DE69826992T2

DE69826992T2 - Verfahren zur bestimmung einer nukleinsäure

Info

Publication number: DE69826992T2
Application number: DE69826992T
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Batz; Frydenlund Henrik HANSEN; Henrik Rum; Troels Koch; B. Gary SHUSTER; A. Bruce ARMITAGE; Danith Ly
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH; Georgia Tech Research Institute; Georgia Tech Research Corp
Current assignee: PNA Diagnostics ApS Sweden; Georgia Tech Research Corp
Priority date: 1997-02-24
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2018-02-24
Also published as: EP0968309B1; WO1998037232A3; DE69826992D1; EP0968309A2; WO1998037232A2; AU6822598A; ATE279534T1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure in einer Probe mit einem Sondenmolekül unter Anwendung des Elektronentransfers von einem Elektronendonator zu einem Elektronenakzeptor. Die Erfindung betrifft außerdem Verbindungen, die für solche Methoden nützlich sind, als auch Verbindungen, die zur Präparierung der Sondenmoleküle nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Bestimmungen von Nukleinsäuren werden als ein Mittel der Diagnose im Gesundheitsbereich immer wichtiger. Zum Beispiel kann das Vorhandensein von Nukleinsäuren aus Organismen, wie etwa Viren, die gewöhnlich nicht im menschlichen Körper vorhanden sind, unter Verwendung von Sonden zum Infizieren der Nukleinsäuren bestimmt werden. Weiterhin können jegliche Veränderungen im Genom, die einen potenziellen Einfluss auf den Stoffwechsel und den Gesundheitszustand des Individuums haben können, bestimmt werden. Solche Veränderungen können durch Mutation oder auf anderen Wegen stattgefunden haben. Die Nukleinsäure-Bestimmung hat durch die Einführung von Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren wie der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction – PCR) weitere Fortschritte gemacht.
Die derzeit bekannten Nukleinsäure-Assays können in zwei Typen eingeteilt werden, die heterogenen und die homogenen Assays. Bei heterogenen Assays wird die Nukleinsäure durch Binden einer Nukleinsäure-Sonde, die für den Nachweis markiert ist, oder durch Einbau markierter Mononukleosidtriphosphate und anschließende Immobilisierung der derart markierten Nukleinsäure an einer Festphase bestimmt. Dies erfolgt vorzugsweise unter Verwendung einer an eine Festphase gebundenen Fangsonde, ein Format, welches den Vorteil bietet, dass jegliche Überschussmenge an markierten Sonden oder Mononukleotiden ohne weiteres von der an die Festphase gebundenen markierten Nukleinsäure getrennt werden kann. Bei der homogenen Art von Nukleinsäure-Assay wird die gegenseitige Beeinflussung zweier Markierungen ausgenützt. Bei einer ersten Methode sind die beiden Markierungen miteinander verknüpft und ruft das Auftreten der Hybridisierung die Spaltung der Verknüpfung zwischen den beiden Markierungen hervor. (Die Markierungen sind so gewählt, dass sie ein Signal auslösen, sobald sie getrennt werden.) Bei einer zweiten Methode verändert sich der Abstand zwischen den Markierungen durch Hybridisierungsereignisse. In diesem Fall können die Markierungen an einer Sonde oder an zwei separaten Sonden mit der Fähigkeit zum Hybridisieren an die Analyt-Nukleinsäure lokalisiert sein, so dass die Markierungen miteinander wechselwirken können.
Der Elektronentransfer zwischen Donatoren und Akzeptoren ist weiter in zwei Kategorien zu unterteilen. In der ersten Kategorie werden die Donatoren (Do) und Akzeptoren (Ak) an die DNA-Doppelhelix durch nicht-kovalente Kräfte gebunden, wie etwa den Van der Waals-Kräften, der elektrostatischen Kräfte und der Wasserstoffbrückenbindung. Zur zweiten Klasse zählen Systeme, bei denen Do und Ak kovalent an die DNA geknüpft sind. Der früheste Nachweis des ersten Ansatzes wurde von Fromherz und Rieger im Jahr 1986 berichtet, die den photoinitiierten Elektronentransfer (PET) von interkaliertem Ethidium zu Oberflächen-assoziiertem Methylviologen untersuchten (Formherz, P.; Rieger B. J. Am Chem. Soc. 1986, 108, 5361). Die Elektronentransferprodukte wurden durch direkte Beobachtung des reduzierten Viologen-Akzeptors nachgewiesen. Allerdings wurde keine spezielle Wirkung der DNA, über die Schaffung einer hohen Effektivkonzentration an Donator und Akzeptor hinaus, beobachtet. Im Jahr 1992 berichteten Harriman und Brun den PET von Ethidium- und Acridin-Donatoren zu Diazapyrenium-Akzeptoren unter Bedingungen, bei denen die Redox-Komponenten interkaliert waren (Brun, A. M.; Harriman, A. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3656). Die multiexponentielle Elektronentransfer-Kinetik wurde den Do/Ak-Trennungen von 3, 4 und 5 Basenpaaren zugeschrieben. Der in jener Studie hergeleitete β-Wert (0,88 Å^–1) ist dem für die Do/Ak-Systeme in Proteinen bestimmten vergleichbar, bei denen keine gestapelten π-Elektronensysteme zur Vermittlung des Elektronentransfers zur Verfügung stehen. Barton, Barbara und Mitarbeiter untersuchten Übergangsmetallkomplex- Donatoren und -Akzeptoren, die in DNA interkaliert sind, und stellten fest, dass das Löschen der Donatorfluoreszenz als auch das Wiederherstellen der Absorption des Grundzustands bei Raten verläuft, die unabhängig von der Zahl der gebundenen Akzeptoren sind, was eine sehr flache Distanzabhängigkeit für den Elektronentransfer durch die DNA-Doppelhelix (β < 0,2 Å^–1) nahelegt (Arkin, M. R.; Stemp, E. D. A.; Holmlin, R. E.; Barton, J. K.; Hörmann, A.; Olson, E. J. C.; Barbara, P. F. Science 1996, 273, 475). Allerdings konnte ein kooperatives Binden der Donator- und Akzeptor-Moleküle, was die ladungsabhängige Kinetik erklären würde, in jenem System nicht völlig ausgeschlossen werden.
Eines der Probleme, das mit der Verwendung nicht-kovalent gebundener Donator- und Akzeptor-Moleküle in diesen Studien verbunden ist, besteht in dem Unvermögen, die Lokalisation der Redox-Komponenten relativ zueinander, wenn diese an die DNA gebunden sind, präzise zu kontrollieren. Bei einem Extrem werden die Interkalationslokalisationen statistisch kontrolliert sein, was zu einer Verteilung der Do-Ak-Trennabstände führt. Bei einem anderen Extrem wird die Bindung kooperativ sein, was zu kurzen Abständen zwischen Do und Ak über einen breiten Bereich von Konzentrationen führt.
Die kovalente Bindung von Do und Ak an die 5'-Enden komplementärer Oligonukleotide hat zu Systemen mit besser definierten Do-Ak-Trennabständen geführt. Barton, Turro und Mitarbeiter berichteten von einer Fluoreszenzlöschung, die innerhalb von weniger als einer Nanosekunde bei einem System auftritt, das verknüpfte Do- und Ak-Metallkomplexe enthält, die nahe der Enden einer Doppelhelix aus 15 Basenpaaren interkaliert sind (Murphy, C. J.; Arkin, M. R.; Jenkins, Y.; Ghatlia, N. D.; Bossmann, S.; Turro, N. J.; Barton, J. K. Science 1993, 262, 1025). Eine derart schnelle Rate zeigt auf, dass die Abstandsabhängigkeit des Elektronenstransfers durch DNA extrem flach ist, doch muss diese Interpretation mit Vorsicht betrachtet werden, da ein klarer Nachweis der Redox-Produkte noch aussteht. Im Gegensatz dazu liegt ein Bericht über ein kovalent verknüpftes System mit Do- und Ak-Metallkomplexen an den entgegengesetzten Enden einer Doppelhelix mit 8 Basenpaaren vor, welches einen Elektronentransfer auf einer Zeitskala im Mikrosekundenbereich zeigt (Meade, T. J.; Kayyem, J. F. Angew. Chemie. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 352). In diesem Fall wurden die Redox-Komponenten nicht innerhalb der Helix interkaliert, so dass die Rate des Elektronentransfers einfach die er forderliche Zeit zur Orientierung des Donators und Akzeptors widerspiegeln kann, um eine ausreichende elektronische Kopplung durch den π-Elektronenstapel zu erzielen, bevor ein Elektronentransfer bei großem Abstand erfolgen kann.
Zu diesem Zeitpunkt gibt es viele ungelöste Fragen hinsichtlich der Vermittlungsfähigkeit des Elektronentransfers durch die DNA-Doppelhelix. Keines der oben zitierten Systeme hat eindeutig eine Effizienzrate beim Elektronentransfer zwischen Donator- und Akzeptor-Komponenten, die in einem fixierten Trennabstand in einem DNA/DNA-Duplex gehalten werden, demonstriert.
In einer für den Nachweis der Hybridisation von Nukleinsäuren in homogener Lösung entworfenen Modifikation beschreiben Tyagi und Kramer (Tyagi, S.; Kramer, F. R. Nature Biotechnology 1996, 14, 303) ein doppelt substituiertes einzelsträngiges DNA-Konstrukt, das eine Stamm-Schleife(d. h. Haarnadel)-Struktur aufweist. Das Konstrukt enthält eine kovalent an eine Endigung des Strangs gebundene fluoreszierende Komponente und einen Energietransfer-Quencher der fluoreszierenden Komponente an der entgegengesetzten Endigung. Im unkonjugierten Zustand liegt diese einzelsträngige Kette hauptsächlich in Haarnadel-Konformation vor, welche die fluoreszierende und löschende Komponente auf einen relativ dichten Abstand zueinander beschränkt. In dieser strukturellen Form führt die Anregung der fluoreszierenden Komponente mit Actinlicht zu einer verminderten Emission, da der fluoreszierende angeregte Zustand seine Energie auf den nahegelegenen Quencher überträgt. Hybridisiert diese einzelsträngige Struktur allerdings mit einem zu ihrer Schleifenregion komplementären zweiten Strang, so ist der Abstand zwischen der fluoreszierenden und der löschenden Komponente erhöht, weshalb die Fluoreszenzeffizienz zunimmt. Die Veränderung der Fluoreszenzintensität ist ein Indikator dafür, dass die Hybridisation stattgefunden hat.
Die von Tyagi und Kramer beschriebene Modifikation bietet verschiedene Vorteile für homogene Echtzeit-Hybridisationsassays. Allerdings weist das von ihnen berichtete System auch gewisse Nachteile auf. Zunächst beruht die Anzeige der Hybridisation auf der Energietransfer-Löschung der fluoreszierenden Komponente. Dies erfordert einen Quencher mit einer geringeren Singulett-Anregungsenergie als die fluoreszierende Komponente, was zu Schwierigkeiten bei der Auswahl eines Quenchers führen kann, dessen Absorptionsspektrum nicht mit dem der fluoreszierenden Komponente überlappt. Zweitens erfordert die Natur der Haarnadelstruktur, dass ein Teil des einzelsträngigen Sondenmoleküls selbst-komplementär ist. Im allgemeinen wird dieser selbst-komplementäre Abschnitt nicht mit dem Zielstrang der zu bestimmenden Nukleinsäure hybridisieren. Diese Anforderung setzt die Assoziationskonstante der Hybrid-DNA-Doppelhelix herab. Ein weiterer Nachteil der von Tyagi und Kramer beschriebenen Modifikation ist der, dass eine kovalente Knüpfung der fluoreszierenden Komponente und des Quenchers an die terminalen Positionen der einzelsträngigen DNA-Sonde mühsam zu synthetisieren und alles andere als ideal für einen Assay ist. Die zur Bindung der fluoreszierenden Komponente und Donators an die einzelsträngige DNA verwendete lange Kette von Atomen ist flexibel, weshalb folglich die fluoreszierende Komponente und der Quencher in vielen Konformationen vorliegen wird, sogar in der Stamm-Schleifen-Struktur, von denen einige beim Löschen der Emission der fluoreszierenden Komponente ineffizient sein können. Dies wird zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz bei Hybridisationsassays beitragen. Schließlich ist ein weiterer Nachteil der kovalenten Bindung der fluoreszierenden Komponente und des Quenchers an den terminalen Positionen der, dass ein Auftrennen der Stammstruktur an diesen Positionen, welches häufig zu erwarten steht, den Abstand zwischen der fluoreszierenden Komponente und dem Quencher vergrößern und die Zahl der verfügbaren Konformationen erhöhen wird. Beide Effekte werden zu einem Anstieg der Hintergrundemission führen.
Bei einem weiteren Versuch der Modifikation von DNA berichteten Shimidzu und Mitarbeiter von der Synthese und Charakterisierung eines modifizierten DNA-Oligomers, das eine Acridin-Komponente in kovalenter Bindung an eine interne Position enthält (Fukui, K.; Morimoto, M; Segawa, H.; Tanaka, K.; Shimidzu, T. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 349). Die Hybridisation mit einem komplementären Oligomer, das entweder eine Thymin- oder eine abasische Stelle an der geeigneten Position gegenüber dem Acridin enthält, ergibt einen 1 : 1-Duplex, bei dem das Acridin offensichtlich innerhalb der Helix interkaliert ist. Ein Elektronentransfer zur Acridin-Komponente wurde nicht berichtet.
In WO 95/15971 ist die Konjugation von Oligonukleotiden mit Interkalatoren beschrieben, die als Elektronendonatoren oder Elektronenakzeptoren dienen können. Die resultierenden Komplexe repräsentieren eine Reihe von Derivaten, die bimolekulare Tem platen sind, deren Verwendung als Sondenmoleküle auf Duplex-DNA beruht, um einen Weg für den Transfer von Elektronen über sehr große Distanzen bei extrem schnellen Raten zu schaffen. In dieser Rolle wird der DNA-Duplex als ein "Bioconductor" beschrieben und muss als solcher fungieren. In WO 95/15971 findet sich eine Beschreibung eines Verfahrens, bei dem Oligonukleotide an jedem Ende mit verschiedenen Elektronentransfer-Komponenten markiert sind, und worin gezeigt wird, dass diese Komponenten zum Elektronentransfer durch den Duplex unter bestimmten Bedingungen fähig sind. Diese Elektronentransfer-Komponenten stellen Komplexe aus Ruthenium und anderen Schwermetallionen mit organischen Liganden dar, die den elektronischen Zustand während des Elektronentransfers verändern können. Weiterhin findet sich in WO 95/15971 der Vorschlag, dass die Phosphodiester-Bindungen in einem Oligonukleotid durch Peptidbindungen ersetzt werden können, folglich also peptidische Nukleinsäuren (PNA) als Bioconductoren eingesetzt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure in einer Probe, welches das Binden einer Sonde mit einem polymeren Grundgerüst umfasst, das verschieden vom natürlichen Zuckerphosphat-Grundgerüst der DNA oder RNA ist, an die Nukleinsäure über eine Basen-vermittelte Wasserstoffbindung, wobei diese Sonde einen Elektronenakzeptor oder einen Elektronendonator oder beides in kovalenter Bindung an interne Positionen des Sondenmoleküls aufweist. Weiterhin ruft die Stimulierung des Elektronendonators oder Elektronenakzeptors mittels einer von mehreren Methoden ein unterschiedliches Ergebnis in Abhängigkeit davon hervor, ob das Sondenmolekül an die Nukleinsäure gebunden ist. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Induzieren eines Elektronen- oder Ladungslöchertransfers von einem Elektronendonator zu dem Elektronenakzeptor oder einen Ladungslöchertransfer von dem Elektronenakzeptor zu einem Elektronendonator und das Bestimmen des Erfolgens des Elektronentransfers als einem Maß der Nukleinsäure bereit. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum zuverlässigen Nachweis des Elektronen- oder Ladungslöchertransfers.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Modifikation der Effizienz oder Rate des Elektronen-(Ladungslöcher)-Transfers in Bioisolatoren und Bioconductoren.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Kontrollieren der Rate und Effizienz des Elektronen-(Ladungslöcher)-Transfers bei hoher Spezifität zur Anzeige der Duplexbildung.
Nach diesem Stand der Technik ist für einen Fachmann des Gebiets nicht ersichtlich, dass DNA/DNA-, DNA/PNA- und PNA/PNA-Hybride Bioconductoren unter allen Bedingungen der Antriebskräfte und Zeitskalen des Elektronentransfers sein werden. Insbesondere muss die Elektronenleitung (Elektronentransfer oder Ladungslöchertransfer) von einem elektronisch angeregten Zustand, oder einer anderen Elektronendonator- oder Elektronenakzeptor-Art, die keine im wesentlichen unendliche Lebensdauer aufweist, mit dem Zurückkehren des elektronisch angeregten Zustands zu seinem Grundzustand, oder dem Verbrauch auf irgendeine andere Weise des Elektronendonators oder -akzeptors mit einer begrenzten Lebensdauer, konkurrieren. Erfolgt die Weiterleitung eines Elektrons durch einen DNA/DNA-, DNA/PNA- und PNA/PNA-Duplex auf einer längeren Zeitskala als die Rückkehr vom angeregten Zustand zum Grundzustand oder dem Verbrauch des Elektronendonators oder -akzeptors, so wird der DNA/DNA-, DNA/PNA- und PNA/PNA-Duplex agieren, als ob er ein "Bioisolator" anstelle eines Bioconductors sei.
Die molekularen und energetischen Merkmale, die die Rate und Effizienz der Elektronentransferreaktionen kontrollieren, wurden umfangreich untersucht. Die Marcus-Theorie des Elektronentransfers (Marcus, R. A. Ann. Rev. Phys. Chem. 1964, 15, 155. Marcus, R. A. J. Chem. Phys. 1965, 43, 679) ist in ihrer Vorhersage der Reaktionsraten bemerkenswert erfolgreich. In ihrer einfachsten Formulierung (Gleichungen 1 und 2) identifiziert die Theorie drei Faktoren, die die Ratenkonstante für den Elektronentransfer (k_et) bestimmen. Diese stellen die Antriebskraft (ΔG_et) für die Reaktion, die Reorganisationsenergie (λ) und die maximale Ratenkonstante (k_max) dar, die auftreten, wenn ΔG^≠ = 0. In der klassischen Theorie ist k_max = k_elν_n, wobei k_el der elektronische Transmissionskoeffizient und ν_n die Häufigkeit des Durchgangs durch den Übergangszustand ist. ket = kmax·exp(–ΔG≠/RT) (1)
Von höchster Relevanz für die vorliegende Erfindung ist die Bestimmung der k_et und ihr Vergleich mit chemischen oder physikalischen Reaktionen, die den elektronisch angeregten Zustand, oder die andere Elektronendonator- oder Elektronenakzeptor-Arten, die keine im wesentlichen unendliche Lebensdauer aufweisen, verbrauchen. Ist die Rate des Elektronentransfers vom Donator zum Akzeptor größer als die Raten der konkurrierenden chemischen oder physikalischen Reaktionen, so wird der Elektronentransfer effizienter sein. Die Bildung eines Komplexes zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Nukleinsäure kann die Größe von k_et und/oder die Größe der Raten der chemischen oder physikalischen Reaktionen, die den elektronisch angeregten Zustand, oder die andere Elektronendonator- oder Elektronenakzeptor-Art, die keine im wesentlichen unendliche Lebensdauer aufweist, verändern. Die Bildung des Komplexes zwischen dem Sondenmolekül und der zu bestimmenden Nukleinsäure kann ΔG_et modifizieren, so dass die Rate des Elektronentransfers auf die Komplexbildung hin zunimmt oder abnimmt. Alternativ kann die Komplexbildung Veränderungen in der Umgebung des Elektronendonators oder Elektronenakzeptors bewirken, so dass sich die Rate der chemischen oder physikalischen Reaktionen, die den elektronisch angeregten Zustand, oder die andere Elektronendonator- oder Elektronenakzeptor-Art, die keine im wesentlichen unendliche Lebensdauer aufweist, verbrauchen, relativ zur Rate der Elektronentransferreaktion verändert. Ausgehend von der Marcus-Theorie bewirkt die Bildung des Komplexes zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Nukleinsäure eine Veränderung in der Marcus-Reorganisationsenergie für den Elektronentransfer oder eine Veränderung in der Marcus-k_max. Eine Veränderung bei jedem der Parameter kann zu einem Anstieg oder einer Abnahme der Rate des Elektronentransfers führen. In dem Fall, bei dem die Bildung des Komplexes zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Nukleinsäure zu einem Anstieg der k_et führt, kann der resultierende Komplex als ein Bioconductor bezeichnet werden, da er den Elektronentransfer erleichtert. Es stellt eine überraschende Entdeckung dar, dass, in Abhängigkeit von einigen spezifischen Einzel heiten der Struktur, die Bildung des Komplexes zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Nukleinsäure eine Abnahme der Ratenkonstante für den Elektronentransfer im Komplex ergibt. Daher kann in einigen Fällen der durch das Sondenmolekül und die zu bestimmende Nukleinsäure gebildete Komplex ein "Bioisolator" sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt schematisch den Elektronentransfer-(ET)-Mechanismus bei langer Distanz der vorliegenden Erfindung. Das Konzept wird durch das Beispiel veranschaulicht, bei dem der Donator und Akzeptor auf demselben Strang lokalisiert sind. Die Bezeichnungen n und m beziehen sich auf die elektronischen Zustände des Donators und des Akzeptors.
2 zeigt eine erste Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung lediglich eines Sondenmoleküls, das mit einem entfernt positionierten Elektronendonator (Donator) und einem intern positionierten Akzeptor (Akz.) markiert ist.
3 zeigt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der zwei markierte Sonden verwendet werden. Dabei enthält eine Sonde den Akzeptor (entfernt lokalisiert), und die andere Sonde enthält den Donator (entfernt lokalisiert).
4 zeigt ein Format unter Verwendung einer immobilisierten Sonde, die einen intern positionierten Akzeptor und Donator in derselben Sonde enthält.
5 zeigt den vorgeschlagenen Elektronentransfer-Mechanismus durch Ladungslöcher-Hopping.
6 zeigt ein Format unter Verwendung einer Haarnadel-bildenden Sonde.
7 zeigt eine Ausführungsform unter Verwendung zweier komplementärer Sonden.
8 zeigt das Flussdiagramm für die Herstellung von Q1, einem Elektronen-akzeptierenden PNA-Monomer (Linkerlänge 1).
9 zeigt das Flussdiagramm für die Herstellung von Q2, einem Elektronen-akzeptierenden PNA-Monomer (Linkerlänge 4).
10 zeigt das Flussdiagramm für die Herstellung von R1, einem Elektronen-spendenden PNA-Monomer (Linkerlänge 4).
11 zeigt das Flussdiagramm für die Herstellung von R2, einem Elektronen-spendenden PNA-Monomer (Linkerlänge 7).
12 zeigt die Extinktions/Temperatur-Profile für PNA/DNA-Hybride mit verschiedenen Chinon/Linkerlängen für unterschiedliche Wellenlängen. AQ₂ steht für PNA579 und A₃ für PNA586.
13 zeigt die photoinduzierte Spaltung von DNA mit PNA/DNA-Hybriden.
14 zeigt die photoinduzierte Spaltung von DNA mit einer 8-OxoG-Stelle.
15 zeigt die Phosphoreszenzlöschung in PNA/DNA-Hybriden aufgrund des Elektronentransfers.
16 zeigt die Extinktions/Temperatur-Profile für PNA626- und 627-Haarnadeln.
17 zeigt die Extinktions/Temperatur-Profile für DNA626A-Hybride mit PNA626 und PNA627.
18 zeigt schematisch die Synthese eines weiteren PNA-Elektronendonator-Monomers.
Ausführliche Beschreibung
Der Begriff zu bestimmenden Nukleinsäure ist in der vorliegenden Erfindung als eine Analyt-Nukleinsäure oder eine davon abgeleitete Nukleinsäure zu verstehen. Zu Analyt-Nukleinsäuren zählen Nukleinsäuren eines beliebigen Ursprungs, zum Beispiel Nukleinsäuren eines tierischen, menschlichen, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sie können in Lösung, Suspension, doch auch fixiert an Festkörper oder enthalten in zellhaltigen Medien, Zellabstrichen, fixierten Zellen, Geweben oder fixierten Organismen vorhanden sein. Davon abgeleitete Nukleinsäuren stellen Nukleinsäuren dar, die aus Analyt-Nukleinsäuren oder Teilen davon hergestellt sind, zum Beispiel als Kopien der oben genannten Nukleinsäuren oder von Teilen davon. Zu diesen Kopien zählen Nukleinsäuren, die von jenen ursprünglichen Analyt-Nukleinsäuren durch Amplifikation, einschließlich jeglicher Replikations- und/oder Transkriptions/reversen Transkriptionsreaktionen, z. B. durch die Polymerase-Kettenreaktion, abgeleitet sind.
Gewöhnlich wird die zu bestimmende Nukleinsäure vorbehandelt, um in einen zur Bindung des Sondenmoleküls bereiten Zustand versetzt zu werden, sofern dieses nicht bereits zugänglich ist. Eine solche Vorbehandlung kann das Denaturieren doppelsträngiger Nukleinsäuren durch Verändern des pH-Werts in den alkalischen Bereich, Wiederholen extremer Temperaturschwankungen (Gefrieren/Auftauen), Verändern der phy siologischen Sondenbedingungen (osmotischer Druck), Lysieren der Zellwände durch Detergenzien, chaotrope Salze oder Enzyme (z. B. Proteasen, Lipase) umfassen. Diese Schritte können entweder einzeln oder in Kombination angewendet werden, um die Nukleinsäuren freizusetzen. In einigen Fällen kann es von Vorteil sein, die Nukleinsäuren von anderen Komponenten in der Probe zu trennen, wie etwa Proteinen, Zellen, Zellfragmenten, doch auch von Nukleinsäuren, die nicht nachgewiesen werden sollen.
Die Bindung des Sondenmoleküls an die Nukleinsäure ist so definiert, dass es ein polymeres Grundgerüst, das von dem Grundgerüst des natürlichen Zuckerphosphats verschieden ist, aufweist. Beispiele solcher Sondenmoleküle sind heutzutage im Fachgebiet wohlbekannt. Diese Sonden können auf monomeren Untereinheiten basieren, die in sich wiederholender Weise verknüpft sind. Bevorzugt enthält das Sondenmolekül mindestens fünf monomere Untereinheiten, wobei jede monomere Untereinheit mit anderen monomeren Untereinheiten durch Peptidbindungen verbunden ist. Die Peptidbindung wird als eine Bindung verstanden, die ein primäres oder sekundäres Amin und einen Carbonsäure-Rest verbindet. Andere Arten von Verknüpfungen innerhalb der Monomere oder Verbindungen von ein oder mehreren Monomeren im Grundgerüst sind möglich, wie z. B. bei Ether- oder Aminobindungen. Beispiele solcher Sondenmoleküle sind beschrieben in WO 92/20702, einschließlich Sondenmolekülen mit Liganden, die an Aza-Stickstoffatome gebunden sind, WO 94/25477 und WO 96/20212. Sondenmoleküle mit gemischten unterschiedlichen Verknüpfungen zwischen den Monomeren sind beschrieben in EP-A-0 672 677. Der Begriff Sondenmolekül umfasst außerdem Moleküle mit der obigen Strecke des nicht-natürlichen Grundgerüsts und einer zusätzlichen Strecke aus dem natürlichen Zuckerphosphat-Grundgerüst. Solche Chimären können eine etwas geringere Affinität zu komplementären Nukleinsäuren zeigen, sind aber nichtsdestotrotz für die vorliegende Erfindung nützlich.
Der Begriff Grundgerüst in der vorliegenden Erfindung soll die polymere Komponente bezeichnen, an die an verschiedenen Anknüpfungspunkten heterocyclische Basenkomponenten in einer konsekutiven Weise gebunden sind.
Die Bindung des Sondenmoleküls an die Nukleinsäure wird durch Wasserstoffbindungen erreicht, die durch Basenkomponenten am Grundgerüst vermittelt werden. Eine solche Wasserstoffbindung tritt beispielsweise zwischen komplementären Nukleobasen, wie z. B. bei der Basenpaarung in Nukleinsäuren, die das natürliche Zuckerphosphat-Grundgerüst oder künstliche Basen, die ähnliche Eigenschaften für die Wasserstoffbindung wie die natürlichen Basen schaffen, aufweisen. Während die hervorstechendste Bindungsform in der Duplexbildung besteht, binden einige Moleküle an Nukleinsäuren durch Triplexbildung (siehe zum Beispiel WO 95/01370). Zu künstlichen Basen zählen Diaminopurin, Pseudouridin, Thioguanin und 7-Deazaguanin. Die Methode der Erfindung erfordert eine Strecke von mindestens fünf aufeinanderfolgenden monomeren Einheiten, mit denen die Basen des Sondenmoleküls gekoppelt werden. Das Sondenmolekül sollte eine Länge von mindestens 9 basenpaarenden Monomereinheiten, vorzugsweise 9 bis 30, und am bevorzugtesten 10 bis 25 basenpaarenden Monomereinheiten aufweisen.
Diese Sondenmoleküle können analog den Verfahren hergestellt werden, die in den oben genannten Dokumenten beschrieben sind. Ihre Präparierung kann Techniken beinhalten, wie sie gewöhnlich in der Peptidchemie angewendet werden. Allerdings zählen zu den beim vorliegenden Verfahren besonders bevorzugten Sondenmolekülen neue Ausgangs- und Intermediatverbindungen, die zur Einführung jeglicher Elektronendonator- und/oder jeglicher Elektronenakzeptor-Komponenten in die Sonde nützlich sind. Ihre Präparierung wird später beschrieben werden.
Ein Elektronenakzeptor oder ein Elektronendonator oder ein Elektronenakzeptor und ein Elektronendonator werden kovalent an das Sondenmolekül an definierten, fixierten Positionen gemäß der Erfindung gebunden. Die generell möglichen Positionen zur Anknüpfung von Komponenten an polymere Grundgerüste lassen sich systematisch in eine erste Gruppe einteilen, bei der die Komponente an eines oder beide Enden des polymeren Grundgerüsts gebunden wird, eine zweite Gruppe, bei der mindestens eine der Gruppen an das polymere Grundgerüst an einer Position auf dem Grundgerüst gebunden wird, die nicht an der ersten und der letzten basentragenden monomeren Einheit des Grundgerüsts lokalisiert ist, und eine dritte Gruppe, bei der die Komponente an eine Basenposition gebunden wird, die an eine beliebige der monomeren Einheiten angeknüpft ist. Überraschenderweise werden die Aufgaben der vorliegenden Erfindung mit der zweiten Gruppe besser erfüllt. Innerhalb dieser Gruppe haben sich solche Son denmoleküle als am erfolgreichsten erwiesen, in denen die Nukleobasen-Komponente einer oder mehrerer der monomeren Untereinheiten vollständig durch eine Gruppe oder Gruppen ersetzt ist/sind, die den Elektronenakzeptor oder einen Elektronendonator enthalten, vorzugsweise in solcher Weise, dass die Rate oder Effizienz des Elektronentransfers in der Sonde durch die Nukleobasen der zu bestimmenden Nukleinsäure modifiziert wird. Nicht nur die Modifikation lediglich einer Untereinheit durch solche Komponenten ist möglich, sondern auch die mehrerer Untereinheiten, was von der Gesamtlänge des Sondenmoleküls abhängt. Als einer generellen Regel ist es jedoch bevorzugt, nicht mehr als 30% der modifizierten monomeren Einheiten gegenüber der Gesamtzahl der monomeren Einheiten im Sondenmolekül aufzunehmen. Ist mehr als eine modifizierte monomere Untereinheit innerhalb des Sondenmoleküls enthalten, so sollten diese monomeren Einheiten nicht an den äußersten monomeren Untereinheiten lokalisiert sein.
Bevorzugte Sondenmoleküle sind Verbindungen der allgemeinen Formel I
Formel I worin
n eine ganze Zahl von mindestens 3 ist,
x eine ganze Zahl von 2 bis n – 1 ist,
jedes von L¹–Lⁿ ein Ligand ist, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, (C₁-C₄)Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, aromatischen Komponenten, DNA-Interkalatoren, Nukleobasen-bindenden Gruppen, heterocyclischen Komponenten, Re porterliganden und komplexbildenden Komponenten, worin mindestens eines von L²–L^n–1 ein nicht-nukleobasischer Elektronenakzeptor oder eine Donator-Komponente und mindestens 2 von L¹–Lⁿ eine Nukleobasen-bindende Gruppe oder eine natürlich oder nicht-natürlich vorkommende Nukleobase ist;
jedes von C¹–Cⁿ ist (CR⁶R⁷)y (vorzugsweise CR⁶R⁷, CHR⁶CHR⁷ oder CR⁶R⁷CH₂), worin R⁶ Wasserstoff ist und R⁷ gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Seitenketten der natürlich vorkommenden Alpha-Aminosäuren, oder R⁶ und R⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C₁-C₆)Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxyl, (C₁-C₆)Alkoxy, (C₁-C₆)Alkylthio, NR³R⁴ und SR⁵, worin R³ und R⁴ wie nachstehend definiert sind, und R⁵ Wasserstoff, (C₁-C₆)Alkyl, Hydroxyl, (C₁-C₆)Alkoxy oder (C₁-C₆)Alkylthio-substituiertes (C₁-C₆)Alkyl ist, oder R⁶ und R⁷ zusammengenommen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen; oder C¹–Cⁿ CO, CS, CNR³ ist;
jedes von D¹–Dⁿ ist (CR⁶R⁷)_z (vorzugsweise (CR⁶R⁷, CHR⁶CHR⁷ oder CH₂CR⁶R⁷), worin R⁶ und R⁷ wie oben definiert sind;
jedes von y und z Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, wobei die Summe y + z mindestens 2 ist, vorzugsweise größer als 2, doch nicht mehr als 10 ist;
jedes von G¹–G^n–1 -NR³CO-; -NR³CS-, -NR³SO- oder -NR³SO₂-, in jeglicher Orientierung, ist, worin R³ wie nachstehend definiert ist;
jedes von A¹–Aⁿ und B¹–Bⁿ so ausgewählt ist, dass:

(a) A¹–Aⁿ eine Gruppe der Formel (I/A), (I/B), (I/C) oder (I/D) ist, und B¹–Bⁿ N oder R³N⁺ ist; oder
(b) A¹–Aⁿ eine Gruppe der Formel (I/D) ist und B¹–Bⁿ CH ist;

³

₂

₃

₂

⁴

¹

²

₁

₄

₁

₄

₁

₄

₁

₄

₁

₄

³

⁴

₁

₄

₁

₄

₁

₆

₁

₆

₂

₃

₂

₃

Alkoxy- und Alkylthiogruppen enthalten vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
Ein Beispiel einer kondensierten aromatischen Komponente ist Naphthol. Eine heterocyclische Komponente ist Pyridin. Reportergruppen sind Komponenten, die, ähnlich fluoreszierenden Komponenten, zum Beispiel Fluoreszein, nachgewiesen werden können, oder Komponenten, die durch eine andere molekulare Einheit erkannt werden können, wie Haptene, die durch einen gegen dieses Hapten gezüchteten Antikörper erkannt werden können.
In den obigen Strukturen, worin Q oder I ein Oligonukleotid oder Oligonukleosid ist, können solche Strukturen als chimäre Strukturen zwischen PNA-Verbindungen und dem Oligonukleotid oder Oligonukleosid betrachtet werden.
Linker A¹–Aⁿ zur Bindung der Akzeptor-Komponenten sind allgemein bevorzugt in einer Länge von 1 bis 10 Atomen, bevorzugter 2 bis 6 Atomen, bei Donator-Komponenten mit einer Länge von 1 bis 10, am bevorzugtesten 2 bis 8 Atomen.
Bevorzugter sind Verbindungen der Untergruppen Ia–Ib, basierend auf der allgemeinen Formel I, worin:

(Ia): B¹–Bⁿ ist N und A¹–Aⁿ ist -CO-(CH₂)₆-
(Ib): B¹–Bⁿ ist N und A¹–Aⁿ ist -CO-NR³-(CH₂)₂-
(Ic): B¹–Bⁿ ist CH und A¹–Aⁿ ist -NR³-CO-(CH₂)₂-

Bevorzugte PNA-enthaltende Verbindungen, die zum Bewirken der Bindung an RNA, ssDNA und dsDNA und zum Erhalt der Triplexstrukturen nützlich sind, sind Verbindungen der Formeln IIa, IIb und IIc:
Formel IIa
Formel IIb
Formel IIc worin:
jedes L unabhängig ausgewählt ist aus den Definitionen für L¹–Lⁿ in Formel I;
jedes R⁷ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten der natürlich vorkommenden Alpha-Aminosäuren;
n eine ganze Zahl größer 1 ist,
jedes k, l und m unabhängig Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist;
jedes p Null oder 1 ist;
R^h und Rⁱ wie für R', R'' und R''' definiert sind.
Elektronenakzeptor-Komponenten und Elektronendonator-Komponenten werden jeweils als Elektronentransfer-Komponenten bezeichnet. Diese sind am bevorzugtesten Komponenten, ausschließlich Nukleobasen (nicht-nukleobasische Komponenten).
Elektronenakzeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung können die Oxidation anderer Komponenten hervorrufen, indem sie ein Elektron aus ihrer Umgebung anziehen, insbesondere nachdem sie mit Licht stimuliert oder auf irgendeine andere Weise aktiviert worden sind. Elektronenakzeptoren sind typischerweise Elektronen-defiziente Arten. Bevorzugte Elektronenakzeptoren sind organische Moleküle. Weiterhin weisen diese organischen Moleküle eine generell flache Struktur mit einem System von delokalisierten π-Elektronen auf. Daher sind organische Moleküle besonders bevorzugt, die aromatische Kohlenwasserstoff-Komponenten enthalten, umfassend funktionelle Gruppen, worin die funktionellen Gruppen Elektronen-entziehende Eigenschaften aufweisen können. Es ist möglich, dass der Elektronenakzeptor sowohl Elektronen-spendende als auch Elektronen-entziehende funktionelle Gruppen enthält. Die Substituenten sollten nicht so massig sein, dass sie die regelmäßige Basenstapelung zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Nukleinsäure stören. Die Elektronendefizienz des Elektronenakzeptors wird normalerweise durch Anregung mit Licht oder durch Stimulation mittels einer anderen Methode erhöht. Im bevorzugten Falle findet kein messbarer Elektronentransfer zum Akzeptor ohne seine Stimulierung im Assay-Medium statt. Die Akzeptor-Komponente wird typischerweise wohlcharakterisierte Redox- und spektroskopische Eigenschaften aufweisen, obschon keine exakte Kenntnis dieser Parameter zur erfolgreichen Anwendung dieser Erfindung erforderlich ist. Die bei dieser Erfindung nützlichen Elektronenakzeptoren vollziehen typischerweise eine Veränderung hinsichtlich ihrer chemischen oder optischen Eigenschaften, wenn sie ein Elektron annehmen. Zum Beispiel können solche Elektronenakzeptoren bei dieser Erfindung nützlich sein, wenn sie, nach Umwandlung durch Elektronenanziehung zu einem radikalen Anion oder einem anderen Elektronenreduktionsprodukt, ein einzigartiges optisches Spektrum mit starken Absorptionsbanden aufweisen. Allerdings ist der Nachweis der Veränderung der chemischen oder optischen Eigenschaften des Elektronenakzeptors für die erfolgreiche Anwendung dieser Erfindung nicht erforderlich.
Diese Akzeptor-Komponenten setzen sich typischerweise aus ein bis 10, bevorzugt 1 bis 4, kondensierten cyclischen Kohlenwasserstoffringen zusammen, die substituiert oder unsubstituiert sein können. Die cyclischen Kohlenwasserstoffe können unabhängig voneinander eine beliebige Ringgröße im Bereich von 5- bis 10-gliedrigen Ringen aufweisen, doch enthalten vorzugsweise 5- oder 6-gliedrige aromatische Ringe. Die cyclischen Kohlenwasserstoffe können in einem beliebig positionierten Isomer kondensiert sein.
Vorzugsweise enthält die Akzeptor- oder die Donator-Komponente eine Gruppe der allgemeinen Formel IIIa oder IIIb
worin X, Y, Z, Q, V und W unabhängig ausgewählt sind aus den Atomen C, N, S und O; X, Y, Z, Q, V und W durch entweder Einzel- oder Doppelbindungen miteinander verbunden sind; R₁–R₆ werden unabhängig ausgewählt aus der Gruppe von -H, -O^–, -OH, -OR', -SH, -SR', -NH₂, NO₂, -SO₃ ^–, -SO₂ ^–, -CN, -PO₃ ^2–, -PO₂ ^–, --COOH, -CO-R', -COOR', -CS-R', CSO-R', -COO^–, -N=N-, Halogen (-F, -Cl, -Br, -I), -NHR', N(R'R''), Hydrocarbyl und Heterozyklus. R' und R'' werden unabhängig ausgewählt aus derselben Gruppe wie R₁–R₆. Zumindest eines von X, Y, Z, Q, V und W kann zusammen mit einem von R₁–R₆ auch -CO-, -SO- oder -SO₂- sein. Zumindest eines von R¹–R⁶ kann auch durch eine Einzel- oder eine Doppelbindung gebunden sein.
Hydrocarbyl umfasst Gruppen wie Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, von denen jede jeweils 1 bis 10 Kohlenstoff-(C)-Atome aufweist, Aryl mit 6–30 C-Atomen, wie z. B. Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Tolyl, Anthracenyl etc., und Kombinationen von diesen in verschiedenen Substitutionsmustern. Diese Hydrocarbylgruppen können geradkettig oder verzweigtkettig, symmetrisch oder asymmetrisch, chiral oder achiral sein, ein oder mehrere Heteroatome enthalten, gewählt aus -N-, -NH-, -S-, -O-, und können auch kondensiert sein. Die Hydrocarbylgruppen können unsubstituiert oder durch ein oder mehrere der oben genannten R¹–R⁶ substituiert sein.
Heterocyclyl wird vorzugsweise ausgewählt aus cyclischen aromatischen oder nicht-aromatischen Komponenten, die Heteroatome enthalten, gewählt aus -N-, -NH-, -S- und -O-, vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pyridyl, Imidazolyl, Pyrimidinyl, Pyradazinolyl, Chinolyl, Acridinolyl, Pyrrolyl, Furyl, Thienyl, Isoxazolyl, Oxazolyl und Thiazolyl. Die Heterocyclylgruppen können wahlweise durch ein oder mehrere der oben erwähnten R¹–R⁶ substituiert sein.
Zumindest eine der Komponenten R¹–R⁶ ist so modifiziert, dass sie zum Binden an das Grundgerüst der Sonde fähig ist. Vorzugsweise ist der Elektronenakzeptor über eine freie Sigma-Bindung an eine der Komponenten des Grundgerüsts gebunden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist gemeint, dass die Akzeptor-Komponente als der Komponente definiert ist, die in der Lage und reaktionsfähig zur Aufnahme des Elektrons ist. Jegliche Komponente zwischen dem Grundgerüst und dem Akzeptor ist als ein Linker A definiert.
Bevorzugter kann der Elektronenakzeptor oder Donator eine Gruppe enthalten, ausgewählt aus der Klasse der Imide. Imide können sowohl als Akzeptoren als auch Donatoren agieren. Diese Verbindungen enthalten die essentielle -(C=O)-N(R)-(C=O)- Einheit, wobei die Carbonyle in einer Kohlenwasserstoff-Ringstruktur platziert sind, die an ein aromatisches Ringsystem über eine Konjugation der Carbonyle gebunden ist. Das Imid ist in einem Kohlenwasserstoffring enthalten, welcher 5, 6, 7, 9-gliedrig sein kann, doch vorzugsweise ein 5- oder 6-gliedriger Ring ist. Der Akzeptor/Donator kann 1–10 Imide enthalten, die über das aromatische System verknüpft sind. Ein Akzeptor/Donator kann Imide derselben Ringgröße enthalten oder kann Imide von unterschiedlichen Ringgrößen enthalten. Die aromatische Struktur umfasst 1–10 kondensierte cyclische aromatische Kohlenwasserstoffe und ist wahlweise mit den Substituenten (R) substituiert. Die cyclischen Kohlenwasserstoffe können gebunden/kondensiert in einem beliebigen Positionsisomer sein. Die cyclischen Kohlenwasserstoffe können unabhängig voneinander von jeglicher Ringgröße (5, 6, 10, 14-gliedrige Ringe) sein, sind aber vorzugsweise 5, 6-gliedrige aromatische Ringe, die unabhängig voneinander ein oder mehrere Heteroatome enthalten können, gewählt aus -N-, -NH, -S- und -O-.
Bevorzuge Imide umfassen Gruppen der allgemeinen Formeln IVa–IVe.
worin die Definitionen für R gewählt sind aus den möglichen Definitionen für R¹–R⁶ der allgemeinen Formeln IIIa und IIIb und worin n und m 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind und k, r und l 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 sind. Es ist klar, dass lediglich so viele Substituenten R gebunden sind, dass die Valenz und Ladung des Atoms der Bindung des Substituenten R nicht verändert wird.
Eine weitere bevorzugte Komponente wird gewählt aus der Gruppe der n-Alkyl-Aza-aromatischen Verbindungen. N-Alkyl-Aza-Aromaten können sowohl als Akzeptoren als auch als Donatoren agieren (Formeln Va–d, vide infra). Bei diesen Verbindungen sind die Stickstoffatome in den aromatischen Ringen alkyliert. Dies bildet positiv geladene Moleküle. Die aromatischen Ringe, an denen die Aza-Atome lokalisiert sind, können 5, 6, 10, 14-gliedrige Ringe sein, sind aber vorzugsweise 5- und 6-gliedrige Ringe. Der Akzeptor/Donator kann 1 bis 10 alkylierte cyclische Stickstoffatome enthalten, die in ein aromatisches System von 1 bis 10 kondensierten aromatischen Ringen platziert sind.
Das kondensierte cyclische Kohlenwasserstoffsystem kann sich aus 5, 6, 10, 14-gliedrigen aromatischen Ringen, vorzugsweise aber 5- und 6-gliedrigen Ringen, zusammensetzen, die unabhängig voneinander ein oder mehrere Heteroatome umfassen, gewählt aus -N-, -N, -S- und -O-. Der Akzeptor kann sich aus alkylierten cyclischen Stickstoffatomen derselben Ringgröße und/oder unterschiedlicher Ringgröße zusammensetzen. Die aromatischen Kohlenwasserstoffe, die die alkylierten cyclischen Stick stoffatome tragen und/oder der kondensierte aromatische Ring, der die alkylierten Stickstoffatome nicht trägt, sind vorzugsweise substituierte (R).
Innerhalb dieser Gruppe befinden sich Verbindungen der allgemeinen Formeln Va–Vd
worin die Definitionen der Substituenten der Formel IV gelten und worin r 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
Bevorzugt als Akzeptoren sind Verbindungen, die eine chinoide Struktur enthalten. Diese Verbindungen sind einem Fachmann des Gebiets wohlbekannt. Die bei dieser Erfindung besonders nützlichen Chinone setzen sich aus mindestens zwei konjugierten Carbonylgruppen (wahlweise Thiono oder Azo) zusammen, die in denselben oder in separaten Ringen platziert sind, welche mit 1–10 cyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen kondensiert und wahlweise mit den Substituenten (R¹–R⁶) substituiert sind und 2–20 konjugierte Carbonylgruppen in Paaren aufweisen, vorausgesetzt, dass die Zahl der konjugierten Carbonylgruppen das Doppelte der Zahl der kondensierten cyclischen Kohlenwasserstoffe nicht übersteigt. Die cyclischen Kohlenwasserstoffe können in einem beliebigen Positionsisomer kondensiert sein. Die cyclischen Kohlenwasserstoffe können unabhängig voneinander von jeglicher Ringgröße sein, sind aber vorzugsweise 5, 6 Kohlenstoffatome enthaltende aromatische Ringe, die unabhängig voneinander ein oder mehrere Heteroatome enthalten können, gewählt aus -N-, -NH, -S- und -O-. Die konjugierten Carbonylgruppen können in einem dieser Ringe lokalisiert sein, vorausgesetzt, dass die chinoide Struktur beibehalten bleibt.
Besonders bevorzugte chinoide Strukturen enthalten die allgemeinen Formeln VIa–VIc.
worin die Definitionen der Substituenten ausgewählt sind aus den Definitionen der Formeln IV und worin o und p 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind und t und q 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 sind. Bevorzugte Beispiele dieser Gruppe sind Anthrachinon und Phenanthrachinon.
Als Elektronendonatoren sind generell alle Verbindungen nützlich, die im Grundzustand oder im elektronisch angeregten Zustand oder nach Stimulierung auf irgendeine andere Weise durch einen Elektronenakzeptor durch Abgeben eines Elektrons oxidiert werden können. Bevorzugte Donatoren sind organische Moleküle. Vorzugsweise werden die Donatormoleküle so ausgewählt, dass die Elektronendefizienz, wie durch die Oxidation bewirkt, in der Folge die Veränderung einer oder mehrerer ihrer physikalischen oder chemischen Eigenschaften bewirkt, wodurch der Nachweis der Elektronendefizienz (des Oxidationsereignisses) möglich wird. Typische Donatoren sind elektronenreiche kondensierte aromatische Systeme, die funktionelle Gruppen tragen und wahlweise substituiert sind. Der Donator wird vorzugsweise eine aromatische Struktur aufweisen, die durch Elektronen-spendende Gruppen substituiert ist. Daher werden die Donatoren vorzugsweise gewählt aus den allgemeinen Formeln III bis V, worin die Substitution mit Elektronen-spendenden Gruppen verdrängt ist.
Elektronen-entziehende Gruppen oder Elektronen-anziehende Gruppen sind vorzugsweise die Gruppen NO₂, -SO₃ ^–, -SO₂ ^–, -CN, -PO₃ ^2–, -PO₂ ^–, -COOH, -CO-R', -COOR', -CS-R', CSO-R', -COO^–, Halogen (-F, -Cl, -Br, -I), wohingegen Elektronen-freisetzende Gruppen/Elektronen-spendende Gruppen vorzugsweise ausgewählt sind aus den Gruppen H, -O^–, -OH, -OR', -SH, -SR', -NH₂, -N=N-, -I, -NHR', N(R'R'').
Eine mögliche Donator-Komponente ist die natürliche Base Guanin und deren Derivate. Es wurde bei der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass Guanin einen effektiven Donator darstellt, indem es eine chemisch reaktive Spezies bildet.
1 zeigt schematisch eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Der Sondenstrang enthält eine Donator-Komponente D mit n Elektronen und einen Elektronenakzeptor A mit m Elektronen in kovalenter Bindung. Auf die Induktion des Elektronentransfers (ET) hin wird ein Elektron von der Donator-Komponente auf die Akzeptor-Komponente übertragen, wodurch die Zahl der Elektronen in jeder Komponente verändert wird.
Zwar wollen die Anmelder nicht an diese Hypothese gebunden werden, doch scheint es, dass die Verwendung der Nukleinsäure-Analoga eine sehr selektive Kontrolle der Rate oder der Effizienz des Elektronen- und Ladungslöchertransfers zwischen einem Donator und einem Akzeptor durch Modifikation des Abstands oder der Effizienz des Elektronen- oder Ladungslöchertransports durch den π-Elektronenstapel der DNA oder des Nukleinsäure-Analogons, wenn an einen komplementären Nukleinsäure-Strang gebunden, erlaubt. Die Orientierung innerhalb solch eines Komplexes wird als so starr erachtet, dass der Donator (Akzeptor) nach der Anregung, oder Stimulierung auf irgendeine Weise, ein Elektron (Ladungsloch) von einem nahegelegenen Akzeptor (Donator) oder einer Nukleinsäure-Base spenden (anziehen) kann. Die Base, von der das Elektron oder Ladungsloch herkommt, ist nun oxidiert oder reduziert und kann eine positive oder negative Ladung tragen. Der Akzeptor ist folglich negativ geladen. Fehlt einer chemischen Komponente (hierin einer Nukleobase) ein Elektron, so wird ein "Elektronenloch" (oder nur Loch) im Molekül geschaffen. Das Elektronenloch in der ersten Base kann dann durch Transfer eines Elektrons von einer anderen Base aufgefüllt werden (siehe 5), welcher Vorgang als Loch-Hopping bezeichnet wird. Durch mehrere solcher Loch-Hoppings ergibt die Anregung des Akzeptors und die anschließenden Elektronentransfers die Oxidation einer entfernten Position im Bindungsprodukt (z. B. einem Hybrid zwischen dem Nukleinsäure-Analogon und der zu bestimmenden Nukleinsäure). Der Elektronentransfer kann sich in dem Strang fortpflanzen, in dem er ausgelöst wurde, doch kann sich auch im entgegengesetzten Strang fortpflanzen. Die Rate oder Effizienz des Elektronen- oder Loch-Hoppings hängt von seiner Zeitskala und der Zeitskala der chemischen oder physikalischen Vorgänge ab, die um den Verbrauch des angeregten oder stimulierten Elektronendonators oder -akzeptors konkurrieren.
5 zeigt schematisch den Vorgang des Loch-Hoppings, wie durch Bestrahlen bei 350 nm für eine Peptid-Nukleinsäure (unterer Strang), die einen Elektronenakzeptor aufweist, beispielhaft dargestellt als Q innerhalb der Sequenz, der eine Base ersetzt, und eine Nukleinsäure (oberer Strang), die die Basen B aufweist, die komplementär zu den Basen der Peptid-Nukleinsäuren sind, eingeleitet. Der Elektronentransfer schafft eine positiv geladene Base an der Nukleinsäure (B⁺) durch Loch-Hopping. Diese positive Ladung wird vorzugsweise auf die 5'-terminale Base einer GG-Sequenz übertragen, was schließlich die chemische Zerstörung dieser Base bewirkt. Auf die Behandlung mit Piperidin hin wird die Verknüpfung zwischen der zerstörten Base und dem Nukleinsäure-Grundgerüst gespalten. Die Freisetzung der Base erlaubt dann das Aufspalten des Analyt-Grundgerüsts, was zur Bildung kleinerer Fragment-Moleküle führt, die durch elektrophoretische oder chromatographische Techniken ohne weiteres nachgewiesen werden können. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Anwendung dieses Elektronentransfers von einem Elektronendonator auf dem Analyt zu einem Elektronenakzeptor, der kovalent an das Sondenmolekül geknüpft ist, und der anschließenden Spaltung des Analyts, um die Hybridisation nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der Tatsache, dass dieser Elektronentransfer lediglich dann möglich ist, wenn dieser Komplex zwischen der zu bestimmenden Nukleinsäure und dem Nukleinsäure-Analogon gebildet ist, da einzelsträngige PNA-Sonden mit Analyt-Nukleinsäuren durch Elektronentransfer entweder überhaupt nicht oder bei einer wesentlich geringeren Rate reagiert, wenn die beiden Stränge nicht hybridisiert sind. Die Rate oder Effizienz des Elektronentransfers ist bei Komplexen mit einer internen Fehlpaarung wesentlich vermindert. Bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass der Elektronentransfer nicht reversibel ist.
Die Probe, die die zu bestimmende Nukleinsäure enthält, wird mit dem Sondenmolekül zusammengebracht, um den Komplex zwischen jenem Sondenmolekül und der zu bestimmenden Nukleinsäure zu schaffen. Dieser Komplex bildet sich über Basen-vermittelte Wasserstoffbindung. Peptid-Nukleinsäuren als Sondenmoleküle weisen den Vorteil auf, dass sie in einen Strang doppelsträngiger Nukleinsäuren einbrechen können. Daher ist es nicht einmal erforderlich, doppelsträngige Nukleinsäuren vor Zuführung des Sondenmoleküls in Einzelstränge zu trennen. Die Bindung des Sondenmoleküls an die Nukleinsäure wird gemäß den Fachleuten des Gebiets bekannten Bedingungen erreicht. Solche Bedingungen sind für Peptid-Nukleinsäuren gut beschrieben, z. B. in WO 92/20703, worauf in dieser Hinsicht Bezug genommen wird. Da in vielen Fällen die Menge an Nukleinsäuren in der Probe nicht erkennbar ist, mag es vorzuziehen sein, das Sondenmolekül in einer Menge zu wählen, die die höchste erwartete Menge an Nukleinsäuren in der Probe übersteigt. Um allerdings einen geringen Grad an Hintergrundsignal aufrechtzuerhalten, mag es ratsam sein, die Menge an Sondenmolekülen in der Größenordnung der zu erwartenden Nukleinsäure zu wählen. Wie in WO 95/15971 beschrieben, gibt es mehrere Möglichkeiten, das Vorhandensein jeglicher Nukleinsäure zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung erfordert jedoch, dass zumindest ein Sondenmolekül durch eine Elektronendonator-Komponente oder eine Elektronenakzeptor-Komponente oder beides markiert ist. Die prinzipielle Regel ist, dass innerhalb des Komplexes, der die zu bestimmende Nukleinsäure und das Sondenmolekül enthält, es zumindest eine Elektronendonator- und zumindest eine Elektronenakzeptor-Komponente gibt. Während eines von Elektronendonator- und Elektronenakzeptor-Komponente kovalent an das Sondenmolekül gebunden sein muss, kann mindestens eine der anderen Arten der Elektronentransfer-Komponenten entweder innerhalb desselben Sondenmoleküls, der zu bestimmenden Nukleinsäure oder einem anderen Sondenmolekül lokalisiert sein. Dieses andere Sondenmolekül kann entweder ein natürlich Zuckerphosphat-Grundgerüst oder ein nicht-natürliches Nukleinsäure-Analogon-Grundgerüst aufweisen, wohingegen die zu bestimmende Nukleinsäure vorzugsweise das natürliche Zuckerphosphat-Grundgerüst aufweist.
Bei einer ersten Ausführungsform wird ein Komplex aus einem Sondenmolekül eines Nukleinsäure-Analogons mit einer Elektronenakzeptor-Komponente, die an einer internen Grundgerüstposition gebunden ist, der zu bestimmenden Nukleinsäure oder einer Nukleinsäure, die das Produkt eines Amplifikationsprozesses einer zu bestimmenden Nukleinsäure ist, und einem weiteren Sondenmolekül eines Sonden-Nukleinsäure-Analogons, das eine Elektronendonator-Komponente in Bindung an das Grundgerüst an einer nicht-terminalen Position enthält, gebildet, wobei die Sondenmoleküle an un terschiedliche, doch aneinander angrenzend lokalisierte Nukleotidsequenzen an der Nukleinsäure gebunden werden. Es ist wichtig, eine Unterbrechung der Basenstapelung zwischen den Bindungsstellen der beiden Sonden zu vermeiden. Der Elektronendonator und der Elektronenakzeptor zweier unterschiedlicher Sondenmoleküle sollten nicht an Endigungen liegen, die sich in Bindung an die Nukleinsäure gegenüberliegen. Es ist offensichtlich, dass Gruppen an einander gegenüberliegenden Endigungen die Bindungsmöglichkeit der Sonden an benachbarte Sequenzen auf der zu bestimmenden Nukleinsäure ernstlich behindern würden.
Bei einer zweiten Ausführungsform wird die Nukleinsäure markiert, um eine Elektronendonator- oder Elektronenakzeptor-Komponente innerhalb des π-Stapels zu enthalten. Wie für das Sondenmolekül beschrieben, ist es daher vorzuziehen, eine flache Elektronentransfer-Komponente anstelle einer Nukleobase einzuführen. Solche Nukleinsäuren können zum Beispiel unter Verwendung eines chemisch synthetisierten Oligonukleotid-Primers, der die Elektronentransfer-Komponente nahe dem 3'-Ende aufweist, hergestellt werden. Während der Amplifikation wird, wenn die ursprüngliche Analyt-Nukleinsäure vorhanden ist, dieser Primer durch Anheften weiterer Mononukleotide verlängert. Das Sondenmolekül wird dann so gewählt, dass es an eine Position bindet, die sowohl den Teil des Primers, in dem die Elektronentransfer-Komponente lokalisiert ist, als auch einen Teil des angrenzenden Extensionsprodukts enthält.
Zur weiteren Bestimmung des Komplexes ist es wichtig, dass durch diesen Bindungsvorgang ein Komplex mit mindestens einer Elektronenakzeptor-Komponente und mindestens einer Elektronendonator-Komponente in kovalenter Bindung entweder an das Sondenmolekül oder die zu bestimmende Nukleinsäure erhalten wird. Folglich enthält der Komplex mindestens einen Elektronenakzeptor und mindestens einen Elektronendonator.
Die Bildung des Komplexes wird durch Induzieren des Elektronentransfers von einem Elektronendonator innerhalb des Komplexes zu einem Elektronenakzeptor innerhalb des Komplexes und Bestimmen des Erfolgens dieses Elektronentransfers als einem Maß der Nukleinsäure bestimmt. Diese Induktion des Elektronentransfers hängt natürlich von der Wahl des Elektronendonators und/oder des Elektronenakzeptors ab. Es gibt mindestens zwei Möglichkeiten, die Induktion zu starten. Im ersten Fall wird der Elektronendonator aktiviert, um ein Elektron an den π-Stapel innerhalb des Komplexes abzugeben. Im zweiten Fall wird der Elektronenakzeptor aktiviert, um ein Elektron von einer Komponente innerhalb des π-Stapels wie oben beschrieben zu absorbieren. Generell wird daher der Elektronenakzeptor in seiner elektronischen Konfiguration verändert, was von den beteiligten π-Systemen abhängt. Der Aktivierungsprozess wird im folgenden unter Verwendung des Beispiels von Verbindungen beschrieben, die gewählt sind aus der allgemeinen Formel V. Zum Beispiel weisen Anthrachinon-Derivate im angeregten Zustand eine nπ*-elektronische Konfiguration auf. Auf Anregung mit Licht hin erfolgt eine schnelle (≤ 10 ps) Intersystem-Crossing zum Triplett-Zustand, was die Fluoreszenzemission ausschließt. Allerdings kann eine Phosphoreszenz durch den Triplett-Zustand bei niedrigen Temperaturen beobachtet werden. Diese Emission wird effizient gelöscht, wenn der Elektronenakzeptor in den π-Stapel des Komplexes interkaliert wird, der aufgrund des schnellen Elektronentransfers von einer der angrenzend an den Interkalationsort gelegenen Basen zum angeregten Elektronenakzeptor gebildet wird. Ist der Elektronenakzeptor nicht innerhalb des π-Stapels lokalisiert, so ist die elektronische Wechselwirkung mit den Basen höchstenfalls schwach und erfolgt eine beträchtlich verminderte Löschung.
Bei einer ersten Ausführungsform wird daher das Erfolgen des Elektronentransfers durch Bestimmen des Grades der Verminderung der Löschung im Vergleich zu dem Fall bestimmt, bei dem keine zu bestimmende Nukleinsäure vorhanden ist.
Die bevorzugte Form der Induzierung des Elektronentransfers bei diesem Aspekt der Erfindung ist daher die Induzierung durch Bestrahlen der den Komplex enthaltenden Probe mit Licht bei einer Wellenlänge, mit der die Aktivierung des Elektronenakzeptors erreicht wird. Dies wird für die oben genannten Elektronenakzeptoren oberhalb einer Wellenlänge von 300 nm bis 450 nm, am bevorzugtesten 330 nm bis 360 nm, der Fall sein. Das Gefäß oder Behältnis, worin die Probe gehalten wird, ist vorzugsweise für das verwendete Licht transparent, so dass die Lichtausbeute verbessert wird.
Die Erzeugung des Elektronentransfers (ET) wird vorzugsweise in einer wässrigen Umgebung vorgenommen. Daher ist das verwendete Lösungsmittel vorzugsweise Wasser oder ein Wasser, das bis zu 40% (Vol/Vol) eines organischen Mediums, vorzugsweise bis zu 10% (Vol/Vol) eines organischen Lösungsmittels wie Methanol, enthält. Höhere Gehalte an organischen Lösungsmitteln werden aufgrund der Instabilität der aus Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Analoga, wie z. B. PNA, unter diesen Bedingungen gebildeten Duplexe nicht verwendet.
Das Lösungsmittel ist vorzugsweise gepuffert, wobei der pH-Bereich 2–12 beträgt. Die Puffer können unter den herkömmlicherweise in biologischen Assays verwendeten Puffern ausgewählt werden, doch werden häufig Phosphatpuffer bei pH 7 sein. Die Salzkonzentration im Puffer kann variieren, doch liegt vorzugsweise im Bereich von 10 mM bis 0,5 M.
Es kann von Vorteil sein, das Reaktionsgemisch, das den Komplex enthält, während der Bestrahlung zu mischen, so dass eine homogene Induzierung erreicht wird.
Zu weiteren möglichen Wegen der Induzierung des Elektronentransfers zählen die Stimulierung des Elektronenakzeptors an einer Elektrode oder mittels chemischer Methoden oder durch Bestrahlung mit Elektronen oder durch Unterziehen der Proben einer ionisierenden elektromagnetischen Bestrahlung.
Die Dauer, für die die Stimulationsbedingungen aufrechterhalten werden, hängt von der Stärke des Stimulus ab. Für einen Fachmann des Gebiets ist offensichtlich, dass bei Verwendung einer starken Stimulationsquelle die Induktion in einer kürzeren Zeit erreicht werden kann als bei Verwendung einer Quelle von geringer Stärke. Um die Dauer des Assays einzuschränken, sind Bestrahlungszeiten von weniger als 6 Stunden, bevorzugter weniger als 1 Stunde, bevorzugt. Eine praktisch mögliche Untergrenze für die Stimulationsdauer kann weniger als 1 Sekunde betragen. Bei höherer Stimulationsenergie besteht die Möglichkeit von Schädigung entweder der Probe oder der Umgebung der Probe.
Der induzierte Elektronentransfer wird als ein Maß der zu bestimmenden Nukleinsäure bestimmt. Das Erfolgen des Elektronentransfers kann mittels verschiedener Methoden gemessen werden. Sie können das Bestimmen des Elektronentransfers selbst umfassen oder können das Bestimmen jeglicher anderer Veränderungen umfassen, die innerhalb des Komplexes oder seiner Komponenten auftreten und durch den Elektronentransfer verursacht sind. Besonders bevorzugt ist die Bestimmung der Veränderungen innerhalb des Elektronenakzeptors entweder unmittelbar nach dem Elektronentransfer oder nach einer gewissen Zeit, wenn der Prozess seinen Endzustand erreicht hat. Die offensichtlichste Veränderung des Elektronenakzeptors besteht in der Absorption des Elektrons, was die elektronische Konfiguration des Elektronenakzeptors oder -donators verändert. Diese Veränderung kann unter Ausnutzung entweder der chemischen oder spektroskopischen Eigenschaften des nun elektronenreichen Elektronenakzeptors gemessen werden. Am bevorzugtesten sind Bestimmungen der spektroskopischen Eigenschaften, wie etwa der Lichtabsorption oder Emission bei charakteristischen Wellenlängen (oder deren Löschung). Der elektronenreiche Elektronenakzeptor kann auch durch chemische oder physikalische Methoden bestimmt werden, wie etwa dem Übertragen seines überschüssigen Elektrons auf einen zweiten Akzeptor oder eine Elektrode.
Der Elektronendonator verändert seine chemischen und spektroskopischen Eigenschaften auch durch Verlieren eines Elektrons. Ist beispielsweise Guanin der Elektronendonator, so wird durch Verlieren eines Elektrons eine reaktive Spezies geschaffen, die das Nukleinsäure-Grundgerüst speziell an der Oxidationsstelle durch Piperidinbehandlung anfällig für Spaltung macht. Diese chemische Reaktion ist dem Fachmann des Gebiets bekannt. Das Erfolgen des Elektronentransfers kann dann durch Nachweisen der Nukleinsäuren oder Sondenmoleküle, die von kürzerer Länge als erwartet sind, bestimmt werden. Dies kann entweder durch direkte Gelelektrophorese oder nach Sequenzieren als auch durch flüssigchromatographische Methoden erfolgen.
Sollten die Elektronendonatoren ihre spektroskopischen Eigenschaften auf den Verlust eines Elektrons hin verändern, so können die spektroskopischen Eigenschaften des modifizierten Elektronendonators bestimmt werden. Ähnlich der Bestimmung jeglicher Veränderungen im Akzeptor ist es möglich, das Vorhandensein der geschaffenen Art unter Ausnutzung ihrer Lichtabsorption oder Fluoreszenz bei einer charakteristischen Wellenlänge spektroskopisch zu bestimmen.
Ein weiterer Hinweis auf den Elektronentransfer ist das Löschen einer möglichen Lumineszenz des Elektronendonators oder Elektronenakzeptors. Den Fachleuten des Gebiets ist wohlbekannt, dass elektronisch angeregte Zustände vieler Elektronendonatoren oder Elektronenakzeptoren Licht aussenden. Elektronentransferreaktionen können diese Emission effizient löschen. Bei einem Aspekt dieser Erfindung stellt das Löschen der Lumineszenz des angeregten Elektronendonators oder des angeregten Elektronenakzeptors das Mittel dar, durch das die Bildung des Komplexes zwischen der Sonde und der Nukleinsäure bestimmt wird. So wird beispielsweise die Lumineszenz vom Elektronendonator oder Elektronenakzeptor durch Bildung des Komplexes vermindert, wenn die Rate oder Effizienz des Elektronentransfers durch die Komplexbildung erhöht ist. Bei der bevorzugten Anwendung dieser Erfindung wird die Lumineszenz vom angeregten Donator oder Akzeptor durch Komplexbildung erhöht, da die Rate oder Effizienz des Elektronentransfers als Folge der Komplexbildung abgenommen hat.
Über die Abhängigkeit der Reaktionsrate von der freien Energie hinaus hängt die Reaktionsrate auch vom Abstand ab. Insbesondere wird erwartet, dass die Reaktionsrate exponentiell zum Abstand abnimmt: ket∝e–βr worin r der Abstand ist, der den Donator und den Akzeptor trennt, und β ein Abschwächfaktor mit den Einheiten des Abstands^–1 ist. Der Abschwächfaktor β' ist ein Maß der Leitfähigkeit des Mediums: ein niedriges β wird das Erfolgen des Elektronentransfers über sehr lange Abstände hinweg ermöglichen, wohingegen ein hohes β den Elektronentransfer lediglich über kurze Abstände hinweg zulässt.
Derzeit gibt es einige Kontroversen bezüglich des β-Werts für Duplex-DNA: Barton und Mitarbeiter haben vorgeschlagen, dass β sehr niedrig sein könnte (< 0,2 Å^–1) (Murphy, C. J.; Arkin, M. R.; Jenkins, Y.; Ghatlia, N. D.; Bossmann, S. H.; Turro, N. J.; Barton, J. K.; Science 1995, 262, 1025–1029), wohingegen Harriman und Brun einen β-Wert von 0,88 Å^–1 gemessen haben (Brun, A. M.; Harriman, A. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3656–3660). Der Barton-Wert würde nahelegen, dass Duplex-DNA ein außerordentlicher Leiter ist, wohingegen der Harriman/Brun-Wert annehmen ließe, dass Duplex-DNA ein gewöhnlich guter Leiter ist. Der Barton-Wert ist nicht durch Experiment wohlbelegt (d. h. das Erfolgen des Elektronentransfers wurde nicht nachgewiesen), so dass der Harriman/Brun-Wert derzeit als der zuverlässigere erscheint. Es sollte auch zur Kenntnis genommen werden, dass die β-Werte für PNA-DNA und DNA-DNA recht unterschiedlich sein könnten, da das übertragene Elektron durch den π-Stapel wandert und die Strukturen der π-Stapel für die beiden Arten von Duplexen recht unterschiedlich sind.
Wird ein "normaler" β-Wert von ca. 1,0 Å^–1 angenommen, so würde eine Veränderung des Abstands von 10 auf 20 Å die Elektronentransferrate um mehr als vier Größenordnungen herabsetzen. Eine derart starke Abhängigkeit der Elektronentransferrate vom Abstand stellt die Grundlage für unsere Unterscheidung zwischen Bioconductoren und Bioisolatoren dar, insbesondere bezüglich der strikten Zeitbeschränkungen, die dem System unter Anwendung der Photoinduktion auferlegt sind. Die als entweder dem Donator oder Akzeptor verwendete Art wird im angeregten Zustand für relativ kurze Zeit existieren. In einer bevorzugten Ausführungsform absorbiert der Donator ein Photon und besitzt eine relativ kurze Lebensdauer, was bedeutet, dass er nach wenigen Nanosekunden der Anregung zum Grundzustand abklingt. Dieses Abklingen kann durch mehrere Mechanismen erfolgen, doch ist der wichtigste Weg die Fluoreszenz, durch die das Lichtphoton emittiert wird. In Gegenwart eines geeigneten Elektronenakzeptors, was zur Abnahme der Fluoreszenz führt. Die "Eignung" wird durch das Akzeptor-reduzierende Potenzial bestimmt: idealerweise wird das Potenzial gering genug sein, um eine negative freie Energie für den Elektronentransfer zu erzielen. Ist das Potenzial zu hoch, so wird der Elektronentransfer zu langsam sein, um effizient mit der Fluoreszenz zu konkurrieren, weshalb wenig Löschung resultiert. Daher weist die starke Abhängigkeit des Elektronentransfers vom Abstand darauf hin, dass bei einem geeigneten Donator/Akzeptor-Paar ein System von einem Bioconductor zu einem Bioisolator durch einfaches Erhöhen des trennenden Abstands von Donator zu Akzeptor umgewandelt werden kann. Der Schlüssel liegt im Erhöhen des Abstands (Vermindern der Reaktions rate), bis der Elektronentransfer zu langsam wird, um mit der Fluoreszenz zu konkurrieren.
Im PNA-Haarnadelsystem haben wir Nutzen aus der großen Zunahme des Abstands gezogen, der den Donator und den Akzeptor nach der Hybridisation trennt, um den Elektronentransfer zu hemmen. Die Tatsache, dass wir wesentlich mehr Fluoreszenz nach der Hybridisation als bei der Haarnadel-Konformation beobachteten, weist darauf hin, dass β nicht sehr klein ist. Eine ideale fluoreszierende Komponente wird eine kurze Lebensdauer (je kürzer, umso besser), eine hohe Quantenausbeute, eine geringe Intersystem-Crossing-Rate und eine Energetik, bei der der Energietransfer schnell ist, aufweisen und flach sein, so dass sie in die Haarnadel und den Duplex interkaliert, ohne die Basenpaar-Erkennung durch Wasserstoffbindung durcheinander zu bringen, wird dort absorbieren, wo es das Anthrachinon nicht tut, wird im "roten" Bereich des Spektrums fluoreszieren und sollte außerdem einfach zu synthetisieren sein.
Eine solche ideale fluoreszierende Komponente würde einen im wesentlichen schwarzen Hintergrund ergeben, wenn keine zu bestimmende Nukleinsäure vorhanden ist, und außerdem eine helle Fluoreszenz im Komplex aus Sonde und Nukleinsäure.
Bei einer bevorzugten Form des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist die Rate oder Effizienz des Elektronentransfers in der Sonde verschieden zu der Sonde, die an die Nukleinsäure gebunden ist. In diesem Fall sind der Elektronendonator und Akzeptor vorzugsweise kovalent an dasselbe Sondenmolekül gebunden, am bevorzugtesten bei einem definierten, fixierten ersten Abstand. Auf das Binden der Sonde an die zu bestimmende Nukleinsäure hin verändert sich der Abstand vom Elektronendonator zum Elektronenakzeptor, und ist vorzugsweise vergrößert, wodurch die Reaktionsrate des Elektronentransfers abnimmt. Der vergrößerte Abstand führt zu einer verminderten Rate des Elektronentransfers und einer begleitenden Zunahme des nachweisbaren Signals. Der nachweisbare Prozess wird dann als eine Anzeige oder ein Maß des Elektronentransfers und damit des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer nachzuweisenden Nukleinsäure dienen.
Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung ist daher ein solches, bei dem der Abstand zwischen dem Akzeptor und dem Donator in einer Sonde auf das Binden an die Nukleinsäure hin verändert wird und vorzugsweise mehr als fünf Baseneinheiten in einem Stapel beträgt.
Um die Ergebnisse aus der Bestimmung des Erfolgens des Elektronentransfers auszuwerten, wird ein Fachmann des Gebiets die aus Experimenten erhaltenen Signale oder Ergebnisse korrelieren, wobei die Menge oder das Vorhandensein einer zu bestimmenden Nukleinsäure definiert wird. Dies kann durch gewöhnliche Kalibrationsexperimente erfolgen, zum Beispiel unter Verwendung standardmäßiger Proben, die unterschiedliche spezifizierte Mengen an zu bestimmenden Nukleinsäuren enthalten, wobei die Standardproben denselben Bedingungen unterzogen werden wie die Proben, bei denen ein Gehalt an zu bestimmender Nukleinsäure vermutet wird. Es sind qualitative und quantitative Bestimmungen möglich.
Ein wichtiges Merkmal der Bildung des Sonden-Analyt-Komplexes ist, dass der Abstand zwischen dem Donator und dem Akzeptor relativ fixiert ist.
Diese stellen zwar die Kernschritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung dar, doch kann dieses Verfahren auf bekannte, bequem geeignete Formate übertragen werden, beispielsweise durch Übernahme des Konzeptes in Assays, bei denen die zu bestimmende Nukleinsäure in einem immobilisierten Zustand bestimmt wird. Ein sehr vorteilhaftes Format der vorliegenden Erfindung ist in 2 dargelegt. Bei diesem homogenen (d. h. einzelne Lösung) Format werden die Probe, die die zu bestimmende Nukleinsäure (komplementäre Ziel-DNA) und nicht zu bestimmende Nukleinsäuren (nicht-komplementäres Ziel) in löslicher Form enthält und das Sondenmolekül, das den Elektronenakzeptor und einen Elektronendonator enthält, gemischt. Lediglich die zu bestimmenden Nukleinsäuren werden an das spezifische Sondenmolekül hybridisieren. Nukleinsäuren, die nicht zum Sondenmolekül komplementär sind, werden nicht hybridisieren. Daher wird nach Induzierung des Elektronentransfers eine höhere oder geringere Lichtemission vom Donator oder Akzeptor erfolgen, wenn die zu bestimmende Nukleinsäure vorhanden war.
In 3 ist dasselbe homogene Format beschrieben, wobei eine Sonde, die einen Akzeptor enthält, und eine andere Sonde, die einen Donator enthält, verwendet werden. Lediglich ein aneinander angrenzendes Binden beider Sonden, wodurch der Elektronentransfer zum Fortpflanzen von Donator zu Akzeptor befähigt wird, wird eine Veränderung bei der Lichtemission ergeben.
In 4 ist ein heterogenes Assay-Format beschrieben. Das Sondenmolekül, das sowohl einen Elektronenakzeptor (Akz.) als auch einen Elektronendonator (Donator) enthält, ist an eine feste Phase, z. B. eine Polystyrol-Oberfläche, gebunden. Dies kann entweder durch kovalente Bindung oder unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Oberflächen und Biotin-markierten Sonden erreicht werden. Auf die Anregung des Elektronenakzeptors hin wird der Elektronentransfer an der festen Phase induziert und kann dann durch Identifizieren des modifizierten Donators nur dann nachgewiesen werden, wenn die zu bestimmende Nukleinsäure an die feste Phase nahe der Basenpaarung über das immobilisierte Sondenmolekül gebunden wurde. Das Assay-Format unter Verwendung einer immobilisierten Sonde ist besonders vorteilhaft, wenn die Probe weitere Inhaltsstoffe enthält, die die Bestrahlung einer Nachweisprobe stören, indem sie zum Beispiel Licht im Bereich der Bestrahlungs- oder Emissions-Wellenlänge absorbieren.
Bei einer Ausführungsform wird die zu bestimmende Nukleinsäure durch Sondenmoleküle der Analyt-Nukleinsäure, die zum Bilden einer Haarnadelstruktur fähig ist, gebunden. Bei dieser Gestaltung werden der Elektronendonator (Do) und Akzeptor (Akz) zunächst aufgrund der Beschaffenheit der Haarnadelstruktur in relativ große Nähe zueinander gebracht (6). Die dichte Lokalisation der Elektronentransfer-Komponenten wird generell zu hohen Elektronentransfer-Raten und -Effizienzen zwischen diesen beiden Gruppen führen. Dies wird die durch Elektronentransfer induzierten spektroskopischen Veränderungen ausgeprägter machen. Dies könnte beispielsweise auf die Lumineszenz-Hervorrufung oder Lumineszenz-Löschung durch Elektronentransfer zutreffen. Eine bevorzuge Anwendung dieser Erfindung besteht in dem Fall, bei dem Duplex-DNA oder DNA-PNA-Komplex aus der Sonde und der zu bestimmenden Nukleinsäure die Eigenschaft eines Bioisolators zeigt. In diesem Fall werden, wenn die Haarnadelsonde an eine Ziel-Nukleinsäure (z. B. ein PCR-Amplikon) hybridisiert ist, die Elektronentrans ferraten im Vergleich zur Rate in der Sonde selbst vermindert sein, weshalb weniger oder keine Lumineszenz-Löschung weder vom Komplex noch von der Sonde beobachtet wird.
Eine Haarnadelstruktur wird vorzugsweise im Parallelmodus synthetisiert. Sie besteht aus zwei hybridisierbaren Segmenten und einem Gelenksegment (ein Segment, das die hybridisierbaren Segmente verbindet). Die beiden hybridisierbaren Segmente sind zueinander komplementär, ebenso wie zu zwei nicht-überlappenden Segmenten der zu bestimmenden Nukleinsäure. Aufgrund der parallelen Synthese der gesamten Haarnadel werden die beiden Segmente einen antiparallelen Duplex bilden. Die beiden hybridisierbaren Segmente setzen sich vorzugsweise jeweils aus 6–12 Monomeren zusammen, wobei jedes Segment eine Elektronentransfer-Komponente enthält, die zum Bilden von Wasserstoffbindungen fähig ist oder auch nicht. Die Elektronentransfer-Komponenten werden vorzugsweise in solcher Weise platziert, dass sie in der Haarnadelstruktur so aneinander gelagert werden, dass eines davon ein Elektronendonator und das andere ein Elektronenakzeptor ist. Die enge Positionierung der Elektronentransfer-Komponenten macht den Elektronentransfer so optimal wie möglich. Der bevorzugte Abstand der Elektronentransfer-Komponenten an unterschiedlichen Segmenten beträgt zwischen 1 und 10, bevorzugter 1 und 5, wenn die Segmente aneinander hybridisiert werden (ein Abstand von 0 bedeutet Basenpositionen, die Wasserstoffbindungen miteinander bilden, sofern Basen an dieser Position vorhanden sind). Das Gelenksegment setzt sich aus 2–7 Monomeren, vorzugsweise aus 3–5 Monomeren, zusammen.
Stamm-Schleifen-(Haarnadel)-RNA und -DNA-Strukturen sind dafür bekannt, dass sie sich ohne weiteres aus geeigneten Nukleinsäuresequenzen bilden. Wir haben nun gezeigt, dass PNA ebenfalls Haarnadelstrukturen bildet. Charakteristischerweise ist die thermodynamische Stabilität der PNA-Struktur, wie durch ihre Schmelztemperatur erkennbar, größer als die, die für eine identische Sequenz enthaltende DNA beobachtet wurde. Insbesondere in Fällen, bei denen eine Veränderung der Raumbeziehung das nachgewiesene Signal liefert, wird PNA eine größere Raumdifferenzierung bei weniger Basenpaaren als die vergleichbare Sequenz auf DNA-Basis liefern. Eine Ausnützung dieses Vorteils erfordert die Herstellbarkeit spezifischer PNA-Sequenzen in kovalenter Knüpfung an "Reporter"-Einheiten, die die Haarnadelstruktur nicht völlig zerstören. Wir haben eine Synthesetechnologie entwickelt, um an interne PNA-Positionen geknüpfte Reportergruppen einzubauen.
Die Haarnadel-PNA enthält einen Elektronendonator, zum Beispiel eine Aminoacridingruppe, anstelle einer der Basen am PNA-Grundgerüst. Durch derartige Konstruktion fällt die Acridingruppe in die Duplexregion der PNA-Haarnadel. Das Schmelzverhalten, und insbesondere die Zirkulardichroismus-Spektroskopie zeigen an, dass der Einbau des Acridins die Haarnadelbildung nicht verbietet. Ähnlich zeigt der Nachweis, dass eine PNA, die zwei Nicht-Nukleinsäuregruppen (ein Acridin und ein Anthrachinon), die in der Duplexregion der Haarnadel gebunden sind, ebenfalls die Fähigkeit zur Bildung der Stamm-Schleifen-Strukturen beibehalten.
Eine der durch einen Nukleinsäure-Biosensor zu erfüllenden Schlüsselanforderungen ist die Selektivität. Die Sonde muss ihr Komplement selektiv erkennen und ein einzelnes, wahrnehmbares Ereignis hervorrufen. Die konkurrenzlose Fähigkeit von PNA, einen Duplex und Strukturen höherer Ordnung mit komplementärer DNA und RNA zu bilden, legte nahe, dass ihre Modifikation zum Erhalten von Reportergruppen die Erkennungsfähigkeit nicht zerstören würde. Die unten beschriebenen Experimente ergeben, dass dies der Fall ist. Das für Gemische von PNA beobachtete Schmelzverhalten und die Reaktion mit einer Dodecamer-DNA, die lediglich zur Schleife und einem Teil der Stammregion der PNA komplementär ist. Das Schmelzverhalten und die CD-Spektroskopie der PNA/DNA-Struktur zeigen die Bildung einer Hybridstruktur an, bei der die PNA-Haarnadel geöffnet ist.
Die bevorzugte Aminoacridin-Einheit eines Nicht-Nukleotid-Substituenten wird vorzugsweise an das PNA-Grundgerüst durch eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung an ihrer 9-Aminogruppe geknüpft. Während die Eigenschaften des 9-Aminoacridins umfangreich untersucht wurden, gibt es nur wenige Berichte betreffend die Mono-N-alkylierten Aminoacridine. Wir verwenden 9-(N-Methylamino)acridin als ein Modell für die Acridingruppe von Ar. In Acetonitrillösung beträgt die Fluoreszenzquantenausbeute (Φ_fl) für 9-Aminoacridin 0,96 und ihre Singulett-Lebensdauer 15,8 ns (Kubota et al., J. Phys. Chem. 84, 2855–2861 (1980)). Im Gegensatz dazu beträgt unter diesen Bedingungen die (Φ_fl) für 9-(N-Methylamino)acridin lediglich 0,011 und ihre Singulett-Lebensdauer ist entsprechend auf 2 ns reduziert. Diese enorme Veränderung bei den photophysikalischen Eigenschaften spiegelt einen Vergleich der Photoelektronen-Spektren wieder (Li et al., Zh. Obshch. Khim 61, 186–191, 1991). Diese Wirkungen sind einer Veränderung des Charakters des Anregungszustands zuzuschreiben, wie durch Verlust der Überlappung des Acridin-π-Elektronensystems mit den nicht-bindenden Elektronen des Aminostickstoffatoms aufgrund der sterischen Wirkungen verursacht, wenn die Methylgruppe des 9-(N-Methylamino)-Derivats mit dem Acridin koplanar ist. Die verminderte Lebensdauer des Methylaminoacridins macht es weniger anfällig für Fluoreszenzlöschung durch Guanin und Adenin (Kubota, 1980). Folglich beobachten wir wenig Unterschied bei der Intensität der Aminoacridinfluoreszenz zwischen der Haarnadel und den linearen Formen der PNA.
Die Aminoacridin-Fluoreszenz der PNA wird stark gelöscht, wenn sie in ihrer Haarnadelform vorliegt. Dies schreiben wir dem Elektronentransfer vom angeregten Singulettzustand des Acridins zur nahegelegenen Anthrachinongruppe zu. Das Oxidationspotenzial von 9-(N-Methylamino)acridin wird mit 0,21 V gegen SCE berichtet (Shen et al., Science in Clinic. (Ser. B) 35, 137–145 (1992)). Das Reduktionspotenzial von eng verwandten Anthrachinon-Derivaten beträgt Q gleich –0,58 V gegen SCE (Breslin et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2311–2319 (1996)). Die Energie des Singulett-Anregungszustandes des Aminoacridins in PNA, wie aus seinem Fluoreszenzspektrum errechnet, beträgt 3,45 eV. Die Anlegung der Weller-Gleichung (Rehm et al. Isr. J. Chem. 8, 259 (1970)), die den Coulomb-Arbeitsbegriff ignoriert, der vernachlässigbar sein sollte, ergibt, dass die freie Energie für den Elektronentransfer (ΔG_et) –2,66 eV für den Transfer eines Elektrons vom Singulett-Anregungszustand des Aminoacridins zum Anthrachinon beträgt. Diese Reaktion ist ausreichend exotherm, damit sie bei jedem Zusammentreffen zwischen dem angeregten Acridin und dem Chinon erfolgt.
Es liegt eine schwache restliche Aminoacridin-Fluoreszenz von der Haarnadelform der PNA vor. Wir schreiben dies den multiplen Konformationen der Chinon- und Acridingruppen zu, wie ihr vielphasiges Schmelzverhalten folgern lässt. Ist die Aminoacridingruppe im Anregungszustand in Kontakt mit dem Chinon, so sollte das Löschen nahezu sofort und vollständig erfolgen. Die exakte Bedeutung von "Kontakt" ist durch diese Ex perimente nicht klar definiert. Wir messen ihm provisorisch die Bedeutung bei, dass sowohl das Chinon als auch das Acridin innerhalb der Duplexregion der PNA-Haarnadel interkaliert sind. In dieser Hinsicht scheint es unwahrscheinlich, dass, wenn entweder das Chinon oder das Acridin bei angeregtem Acridin extrahelikal ist, die Bindung innerhalb des Duplex innerhalb der ca. 2 ns Lebensdauer des angeregten Zustands erfolgen wird. Die Daten zeigen, dass die Aminoacridin-Fluoreszenz um das ca. 3,3-fache ansteigt, wenn die PNA von ihrer Haarnadelform zur linearen Form umgewandelt wird. Interpretiert innerhalb des Multikonformationsmodells ergibt das ein Verhältnis der PNA-Strukturen, bei dem Chinon/Acridin in Kontakt zu solchen ist, bei denen eine Gruppe extrahelikal ist, von ca. 3,3 : 1.
Die Daten zeigen, dass die Reaktion der Haarnadel-PNA entweder mit DNA oder PNA zu einer ca. 6,5-fachen Zunahme der Intensität der Aminoacridin-Fluoreszenz führt. Wir schreiben dies der Umwandlung der Haarnadelform der PNA zu einem linearen Hybridduplex zu, in welchem Acridin und Chinon nicht mehr in Kontakt stehen. In letzter Zeit wurde die Fähigkeit der DNA zum Leiten von Ladungslöchern (radikalen Kationen) und Elektronen in beträchtlichem Umfang diskutiert (Beratan et al., Chemistry and Biology 4, 3–8 (1997). Barton und Mitarbeiter (Arkin et al., Chem. & Biology 4, 389–400 (1997); Dandliker et al., Science 275, 1465–1468 (1997), Hall et al., Nature 382, 731–735 (1996)) haben für einen sehr schnellen Transport plädiert. Meade und Mitarbeiter (Meade et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 352–354 (1995)) haben eine langsamere Rate berichtet. Unsere Befunde legen nahe, dass sich auf der Kurzzeitskala der Aminoacridin-Lebensdauer der PNA/DNA-Hybridduplex als ein Isolator und nicht als ein Conductor verhält. Daher löscht das Chinon, ob nun interkaliert oder nicht, die Aminoacridin-Fluoreszenz, wenn die beiden Gruppen um zwölf Paare im Hybridduplex getrennt sind.
Die Verwendung von PNA bei der Konstruktion der Sonden zum Messen von Nukleinsäuren bietet mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung von DNA als dem Sequenz-selektiven Erkennungselement. PNA/DNA-Hybridduplexe bieten eine ausgezeichnete Einzelbasen-Fehlpaarungs-Selektivität (Wang et al., Anal. Chem. Acta 344, 111–118 (1997)) und bieten eine größere Stabilität als ihre DNA/DNA- oder DNA/RNA-Gegenstücke. Dies ist besonders vorteilhaft im Haarnadel-Format der Molecular Beacons. Die Duplexregion der Haarnadel wird allgemein nicht vollkommen komplementär zur angezielten Nukleinsäure sein, und diese Region kann bei einer PNA-Sonde kürzer als bei einer DNA-Sonde sein. Außerdem gibt es, da PNA nicht-natürlich ist, keine Nukleaseenzyme, die sie zerstören. Dies bietet einen speziellen Vorteil für homogene Assays, da weniger Probenvorbereitungsschritte erforderlich sein werden. Schließlich, und vielleicht von größter Bedeutung, können die fluoreszierenden und Quenchergruppen leicht in interne Positionen der PNA platziert werden. PNA lässt sich mittels standardmäßiger Peptidmethoden ohne weiteres synthetisieren und die erforderlichen monomeren Derivate ohne weiteres durch einfache Reaktionen präparieren. Die internen Positionen für die fluoreszierende Komponente und den Quencher bieten die Aussicht einer hohen Empfindlichkeit, da kein "Abtragen" erfolgen wird, das wahrscheinlich auftreten würde, wenn die fluoreszierende Komponente und der Quencher an entgegengesetzte Endigungen des Haarnadelduplex gebunden sind.
Bei einer anderen Ausführungsform wird ebenfalls die enge elektronische Wechselwirkung zwischen dem Donator und dem Akzeptor ausgenützt (siehe 7). Bei dieser Ausführungsform enthält die Analyt-spezifische Sonde (PNA2) den Donator (oder den Akzeptor). Eine zweite Sonde (PNA1), die die andere Elektronentransfer-Komponente enthält, ist zu einem Teil der ersten Sonde koplementär. Sind diese hybridisiert, so ist die Wechselwirkung zwischen dem Akzeptor und dem Donator wie oben skizziert. Wird das Analyt in das Gemisch eingeführt, so wird die kurze Akzeptor-Sonde durch das Analyt verdrängt, was die Elektronentransfer-Wechselwirkung zwischen dem Donator und dem Akzeptor verhindert. In Abhängigkeit von der Wahl des Donators/Akzeptors könnte dies entweder zur Hervorrufung oder Löschung der Lumineszenz führen.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können in vorteilhafter Weise beim oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure in einer Probe als dem Sondenmolekül aus dem Nukleinsäure-Analogon verwendet werden. Diese Verbindungen können analog der in WO 92/20702, WO 94/25477, WO 96/20212, EP-0 672 677 und EP-0 700 928 beschriebenen Synthese hergestellt werden, wobei lediglich ein oder mehrere der bei der Oligomerisation mit ein oder mehreren Monomeren verwendeten Monomere ersetzt werden, welche Nicht-Nukleobasen-enthaltende Elektronenakzeptoren oder Nicht-Nukleobasen-enthaltende Elektronendonatoren enthalten. Ein bevorzug ter Weg zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I ist die schrittweise chemische Synthese gemäß WO 92/20702 und der Einbau als einem Monomer einer Verbindung der allgemeinen Formel VIIIa–VIIIc.
worin die Definitionen von A, B, C und D aus den Definitionen von A¹–Aⁿ, B¹–Bⁿ, C¹–Cⁿ und D¹–Dⁿ in Formel I jeweils unter der Bedingung gewählt werden, dass jegliche Aminogruppen darin durch Amino-Schutzgruppen geschützt sind; E ist COOH, CSOH, SOOH, SO₂OH oder ein aktiviertes Derivat davon; F ist NHR³ oder NPgaR³, worin R³ wie oben definiert ist und Pga eine Aminoschutzgruppe ist und L eine Nicht-Nukleobasen-Elektronendonator- oder -Akzeptor-Komponente ist.
Bevorzugte Monomeren sind Aminosäuren mit folgender Formel (IX)
worin X' eine Carbonsäure-Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, R⁷ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten der natürlich vorkommenden Alpha-Aminosäuren oder den Amino-geschützten und/oder Säure-terminalen aktivierten Derivaten davon.
Daher ist eine bevorzugte Herstellungsmethode eines Moleküls der allgemeinen Formel I dadurch gekennzeichnet, dass ein Molekül der allgemeinen Formel VIIIa–VIIIc oder IX, worin X' Wasserstoff ist, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel X umgesetzt wird H₂N-K. (X)worin
K eine feste Phase ist, wie z. B. Amino-modifiziertes Glas, oder eine Festphasen-gebundene oder freie Verbindung der allgemeinen Formel I oder II oder eine Verbindung der Formel I in geschützter Form. Diese Verbindungen können durch Anheften von Monomereinheiten, die keine Elektronentransfer-Komponente enthalten, weiter modifiziert werden.
Jegliche reaktive Gruppen, wie etwa primäre Aminogruppen oder Hydroxylgruppen, werden vorzugsweise durch entfernbare oder nicht-entfernbare Schutzgruppen wie Benzyloxycarbonyl, Boc oder Fmoc geschützt, wenn sie bei der Elongationsreaktion nicht umgesetzt werden sollen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung unter Verwendung von PNA als einem Beispiel eines Sondenmoleküls ausführlicher erläutern. Die oben beschriebenen PNA-Oligomere werden mittels Festphasten-Syntheseverfahren synthetisiert. Der bevorzugte Festträger ist Polystyrol, doch auch andere Festträger wie Tentagel^® und Controlled Pore Glass^® können verwendet werden. Die Synthese erfolgt von der C-terminalen Position der PNA und verläuft über Kopplungen der Monomere und/oder mit säurelabilen Schutzgruppen geschützten Aminosäuren. Reaktive Gruppen an den Basen/Seitenketten werden ebenfalls geschützt. Nach Schutzentfernung an der Komponente, die direkt an den Festträger gebunden ist, werden dann die nachfolgenden Baublöcke (Monomere/Aminosäuren) in der gewünschten Sequenz gekoppelt. Die Schutzentfernung an der N-terminalen Position wird vor der Kopplung der folgenden Monomereinheit vorgenommen.
Die Kopplung der monomeren Einheit wird über Aktivierung des Carbonsäurerests vorgenommen. Eine derartige Aktivierung ist den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt, und Beispiele dazu sind: HATU, HBTU und Carbodiimide. Die Kopplung wird in Lösungsmitteln vorgenommen, wie sie normalerweise bei der Peptidchemie verwendet werden, d. h. NMP, DMF, Acetonitril, Pyridin, Dichlormethan oder Gemische davon. Aktivierungsverstärker wie DMAP können zugesetzt werden. Das aktivierte monomere Derivat wird in einer Überschussmenge gegenüber dem zuvor entschützten Rest, und typischerweise in einem 2- bis 10-fachen Überschuss, verwendet. Wird eine hohe Kopplungsausbeute nachgewiesen (typischerweise > 99%), so folgt dem Kopplungsschritt ein Verkappungsschritt, welcher die Behandlung des gekoppelten und an Oligomer gebundenen Harzes mit Acetanhydrid umfasst. Das Verkappungsgemisch umfasst 2–20% (Vol/Vol) Acetanhydrid in NMP/Pyridin. Wird eine unzufriedenstellende Kopplung nachgewiesen, so wird der Kopplungsschritt zum Erhalt einer hohen Kopplungsausbeute wiederholt.
Die Kopplung eines Konjugats, das eine Carbonsäure enthält, kann analog dem oben beschriebenen Verfahren vorgenommen werden. Andere Liganden, die keine Carbonsäure enthalten, können ebenfalls an die Harz-gebundenen Oligomere geknüpft werden. Solche weiteren Verknüpfungen können über Isocyanate, Isothiocyanate (z. B. Fluoreszeinisothiocyanat), Kohlensäure-Aktivester und Sulfonylchloride vorgenommen werden.
Die beschriebene schrittweise Synthese von PNA kann manuell oder automatisch vorgenommen werden. In letzterem Fall können handelsübliche Synthesizer (z. B. Peptidsynthesizer, Multiple Peptidsynthesizer, DNA-Synthesizer) verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Hardware in den Instrumenten mit der während der PNA-Synthese angewandten Chemie kompatibel ist.
Das synthetisierte Oligomer wird abschließend vom Harz entfernt. Dies wird vorzugsweise durch Behandlung mit einer starken Säure wie TFMSA oder HF vorgenommen. Die Reinigung des freigesetzten Oligomers wird mittels HPLC und/oder Ionenaustausch vorgenommen. Die Identität des reinen Materials wird durch Massenspektrometrie und HPLC bestätigt.

Die Buchstabenbezeichnung der Aminosäuren und die Orientierung der PNA folgt der herkömmlicherweise verwendeten Nomenklatur. Beispiele Abkürzungen

Q1	Bezeichnet eine Monomereinheit, zusammengesetzt aus: 3,6-Diaza-(N³-2-anthrachinoyl)-N⁶-boc-capronsäure
Q2	Bezeichnet eine Monomereinheit, zusammengesetzt aus: 3,6-Diaza-(N³-boc-aminoethyl)-4,7-dioxo-7-(2-anthrachinoyl)-heptansäure
Boc	tert-Butyloxycarbonyl
R1	Bezeichnet eine Monomereinheit, zusammengesetzt aus: 3,7-Diaza-(N³-boc-aminoethyl)-(N⁷-9-acridinyl)-4-oxo-heptansäure
R2	Bezeichnet eine Monomereinheit, zusammengesetzt aus: 3,10-Diaza-(N³-boc-aminoethyl)-(N¹⁰-9-acridinyl)-4-oxo-decansäure
DCC	Dicyclohexylcarbodiimid
DCM	Dichlormethan
DIEA	Diisopropylethylamin
DMAP	Dimethylaminopyridin
DMF	Dimethylformamid
ET	Elektronentransfer
HATU	O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
HBTU	O-(7-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
HOBT	1-Hydroxybenzotriazol
NMP	N-Methylpyrrodlidinon
NMR	Kernmagnetische Resonanz
PNA	Peptid-Nukleinsäure gemäß WO 92/20702
TFA	Trifluoressigsäure
TFMSA	Trifluormethansulfonsäure
HF	Fluorwasserstoff
AQ	Anthrachinone (Gattung)

Die Oligomere werden entsprechend den PNA-Zahlen bezeichnet, wie durch PNA Diagnostics zugeordnet.
Beispiel 1
Synthese von 3,6-Diaza-(N³-2-anthrachinoyl)-N⁶-boc-capronsäure (Q₁, 8)
Anthrachinon-2-carbonsäure (2 g, 7,9 mmol), DCC (1,7 g, 8,3 mmol), HOBT (1,08 g, 8,0 mmol) und Methyl-(N-(2-Boc-aminoethyl))glycinat (2 g, 8,6 mmol) wurden in DMF (25 ml) gelöst und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat mit DCM (2 × 25 ml) gewaschen. Die Lösung wurde mit verdünntem NaHCO₃ (3 × 25 ml), 2 M NaHSO₄ (2 × 25 ml) und Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit MgSO₄ getrocknet, filtriert und bis zur Trockenheit unter reduziertem Druck eingedampft. Der gelbe Schaum wurde in THF (10 ml) gelöst und 1 M LiOH (30 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang gerührt. THF wurde aus der Lösung unter reduziertem Druck entfernt und der pH-Wert auf 2,8 mit 2 M NaHSO₄ eingestellt. Das Präzipitat wurde mit DCM (2 × 25 ml) extrahiert, bis zur Trockenheit eingedampft und dann in Ethylacetat (3 ml) wieder gelöst. Die Ethylacetatlösung wurde in Hexan (150 ml) gegossen, wobei das Zielmolekül ausgefällt wurde. Ausbeute 3,1 g (87%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: 7,81–8,30 (m, 7H, Aromaten); 6,98 und 7,72 (m, 1H, BocNH); 4,17 und 3,97 (s, 2H CH₂Ο); 3,52 und 3,24 (m, 2Η, CH₂); 3,21 und 3,02 (m, 2H, CH₂); 1,17, und 1,19 (s, 9H, Boc).
Beispiel 2
Synthese von 3,6-Diaza-(N³-Boc-aminoethyl)-4,7-dioxo-7-(2-anthrachinyl)-heptansäure (Q₂, 9)
Methyl-4-(2-anthrachinyl)-4-oxo-3-aza-butanoat
Anthrachinon-2-carbonsäure (3 g, 11,9 mmol), DIEA (3,1 ml, 24 mmol) und HATU (4,5 g, 11,9 mmol) in DCM (30 ml) wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Methylglycinathydrochlorid (1,5 g, 11,9 mmol) wurde zugegeben, woraufhin das Produkt auszufällen begann. Das Gemisch wurde weitere 3 Stunden lang gerührt. Das ausge fällte Material wurde mittels Filtration aufgesammelt. Das Volumen der Stammlösung wurde auf ein Drittel reduziert und eine weitere Ernte eingesammelt. Ausbeute 3,65 g (93%).
4-(2-Anthrachinyl)-4-oxo-3-aza-butansäure
Methyl-(2-anthrachinoyl)-3-aza-butanoat (3,65 g, 11,3 mmol) wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 1 M LiOH (20 ml) und THF (3 ml) gerührt, wobei sich das Ausgangsmaterial löste. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 2,8 mit 2 M NaHSΟ₄ eingestellt und das Zielmolekül ausgefällt. Die organischen Lösungsmittel wurden aus der Suspension unter reduziertem Druck entfernt und das Präzipitat mittels Filtration abgesammelt und getrocknet. Ausbeute 3,5 g (100%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: 9,37 (t, 1H, NH); 8,67 (d, 1H, H-laq); 8,36 (dd, 1H, H-3aq); 8,30 und 8,28 (1H, H-4aq); 8,23 (m, 2H, H-5 und H-8aq); 7,95 (m, 2H, H-6 und H-7aq); 4,00 (d, 2H, CH₂).
3,6-Diaza-(N³-Boc-aminoethyl)-4,7-dioxo-7-(2-anthrachinyl)-heptansäure (Q₂)
4-(2-Anthrachinoyl)-4-oxo-3-aza-butansäure (3,5 g, 11,5 mmol), DCC (2,6 g, 12,65 mmol), HOBT (1,7 g, 12,65 mmol) und Methyl-(N-(2-Boc-aminoethyl))glycinat (3,2 g, 13,8 mmol) wurden in DMF (50 ml) bei Raumtemperatur für 48 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Rückstand mit DCM (2 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde mit verdünntem NaHCO₃ (3 × 30 ml), 2 M NaHSO₄ (2 × 30 ml), Kochsalzlösung, extrahiert, mit MgSO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Die Kristallisation aus Ethylacetat ergab 4,0 g (67%) an Methyl-3,6-Diaza-(N³-Boc-aminoethyl)-4,7-dioxo-7-(2-anthrachinoyl)-heptanoat. Das Methyl-3-aza-3-(N-2-Boc-aminoethyl)-4,7-dioxo-6-aza-7-(2-anthrachinoyl)-heptanoat wurde bei Raumtemperatur in 1 M LiOH und 10% THF hydrolysiert. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 2,8 mit 2 M NaHSO₄ eingestellt und das Zielmolekül als ein Öl ausgefällt. Das Öl wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase mit MgSO₄ getrocknet. Das Volumen wurde auf 2 ml reduziert und Hexan (250 ml) unter Rühren zugegeben, wobei 3-Aza-3-(N-2-Boc-aminoethyl)-4,7-dioxo-6-aza-7-(2-anthrachinoyl)-heptansäure ausgefällt wurde. Ausbeute 3,7 g (92%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: 12,64 (s, 1H, COOH); 9,14 (m, 1H, NH); 8,69 (d, 1H, H-laq); 8,67 und 8,35 (dd, 1H, H-3aq); 8,32 und 8,30 (dd, 1H, H-4aq); 8,25 (m, 2H, H-5 und H-8aq); 7,96 (m, 2H, H-6 und H-7aq); 6,90 und 6,75 (t, 1H, BocNH); 4,24 (d, 2H, CH₂CO); 4,24 und 4,12 (dd, 2H, CH₂CO); 3,90 (s, 2H, CH₂CO); 3,44, 3,17 und 3,06 (m, 2H, CH₂); 1,40 und 1,38 (s, 9H, Boc).
Beispiel 3
Synthese von R₁ (10)
9-(2-Carboxyethyl)aminoacridin
β-Alanin (1 g, 11,2 mmol) wurde einer Lösung von 9-Phenoxyacridin (2,7 g, 10 mmol) in Phenol (15 g) zugegeben. Die Suspension wurde bei 120°C für 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und in Ether gegossen, wobei das Produkt als ein gelb-grüner Feststoff ausgefällt wurde. Dieser wurde mit heißem Ethanol trituriert, filtriert und dann mit Ethanol gewaschen, was rohes 9-(2-Carboxyethyl)aminoacridin ergab. Ausbeute 1,9 g (71%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: 8,27 (d, 2H, Acr. 1, 8); 7,59 (m, 4H, Acr. 2, 3, 6, 7); 7,26 (m, 2H, Acr. 4, 5); 4,05 (t, 2H, CH₂CO); 2,82 (m, 2H, CH₂N). C₁₆H₁₄N₂O₂: berechnet/festgestellt: 266/266
3,7-Diaza-(N³-Boc-aminoethyl)-(N⁷-9-acridinyl)-4-oxo-heptansäure (R₁)
Ein Gemisch aus 9-(2-Carboxyethyl)aminoacridin (1,7 g, 6,4 mmol), DIEA (1,8 g, 13,8 mmol) und HATU (2,68 g, 7 mmol) wurde in DMF (40 ml) bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Methyl-Boc-aminoethylglycinat (1,8 g, 7,8 mmol) wurde zugegeben und die Lösung bei 60°C für 4 Stunden gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt und DCM (100 ml) wurde zugegeben. Anschließend wurde die Lösung mit 0,5 M NaHCO₃ (3 × 40 ml), 2 M NaHSO₄ (2 × 40 ml) und Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit MgSO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in THF/1 M LiOH (2/10), 60 ml, gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 2,8 mit NaHSO₄ eingestellt, wobei ein Öl ausgefällt wurde. Die Wasserphase wurde abgegossen und das Öl in Ethanol (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde in Ether gegossen und 3,7- Diaza-(N³-Boc-aminoethyl)-(N⁷-9-acridinyl)-4-oxo-heptansäure (R₁) ausgefällt. Ausbeute 2,3 g (77%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: C₁₆H₃₀N₄O₅: 8,50 (dd, 2H, Acr. 1, 8); 7,91 (m, 2H, Acr. 2, 7); 7,84 (m, 3H, Acr. 3, 6 und 9 NH); 7,49 (m, 2H, Acr. 3, 6); 6,89 und 6,76 (m, 1H, BocNH); 4,38 (m, 2H, CH₂CO); 4,05 und 3,92 (s, 2H, CH₂CO); 2,82 (m, 2H, CH₂N). C₂₅H₃₀N₄O₅: berechnet/festgestellt: 466/466.
Beispiel 4
Synthese von 3,10-Diaza-(N³-Boc-aminoethyl)-(N¹⁰-9-acridinyl)-4-oxo-decansäure (R₂, 11)
9-(5-Carboxypentyl)-aminoacridin
6-Aminocapronsäure (1,47 g, 11,2 mmol) wurde einer Lösung von 9-Phenoxyacridin (2,7 g, 10 mmol) in Phenol (15 g) zugegeben. Die Suspension wurde bei 120°C für 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und in Ether gegossen, wobei das Produkt als ein gelb-grüner Feststoff ausgefällt wurde. Dieses wurde mit heißen Ethanol trituriert, filtriert, dann mit Ethanol gewaschen, was rohes 9-(5-Carboxypentyl)-aminoacridin ergab. Ausbeute 2,4 g (78%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: 8,27 (d, 2H, Acr. 1, 8); 7,61 (m, 4H, Acr. 2, 3, 6, 7); 7,26 (m, 2H, Acr. 4, 5); 3,79 (t, 2H, CH₂CO); 2,16 (t, 2H, CH₂N); 1,72, 1,50 und 1,37 (m, 2H, CH₂). C₁₉H₂₀N₂O₂: berechnet/festgestellt: 308/308
3,10-Diaza-(N³-Boc-aminoethyl)-(N¹⁰-9-acridinyl)-4-oxo-decansäure (R₂)
Ein Gemisch aus 9-(5-Carboxypentyl)-aminoacridin (1 g, 3,2 mmol), DIEA (0,9 g, 6,9 mmol) und HATU (1,34 g, 3,5 mmol) wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten in DMF (30 ml) gerührt. Methyl-Boc-aminoethylglycinat (0,9 g, 3,8 mmol) wurde zugegeben und die Lösung bei 60°C für 4 Stunden gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt, und DCM (60 ml) wurde zugegeben. Anschließend wurde die Lösung mit 0,5 M NaHCO₃ (3 × 30 ml), 2 M NaHSO₄ (2 × 30 ml) und Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit MgSO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in THF/1 M LiOH (2/10) (40 ml) gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 2,8 mit NaH SO₄ eingestellt, wobei ein Öl ausgefällt wurde. Die Wasserphase wurde abgegossen und das Öl in Ethanol (5 ml) gelöst. Die Lösung wurde dann in Ether gegossen und 3N-(Boc-Aminoethyl)-10N-(9-acridinyl)-3,10-daza-4-oxy-nonansäure ausgefällt. Ausbeute 1,2 g (76%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: 8,51 (d, 2H, Acr. 1, 8); 7,90 (m, 2H, Acr. 2, 7); 7,82 (m, 2H, Acr. 3, 6); 7,71 (m, 1H, NH); 6,83 und 6,45 (m, 1H, BocNH); 7,51 (m, 2H, Acr. 4, 5); 4,01 (m, 2H, CH₂CO); 3,98 und 3,88 (s, 2H, CH₂CO); 3,23, 3,00, 2,30, 2,03 und 1,88 (m, 2H, CH₂); 2,16 (t, 2H, CH₂N); C₂₇H₃₆N₄O₅: berechnet/festgestellt: 508/508
Beispiel 5
Synthese von 3,6-Diaza-(N³-acetyl,N⁶-Boc)-capronsäure
Einer Lösung von Methyl-N-(Boc-aminoethyl)glycinat (2 g, 8,6 mmol) in DCM (30 ml) wurde Acetanhydrid (0,9 g, 8,8 mmol) und Pyridin (1 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit 0,5 M NaHCO₃ (3 × 30 ml), 2 M NaHSO₄ (2 × 30 ml) und Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit MgSO₄ getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in THF/LiOH (1 M) 2/10 (40 ml) gelöst und 1 Stunde lang gerührt, woraufhin der pH-Wert auf 2,8 mit NaHSO₄ eingestellt wurde. Die Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase mit MgSO₄ getrocknet: 3,6-Diaza-(N³-acetyl,N⁶-Boc)-capronsäure wurde durch Eindampfung bis zur Trockenheit eingesammelt. Ausbeute 1,8 g (82%).
H¹-NMR DMSO-d₆ δ: 12,31 (s, 1H, COOH); 6,83 und 6,69 (t, 1H, BocNH); 4,07 und 3,89 (2, 2H, CH₂CO); 3,30 (m, 2H, CH₂); 3,09 (m, 2H, CH₂); 2,00 und 1,89 (s, 3H, CH₃); 1,37 (s, 9H, Boc).
Beispiel 6
Synthese von PNA-Oligomeren
Die oben beschriebenen Monomere wurden durch die zuvor und in WO 92/20702 beschriebenen Oligomerisationsverfahren im wesentlichen eingebaut. Allerdings stellten die PNA-Synthesen, die die Donator-Komponenten enthielten, einen speziellen Fall dar, da der Verkappungsschritt beim Teil der Synthese einschließlich und im Anschluss an das Donator-Monomer weggelassen wurde. Um jedoch hohe Kopplungsausbeuten zu erhalten, wurden die monomeren Komponenten dieses Teils der Synthese doppelt gekoppelt. Spätere Experimente haben gezeigt, dass die Verkappung der während der Oligomerisation des Moleküle-enthaltenden Donators angewendet werden kann. Alle Oligomere wurden vom Harz mittels TFMSA abgespalten und anschließend HPLC-gereinigt. Die Identität wurde durch Massenspektroskopie (MALDI-TOF) bestätigt.
PNA 554: berechnet/festgestellt: 5237/5239
PNA 555: berechnet/festgestellt: 5469/5467
PNA 579: berechnet/festgestellt: 5429/5426
PNA 586: berechnet/festgestellt: 5336/5333
PNA 626: berechnet/festgestellt: 6631/6636
PNA 627: berechnet/festgestellt: 6563/6564
Beispiel 7
Bestimmung der PNA-Konzentrationen
Die Konzentrationen der PNA-Stammlösungen wurden mittels UV-Extinktion bei 260 nm bestimmt. Die Extinktionskoeffizienten der PNA-Oligomere wurden unter Verwendung der Werte der nächsten Nachbarn für DNA berechnet, wobei Adenin Q oder R ersetzte. (Aufgrund der Länge der PNA-Oligomere ist der durch diese Substitution eingeführte Fehler vernachlässigbar). Bei einer typischen Messung wurde PNA in Wasser gelöst und die Extinktion bei 260 nm nach Inkubation für 5 Minuten bei 75°C gemessen, um die Sekundärstruktur in der PNA zu minimieren. (Die aus Extinktionsmessungen bei Raumtemperatur bestimmten Extinktionskoeffizienten neigen dazu, um 5–10% geringer zu sein gegenüber solchen, die bei höherer Temperatur gemessenen werden). Die DNA-Oligomere wurden von Midland Certified Reagent Company bezogen.
Beispiel 8
Bildung stabiler PNA/DNA-Hybride: Wärmedenaturierungs-Studien
Dieses Beispiel weist die Fähigkeit von einen Elektronenakzeptor enthaltenden PNAs zum Hybridisieren mit komplementären DNA-Oligomeren nach.
Proben wurden präpariert, die aus äquimolaren Konzentrationen von PNA- und DNA-Oligomeren (jeweils 1,0 oder 2,0 μM) in 1,0 ml von 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,0) bestanden. Der PNA-Strang fällt oftmals auf Zugabe des Phosphats hin aus, was vermutlich an der Komplexierung der Lysineinheiten durch das Phosphat liegt. Das Mischen und die Zugabe des DNA-Strangs führt zur Auflösung der PNA. Die Proben wurden in Küvetten platziert (1,5 ml Volumen, 1,0 cm Weglänge) und mit Klebeband versiegelt, um eine Verdampfung von Wasser während der Erhitzungs/Abkühlungszyklen zu verhindern. Die Extinktion der Proben bei 260 nm wurde als einer Funktion der Temperatur für drei aufeinanderfolgende Durchläufe überwacht: Erhitzung bei 1,0°C/min und Abkühlung bei 0,5°C/min und nochmalige Erhitzung bei 0,5°C/min. Bei zwei Experimenten wurde die Extinktion bei 330 nm überwacht, bei welcher Wellenlänge die AQ-(Anthrachinon)-Einheit absorbiert. Aufgrund des niedrigen Extinktionskoeffizienten des AQ wurden diese Experimente bei 20 μM jeweils von PNA und DNA vorgenommen.
Die Daten wurden durch Exportieren einer ASCII-Datei und Importieren einer standardmäßigen Graphik-Software analysiert. Die Extinktion wurde gegen die Temperatur für jede Probe aufgetragen. Die Schmelztemperaturen (T_m) wurden als dem Maxima der Diagramme des ersten Derivats der Extinktion bezüglich der Temperatur bestimmt, wobei von einem Phasenübergang der ersten Ordnung ausgegangen wurde. Die im Text und den Tabellen wiedergegebenen T_m-Werte weisen Fehlerwerte von ±0,5°C auf.
Eine zu beantwortende Ausgangsfrage hatte zum Inhalt, was am DNA-Strang an der zentralen Stelle, d. h. direkt gegenüber des AQ im Hybrid, tolerierbar wäre. Fünf Variationen wurden erwogen: (1) Eine abasische Stelle (X) wurde in das Oligomer eingebaut. Dieser Rest ersetzte die standardmäßige DNA-Base durch ein Wasserstoffatom am Kohlenstoff-1 der Desoxyribose-Komponente und sollte erwartungsgemäß den meisten Raum zur Unterbringung des AQ im Duplex schaffen. (2)–(5) Jede der vier DNA-Basen: G, A, C und T, wurde in die Sequenz eingebaut. Diese DNA-Oligomere sind identifiziert als DNA579Z, worin Z = X (abasisch), G, A, C bzw. T.
DNA: 5'-TCG-CTG-GAA-Z-AAG-GTA-GGA-3'
DNA579Z
PNA: H-Lys-Lys-TCC-TAC-CTT-Y-TTC-CAG-CGA-Gly-NH₂
PNA554: Y = Acetyl
PNA579: Y = Q1
PNA586: Y = Q2
Der PNA579/DNA579X-Hybrid schmilzt mit hoher Kooperativität bei T_m = 61,4°C (12). Es liegt keine Hysterese im Übergang vor, die indikativ für eine schnelle Hybridisationskinetik wäre, wie zuvor für 1 : 1-PNA-DNA-Duplexe der vollen Länge beobachtet. Der PNA586/DNA579X-Hybrid schmilzt bei 68,3°C, etwa sieben Grad höher als bei PNA579. Die größere Stabilisation bei PNA586 könnte an der erhöhten Flexibilität liegen, die aus dem längeren Linker entsteht, der das AQ und das PNA-Grundgerüst verbindet. In beiden Fällen ist die T_m signifikant höher als dann, wenn die PNA lediglich eine Acetylgruppe an der zentralen Position trägt, was aufzeigt, dass die AQ-Komponente den PNA/DNA-Hybrid stabilisiert (Tabelle 1).
Die Überwachung der T_m bei 330 nm, bei der lediglich die AQ-Einheit Licht absorbiert, ergibt monophasische Übergänge für beide PNA/DNA-Hybride (12). Die für den PNA586/DNA579X-Hybrid beobachtete Hyperchromie ist nahezu zweimal so groß wie die für den PNA579/DNA579X-Hybrid, was mit einer Struktur übereinstimmt, in der die AQ-Einheit in den Duplex interkaliert ist, wobei diese Insertion des AQ für den längeren Linker bevorzugter ist.
Tabelle 1. Auswirkung der AQ-Linkerlänge auf die Stabilität des PNA/DNA-Hybrids
Die PNAs bilden stabile Hybride mit den DNA579Z-Oligomeren, in denen Z = G, A, C oder T (Tabelle 2). Die resultierenden Hybride sind lediglich geringfügig weniger stabil als die entsprechenden Duplexe mit Z = X.
Tabelle 2. Auswirkung der entgegengesetzten Base auf die Stabilität des PNA/DNA-Hybrids (T_m angegeben in °C)
Auswirkung einzelner Fehlpaarungen. PNA555 ist analog zu PNA579, mit Ausnahme der Ersetzung von C durch G an Position 7. Die Hybridisation dieser PNA mit ihrem abasischen DNA-Komplement (DNA555X) ergibt einen Duplex, der bei 63,1°C schmilzt. Die 2°C-Stabilisation relativ zu PNA579/DNA579X könnte eine größere Basenstapelung in der Region des C-7-(PNA)/G-32-(DNA)-Basenpaars widerspiegeln. Die Hybridisation von PNA555 mit DNA579 ergibt einen Duplex, welcher eine G-G-Fehlpaarung besitzt und bei 53,4°C schmilzt. Folglich senkt eine einzelne Fehlpaarung die T_m um 8–10°C.
Auswirkung der PNA-Orientierung auf die Stabilität des Hybrids. Die bevorzugte Orientierung der PNA/DNA-Duplexe ist antiparallel, wobei die N-Endigungen der PNA mit den 3'-Endigungen der DNA ausgerichtet sind. Ist die PNA579-Sequenz invertiert, so erzeugt die Hybridisation mit DNA579 einen Duplex, der bei 49,9°C schmilzt. Daher führt die parallele Orientierung der PNA- und DNA-Stränge zur Senkung der T_m um ca. 11°C.
Diese Experimente zeigen, dass die DNA-Erkennungseigenschaften der PNA(AQ)-Konjugate völlig analog denen der unmodifizierten PNA-Stränge sind. Da die Stabilität der resultierenden Duplexe höchstwahrscheinlich geringer ist als sie bei einem PNA-DNA-Hybrid mit 19 Basenpaaren beobachtet würde (aufgrund des Fehlens der Basenpaarung an der zentralen AQ-Position), stabilisiert das Vorhandensein der AQ-Komponente den Duplex um > 4°C relativ zu dem Fall, bei dem beide Stränge abasische Reste an der zentralen Position enthalten, was indikativ für eine starke Wechselwirkung (Stapelung) zwischen dem AQ und dem Duplex ist.
Beispiel 9
Nachweis des Elektronentransfers innerhalb von PNA/DNA-Hybriden mittels Photospaltungs-Assay
In diesem Beispiel wird die Fähigkeit von ein Anthrachinon (AQ) enthaltender PNA zum Hervorrufen der Photospaltung des DNA-Strangs innerhalb eines Hybrid-Duplexes durch photoinduzierten Elektronentransfer beschrieben.
Die Photospaltung des DNA-Strangs innerhalb von PNA-AQ/DNA-Hybriden wurde unter Verwendung radiomarkierter DNA und der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) untersucht. Synthetische DNA-Oligomere wurden am 5'-OH-Terminus unter Verwendung von [γ-³²P]-ATP und T4-Polynukleotidkinase gemäß standardmäßigen Verfahrensweisen markiert. 5'-endmarkierte Oligomere wurden durch 20% denaturierende PAGE und Ausfällung gereinigt. Die Proben wurden für die Bestrahlung unter Mischen von 5,0 μM jeweils der PNA und der unmarkierten DNA als auch markierter DNA (2000–4000 cpm pro Probe) in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,0) präpariert. Dies gewährleistet, dass ein leichter Überschuss an DNA gegenüber PNA vorhanden sein wird, was den Beitrag von unhybridisierter PNA minimiert. Die Proben wurden 85°C für 5 Minuten erhitzt und durften sich dann auf Raumtemperatur abkühlen. In Fällen, bei denen der einzige Unterschied bei den Proben die Bestrahlungsdauer sein würde, wurde eine Einzelprobe mittels dieser Verfahrensweise hergestellt und bestrahlt, wobei Teilmengen zu den gewünschten Zeitpunkten entfernt wurden.
Die Bestrahlung wurde unter Verwendung eines Rayonet-Photoreaktors, ausgestattet mit 8 Lampen (λ_max = 350 nm) vorgenommen. Die Proben wurden in Mikrozentrifugenröhrchen eingebracht und parallel zu den Lampen an einem rotierenden Probenhalter aufgehängt. Ein Großteil des Anregungslichts fällt zwar entweder nicht in die Röhrchen ein oder wird von diesen gestreut, doch sind die Röhrchen bei 330 nm ausreichend transparent, um den Ablauf der Photospaltung in sinnvollen Zeitspannen (weniger als eine Stunde) zu ermöglichen.
Für Experimente unter Beteiligung von Methylenblau wurden PNA-DNA-Hybride wie oben beschrieben hergestellt, dann Methylenblau zum Erhalt von Konzentrationen von 10 oder 20 μM zugegeben. Die Proben wurden 15 Minuten lang unter Anwendung der gefilterten (λ > 600 nm) Leistung einer 150 W Hg-Bogenlampe bestrahlt.
Bei Experimenten, bei denen D₂O durch Wasser ersetzt war, wurden alle der Komponenten (PNA, DNA, Puffer, Methylenblau, wo erwünscht) vermengt, dann das Wasser unter Vakuum eingedampft. 20 μl D₂O wurden den Proben zugegeben und dann durch Eindampfung entfernt. Diese Verfahrensweise wurde wiederholt, dann die Proben abschließend in einer geeigneten Menge an D₂O gelöst. Bei einem identischen Verfahren folgte die Anwendung von H₂O zur Kontrolle der Proben.
Nach der Bestrahlung wurde die Salzkonzentration erhöht, indem Natriumacetat (pH = 5,2) auf 0,3 M und Magnesiumchlorid auf 10 mM in einem Gesamtvolumen von 50 μl zugegeben wurde. 100 μl kaltes Ethanol wurde zugegeben, und nach dem Verwirbeln wurden die Proben für 30 Minuten auf Trockeneis platziert, gefolgt von Zentrifugieren bei 12.000 g für 30 Minuten. Der Überstand wurde weggegossen und das Pellet mit 80% Ethanol gewaschen und dann getrocknet. Die Proben wurden entweder dann in denaturierendem Ladungspuffer suspendiert oder mit 100 μl Piperidin (1 M) für 30 Minuten bei 90°C inkubiert. Nachdem das Piperidin durch Vakuumeindampfung entfernt war, wurde die DNA in 20 μl Wasser gelöst, welches dann eingedampft wurde. Diese Verfahrensweise wurde nochmals vorgenommen und dann die DNA in denaturierendem Ladungspuffer suspendiert. Die DNA-Fragmente wurden schließlich auf einem 20% denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt und die Spaltstellen durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die Bestrahlung eines PNA579/DNA579X-Duplex mit 350 nm Licht für eine Stunde führte zu einem sehr geringen spontanen Abbau der DNA. Allerdings wird nach der Piperidinbehandlung eine starke Spaltung an verschiedenen Positionen beobachtet (13, Bahn 8). Die Spaltung wird bei einem PNA554/DNA579X-Hybrid, dem eine AQ-Komponente fehlt, nicht beobachtet (Bahn 4). Die Hauptspaltstellen sind die drei GG-Schritte als auch die abasische Stelle am Zentrum des Duplex. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass die Bestrahlung von DNA-interkaliertem AQ zu einer Piperidin-abhängigen Spaltung mit hoher Selektivität am 5'-G der GG-Dubletts führt. In der Literatur wurde eindeutig gezeigt (Breslin, D. T. und Schuster, G. B. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 2311–2319), dass diese GG-selektive Spaltung der DNA durch photoinduzierten Elektronentransfer von den DNA-Basen zum AQ im angeregten Zustand hervorgerufen wird. Eine in 13 gezeigte ähnliche Selektivität legt nahe, dass das AQ ähnlich mit dem PNA/DNA-Hybrid reagiert.
Für die beiden GG-Stellen am 3'-Ende des Duplex wird die Spaltung am 5'-G der am 3'-G vorgezogen. So zeigen die beiden GG-Stellen, die in der 3'-Richtung relativ zum AQ orientiert sind, dieselbe 5'-abhängige Spaltung wie bei der Duplex-DNA beobachtet. Allerdings ist die Spaltung am GG-Schritt auf der 5'-Seite des AQ gleichmäßig zwischen den beiden Stellen verteilt. Von der 5'- gegenüber 3'-Verteilung der Spaltung am GG-Schritt wurde vorgeschlagen, dass sie vom Rotationswinkel zwischen den beiden Guaninen in ihrer aufeinandergestapelten Form abhängt (Sugiyama, H. und Saito, I., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7063–7068). Es ist jedoch wichtig, zur Kenntnis zu nehmen, dass das Einfangen nicht nur ein wesentlich geringeres Oxidationspotenzial an der GG-Stelle erfordert, sondern auch eine chemische Reaktion, um das Elektron und das Ladungsloch am Rekombinieren zu hindern. Dieser Schritt beinhaltet die Zugabe von entweder Wasser oder Sauerstoff zum Guanin-Radialkation, ein Vorgang, der durch das Aussetzen der Base einem Lösungsmittel beeinflusst wird. Es wurde bemerkt, dass die Basen in PNA-DNA-Hybriden dem Außenbereich der Helix näher sind als bei B-Form-DNA. NMR (Erikkson, M.; Nielsen, P. E. Nature Struct. Biol. 1996, 3, 410–413) und Röntgendiffraktionsdaten (Betts, L.; Josey, J. A.; Veal, J. M.; Jordan, S. R. Science 1995, 270, 1838–1841) ergeben, dass der Grad der Inter- und Intrastrang-Stapelung innerhalb PNA-DNA-Hybriden hochgradig sequenzabhängig ist. Daher besteht kein Grund, zu erwarten, dass die GG-Spaltung dieselbe 5'-Präferenz entwickeln wird wie bei Duplex-DNA beobachtet. Dies wird durch die Spaltdaten von PNA/DNA-Hybriden gestützt, die in dieser Erfindung beschrieben sind.
Es wurden Experimente mit PNA586/DNA579X vorgenommen, die analog jenen waren, die mit PNA579 vorgenommen wurden. Die Ergebnisse für den längeren Linker sind ähnlich denen für den kürzeren Linker: Nach der Piperidinbehandlung wird eine Spaltung an allen drei GG-Stellen als auch an der abasischen Stelle beobachtet (13, Bahn 12). Das 5'-G ist eindeutig bevorzugt gegenüber den beiden Stellen, die an der 3'-Seite der abasischen Stelle liegen, während die beiden Gs etwa gleichermaßen an der anderen GG-Stelle gespalten werden. Eine bemerkenswerte Beobachtung ist, dass die Spalteffizienz für den längeren Linker, der AQ mit den PNA-Grundgerüst verknüpft, signifikant geringer ist als für den kürzeren Linker.
Es ist klar, dass die Spaltung an Positionen erfolgt, die dem AQ fern sind. Insbesondere ist der distale GG-Schritt in der 3'-Richtung innerhalb des Hybrids ca. 22 Å entfernt vom AQ (basierend auf einem Anstieg von 3,6 Å pro Basenpaar). Selbst dann, wenn das AQ in der Lage wäre, extrahelikale Konformationen anzunehmen, schließt der kurze Linker, der es mit dem Grundgerüst verbindet, eine direkte Reaktion zwischen dem AQ und den entfernt gelegenen G-Stellen aus. Als nächstes untersuchten wir die Möglichkeit, dass das AQ eine frei diffundierbare Spezies erzeugen würde. Werden die PNA- und DNA-Stränge in Gegenwart eines zehnfachen Überschusses an unmarkierter DNA579X vereinigt, so wird die Spaltung vollständig eliminiert. Wird jedoch die Vereinigung in Gegenwart eines Überschusses an unmarkierter, nicht-komplementärer DNA vorgenommen, so wird keine Auswirkung auf die Spaltung beobachtet. Dies schließt die mögliche Vermittlung eines frei diffundierenden Spaltagens aus. Wird außerdem die überschüssige unmarkierte DNA579X nach der Vereinigung, doch vor der Bestrahlung, hinzugegeben, so wird eine minimale Abschwächung der Spaltung beobachtet. Dies ergibt, dass der PNA-DNA-Hybrid während der ganzen Bestrahlungsdauer wärmestabil ist. Diese Experimente zeigen, dass die Spaltung aus der Anregung der AQ-Komponente entsteht und dass die Beschädigung an demselben Duplex lokalisiert ist, an dem das Photon absorbiert wird.
Eine selektive Spaltung an G-Resten durch Photonukleasen in Duplex-DNA ist typischerweise das Ergebnis entweder einer Elektronentransfer-Chemie oder von Singulettsauerstoff, welches durch Moleküle im Triplett-Zustand erzeugt werden kann. Wir haben auf die Beteiligung von Singulettsauerstoff durch Vergleichen der Spalteffizienzen für PNA/DNA-Hybrid in Gegenwert von D₂O mit H₂O getestet. (Die Lebensdauer des Singulettsauerstoffs wird nahezu zehnfach erhöht in Gegenwart von D₂O, was zu einer signifikant erhöhten Spaltung durch Singulettsauerstoff-Generatoren führt). Bei der in D₂O bestrahlten Probe findet keine Verstärkung der Spaltung statt, was gegen eine Rolle des Singulettsauerstoffs bei diesem Mechanismus spricht. Wir haben auch die Spaltung des DNA-Strangs im PNA/DNA-Hybrid unter Verwendung eines bekannten Singulettsauerstoff-Generators, nämlich Methylenblau, untersucht. Die Bestrahlung mit sichtbarem Licht (λ > 600 nm) führt zur selektiven Spaltung an den Guanin-Resten bei einem Muster, das dem der AQ-sensibilisierten Spaltung ähnlich ist. Allerdings wird diese Chemie stark erhöht, wenn D₂O durch H₂O ersetzt wird.
Bei einer ersten Betrachtung würden die ähnlichen Spaltungsmuster, wie für die direkte Bestrahlung des AQ und für die Singulettsauerstoff-Erzeugung durch Methylenblau beobachtet, nahelegen, dass die Chinon-vermittelte Spaltung auch Singulettsauerstoff einbezieht. Allerdings zeigt das Fehlen einer Inhibierung durch nicht-spezifische DNA, dass die Spaltung nicht durch frei diffundierenden Singulettsauerstoff vermittelt ist. Der einzige Weg, auf dem Singulettsauerstoff für die Spaltung verantwortlich sein könnte, besteht in dem Fall, dass es durch AQ an der zentralen Position des Duplex erzeugt wird, dann eindimensional entlang einer der Furchen in irgendeine Richtung diffundiert, bis es mit einem Guanin reagiert. Die für verschiedene Gs beobachteten unterschiedlichen Intensitäten würden dann den Zugriff der Base auf das Singulettsauerstoff-Molekül widerspiegeln. Ein derartiger Prozess sollte allerdings eine Distanzabhängigkeit zeigen, da der erste GG-Schritt in der 3'-Richtung erwartetermaßen eine Barriere für die Spaltung am distalen GG-Schritt sein sollte. Die gleich erfolgende Spaltung, die an diesen beiden Stellen beobachtet wird, stimmt eindeutig nicht mit einem derartigen Mechanismus überein. Ein weiterer Beweis gegen einen Singulettsauerstoff-abhängigen Mechanismus folgt aus der Beobachtung, dass Anthrachinon-2-sulfonat, das in Lösung frei diffundierend ist, keine Spaltung des PNA-DNA-Hybrids induziert. Es ist unwahrscheinlich, dass das kovalent gebundene AQ Singulettsauerstoff erzeugen kann, wenn das ungebundene AQ dies nicht kann, insbesondere im Lichte der starken Phosphoreszenz-Löschung (siehe Beispiel 10) innerhalb des Duplex. Ein weiteres Argument gegen durch Singulettsauerstoff erfolgende Spaltung leitet sich aus der densitometrischen Analyse des Verhältnisses der Spaltung an den 5'- und 3'-Guanin-Resten an der distalen GG-Stelle zum 3'-Ende des Duplex hin ab. Für die AQ-initiierte Spaltung beträgt dieses Verhältnis 1,40, wohingegen es für Methylenblau 0,69 beträgt. Wären dieselben Intermediate für die DNA-Beschädigung verantwortlich, so sollte das Verhältnis der 5'/3'-Spaltung für AQ und Methylenblau dasselbe sein.
Im Lichte der vorangegangenen Erörterung ist die einzige Erklärung für die beobachtete Spaltung ein Elektronentransfer im PNA/DNA-Duplex. Das AQ-Triplet wird durch Elektronentransfer von einer benachbarten Base gelöscht, was zur Injektion eines Ladungslochs innerhalb des Duplex führt. Dieses Ladungsloch kann anschließend durch die Helix wandern, bis es an einer GG-Stelle eingefangen wird (siehe 5). Der Einbau in den Duplex einer "Fang"-Stelle, d. h. einer Stelle mit einem sogar noch niedrigeren Oxidationspotenzial als GG, sollte die Spalteffizienz an der GG-Stelle beträchtlich verändern. Das Guanin-Oxidationsprodukt, 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-OxoG) wurde als einer potenzialen Fangstelle gewählt, da sein Oxidationspotenzial durch Sheu und Foote als ca. 0,4 V geringer als das von Guanin bewertet wurde (Sheu, C.; Foote, C. S. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 6439–6442). DNA579T (OxoG) ist der DNA579T analog, außer, dass G-13 durch 8-OxoG ersetzt ist. Diese DNA wurde an der 5'-Endigung gemäß standardmäßigen Verfahrensweisen radiomarkiert, dann mit PNA579 hybridisiert und bestrahlt. Nach der Piperidinbehandlung wird eine beträchtliche Verstärkung der Spaltung an der 8-OxoG-Position beobachtet, während die Spaltung an der distalen GG-Stelle relativ zu dem Fall beträchtlich unterdrückt ist, bei dem ein normales G an Position 13 vorhanden ist. (Siehe 14, vergleiche Bahnen 8 und 4). Diese Beobachtung stimmt mit einem Modell überein, bei dem das AQ im angeregten Zustand ein Elektron von einer benachbarten Base an der Interkalationsstelle annimmt, wobei ein Ladungsloch in die PNA/DNA-Helix injiziert wird. Dieses Ladungsloch wandert entlang der Helix mittels einer Reihe einzelner Elektronentransfers, bis es eine GG-Stelle erreicht, wo es durch Reaktion mit Wasser oder Sauerstoff eingefangen werden kann. Die (8-OxoG)G-Stelle stellt eine wirksamere Falle dar als eine normale GG-Stelle, indem sie die Wanderung des Ladungslochs zur distalen GG-Stelle hemmt. Signifikan terweise bleibt die Spaltung an der GG-Stelle in der anderen Richtung durch das 8-OxoG unbeeinflusst.
Beispiel 10
Beweis für den photoinduzierten Elektronentransfer durch Niedertemperatur-Phosphoreszenz-Experimente
Bei diesem Beispiel wird die Phosphoreszenzspektroskopie zur Untersuchung der Reaktion des AQ im angeregten Zustand mit dem PNA/DNA-Hybrid angewendet.
Die Phosphoreszenzemission wurde als einer Indikation für den Elektronentransfer von den Basen des Hybrids zum photoangeregten AQ gemessen, da der Elektronentransfer diese Emission löscht. (Die Quantenausbeuten für die Phosphoreszenz sind so gering, dass die Proben in einer gefrorenen Glasmatrix zubereitet werden mussten, um die Phosphoreszenz nachweisen zu können. Die verwendete Matrix bestand in 30% Ethylenglykol in 10 mM Phosphatbuffer, pH = 7,0. Stabile Hybride werden selbst in Gegenwart des Glykols gebildet, wie durch eine Unterdrückung der T_m um weniger als 5°C nachgewiesen.) Es wurden Proben bereitet, bestehend aus AQC(2) (ein wasserlösliches AQ) oder PNA-AQ alleine oder mit komplementärer DNA. In jedem Fall betrug die Konzentration des AQ (an PNA geknüpft oder unverknüpft) 5,0 μM, ebenso wie die DNA-Konzentration der letzten Probe. Die Proben wurden in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,0) und 30% Ethylenglykol zubereitet, was erforderlich ist, um ein Niedertemperatur-Glas zu erzeugen. Für PNA/DNA-Hybride wurden die Proben auf 85°C für 5 Minuten erhitzt und durften sich dann auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Ethylenglykol zugegeben wurde. Die Proben (400 μl) wurden NMR-Röhrchen zugegeben, zum Absetzen der Flüssigkeit am Boden der Röhrchen geschüttelt, dann in Flüssigstickstoff eingefroren. Die Phosphoreszenzspektren wurden über den Spektralbereich von 400 bis 600 nm unter Anregung bei 330 nm aufgezeichnet. Die Spalten wurden bei 5,0 mm an beide Monochromatoren eingestellt, um die Signalintensität zu maximieren. Die Spektren wurden nach Subtrahieren der Grundlinie aufgezeichnet, wie mit einem gefrorenen Glas, dem AQ fehlte, und einer Normalisierung bei 400 nm erhalten.
Die Emissionsspektren wurden für drei Fälle aufgezeichnet: (i) wasserlösliches AQ in Abwesenheit von PNA und DNA, (ii) einzelsträngige PNA, und (iii) PNA-DNA-Hybride. Für PNA579 wird die Phosphoreszenz um ca. 70% und > 90% in den einzelsträngigen bzw. Hybridformen gelöscht, relativ zum freien AQ. Dagegen wird für PNA586 die Phosphoreszenz um > 90% in sowohl den einzelsträngigen als auch den Hybridformen gelöscht. (Daten für PNA586 sind in 15 aufgetragen). Diese Ergebnisse zeigen, dass ein wirksamer photoinduzierter Elektronentransfer von den Basen zum AQ im Hybrid erfolgt. Darüber hinaus ist der Elektronentransfer in der einzelsträngigen Form ebenfalls recht effizient, was zeigt, dass die AQ-Komponente zum Reagieren mit den PNA-Basen als auch den DNA-Basen fähig ist.
Beispiel 11
DNA-Erkennung durch PNA-Haarnadeln
In diesem Beispiel wird die Anwendung der Hybridisation zur Hemmung der Elektronentransfer-Löschung beschrieben, was die Fähigkeit der PNA/DNA-Duplexe zeigt, als "Bioisolatoren" zu agieren.
In diesem Beispiel wird die Sequenz-spezifische Erkennung von ssDNA durch PNA-Haarnadeln 626 und 627 durch Wärmedenaturierung und Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen. Ein ähnlicher Ansatz wurde berichtet von Tyagi und Kramer (Tyagi, S.; Kramer, F. R. Nature Biotechnol. 1996, 14, 303–308). Bei dieser Strategie wurde eine DNA-Haarnadel mit einem Elektronendonator und -akzeptor markiert. Die Hybridisation führte zu einem verminderten Energietransfer zwischen dem Donator und dem Akzeptor. Die Verwendung von PNA bei der vorliegenden Erfindung anstelle von DNA ist aufgrund der überlegenen Hybridisationseigenschaften von PNA, nämlich der viel höheren Affinitäts- und Ionenstärke-Unabhängigkeit der PNA-DNA-Erkennung, bevorzugt. Die Wahl des Elektronentransfers anstelle des Energietransfers bei der vorliegenden Erfindung entspringt der Tatsache, dass weniger Beschränkungen hinsichtlich der Donator- und Akzeptor-Komponenten für die photoinduzierte Elektronentransfer-Chemie bestehen. Insbesondere können entweder der Donator oder der Akzeptor bestrahlt werden und besteht nicht die Anforderung, dass der Donator Licht einer kürzeren Wellenlänge als der Akzeptor absorbiert.
PNA626 und PNA627 sind nachstehend in ihren extendierten und gefalteten Konformationen gezeigt. PNA626 enthält eine Acridin-Komponente (R₂), welche als ein Lichtabsorbens und Elektronendonator fungiert, plus einer Anthrachinon-Komponente (Q₁), welche als ein Elektronenakzeptor fungiert. In der gefalteten Konformation sind das Acridin und Chinon in großer Nähe zueinander platziert, insbesondere dann, wenn beide innerhalb der Helix gestapelt sind, was zu einem effizienten photoinduzierten Elektronentransfer führt, welcher durch Löschen der Acridin-Fluoreszenz nachgewiesen wird. PNA627 ist analog dem PNA626, außer, dass ihm der Chinon-Akzeptor fehlt. Ein Thymin wird anstelle des Chinons aufgenommen, was zu einer T-T-Fehlpaarung in der gefalteten Konformation führt.
DNA-Ziele (einzelsträngig, linear)

626A: 5'-T-G-G-A-T-C-A-G-C-C-A-A-3'
626B: 5'-T-G-G-A-T-C-A-G-C-C-T-A-3'
626C: 5'-T-G-G-A-T-C-T-G-C-C-A-A-3'
626D: 5'-A-T-A-T-A-T-T-G-G-A-T-C-A-G-C-C-A-A-T-A-T-A-T-3'

626A ist perfekt komplementär zu der 12-Basensequenz, die das Chinon vom Acridin trennt. 626B und 626C werden mit den PNAs hybridisieren, doch bei einzelnen Basenfehlpaarungen. Die Fehlpaarung bei 626B wird nahe dem Ende des resultierenden Duplex lokalisiert sein, was ein Segment aus zehn Basenpaaren ergibt, wohingegen die Fehlpaarung bei 626C nahe dem Zentrum des resultierenden Duplex lokalisiert sein wird, was Segmente von 6 und 5 Basenpaaren ergibt. 626D wird mit der vollen Länge der PNAs hybridisieren, was Thymine gegenüber den Acridin- und Chinon-Komponenten platziert.
Wärmedenaturierungs-Experimente. Es wurden Proben hergestellt, die 2,5 μM PNA in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,0) mit und ohne 2,5 μM DNA626A enthalten. Die Schmelzkurven wurden durch Überwachen der Extinktion bei 260 nm über den Temperaturbereich von 25 bis 90°C aufgezeichnet.
16 zeigt die Schmelzkurven der PNAs in Abwesenheit von DNA. Die beträchtliche Hyperchromie (> 20%) stimmt eher mit einer gefalteten Haarnadelstruktur als einer extendierten linearen Konformation überein. Der Übergangsmittelpunkt liegt bei etwa 55°C für PNA627. Das Schmelzen ist für PNA626 komplexer, doch erfolgt der Übergang zur extendierten Konformation innerhalb des Bereichs von 55–65°C.
17 zeigt die Schmelzkurven der PNAs in Gegenwart von DNA626A. Die Tatsache, dass die beiden Kurven in dieser Figur signifikant verschieden von der in 1 sind, weist nach, dass die PNA- und DNA-Stränge miteinander wechselwirken. Ein klarer Übergang wird bei ca. 76°C für beide PNAs beobachtet. Dieser Übergang wird dem Schmelzen der gewünschten PNA/DNA-Hybride zugeschrieben.
Fluoreszenz-Experimente. Es wurden Proben zubereitet, die 1,0 μM PNA in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,0) mit und ohne 1,0 μM DNA enthielten. Die Proben wurden auf 90°C für 5 Minuten erhitzt, dann auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 90 Minuten abgekühlt. Die Fluoreszenz-Emissionsspektren wurden über den Bereich von 430–600 nm bei Anregung bei 417 nm aufgezeichnet. 2,5 mm-Spalten, 1,0 nm-Zunahmen und 0,5 Sek Integrationsdauer wurden für die Datenerhebung angewendet. Nach der Erhebung wurden die Spektren integriert, was die unten gezeigten Daten ergab.
Tabelle 3. Auswirkung der Hybridisation auf die ET-Löschung der Acridin-Fluoreszenz
Auswirkung von Chinon in PNA-Haarnadel. Beim Vergleich der Proben 1 und 6 ist die Fluoreszenz bei Vorhandensein des Chinons 3,6-mal geringer, was mit der Löschung der Acridin-Fluoreszenz durch Elektronentransfer zum benachbarten Chinon übereinstimmt. Das Fehlen einer vollständigen Löschung ist höchstwahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Elektronentransferreaktion energetisch nicht sehr günstig ist und die Lebensdauer des Acridins möglicherweise recht kurz ist (einige wenige Nanosekunden). Ein zusätzlicher Faktor, wie durch die breiten Haarnadel-Schmelzkurven angezeigt, ist der, dass das Acridin und ebenso das Chinon multiple Konformationen aufweisen (z. B. interkaliert und extrahelikal). Die unvollständige Löschung könnte aus einer Population von Haarnadeln entstehen, bei denen lediglich eines der beiden Chromophoren zum Zeitpunkt der Anregung tatsächlich interkaliert ist.
Auswirkung der Hybridisation. In Gegenwart von komplementärer DNA wird die Haarnadel zerstört und ein PNA/DNA-Hybrid gebildet. Im Hybrid sind das Acridin und Anthrachinon durch 12 Basenpaare getrennt, statt wie in der Haarnadel in Kontakt zu sein. Dies führt zu einem wesentlichen Anstieg der Fluoreszenz (vgl. Proben 1 und 2). Der Anstieg ist für PNA626 viel größer als für 627, was aufzeigt, dass der Großteil der erhöhten Fluoreszenz aus einem verzögerten Elektronentransfer statt aus der Veränderung in der Umgebung des Acridin-Fluorophors aufgrund der Hybridisation mit dem DNA-Strang resultiert. Zu beachten ist, dass die Fluoreszenz nach wie vor für PNA627 größer ist, was nahelegt, dass noch immer etwas Elektronentransfer-Löschung über 12 Basenpaare innerhalb des Hybrids auftritt.
Auswirkung der einzelnen Basenfehlpaarungen. Eine einzelne Fehlpaarung nahe dem Ende der Erkennungsstelle führt zu einer Abnahme von 12% der Fluoreszenzverstärkung, wohingegen eine Fehlpaarung nahe dem Zentrum der Erkennungsstelle zu einer Abnahme von 23% der Fluoreszenzverstärkung führt. Wie erwartet, ergibt die zentrale Fehlpaarung kürzere (und daher weniger stabile) Hybridregionen, was zu weniger Fluoreszenzverstärkung führt.
Auswirkung der Volllängen-Hybridisation. Die größte Verstärkung resultiert aus der Hybridisation mit einem DNA-Komplement der vollen Länge (DNA626D, siehe Proben 5 und 10). Dieses Ergebnis unterstreicht die Empfindlichkeit der Quantenausbeute der Acridin-Fluoreszenz auf ihre Umgebung: Die Emission ist signifikant größer, wenn das Acridin Teil eines Duplexes im Gegensatz zu einem Einzelstrang ist. (Die Ergebnisse für PNA627 zeigen auch, dass die Quantenausbeute der Acridinfluoreszenz für einen PNA-DANN- gegenüber einem PNA-PNA-Hybrid größer ist. Die Fluoreszenz steigt um 2,67 in Gegenwart von DNA.) Die Kombination dieser Wirkung mit dem verminderten Elektronentransfer ergibt diese große Fluoreszenzverstärkung.
Auswertung. Die Donator-Akzeptor-PNA-Haarnadeln scheinen designgemäß zu funktionieren, da signifikante Verstärkungen der Fluoreszenz aus der Hybridisation mit allen vier DNA-Oligomeren entstehen. In jedem Fall war die Fluoreszenz um 2,4- bis 2,8-mal höher für PNA626 als für PNA627, was die Wichtigkeit des Elektronenakzeptors im System nachweis. Die Experimente wurden an Proben vorgenommen, die jeweils 1 Nanomol des PNA- und des DNA-Ziels enthielten; dies konnte ohne weiteres um einen Faktor von 10 vermindert werden.
Beispiel 12
PNA-Haarnadel unter Verwendung eines unterschiedlichen Elektronendonators
Bei diesem Experiment ist die Benennung entsprechend dem Beispiel 11. N steht für das Monomer, das einen ANI-Rest enthält. Das N-Monomer ist in 18 gezeigt.
PNA 800: H-ATA-TQT-TGG-CTG-ATC-CAN-TAT-AT-LYS-Lys-NH2
PNA 801: H-ATA-TQX-TGG-CTG-ATC-CAN-XAT-AT-LYS-Lys-NH2
PNA 802: H-ATA-TTT-TGG-CTG-ATC-CAN-TAT-AT-LYS-Lys-NH2
In PNA 800 befinden sich die Ts gegenüber Q und N. In PNA 801 befindet sich ein nicht-basisches X gegenüber dem Q und N, was den massigen Chromophoren mehr Raum geben sollte. In 802 ist lediglich ANI platziert.
DNAs: (einzelsträngig, linear)
DNA A: 3'-ACC-GAC-TAG-GT-5'
DNA D: 3'-TAT-ATA-ACC-GAC-TAG-GTT-ATA-TA-5'
Analoge Tm-Experimente zum Acridin/Q-System wurden vorgenommen, und die Haarnadel-Bildung für einzelne PNA-Oligomere und die Hybridbildung für jedes PNA-Oligomer sowohl mit DNA A als auch D wurde gezeigt. Fluoreszenz-Experimente werden dann wie unten beschrieben vorgenommen, wobei die Quantifikation wie folgt war:
PNA 802 weist kein Q-Monomer auf, weshalb keine Differenz beim Fluoreszenzunterschied zwischen der Haarnadel und der ungefalteten Haarnadel, dem PNA-DNA-Duplex vorliegt. Sowohl bei PNA 800 als auch 801 löscht das Chinon die Fluoreszenz, wenn die Haarnadel gebildet wird. Dies zeigt, dass die Anregung von ANI zu einem Elektronentransfer zum Chinon führt, weshalb kein Strahlungsereignis stattfindet. Ist entweder die kurze oder die lange DNA vorhanden, so ist die Haarnadel ungefaltet und die Löschung durch das Chinon signifikant reduziert, was zur Fluoreszenz durch das AN-Chromophor führt. Dieses Experiment zeigt, dass der Elektronentransfer bei PNA/DNA nicht unmittelbar erfolgt und dass die dazwischenliegenden Basenpaare diese Eigenschaft ausüben.
a) N-Monomer-Synthese
Benzyl-N-(4-amino-1,8-naphthalimido)glycinat
Eine Suspension von 2,1 g (10 mmol) 4-Amino-1,8-naphthalimid und Kaliumcarbonat (4,14 g, 30 mmol) in DMF (50 ml) wurde bei 40°C für 0,5 Stunden gerührt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und Benzylbromacetat (12 mmol, 1,8 ml) wurde in einer Portion zugegeben. Die Suspension wurde über Nacht gerührt. Der Reaktion wurden 10 g Kieselgur zugegeben und durch 1 cm Kieselgur auf einem Filter filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand aus Ethylacetat auskristallisiert.
Ausbeute 3,1 g (89%)
¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 4,84 (s, 2H, CH₂CΟ); 5,19 (s, 2Η, CH₂CΟ); 6,87 (d, 1Η, H-3); 7,37 (m, 5H, Benzyl); 7,56 (s, 2Η, NH₂); 7,68 (t, 1Η, Η-6); 8,21 (d, 1Η, H-5); 8,46 (dd, 1H, H-2); 8,67 (dd, 1H, H-7).
N-(4-Amino-1,8-naphthalimido)glycin
Einer Lösung von Benzyl-N-(4-amino-1,8-naphthalimido)glycinat (2,5 g, 7,2 mmol) in THF (20 ml) wurde Lithiumhydroxid (30 ml, 1 M) zugegeben und dies 3 Stunden lang gerührt. Das THF wurde unter reduziertem Druck entfernt und der pH-Wert auf 2,8 eingestellt und die ausgefällte freie Säure durch Filtration abgesammelt und mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Ausbeute 1,6 g (86%)
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 4,66 (s, 2H, CH₂CO); 6,86 (d, 1H, H-3); 7,52 (s, 2H, NH₂); 7,67 (t, 1H, H-6); 8,20 (d, 1H, H-5); 8,45 (dd, 1H, H-2); 8,66 (dd, 1H, H-7).
N,N-(2-(N-(4-Amino-1,8-naphthalimido)glycinyl))-(2-Boc-aminoethyl))glycin
N-(4-Amino-1,8-naphthylimido)glycin (1,5 g, 5,8 mmol), DCC (1,6 g, 6,2 mmol) und DhbtOH (1,0 g, 6,2 mmol) wurden gemischt und 10 Minuten lang in DMF (35 ml) gerührt. Dann wurde Methyl-N-(2-Boc-aminoethyl)glycinat (1,5 g, 6,5 mmol) zugegeben und die Reaktion weitere 4 Stunden lang gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurde Dichlormethan (70 ml) zugegeben, woraufhin das Gemisch auf 0°C abgekühlt und filtriert wurde. Das Filtrat wurde mit Natriumbicarbonat (3 × 35 ml, 0,5 M), Natriumbisulfat (2 × 35 ml, 2 M) und Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft, Der Rückstand wurde in Tetrahydrofuran (20 ml) gelöst und Lithiumhydroxid (40 ml an 1 M) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden lang gerührt. Tetrahydrofuran wurde unter reduziertem Druck entfernt und die Lösung filtriert und der pH-Wert des Filtrats auf 2,8 eingestellt, welches die Titelverbindung ausfällte. Das Präzipitat wurde aus Ethylacetat rekristallisiert.
Ausbeute 2,1 g (72%)
¹H NMR (DMSO-d₆): δ 1,37 (d, 9H, Boc); 3,04 (m, 2H, CH₂); 3,27 (m, 2H, CH₂); 4,02 (d, 2H, CH₂CO); 4,80 (d, 2H, CH₂CO); 6,86 (m, 1H, H-3); 6,95 (m, 1H, NH); 7,52 (s, 2H, NH₂); 7,63 (m, 1H, H-6); 8,14 (m, 1H, H-5); 8,36 (m, 1H, H-2); 8,64 (m, 1H, H-7).
b) PNA-Synthese
Die drei PNA-Oligomere wurden gemäß den standardmäßigen Schemata synthetisiert. Die Oligomere wurden HPLC-gereinigt und die Identität durch Massenspektroskopie (MALDI-TOF) überprüft.

Berechnet/festgestellt

PNA 800: 6634/6643

PNA 801: 6386/6384

PNA 802: 6576/6576
e) Fluoreszenzmessungen
DNA-Oligomere wurden von Midland Certified Reagent Company bezogen, mittels Gelfiltration gereinigt und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie charakterisiert. Die Extinktionskoeffizienten der DNA-Oligomere wurden unter Verwendung der Werte der nächsten Nachbarn berechnet: für DNA A, ε₂₆₀ = 108.200 M^–1cm^–1; DNA D, ε₂₆₀ = 238.200 M^–1cm^–1. Entsprechend wurden die Extinktionskoeffizienten der PNA-Oligomere unter Verwendung der DNA-Werte bestimmt, wobei Adenin 4-Amino-1,8-naphthalimid oder Anthrachinon ersetzte: PNA 800, ε₂₆₀ = 232.900 M^–1cm^–1; PNA 801, ε₂₆₀ = 214.700 M^–1cm^–1; PNA 802, ε₂₆₀ = 228.900 M^–1cm^–1. Die Proben für alle Experimente wurden in einem 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH = 7,0 präpariert. Die Fluoreszenzspektren wurden mit Cary IE (UV-Vis) und SPEX 1681 FLUOROLOG aufgezeichnet.
Für die PNA-Haarnadeln wurden Proben hergestellt, die aus 1,0 μM PNA-Oligomer in 1,0 ml an 10 mM Natriumphosphat (pH 7,0) bestanden. Im Falle der PNA/DNA-Hybride wurde eine äquimolare Konzentration der PNA- und DNA-Oligomere (jeweils 1,0 μ) verwendet. Die Proben wurden in Küvetten (1,5 ml Volumen, 1,0 cm Weglänge) eingebracht und mit Teflonband versiegelt, um die Verdampfung von Wasser während der Erhitzungs/Abkühlzyklen zu verhindern. Dieselben Proben wurden auf 90°C für 5 Minuten erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um die vollständige Hybridisation zu gewährleisten. Die Proben wurden in eine Fluoreszenz-Küvette (von Hellma: 1,5 ml Volumen, 1,0 cm Weglänge) eingebracht und bei 450 nm angeregt. Die Fluoreszenzemission wurde von 460 bis 700 nm bei einer Rate von 1 nm/sek mit den folgenden Spaltgrößen überwacht: ex = 2,5 mm und em = 0,5 mm.

Claims

Verfahren zum Bestimmen einer Nukleinsäure in einer Probe, welches umfasst: – Binden an die Nukleinsäure eines Sondenmoleküls mit einem polymeren Grundgerüst, das verschieden vom natürlichen Zuckerphosphat-Grundgerüst ist, über eine Basen-vermittelte Wasserstoffbindung, wobei ein Elektronenakzeptor oder ein Elektronendonator oder ein Elektronenakzeptor und ein Elektronendonator kovalent gebunden ist an das Sondenmolekül an einer Position am polymeren Grundgerüst, die nicht an einer ersten und einer letzten Basen-tragenden monomeren Einheit des Grundgerüst lokalisiert ist, und worin eine Nukleobasen-Komponente von einer oder mehrerer der monomeren Einheiten vollständig durch eine Gruppe oder Gruppen ersetzt ist, die den Elektronendonator oder den Elektronenakzeptor enthalten, welcher zum Teilnehmen am vollständigen Transfer eines Elektrons fähig ist; – Herbeiführen eines Elektronentransfers von dem Elektronendonator oder zu dem Elektronenakzeptor, und – Bestimmen des Auftretens des Elektronentransfers als einem Maß der Nukleinsäure wobei der Elektronendonator oder Elektronenakzeptor von der allgemeinen Formel IIIa oder IIIb ist
worin X, Y, Z, Q, V und W unabhängig ausgewählt sind aus den Atomen C, N, S und O; X, Y, Z, Q, V und W durch entweder Einfach- oder Doppelbindungen miteinander verbunden sind; R₁–R₆ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe von -H, -O^–, -OH, -OR', -SH, -SR', -NH₂, -NO₂, -SO₃ ^–, -SO₂ ^–, -CN, -PO₃ ^2–, -PO₂ ^–, -COOH, -CO-R', -COOR', -CS-R', -CSO-R', -COO^–, -N=N-, Halogen, -NHR', -N(R'R''), Hydrocarbyl und Heterocyclus; R' und R'' unabhängig ausgewählt sind aus denselben Gruppen wie R₁–R₆; worin mindestens eines von X, Y, Z, Q, V und W zusammen mit einem von R₁–R₆ auch -CO^–, -SO^–, -SO₂ ^– sein kann, und mindestens eines von R₁–R₆ durch eine Einfach- oder Doppelbindung gebunden sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenakzeptor und/oder Elektronendonator ausgewählt ist aus den Gruppen der allgemeinen Formeln IVa–IVe
worin die Definitionen für R ausgewählt sind aus den möglichen Definitionen von R₁–R₆ der allgemeinen Formeln IIIA und IIIb in Anspruch 1 und worin n und m 0 sind oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 und k, r und l 0 sind oder eine ganze Zahl von 1 bis 4.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenakzeptor und/oder Elektronendonator ausgewählt ist aus den Gruppen der allgemeinen Formeln Va–Vd
worin R, k, l, m, n und r wie in Anspruch 2 definiert sind und worin r 0 ist oder eine ganze Zahl von 1 bis 4.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenakzeptor ausgewählt ist aus den Gruppen der allgemeinen Formeln VIa–VIc
worin R, k, l, m, n und r wie in Anspruch 2 definiert sind und worin o und p 0 sind oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 und t und q 0 sind oder eine ganze Zahl von 1 bis 4.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronentransfer durch Photoinduzierung hervorgerufen wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronendonator eine Nukleobase ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronendonator gebunden ist an das Sondenmolekül an einer Position am polymeren Grundgerüst, die nicht an einer ersten und einer letzten Basen-tragenden monomeren Einheit des Grundgerüst lokalisiert ist, und worin eine Nukleobasen-Komponente von einer oder mehrerer der monomeren Einheiten vollständig durch eine Gruppe oder Gruppen ersetzt ist, die den Elektronendonator enthalten.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronendonator gebunden ist an das Sondenmolekül und die andere Elektronentransfer-Komponente gebunden ist an ein weiteres Sondenmolekül, das an die Nukleinsäure gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenakzeptor gebunden ist an das Sondenmolekül an einer Position, die verschieden ist von der letzten Nukleobase-tragenden Untereinheit des Sondenmoleküls.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenakzeptor gebunden ist an das Sondenmolekül an einer nicht-terminalen Untereinheit des polymeren Grundgerüsts, das keine Nukleobase trägt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftreten des Elektronentransfers bestimmt wird durch Analysieren von Veränderungen im elektronischen oder photometrischen Status des Elektronenakzeptors.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftreten des Elektronentransfers bestimmt wird durch Analysieren von Veränderungen im elektronischen oder photometrischen Status des Elektronendonators.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftreten des Elektronentransfers bestimmt wird durch Analysieren von Veränderungen in der Molekularstruktur der Nukleinsäure im Vergleich zu der Struktur ohne der Induzierung des Elektronentransfers.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronendonator eine Guanin-Base ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronendonator eine Elektrode ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sondenmolekül an eine feste Phase gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung die Spaltung einer Nukleobase vom Grundgerüst ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Grundgerüst mindestens eine Peptidbindung umfasst.