von Fluorescein von 490 nm bestrahlt wurde, keine Änderung in dem ESR-Signalintensitätsverhältnis und der Breite der ESR-Signallinie auf, wie die Sonde selbst und das unbestrahlte Hybrid aus Sonde und Ziel-DNS.
Beispiel 5
Ein 20-meres Oligonucleotid mit der Basensequenz des Beispiels 1 und mit einer daran gebundenen 3'-Aminogruppe wurde mittels eine automatischen DNS-Synthesevorrichtung synthetisiert.
Riboflavin wurde oxidiert, um seine CH₂OH-Gruppe zu einer COOH-Gruppe zu verändern. Dieses Riboflavin reagierte mit dem vorhergehenden 3'-Amino-Oligonucleotid, um ein Oligonucleotid mit einer daran gebundenen Riboflavin-Gruppe an dem einen Ende zu erhalten.
Die Oligonucleotidsonde mit dem gebundenen Riboflavin wurde mit M13mp18-DNS hybridisiert. Das Reaktionsmedium war eine 10 mM Phosphatpufferlösung. Die Endkonzentration der Sonde wurde auf 3 μM, 6 μM, 10 μM und 20 μM eingestellt. Die Endkonzentration der M13mp18-DNS wurde auf 10 μM eingestellt.
Die Lösung des Hybrids der Sonde mit gebundenem Riboflavin und der M13mp18-DNS wurde mit Licht bei 470 nm, der Anregungswellenlänge von Riboflavin, für 5 Minuten bestrahlt.
200 μl der bestrahlten Lösung wurden mit Nuclease P₁ behandelt und dann mit alkalischer Phosphatase von E. coli verdaut, um die Sonde und die DNS in Nucleoside zu zersetzen. Die Zersetzungsprodukte wurden durch HPLC gemäß dem Verfahren von Kasai (Gann, 75, p. 841-844, (1984)) aufgetrennt, um quantitativ 8-Hydroxyguanosin (8-OH-G) zu bestimmen. Das gleiche Experiment wurde mit einer Lösung der Sonde mit gebundenem Riboflavin allein und mit einer Lösung von M13mp18-DNS und mit nicht an eine Sonde gebundenem Riboflavin durchgeführt.
Im Ergebnis, wie in der 3 gezeigt, hängt die Bildung von 8-OH-G von der Sondenkonzentration ab, und die maximale Bildung wurde erhalten, wenn das Verhältnis der Sonde zu der Ziel-DNS 1:1 war. Kein 8-OH-G wurde mit einer Lösung der Sonde mit daran gebundenen Riboflavinen und mit einer Lösung der M13mp18-DNS und dem nicht an eine Sonde gebundenen Riboflavin nachgewiesen. Folglich wurde 8-OH-G nur gebildet, wenn die Sonde und die DNS hybridisiert waren.
Beispiel 6
Ein 20-meres Oligonucleotid mit daran gebundenem Riboflavin wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 5 hergestellt. Ein Hybrid wurde zwischen diesem Oligonucleotid als einer Sonde und M13mp18-DNS (als eine Ziel-DNS) gebildet. Das Reaktionsmedium war eine 10 mM Phosphatpufferlösung. Die Endkonzentration der Sonde wurde auf 3 μM, 6 μM, 10 μM und 20 μM eingestellt. Die Endkonzentration der M13mp18-DNS wurde auf 10 μM eingestellt. Die Lösung des Hybrids der Sonde mit gebundenem Riboflavin und der M13mp18-DNS wurde mit Licht bei 470 nm, der Anregungswelle von Riboflavin, für 5 Minuten bestrahlt.
Die gleichen Experimente wurden als eine Kontrolle mit einer Lösung der Sonde mit gebundenem Riboflavin allein und mit einer Lösung der M13mp18-DNS und nicht an die Sonde gebundenem Riboflavin durchgeführt.
Zu jeweils 100 μl der Proben nach Lichtbestrahlung wurden 50 μg von Lachshoden-DNS zugegeben, um die Probe an einer Mikroplatte zu fixieren. Es reagierte mit einem Antikörper gegen 8-OH-G gemäß einem ELISA-Verfahren. Der Sekundärantikörper wurde quantitativ durch Farbentwicklung mit alkalischer Phosphortase bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 4 gezeigt. Bei Bewertung mit 50 μg Lachshoden-DNS entwickelte der Komplex aus Sonde-DNS eine Farbe entsprechend der Sondenkonzentration mit einer maximalen Farbentwicklung bei einer äquimolaren Konzentration der Sonde zu der DNS, während die Lösung der Sonde mit gebundenem Riboflavin allein und der Lösung aus nicht and die Sonde gebundener M13mp18-DNS und Riboflavin eine Farbe entwickelte, die so schwach wie die der Lachshoden-DNS war.
Beispiel 7
Ein 20-meres Oligonucleotid mit gebundenem Riboflavin wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 5 hergestellt. Ein Hybrid wurde zwischen diesem Oligonucleotid als einer Sonde und M13mp18-DNS (als eine Ziel-DNS) gebildet. Das Reaktionsmedium war eine 10 mM Phosphatpufferlösung. Die Endkonzentration der Sonde wurde auf 3 μM, 6 μM, 10 μM und 20 μM eingestellt. Die Endkonzentration der M13mp18-DNS wurde auf 10 μM eingestellt. Die Lösung des Hybrids der Sonde mit gebundenem Riboflavin und der M13mp18-DNS wurde mit Licht bei 470 nm, der Anregungswellenlänge von Riboflavin, für 5 Minuten bestrahlt.
Die gleichen Experimente wurden als Kontrolle mit einer Lösung der Sonde mit gebundenem Riboflavin allein und mit einer Lösung der M13mp18-DNS und nicht an eine Sonde gebundenem Riboflavin durchgeführt.
Die Lichtabsorption des Riboflavins wurde bei 450 nm für jede der Proben gemessen. Die 5 zeigt die Resultate. Die Lösung, die nur Riboflavin, die Lösung die nur die Sonde mit gebundenem Riboflavin und die Lösung, die M13mp18-DNS und nicht an eine Sonde gebundenes Riboflavin enthält zeigten eine konstante optische Dichte von 1,5. Im Gegensatz dazu zeigte die Lösung, die das Hybrid der Sonde und der M13mp18-DNS enthält eine Abnahme der Lichtabsorption, was zeigte, dass sich das Riboflavin als das Resultat des Ladungstransfers in eine andere Substanz verändert hat.
Beispiel 8
(1) Bildung eines Succinimidesters von N,N'-Dimethyl-2,7-diazapyrenbis(tetrafluorborat) (DRP²⁺):
DAP²⁺ wurde gemäß dem Verfahren von Hunig (Ann. Chem. 1973, 339) synthetisiert. Das gereinigte DAP²⁺ reagierte mit Bernsteinsäureanhydrid gemäß der Friedel-Craft-Reaktion, wodurch ein gereinigtes Produkt (I) mit einer Carboxylgruppe erhalten wurde. 0,5 g des gereinigten Produkts (I) wurde in ein 100 ml Lichtbeständiges Reaktionsgefäß gegeben und in 30 ml trockenem DMF gelöst. Nachdem die Lösung auf –10 °C gekühlt wurde, wurden 0,4 g N,N'-Succinimidylcarbonat dazugegeben. Die Reaktion wurde bei dieser Temperatur für 5 Stunden fortgesetzt. Die Reaktionslösung wurde in 150 ml Chloroform gegossen. Die Mischung wurde mit 200 ml wässriger Natriumchloridlösung dreimal gewaschen und mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Destillationsrückstand wurde über eine Silicagelsäule gereinigt und aus Ethanol-Isopropanol kristallisiert, um DAP²⁺ (II) zu erhalten.
(2) Einbringen einer Aminogruppe und einer Thiolgruppe in die Nucleinsäure:
Ein 20-meres Oligonucleotid, das eine Basensequenz hat, die teilweise komplementär zu einer Ziel-DNS ist, M13mp18-DNS (Einzelstrang), wurde mittels einer automatischen DNS-Synthesevorrichtung (380A, hergestellt von ABI Co.) synthetisiert. Bei der Synthese wurde eine Aminogruppe an das 3'-Ende des Oligonucleotids unter Verwendung einer Fmoc 3'-Aminomodifizier-CPG-Säule (III), hergestellt von Miligene Co. anstelle des herkömmlichen Amidid-CPG-Reagenz eingeführt. Ferner wurde nach der Synthese eine Thiolgruppe an das 5'-Ende davon unter Verwendung eines 5'-Hexanol-Thiol-Verknüpfers (III'), hergestellt von Miligene Co., anstelle des herkömmlichen Amidid-Reagenz eingeführt.
Das Oligonucleotid wurde von dem CPG-Träger abgeschnitten, entschützt und durch Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie gemäß einem vorher bestimmten Protokoll gereinigt. Das Oligonucleotid hatte die folgende Basensequenz:
5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'
(3) Bindung der Sonde an DAP²⁺
500 μg des vorhergehenden Oligonucleotids, das eine Aminogruppe und eine Thiolgruppe daran gebunden hat, wurden in einer Mischung von 100 μl 1M Natriumcarbonatpufferlösung (pH: 7,0) und 700 μl Wasser gelöst. Dazu wurden 2 mg DAP²⁺ (II) gelöst in 200 μl DMF langsam unter Rühren gegeben. Die Mischung reagierte bei 40 °C für 24 Stunden. Nach der Reaktion verschwand der Peak der Nucleinsäure in dem Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatogramm und ein neuer Peak trat auf, welcher die kombinierten Adsorptionen der Nucleinsäure und von DAP²⁺ hatte. Die Reaktionslösung wurde grob über eine Gelfiltrationssäule (NAP-50, hergestellt von Pharmacia Co.) gereinigt und weiterhin durch HPLC gereinigt. Dadurch wurden 450 μg eines Komplexes aus 3'-DAP²⁺·Sonde (IV) erhalten.
(4) Verbinden der Sonde mit Acridin:
400 μg des Sondenkomplexes (IV), der eine Thiolgruppe an dem 5'-Ende hat, erhalten in dem vorhergehenden Schritt (3), wurde in einer Mischung von 100 μl von 1M Natriumphosphatpufferlösung (pH: 6,0) und 700 μl Wasser gelöst. Dazu wurde eine Lösung von 1 mg N-9-Acrydinylmaleimid (V, Funakoshi) in 200 μl DMF langsam unter Rühren gegeben. Die Mischung reagierte bei 40°C für 24 Stunden. Die Reaktionslösung wurde grob durch eine Gelfiltrationssäule gereinigt und weiterhin durch Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie gereinigt. Dadurch wurden 410 μg eines 5'-Acridin·3-DAP²⁺·Sonden-Komplexes (VI) erhalten.
(5) Reaktion zur Bildung eines Hybrids der Pigmentsonde und der M13mp18-DNS:
0,2 μM des Sondenkomplexes (VI), erhalten im vorhergehenden Schritt (4), und 0,2 μM der M13mp18-DNS (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu einer gemischten Lösung von 1mM Phosphatpufferlösung (pH: 7,0)/145mM NaCl/5mM KCl gegeben und auf 80 °C erwärmt. Die Mischung wurde schrittweise auf Raumtemperatur gekühlt, um ein Hybrid des Sondenkomplexes (VI) mit der M13mp18-DNS zu erhalten. Als das Ergebnis der Hybridbildung veränderte sich das Absorptionsspektrum von Acridin in Richtung einer längeren Wellenlänge um etwa 20 nm.
(6) Fluoreszenzauslöschung bzw. -abschwächung von Acridin:
Eine Lichtbestrahlungsvorrichtung ausgestaltet mit einem Monochrometer wurde verwendet. Die Sonde und/oder das Hybrid wurden mit Licht von 490 nm bestrahlt, der Anregungswellenlänge von Acridin, und die Fluoreszenz bei 533 nm wurde überwacht. Die Sonde selbst zeigte eine leichte Auslöschung der Fluoreszenz während einer langen Bestrahlungszeit. Das Fluoreszenzintensitätsverhältnis des Hybrids des Sondenkomplexes (VI) mit der M13mp18-DNS wurde relativ zu der Fluoreszenzstärke der Sonde selbst gemessen, die als 1 zu jedem Bestrahlungszeitpunkt genommen wurde. Die Ergebnisse sind in der 6 gezeigt.
Die Fluoreszenz des Hybrids nahm mit der Bestrahlungszeit ab. Dies bedeutet, dass die Fluoreszenz des Acridins als das Ergebnis des Ladungstransfers von Acridin zu DAP²⁺ durch die Hilfe des Doppelstrangs des Hybrids des Sondenkomplexes (VI)/M13mp18-DNS ausgelöscht wurde. Auf diese Weise wurde das Hybrid des Sondenkomplexes (VI)/M13mp18-DNS ohne eine B/F-Abtrennung nachgewiesen.
(7) Änderung des Absorptionsspektrums von Acridin über die Zeit:
Die Änderung des Absorptionsspektrums des Sondenkomplexes (VI) selbst und des Hybrids des Sondenkomplexes (VI)/M13mp18-DNS wurde durch kontinuierliche Bestrahlung mit Licht von 490 nm über die Zeit beobachtet. Der Sondenkomplex (VI) selbst zeigte eine Abnahme der Absorption aufgrund des Ladungstransfers zwischen Acridin und DAP²⁺. Das Absorptionsverhältnis des Hybrids des Sondenkomplexes (VI) und der M13mp18-DNS wurden relativ zu der Absorption der Sonde selbst gemessen, die als 1 bei jeder Strahlungszeit genommen wurde. Die Ergebnisse sind in der 7 gezeigt. Die Absorption des Hybrids des Sondenkomplexes (VI) mit der M13mp18-DNS nahm signifikant ab. Dies bedeutet, dass die Ladung von Acridin zu DAP²⁺ durch die gestapelten Basenpaare transferiert wurde.
Beispiel 9
Eine Sonde, welche Acridin an ihr 5'-Ende und DAP²⁺ an ihr 3'-Ende gebunden hat, wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 8 hergestellt, außer dass das Oligonucleotid mit der im folgenden gezeigten Basensequenz als die Sonde verwendet wurde. Die resultierende Sonde reagierte mit M13mp18-DNS und die Fluoreszenzauslöschung und die Abnahme der Absorption wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 8 gemessen.
5'-GTTGTAAAAGGACGGCCAGT-3'
Diese Basensequenz ist darin unterschiedlich zu der in Beispiel 8, dass die zehnte Base vom 5'-Ende G anstelle von C ist, was bedeutet, dass eine Sequenz unterschiedlich von der Sequenz in Beispiel 8 ist, wodurch die Sonde nicht mit der M13mp18-DNS übereinstimmt.
Im Ergebnis wurde weder eine Fluoreszenzauslöschung noch eine Absorptionsabnahme bei der Probe dieses Beispiels beobachtet. Dadurch wurde bestätigt, dass der Ladungstransfer aufgrund der Bildung eines Hybrids nicht auftritt. Dies zeigt, dass die Fehlpaarung des Hybrids nicht nachgewiesen wurde.
Das Nachweisverfahren für eine Zielnucleinsäure der vorliegenden Erfindung hat die Vorteile, dass eine B/F-Abtrennung nicht notwendig ist. Folglich können verschiedene Schritte, die in herkömmlichen Verfahren wesentlich sind, weggelassen werden, etwa die Entfernung eines Überschuss an Sonde, die mühsame Behandlung für die Eliminierung unspezifischer Adsorption, die Ermittlung der Arbeitsbedingungen usw.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht einen selektiven Nachweis eines Hybrids, welches durch die Auswahl der Reagenzien eine genaue Doppelhelixstruktur hat, so dass nur die Signaländerung des genauen Hybrids nachgewiesen werden kann, selbst in dem Fall, wo eine Fehlpaarung in einem Reaktionssystem auftritt.
Ein Verfahren für den Nachweis eines Nucleinsäurehybrids umfasst die Schritte der Zugabe einer Nucleinsäuresonde in eine Probenlösung, die eine Zielnucleinsäure enthält und Nachweis einer Doppelhelixstruktur eines Hybrids gebildet zwischen der Sonde und der Zielnucleinsäure, wobei er Schritt des Nachweises der Doppelhelixstruktur umfasst, das in die Probenlösung zwei oder mehr Sorten an Reagenzien eingebracht werden, welche in der Lage sind, eine nachweisbare Änderung durch Interaktion zwischen ihnen durch die Doppelhelixstruktur zu verursachen, und Messung der durch die Interaktion der Reagenzien verursachten Änderung; und wenigstens eine der zwei oder mehreren Sorten von Reagenzien ist an die Sonde gebunden.

Claims

Verfahren für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nukleinsäurehybrids, das eine Doppelhelixstruktur enthält, das zwischen einer Zielnukleinsäure, welche in einer Probenlösung enthalten sein kann, und einer Nukleinsäuresonde mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure gebildet wird, deren Basensequenz komplementär zu jener der Zielnukleinsäure ist, wobei der Nachweis durch eine nachweisbare Änderung verursacht durch die strukturelle Änderung der Nukleinsäure von einer einzelsträngigen Form zu einer doppelsträngigen Form gemessen wird, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Vorsehen der Nukleinsäuresonde mit einem an die einzelsträngige Nukleinsäure gebundenen Reagenz, wobei das Reagenz mit der Doppelhelixstruktur durch Ladungstransfer interagieren kann, mit einem Oxidations-Reduktionspotenzial, das annähernd gleich zu dem Oxidations-Reduktionspotenzial der Nukleinsäure ist, und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Spin-Labeling-Mitteln; fluoreszierenden Interkalatoren und fluoreszierenden Pigmenten; (b) Zugabe der Nukleinsäuresonde zu der Probenlösung und Erzeugen von Bedingungen in der Probenlösung, dass die Doppelhelixstruktur gebildet wird, wenn die Probenlösung die Zielnukleinsäure enthält; und (c) Nachweis des Ladungstransfers zwischen dem Reagenz und der Doppelhelixstruktur in der aus dem Schritt (b) resultierenden Probenlösung, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des Nukleinsäurehybrids nachzuweisen, wobei der Ladungstransfer zwischen Stapeln von Basenpaaren erfolgt, die die Doppelhelixstruktur bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenz ein Elektronendonor oder ein Elektronenakzeptor für die Doppelhelixstruktur ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenz ausgewählt wird aus Riboflavin, N,N'-Dimethyl-2,7-Diazapyreniumion, Bengalrosa, Floxin B, Eosin, Methylenblau, und Safranin T.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt in (c) den Schritt des optischen Nachweis der Änderung in dem Reagenz oder dem Nucleosid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des optischen Nachweis der Änderung in dem Reagenz oder in dem Nucleoid den Schritt des Nachweis einer Änderung im Adsorptionsspektrum des Reagenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Reagenz ein Spin-Labeling-Mittel ist, welches als ein Elektronenakzeptor wirkt und der Schritt (c) den Schritt des Nachweises einer Änderung im ESR-Spektrum umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt (c) den Schritt des Nachweis einer Änderung des Nucleosids zu 8-Hydroxyguanosin (8-OH-G) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ladungstransfer durch Lichtbestrahlung ausgelöst wird.
Verfahren für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nukleinsäurehybrids, das eine Doppelhelixstruktur enthält, das zwischen einer Zielnukleinsäure, welche in einer Probenlösung enthalten sein kann, und einer Nukleinsäuresonde, die eine einzelsträngige Nukleinsäure hat, deren Basensequenz komplementär zu jener der Zielnukleinsäure ist, gebildet wird, wobei der Nachweis durch eine nachweisbare Änderung verursacht durch die strukturelle Änderung der Nukleinsäure von einer einzelsträngigen Form zu einer doppelsträngigen Form gemessen wird, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Vorsehen eines ersten Reagenz und eines zweiten Reagenz und der Nukleinsäuresonde mit dem an die einzelsträngige Nukleinsäure gebundenen ersten Reagenz, wobei das erste und das zweite Reagenz durch Ladungstransfer durch Stapel von Basenpaaren, die die Doppelhelixstruktur des Hybrids bilden, miteinander interagieren können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Spin-Labeling-Mitteln; fluoreszierenden Interkalatoren, ausgewählt aus Acridin, Anthracen, Pyren, Pyrylium, Proflavin, Porphyrin, Thiazolorange-Dimer, Oxazolgelb, 4',6'-Diamino-2-phenylindoldihydrochlorid, Propidiumiodid; und fluoreszierenden Pigmenten ausgewählt aus Cyanin, Azulen, dreikernigen Pigmenten, Dansyl, Fluorescein, Eosin, Rhodamin und Riboflavin; (b) Zugabe der Nukleinsäuresonde mit dem daran gebundenen ersten Reagenz und Zugabe des zweiten Reagenz zu der Probenlösung und dann und Erzeugen von Bedingungen in der Probenlösung, so dass die Doppelhelixstruktur gebildet wird, wenn die Probenlösung die Zielnukleinsäure enthält; und (c) Nachweis des Ladungstransfers zwischen dem ersten und dem zweiten Reagenz durch Stapel von Basenpaaren, die die Doppelhelixstruktur des Hybrids in der Probenlösung resultierend aus dem Schritt (b) aufbauen, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des Nukleinsäurehybrids nachzuweisen, wobei der Ladungstransfer zwischen Stapeln von Basenpaaren auftritt, die die Doppelhelixstruktur bilden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das erste und das zweite Reagenz an die einzelsträngige Nukleinsäure der Sonde gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das erste Reagenz an ein Ende der einzelsträngigen Nukleinsäure gebunden ist und das zweite Reagenz an das andere Ende der einzelsträngigen Nukleinsäure gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei das erste und das zweite Reagenz an die einzelsträngige Nukleinsäure der Sonde gebunden werden, um nur miteinander zu interagieren, wenn das Nukleinsäurehybrid in der Lösung resultierend aus dem Schritt (b) vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei ein Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Reagenz so eingestellt wird, dass vermieden wird, dass das erste und das zweite Reagenz miteinander direkt interagieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei wenigstens eines des ersten und des zweiten Reagenz ein Elektronendonor und das andere ein Elektronenakzeptor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei wenigstens eines des ersten und des zweiten Reagenz eine Verbindung ist, die eine nachweisbare Änderung in ihrem Absorptionsspektrum durch den Ladungstransfer aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei in Schritt (c) die Änderung in dem ersten oder dem zweiten Reagenz optisch nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die optische Änderung in dem ersten oder dem zweiten Reagenz durch eine Änderung im Absorptionsspektrum des ersten oder des zweiten Reagenz gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Auftreten eines neuen Absorptionsspektrums nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei das erste Reagenz oder das zweite Reagenz ein Spin-Labeling-Mittel ist und das zweite Reagenz ein Elektronendonor für das erste Reagenz ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei in Schritt (c) die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Änderung im ESR-Spektrum nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Spin-Labeling-Mittel 4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin (TEMPO) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei der Schritt in (c) die Unterschritte umfasst: Vorsehen eines dritten Reagenz, dass eine nachweisbare Änderung aufweisen kann, wenn es mit dem ersten oder mit dem zweiten Reagenz interagiert, welches durch den Ladungstransfer modifiziert wird; Zugabe des dritten Reagenz in eine Lösung, die aus dem Schritt (b) resultiert und Reaktion des dritten Reagenz mit dem ersten oder dem zweiten Reagenz, wenn die aus dem Schritt (b) resultierende Lösung das erste oder das zweite Reagenz modifiziert durch den Ladungstransfer enthält, und Nachweis der Änderung in dem dritten Reagenz.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das dritte Reagenz ein Enzym oder ein Antigen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei wenigstens ein Reagenz ein Interkalator ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 24, wobei der Ladungstransfer zwischen dem ersten und dem zweiten Reagenz durch Lichtbestrahlung ausgelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 10 für die Feststellung der Abwesenheit eines Fehlpaarung in einem Nukleinsäurehybrid, wobei das erste Reagenz und das zweite Reagenz miteinander durch Ladungstransfer durch Stapel von Basenpaaren in der Doppelhelixstruktur des Hybrids interagieren, wenn die Doppelhelixstruktur frei von jeder Fehlpaarung zwischen den Reagenzien ist; so dass in Schritt (c) der Ladungstransfer zwischen dem ersten und dem zweiten Reagenz in der Probenlösung aus dem Schritt (b) nachgewiesen wird, um die Abwesenheit einer Fehlpaarung in dem Nukleinsäurehybrid zwischen den Reagenzien nachzuprüfen.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Schritt (c) den Unterschritt des Nachweises des Ladungstransfers zwischen der Reagenzien durch Spektrumsänderung im ESR unter Verwendung eines Spin-Labeling-Mittels als dem ersten Reagenz und einem Elektronendonor als dem zweiten Reagenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei das erste Reagenz 4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin und das zweite Reagenz Fluoresceinisothiocyanat ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Schritt (c) den Unterschritt des Nachweises einer Änderung in einem Absorptionsspektrum der aus dem Schritt (b) resultierenden Probenlösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 29, wobei das erste Reagenz Succinimidester oder N,N'-Dimethyl-2,7-diazapyrenbis(tetrafluorborat) und das zweite Reagenz Acridin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, wobei der Ladungstransfer durch Lichtbestrahlung ausgelöst wird.
Sonde für den Nachweis einer Zielnukleinsäure mit einem ersten Reagenz, einem zweiten Reagenz und einer einzelsträngigen Nukleinsäure mit einer zu der Zielnukleinsäure komplementären Basensequenz, wobei das erste Reagenz und das zweite Reagenz an die einzelsträngige Nukleinsäure der Sonde gebunden sind und das erste Reagenz und das zweite Reagenz miteinander durch Ladungstransfer durch Stapel von Basenpaaren, die die Doppelhelixstruktur eines Hybrids bilden, das durch Hybridisierung der Zielnukleinsäure mit der Sonde gebildet wird, interagieren können, wobei das erste und das zweite Reagenz ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Spin-Labeling-Mitteln; fluoreszierenden Interkaltatoren, ausgewählt aus Acridin, Anthracen, Pyren, Pyrylium, Proflavin, Porphyrin, Thiazolorange-Dimer, Oxazolgelb, 4',6'-Diamin-2-Phenylindoldihydrochlorid, Propidiumiodid; und fluoreszierenden Pigmenten, ausgewählt aus Cyanin, Azulen, dreikernigen Pigmenten, Dansyl, Fluoreszein, Eosin, Rhodamin und Riboflavin.
Sonde nach Anspruch 32, wobei der Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Reagenz so eingestellt ist, dass vermieden wird, dass die Reagenzien miteinander direkt interagieren.
Sonde nach einem der Ansprüche 32 oder 33, wobei wenigstens eines des ersten Reagenz und des zweiten Reagenz eine Verbindung ist, die durch Ladungstransfer einer nachweisbaren Änderung unterzogen wird.
Sonde nach Anspruch 33, wobei die Verbindung einer Änderung in ihrem Absorptionsspektrum unterzogen wird, so dass ein neues Absorptionsspektrum auftritt.
Sonde nach einem der Ansprüche 32 bis 35, wobei das erste Reagenz an ein Ende der einzelsträngigen Nukleinsäure gebunden ist, und das zweite Reagenz an das andere Ende der einzelsträngigen Nukleinsäure gebunden ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 32 bis 36, wobei das erste Reagenz ein Spin-Labeling-Mittel ist, welches eine Veränderung in dem Elektronenspin-Resonanzspektrum durch Aufnahme eines Elektrons verursacht, und das zweite Reagenz ein Elektronendonor für das erste Reagenz ist.
Sonde nach Anspruch 37, wobei das Spin-Labeling-Mittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 3- Hydroxy-4,4-dimethyloxazolidin, 1-Hydroxy-2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin und 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin.
Sonde nach Anspruch 37, wobei der Elektronendonor ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Acridin, Anthracen, Pyren, Ethidiumbromid, Pyrylium, Proflavin, Porphyrin, Thiazolorange-Dimer, Oxazolgelb, 4',6-Diamino-2-Phenylindoldihydrochlorid, Propidiumiodid, Cyanin, Azulen, Dreikernpigment, Dansyl, Fluorescein, Eosin, Rhodamin und Riboflavin.
Sonde nach Anspruch 37, wobei das Spin-Labeling-Mittel 4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin (TEMPO) ist, und das zweite Reagenz Fluoresceinisothiocyanat ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 32 bis 39, wobei wenigstens eines des ersten und des zweiten Reagenz ein Interkalator ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 32 bis 40, wobei der Ladungstransfer durch Lichtbestrahlung ausgelöst wird.