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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäuremarkierungs-Chemie.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Markierung von Nukleinsäuren
mit detektierbaren Sonden war jahrzehntelang eine allgemeine Molekularbiologie-Labortechnik. In
den letzten Jahren stützte
sich die Entwicklung und der kommerzielle Erfolg von Nukleinsäuren-Mikroarrays
(manchmal auch Biochips genannt) oft teilweise auf die Verwendung
von markierten Nukleinsäuresonden.
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Viele
Nukleinsäure-Markierungstechniken
erfordern indirekte Markierung; mit anderen Worten, die Nukleinsäuren werden
mit einem Glied eines spezifischen Bindungspaares (z.B. Biotin)
markiert, mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert und mit dem
anderen Glied des spezifischen Bindungspaars, das detektierbar markiert
ist (z.B. Meerrettichperoxidase-markiertes Streptavidin), visualisiert.
Kürzlich
wurde direkte Markierung von Nukleinsäuren erreicht, mit Hilfe von
Bisulfit-katalysierter Transaminierung (BCT) von Cytidin-Resten innerhalb
einer Nukleinsäure
(U.S. Patente No. 5.506.350 und 5.491.224). Diese direkten, in Lösung durchgeführten Markieungsprozeduren
sind aber durch die Zeit limitiert (zwei oder mehrere Tage), die
erforderlich ist, um ausreichende Markierung der Nukleinsäure zu erreichen.
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Heutzutage
werden Oligonucleotide gemeinhin mit Hilfe einer Festphasen-Methodologie
gemacht, in der die Oligos durch sukzessive iterative Additionen
von Nucleosidmonomeren hergestellt werden, während die wachsende Oligonucleotidkette
an eine Festphase gebunden wird. Es wurden Oligonucleotide mit einzelnen
oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffmolekülen modifiziert, während sie
noch an der Synthese-Festphase gebunden waren, z.B. wie in Haralambidis
et al., Nuc. Acids Res., 18:501-505,1990
beschrieben. Diese Methodologie kann jedoch nicht an komplexen genomischen
DNAs angewendet werden, wie jenen, die aus festen Tumorproben oder
Blutproben extrahiert werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass auf einen festen Träger immobilisierte
Nukleinsäuren effizient
und schnell mit reaktiven Gruppen durch eine Transaminierungsreaktion
(z.B. eine Bisulfit-katalysierte Transaminierungs[BCT]reaktion)
funktionalisiert werden können.
Nach der Transaminierung können
die funktionellen Gruppen (typischerweise primäre Aminogruppen) mit einem
Fluoreszenzfarbstoff derivatisiert werden und mit Hilfe einer Vielfalt
an chemischen Reaktionen von der Festphase getrennt werden. Im allgemeinen
sollten diese Reaktionen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften
haben: (1) die Fluoreszenz des Farbstoffs nicht beeinträchtigen,
(2) die Hybridisierungseigenschaften der DNA-Sonde nicht beschädigen und
(3) hohe Ausbeuten an Fluoreszenz-markierten Nukleinsäure-Produkten geben.
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Ein
hervorstechender Aspekt der Erfindung ist die Reversibilität der Bindungs-Chemie.
Effiziente Bindung von Nukleinsäuren,
zum Beispiel, kann mit Hilfe von Phosphoramidat-Bindungen erreicht werden, die der BCT-
und der Farbstoff-Bindungs-Chemie
gegenüber
stabil sind, aber dennoch effiziente Trennung der Nukleinsäure von
dem festen Träger
erlauben, unter Bedingungen von erhöhten pH-Werten für die DNA-Stabilität. Weil
RNA unter Bedingungen erhöhter
pH-Werte hydrolysiert werden kann, könnte der Trennungsschritt bei RNA-Markierung
eine alternative Trennungs-Chemie erfordern, wie zum Beispiel thermische
Formamid-Behandlung.
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Dementsprechend
zeigt die Erfindung ein Verfahren zum Verknüpfen eines detektierbaren Markers
mit einer Nukleinsäure
durch (1) Bereitstellung einer an einen festen Träger (z.B.
ein Kügelchen
oder ein verchromter Objektträger
aus Glas) gebundenen (z.B. kovalent gebunden) Nukleinsäure, wobei
die Nukleinsäure eine
Cytidin-Base einschließt;
(2) Transaminierung der Cytidin-Base
mit einer reaktiven Gruppe, um eine kovalente Bindung zwischen der
Cytidin-Base und der reaktiven Gruppe zu bilden; und (3) Verknüpfen eines
detektierbaren Markers mit der reaktiven Gruppe, wobei der Transaminierungsschritt
eine Bisulfit-katalysierte Transaminierung, Bromierung/Aminierung
oder Transaminierung durch eine Platin-koordinierte Verbindung ist.
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Die
reaktive Gruppe kann sein a) ein Diamin, b) Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure oder
6-Aminohexansäure
oder c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und
10.000 Dalton hat. Das Diamin kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend
aus Propylen-, Butylen-, Pentylen-, Hexylen-, Ethylen- und Nonylen-Diamin
oder einem Diamin, das einen hydroxylierten Kohlenwasserstoff einschließt. Die
reaktive Gruppe kann Ethylendiamin oder Lysin oder Nithin sein.
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In
dem Verfahren kann die reaktive Gruppe in einem Lösungsmittel
gelöst
sein, das ein chaotropes Trihaloacetat-Anion (z.B. Trifluoracetat)
einschließt,
der detektierbare Marker kann ein fluoreszierendes Molekül sein und
die Nukleinsäure
kann etwa 1 bis 2 Kilobasen lang sein.
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Das
Verfahren schließt
optional die Freisetzung der Nukleinsäure vom festen Träger ein.
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Die
Nukleinsäure
kann durch Reaktion eines terminalen Phosphats einer Nukleinsäure und
eines Amino-aktivierten festen Trägers mit 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid
an den festen Träger
gebunden werden.
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Das
Verfahren schließt
ein Verfahren zum Verknüpfen
eines detektierbaren Markers mit einer Vielzahl von Nukleinsäuren ein,
wobei jede der Vielzahl eine einzigartige Sequenz hat.
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In
einem anderen Aspekt schließt
die Erfindung eine Zusammensetzung ein, die folgendes hat: (1) einen
festen Träger;
(2) eine an den festen Träger
gebundene Nukleinsäure,
wobei die Nukleinsäure
eine Cytidin-Base einschließt;
(3) eine reaktive Gruppe, die kovalent gebunden ist an die Cytidin-Base,
worin die reaktive Gruppe eine von folgenden ist: a) ein Diamin;
oder b) Isopipecolinsäure,
Glucosaminsäure
oder 6-Aminohexansäure;
oder c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und
10.000 Dalton hat; und (4) einen detektierbaren Marker, gebunden
an die reaktive Gruppe (z.B. ein Kügelchen oder ein verchromter
Objektträger
aus Glas), ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem Molekül, das eine Amino-, Carboxyl-, Aldehydradikal,
Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-, Sulfonylhalogenid- oder Carbonsäure-Gruppe oder
einen Fluorophor hat.
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Beispiele
einer reaktiven Gruppe sind Ethylendiamin, Lysin oder Ornithin.
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Zusätzlich kann
der detektierbare Marker ein fluoreszierendes Molekül sein,
die Nukleinsäure
kann etwa 1 bis 2 Kilobasen lang sein und die Nukleinsäure kann
kovalent an den festen Träger
gebunden sein. Die Nukleinsäure
kann an den festen Träger
gebunden werden, durch Reaktion eines terminalen Phosphats einer Nukleinsäure und
eines Amino-aktivierten festen Trägers mit 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid.
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In
noch einem anderen Aspekt schließt die Erfindung einen Kit
ein, der folgendes enthält
(1) einen festen Träger
(z.B. ein Kügelchen),
(2) ein Bisulfit, (3) eine reaktive Gruppe, die eins der folgenden
umfasst (a) ein Diamin; oder b) Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure oder
6-Aminohexansäure;
oder c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und
10.000 Dalton hat; und (4) einen detektierbarer Marker, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus einem Molekül, das eine Amino-, Carboxyl-,
Aldehydradikal-, Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-, Sulfonylhalogenid-
oder Carbonsäure-Gruppe
oder ein Fluorophor hat.
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Die
hierin beschriebene Festphasen-BCT-Markierungs-Prozedur kann innerhalb von Stunden
durchgeführt
werden, ein Zeitrahmen der unerwartet kürzer ist als der, der für BCT-Markierung in Lösung erforderlich ist.
Die neuen Markierungs-Techniken
sind insbesondere für
automatisierte oder roboterbezogene Markierung großer Zahlen
von DNA-Proben nützlich.
Zusätzlich
kann die Leistung der Festphasen-BCT-Markierung von DNA mittels Kits erleichtert
werden, die einen festen Träger,
einen detektierbaren Marker und zur Markierung benötigte BCT-Reagenzien
einschließen.
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Die
Entwicklung von Biochips hat die Zeit reduziert, die zur umfassenden
Analyse einer DNA-Probe erforderlich ist, durch Ermöglichung
simultaner Messung der Expression von Tausenden von Genen. Die Analyse-Gesamtzeit
ist aber in vielen Fällen
durch die Zeit limitiert, die erforderlich ist, um die Proben-DNA
direkt zu markieren. Durch Ermöglichung
hoch effizienter und schneller, direkter Markierung von Nukleinsäuren können die
Verfahren und Kits der Erfindung somit weiterhin die zur umfassenden
DNA-Analyse erforderliche Zeit vermindern.
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Zusätzlich stellen
die Zusammensetzungen der Erfindung ein neuartiges Mittel zur Analyse
einer DNA-Probe zur Verfügung.
Eine fluoreszierend markierte, auf einem festen Träger immobilisierte
DNA-Probe kann, zum Beispiel, mit Sonden-DNA hybridisiert werden,
die einen unterschiedlichen Fluoreszenzmarker enthält. Die
Anwesenheit einer Sequenz, die mit der Sonde hybridisiert, wird
dann durch eine Veränderung
in der Fluoreszenzfarbe detektiert.
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Wenn
nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Termini die gleiche Bedeutung, wie von jemandem
mit gewöhnlichem
Können
in dem Fachbereich, zu dem diese Erfindung gehört, gemeinhin verstanden. Obwohl
geeignete Verfahren und Materialien zur Durchführung oder dem Testen der vorliegenden
Erfindung weiter unten beschrieben werden, können auch andere, im Fachgebiet wohlbekannte
Verfahren und Materialien, die denen hierin beschriebenen ähnlich oder
ihnen äquivalent
sind, verwendet werden.
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Zusätzlich dienen
die Materialien, Verfahren und Beispiele nur zur Veranschaulichung
und sind nicht beabsichtigt limitierend zu sein.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung und aus den Ansprüchen
ersichtlich sein.
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Ausführliche
Beschreibung
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Markierung immobilisierter
Nukleinsäuren
durch Transaminierungsreaktionen, z.B. Bisulfit-katalysierte Transaminierungsreaktionen,
Zusammensetzungen, die BCT-markierte Nukleinsäuren einschließen, die
an einen festen Träger
gebunden sind, und Kits, die zur Durchführung der Markierungsreaktionen
ausreichen.
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Allgemeine
Methodologie
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Im
allgemeinen schließt
das neue Verfahren mindestens drei Schritte ein. Im ersten Schritt
werden die zu markierenden Nukleinsäuren isoliert und an einen
festen Träger
gebunden. Im zweiten Schritt werden die Cytosin-Reste innerhalb
der immobilisierten Nukleinsäure über eine
Transaminierungsreaktion, z.B. eine BCT-Reaktion, an eine reaktive
Gruppe gebunden. Andere Nukleinsäure-Transaminierungs-Markierungstechniken
schließen
Bromierung/Aminierung ein (Keller et al., Anal. Biochem. 170:441-450,
1998) und Chemie, die Platin-koordinierte Verbindungen betrifft
(Europäisches
Patent 0539466 B1). Im dritten Schritt wird ein detektierbarer Marker
an die reaktive Gruppe gebunden, wodurch der detektierbare Marker
an die Nukleinsäure
geknüpft
wird.
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Der
zweite und dritte Schritt kann zu jeder Zeit nach Immobilisierung
der Nukleinsäure
durchgeführt werden.
So zum Beispiel können
der zweite und dritte Schritt gleichzeitig in einer einzigen BCT/Markierungsreaktion
durchgeführt
werden, die die immobilisierte Nukleinsäure, einen Bisulfit-Katalysator
und ein Fluorophor-Konjugat, das eine reaktive Gruppe enthält, beinhaltet.
Die reaktive Gruppe kann auch an das Fluorophor gebunden werden
bevor das resultierende Konjugat an die immobilisierte DNA gebunden
wird.
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Verknüpfung von
Nukleinsäuren
mit festen Trägern
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Im
allgemeinen werden Nukleinsäuren
aus einer biologischen Probe (z.B. eine Blutprobe) isoliert oder gereinigt,
um sie für
Markierung geeignet zu machen. So zum Beispiel werden mononukleare
Zellen aus peripherem Blut aus einer Blutprobe isoliert. Aus den
Zellen wird dann mRNA isoliert und cDNA von der mRNA synthetisiert.
Die cDNA kann dann vor Bindung an einen festen Träger durch
Ethanolausfällung
oder andere Standardverfahren gereinigt werden. Aus den Zellen kann
alternativ genomische DNA isoliert werden und wahlweise durch Ultrabeschallung
geschert oder mit Endonucleasen verdaut werden, um einen gewünschten Längenbereich
von DNA-Fragmenten (z.B. 0,5 Kilobasen bis 5 Kilobasen, insbesondere
1 bis 2 Kilobasen) zu erhalten. Die genomische DNA kann auch chemisch
fragmentiert werden, wie in Iverson et al., Nucl. Acids Res., 15:7823,
1987, und Proudnikov et al., Anal. Biochem., 259:34-41, 1998 beschrieben.
Es kann Nukleinsäureisolierung
aus Zellen und cDNA-Synthese
mittels im Fachbereich wohlbekannter Standardtechniken durchgeführt werden.
Zusätzlich
sind kommerzielle Kits zur Durchführung dieser Prozeduren leicht
erhältlich.
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Ist
die Probe-Nukleinsäure
einmal wie erforderlich isoliert und gereinigt, wird die Nukleinsäure mit
einem festen Träger
verknüpft.
Beispiele für
feste Träger
schließen
Kügelchen,
z.B. gemacht aus Polystyren oder quervernetzter Agarose, und Objekt-Träger, z.B.
aus Glas oder Plastik, ein. Besonders geeignet sind Kügelchen,
weil sie die Oberfläche
auf der die Nukleinsäure
für nachfolgende
BCT-Reaktionen präsentiert
wird, maximieren. Zusätzlich
sind Amino-alctivierte Kügelchen,
wie EAH Sepharose (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Aminofunktionalisierte,
magnetische Eisenoxid-Kügelchen
(Advaced Magnetics, Inc., Cambridge, MA) und Amino-funktionalisierte
Polystyren-Mikrosphären
(Polysciences, Inc., Warrington, PA) leicht verfügbar und erleichtern die Anheftung
und die darauffolgende Entfernung von Nukleinsäuren.
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Andererseits
sind Objekt-Träger
aus Glas besonders geeignet, wenn die BCT-markierte Nukleinsäure mit
einer anderen Nukleinsäure
hybridisiert wird, während
sie noch mit dem festen Träger
verknüpft
ist. Falls nach Hybridisierung irgendwelche fluoreszierende Marker
zu detektieren sind, bieten verchromte Objekt-Träger aus Glas den Vorteil niedriger
Hintergrund-Fluoreszenz
und eine starke nichtkovalente Bindung zwischen der Proben-Nukleinsäure und
dem festen Träger.
Weitere Einzelheiten bezüglich
der Verwendung von verchromten Objekt-Trägern aus Glas als einen festen
Träger
für Nukleinsäuren können im
Europäischen
Patent No. 0962772 gefunden werden.
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Zur
kovalenten Bindung der Nukleinsäure
an den festen Träger
kann jede Anzahl an im Fachgebiet wohlbekannten Reaktionen verwendet
werden. BCT wird, zum Beispiel, nicht nur zur Markierung von Nukleinsäuren verwendet,
sondern auch um Nukleinsäuren
an feste Träger
zu binden (U.S. Patent No. 5.082.935). Zusätzlich kann 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)
carbodiimid (EDAC) verwendet werden, um ein terminales Phosphat
einer Nukleinsäure
mit einem Amino-funktionalisierten festen Träger, wie Polystyren, (Zammatteo
et al., Anal. Biochem., 236:85-94, 1996 und darin enthaltene Referenzen), über eine
Carbodiimid-Kondensationsreaktion zu verknüpfen.
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Bisulfit-katalysierte
Transaminierung von Nukleinsäuren
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Bisulfit-katalysierte
Transaminierung von Nukleinsäuren
ist eine spezifische Reaktion, welche eine reaktive Gruppe mit dem
N4-Atom im Cytidin verknüpft. Der detektierbare Marker
wird vorher, während
oder nach der BCT-Reaktion mit der reaktiven Gruppe verknüpft, wodurch
die Nukleinsäure
markiert wird. BCT-Chemie wird
zusätzlich
in Schulman et al., Nucl. Acids Res., 9:1203-1216 (1981), Gilliam
et al., Anal. Biochem., 157:199-207 (1986), Hayatsu, Prog. Nucl.
Acid Res. Mol. Biol., 16:75-124 (1976) und Draper, Nucl. Acids Res., 12:989-1002
(1984) beschrieben.
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Die
in BCT verwendete reaktive Ausgangsgruppe kann eine organische Verbindung
mit mindestens zwei Substituenten sein. Der erste Substituent ist
in der Lage mit Cytidin-Nucleotiden in einer Nukleinsäure zu reagieren.
Beispiele für
den ersten Substituenten schließen
Alkylamino- (primär
und sekundär),
Hydrazid-, Semicarbazid-, Thiosemicarbazid- und Acylhydrazid-Komponenten ein.
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Der
zweite Substituent der reaktiven Gruppe ist in der Lage mit einem
detektierbaren Markermolekül zu
reagieren. Der zweite Substituent kann blockiert oder nicht blockiert
sein, um gegen wahllose Reaktivität während der Verknüpfung des
Cytidins mit der reaktiven Gruppe über den ersten Substituenten
zu schützen. Ob
blockiert oder nicht blockiert, der zweite Substituent sollte in
der Transaminierungsreaktion, die die reaktive Gruppe mit dem Cytidin
verknüpft,
praktisch mit anderen Molekülen
nicht reagieren. Beispiele für
zweite Substituenten schließen
Amino-, Carboxyl-, Phosphat-, Sulfonat-, Sulfhydryl-, Hydroxyl-,
Hydrazid-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazid- ein. Die Carboxylgruppen
können
entweder in Salz-, Säure-
oder Ester-Form
sein. Wenn in Salz-Form, kann das Kation ein Alkalimetall sein,
wie Natrium oder Kalium.
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In
einer organischen reaktiven Gruppe können sich der erste und der
zweite Substituent an benachbarten Kohlenstoffatomen befinden oder
weiter weg entfernt sein. Die reaktive Gruppe kann ein gerader,
verzweigter oder cyclischer Kohlenwasserstoff sein und schließt eine
Ether- oder Thioether-Verknüpfung ein.
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Ein
Diamin ist ein anderes Beispiel einer geeigneten reaktiven Gruppe.
Als ein Diamin kann die reaktive Gruppe Propylen-, Butylen-, Pentylen-,
Hexylen- und Nonylen- Gruppen einschließen, wie CH3NH(CH2)2NH2 und
CH3NH(CH2)2NHCH3. Diamine,
die hydroxylierte Kohlenwasserstoffe einschließen, sind ebenfalls geeignete
reaktive Gruppen, einschließlich
1,3-Diamino-2-hydroxypropan,
1,4-Diamino-2,3-dihydroxybutan, 1,5-Diamino-2,3,4-trihydroxypentan, 1,6-Diamino-1,6-dihydroxy-D-mannitol,
1,6-Diamino-2,3,4,5-tetrahydroxyhexan, trans-1,2-Diamino-3,4,5,6-tetrahydroxycyclohexan.
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Andere
geeignete reaktive Gruppen schließen bestimmte Aminosäuren, Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure und
6-Aminohexansäure ein.
Die reaktive Gruppe kann ein Molekulargewicht unter 1000 Dalton
haben (z.B. unter 500, 250, 100 oder 50 Dalton). Nicht alle Aminosäuren sind
geeignet, weil einige Funktionalitäten enthalten, die in der BCT-Reaktion
beschädigt
werden könnten.
Zum Beispiel könnten
Schwefelenthaltende Aminosäuren
wie Cystin oder Cystein ungeeignet sein. Andererseits können Methionin-Reste
geeignet sein, weil der Schwefel in Form eines Sulfids vorzufinden
ist. Sicherlich enthalten einige Aminosäuren, z.B. Alanin, Glycin,
Valin und Isovalin Seitenketten, welche keine weitere Aufarbeitung
erlauben. Lysin oder Ornithin sind besonders nützliche Aminosäuren.
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Besonders
geeignete reaktive Gruppen sind Peptide, weil Peptidketten ein vorgebundenes
Farbstoffmolekül
enthalten können,
dessen Fluoreszenz durch die chemische Umgebung, die durch das verknüpfende Peptid
bereitgestellt ist, verstärkt
wird. Diese Farbstoffmoleküle
können
Molekulargewichte zwischen 500 und 10.000 Dalton haben. Die Löslichkeit
ist ein einschränkender
Faktor, weil relativ hohe Konzentrationen an reaktivem Ligand notwendig
sind (0.02 bis 2 M, insbesondere 0,2 bis 2 M), damit BCT bei einer
nützlichen
Geschwindigkeit stattfindet.
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Um
die Effizienz der Chemie zu erhöhen
kann die BCT-Reaktion
in einem chaotropen anionischen Lösungsmittel, wie Trihaloacetat,
durchgeführt
werden. Es ist bekannt, dass Nukleinsäuren, welche Sekundärstrukturen
bilden, gegenüber
BCT weniger anfällig
sind. Weil chaotrope Agenzien helfen können die Nukleinsäure in einer
denaturierten oder einzelsträngigen
Struktur zu erhalten, ist ihr Einschluß in die BCT-Reaktionsmischung
eine wünschenswerte
Option. Es wurde festgestellt, dass Trifluoressigsäure (TFA)
für die
Nukleinsäure-Transaminierungsreaktionen
besonders geeignet ist.
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Verknüpfung detektierbarer
Marker mit reaktiven Gruppen
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Die
in der Praxis dieser Erfindung benutzten detektierbaren Ausgangs-Markermoleküle enthalten
mindestens eine Markerkomponente, die in der Lage ist, mit dem zweiten
Substituenten der reaktiven Gruppe zu reagieren. Die Markerkomponente
kann eine Amino-, Carboxyl-, Aldehydradikal-, Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-,
Sulfonylhalogenid- oder
Carbonsäure-Gruppe
sein. Die gewünschte
spezifische Markerkomponente hängt
von der Natur des zweiten Substituenten der reaktiven Gruppe ab
und ähnlicherweise
hängt die Wahl
eines zweiten Substituenten von der zu benutzenden Markerkomponente
ab. Um Interferenz mit der Hybridisierung der Proben- Nukleinsäure mit
einem „Target" zu minimieren sollte
das Markermolekül
kleiner als 5000 Dalton sein (z.B. kleiner als 2500, 1000 oder 500
Dalton).
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Ist
das detektierbare Markermolekül
ein Fluorophor, kann das Fluorophor einen Extinktionskoeffizienten
von mindestens etwa 6.000 M–1cm–1 haben
(z.B. mindestens 10.000 M-1cm–1)
bei einer Anregungswellenlänge
und einer Quantenausbeute von etwa mindestens 0,02. Beispiele von
detektierbaren Markermolekülen schließen Amino-funktionalisierte
Fluorophore ein, erhältlich
von Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, wie 7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure, Succinimidylester
(AMCA); Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas RedTM);
5- (und 6-) Carboxylrhodamine 101, Succinimidylester; Lissamin Rhodamin
B Sulfonylchlorid; 5- (und 6-) Carboxylfluorescein, Sucinimidylester;
7-Diethylaminocumarin-3-carbonsäure,
Succinimidylester; Tetramethylrhodamin-5-(und 6-)isothiocyanat;
N-(4,4-Difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-3-indacenpropionsäure, Succinimidylester;
aktiviertes Fluorescein-Derivat
(FAP); Eosin-5-isothiocyanat; Erythrosin-5-isothiocyanat und ein
O-Acetylazid-Dervat der 1-Hydroxy-3,6,8-pyrentrisulfonsäure (Cascade BlueTM Acetylazid).
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Die
Reaktionsbedingungen zur Verknüpfung
der reaktiven Gruppe mit dem detektierbaren Marker sind im Fachgebiet
wohl bekannt (siehe, z.B. U.S. Patent No. 5.506.250).
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Verwendungen
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Die
Verfahren der Erfindung können
von Laborpersonal mit gewöhnlichen
Fähigkeiten
im Fachgebiet der Biochemie oder Molekularbiologie durchgeführt werden.
Der Laborarbeiter kann, zum Beispiel, einen Kit der Erfindung verwenden,
der einen festen Träger
(z.B. Amino-aktivierte Sepharose-Kügelchen), eine Bisulfit-Lösung, eine
reaktive Gruppe (z.B. Ethylendiamin) und einen detektierbaren Marker
(z.B. ein Amino-aktiviertes Fluorophor) umfaßt, um die Aminosäure mit
irgendeinem von verschiedenen Fluorophoren chemisch zu markieren,
in einem Maßstab
von z.B. 5,0 μg
bis 1,0 mg. Ist die zu markierende Nukleinsäure-Probe einmal gereinigt
und/oder isoliert, wird die Nukleinsäure mit den Kügelchen
verknüpft
und wie oben beschrieben markiert. Jeder Schritt der Reaktion wird
durch die Verwendung der Kügelchen
erleichtert, was schnelle Waschschritte mit Hilfe von Zentrifugation
erlaubt.
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Der
Kit kann alternativ eine 96-„well"-Mikrotiterplatte
aus Polystyren einschließen,
wovon jedes „well" mit Hilfe von Standardtechniken
Amino-funktionalisiert werden kann. Vielfache Nukleinsäure-Proben
können dann
mit den „wells" verknüpft werden
und parallel markiert werden, während
jede Nukleinsäure-Probe
von den anderen getrennt gehalten wird.
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Zusätzlich können eher
automatische oder Roboter-Geräte
zur Verrichtung der Reaktionsschritte verwendet werden, als dass
ein Laborarbeiter sie durchführt,
um eine große
Anzahl (Hunderte bis Tausende) von Nukleinsäure-Proben parallel und/oder
in Serien zu bearbeiten und zu markieren. Geeignete Geräte und Systeme
zur Automatisierung der Verfahren der Erfindung schließen das
Biomek 2000 System (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) und
das BioRobot 9600 System (Qiagen, N.V., Venlo, Holland) ein. Sowohl
die Biomek 2000 als auch die BioRobot 9600 Produkte verwenden integrierte
Computer-Steuerung und -Monitoring, als notwendig zur Durchführung der
Verfahren der Erfindung.
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Die
Zusammensetzungen und Kits der Erfindung schließen auch Mikrochips ein, die
in den Verfahren der Erfindung verwendet werden können. Der
Begriff Mikrochip oder „Chip" wird hierin zur
Beschreibung von Mikroarray-Geräten
für DNA-Analyse
verwendet. Diese Mikrogeräte
bestehen aus zweidimensionalen Arrays von Locus-spezifischen DNA-Sequenzen,
die auf einem geeigneten Glas oder einer verchromten Glasoberfläche immobilisiert
sind. Die Arrays aus oberflächengebundenen
DNA-Fragmenten können zur
simultanen Analyse von Hunderten von genetischen Loci in einer Untersuchungsprobe
(für gewöhnlich grün-fluoreszierend markiert)
durch Hybridisierung verwendet werden, wenn diese Untersuchungs-DNA
auf die Chipoberfläche
mit z.B., einer rot-fluoreszierend markierten Referenz-DNA co-hybridisiert wird.
Dann stellt grün/rote
Fluoreszenzverhältnis-Messung ein Maß der relativen
Kopienzahl an den konkreten Loci bereit, dargestellt von dem Oberflächen-Array
aus als Punkte aufgetragene DNAs. Auf dem MEMS- (miniaturisierte
elektromechanische Systeme) Gebiet im allgemeinen wird aber der
Begriff Mikrochip in einem viel weiteren Sinne verwendet, um irgendeines
einer Anzahl von Geräten
zu beschreiben, die in der Lage sind eine Vielfalt von mechanischen
oder chemischen Abtast-Operationen
auszuführen,
wie Bewegungs-Abtasten (Airbag-Ausbreitungs-Sensoren), Tintenstrahldruckköpfe oder
biochemische Sensoren (tragbare Blutanalysiergeräte). Diese MEMS-Geräte sind typischerweise
in Silikonwafern mikrobearbeitet durch hochauflösende Oberflächenätzungsverfahren,
die von diejenigen im Fachgebiet routinemäßig praktiziert werden. Aus
Glas oder Plastik gebaute MEMS-Geräte können auch hergestellt werden.
In vielen chemischen Abtastungs-Anwendungen werden Flüssigkeiten
mittels Miniaturmembranpumpen in Silikon-geätzte Kanäle bewegt oder in Glaskanäle mittels
elektroosmotischem Fluß (EOF),
der durch Anlegen einer Spannung quer durch den Kanal erzeugt wird.
Jene Geräte,
in denen Flüssigkeiten
entlang Mikrokanälen
fließen,
werden „microfluidics"-Geräte genannt.
Eine zeitgerechte Besprechung des aktuellen Stands der „microfluidics-System-Entwicklung" kann in Chemical & Engineering News,
February 22, 1999, pp27-36 (American Chemical Society, Washington
DC, USA) gefunden werden.
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Automatisierte
direkte Markierung kann auf einem „microfluidics"-Gerät oder „pillar
chip" (Säulenchip) praktiziert
werden, hergestellt von Cepheid Inc., Sunnyvale, CA (www.cepheid.com)
und beschrieben in Petersen et al., IVD Technol. 4:43-49, 1998.
Diese Säulenchips
(ungef. 5 × 5
mm2) sind aus Tausenden von Silikonfingern
(200 μm
hoch und 34 μm
im Zentrum) gemacht, die in eine kleine Kammer (3,5 mm2 mit
einer Gesamtinnenoberfläche
von 36 mm2) hervorragen, die in eine Silikonwafer
geätzt
ist. Die Kammer wird von einer Glaslasche, die mit der Wafer verbunden
ist, versiegelt. Über
Eintritts- und Auslaßöffnungen
die in den Chip diagonal gegenüber
eingearbeitet sind, werden Flüssigkeiten
in den Chip eingeführt.
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Wie
zuerst hergestellt, ist der Chip reines Silikon, das nicht zu Bindung
von biologischen Liganden führt.
Wird die Oberfläche
aber oxidiert, um eine dünne
Schicht Siliziumdioxid zu erzeugen, können eine Anzahl verschiedener
chemische Verfahren zur Oberflächenmodifizierung
verwendet werden. Durch Verwendung von, zum Beispiel, Silan-aktivierenden
Agenzien, kann die Siliziumoxid-Oberfläche mit, zum Beispiel, Amino-,
Sulfhydryl, Hydroxyl- oder Epoxid- reaktiven Gruppen funktionalisiert
werden, die nachher verwendet werden können um biochemische Liganden
an die Oberfläche
zu binden. So zum Beispiel wird durch die Reaktion der Siliziumdioxid-Chipoberfläche mit
3-Aminopropyltrimethoxysilan eine Oberfläche produziert, die mit Aminogruppen
modifiziert ist, an die doppelsträngige oder einzelsträngige DNA-Oligunucleotide,
die eine terminale Phosphomonoester-Gruppe enthalten, kovalent gebunden
werden können,
durch die EDAC Carbodiimid Kopplungseinrichtung, die verwendet wird,
um diese Nukleinsäuren
an Polymerkügelchen
zu binden, wie hierin beschrieben. Siehe auch Joos et al., Anal.
Biochem. 247:96-101, 1997, der Carbodiimid-aktivierte Bindung von
carboxylierten Oligonucleotiden an Aminopropylsilan-modifizierte
Glas-Festphasen
beschreibt.
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Die
Amino-modofizierte Chipoberfläche
kann mit Nukleinsäuren
auch durch die Mittel der in U.S. Patent No. 5.091.519 beschriebenen
BCT-Reaktion reagieren. Für
In-situ-Synthese
von Oligos auf einer Epoxid-modifizierten Glas-Mikroskop-Objektträger-Oberfläche, siehe Madkos et al., Nuc.
Acids Res. 20:1679-1684, 1992, und darin enthaltene Referenzen.
Falls die Epoxid-modifizierte Glasoberfläche in eine Hydroxyl-Oberfläche umgewandelt
wird, wie von Maskos et al., weiter oben, gezeigt, dann ist Bindung
von Nukleinsäuren
mittels Bromcyan-Aktivierung
möglich.
Zur Bindung von Oligos an eine Sulfhydrylmodifizierte Glas-Objektträger-Oberfläche, siehe,
z.B., Rogers et al., Anal. Biochem. 266:23-30, 1999.
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Reversible
Bindung von DNA kann mit Hilfe der oben beschriebenen EDAC/Phosphoramidat-Prozedur
erreicht werden. Eine Sulfhydryl-Festphase und Disulfid-Verknüpfung der
DNA mit dem Träger
ist mit reduzierenden Agenzien spaltbar, aber eine Disulfid-Bindung
ist gegenüber
den BCT-Bedingungen nicht stabil.
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Mit
einer Gesamtfläche
der inneren Oberfläche
von ungefähr
0,3 cm2 und einer theoretischen maximalen
Bindungseffizienz von 1014 Molekülen/cm2 (ungef. 5 × 10–11 Mol/Chip)
ist der Chip in der Lage ungefähr 8 μg eines 500
bp langen doppelsträngigen
genomischen DNA-Fragments zu binden. Auch wenn die tatsächliche
Ladungskapazität
1-5% der theoretischen ist, würde
der Chip dann in der Lage sein genügend genomische DNA für die Analyse
auf einem DNA-Mikroarray zu markieren.
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Ein
anderer Ansatz der mit dem Säulenchip
(oder mit Kügelchen)
verwendet werden kann ist, die DNA enzymatisch zu markieren, zum
Beispiel durch Bruchstellen-Translation mit fluoreszierenden Nucleotiden, während die
DNA noch an die Festphase gebunden ist. Die DNA kann von der Festphase
freigesetzt werden, mit der Referenz-DNA gemischt und auf ein Mikroarray
gekippt werden. Die Zukunft könnte
das Mikroarray als eine Komponente eines integrierten Microfluidics-Analysesystems
halten, das in der Lage ist DNA zu isolieren, zu markieren, zu hybridisieren
und zu analysieren.
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BEISPIELE
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Die
Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen beschrieben
werden, die den Schutzumfang der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindung
nicht einschränken.
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Beispiel 1: Bisulfit-vermittelte
Fluoreszenz-Markierung einer Nukleinsäure auf einem festen Träger
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Fünfzig Mikroliter
kommerziell aminierter Diaminodipropylamin (DADPA)-Kügelchen
(Pierce Catalog No. 53147) wurden mit 50 μg ultrabeschallter, Hitze-denaturierter
genomischer DNA aus humaner Plazenta gemischt, in Anwesenheit von
0,2 M 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) und 0,1
M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
(MES; pH 6,0). Die Mischung wurde eine Stunde lang bei 50°C inkubiert.
In einem separaten Experiment war über-Nacht Inkubation bei Raumtemperatur
ebenfalls ausreichend, um die DNA an die Kügelchen zu binden.
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Es
wurde festgestellt, dass diese Festphasen-Bindeprozedur etwa 35 μg der 50 μg Ausgangs-DNA stark
gebunden hat. Das Verknüpfen
war bei einer Inkubation in 0,2 M MOPS (pH 7,4) oder 50 mM NaCl
bei 65°C
bis zu 310 Minuten lang stabil. Etwa 10 μg der 50 μg Ausgangs-DNA war schwach an
die Kügelchen gebunden
und konnte freigesetzt werden, durch Inkubation der DNA/Kügelchen
Mischung in 62,5 mM Natriumborat und 1,25 M NaCl (pH 8,5) bei 65°C, sechs
oder mehr Minuten lang.
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Die
Kügelchen
wurden dann fünfmal
gewaschen, eine Minute jede Waschung, mit doppelt destilliertem Wasser
(ddH2O). Die Waschung wurde durch Zentrifugation,
Entfernung des Überstands
und dann wieder Suspendieren in Wasser durchgeführt. Die DNA wurde bei 95°C fünf Minuten
lang denaturiert, gefolgt von rascher Kühlung durch Eintauchen in ein
Eisbad. Es wurde festgestellt, dass etwa 33 μg von den 50 μg Ausgangs-DNA
nach Denaturierung und Kühlung
immer noch an den Kügelchen
gebunden waren.
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Es
wurde ein Transaminierungs-Puffer hergestellt durch Hinzufügen von
1,53 ml Trifluoressigsäure (TFA)
zu 2,5 ml deionisiertem Wasser. Dem Puffer wurde erlaubt 10 Minuten
lang auszukühlen.
0,87 ml Ethylendiamin (freie Base; Sigma Catalog No. E 4397) wurden
dann langsam zu dem Puffer auf Eis hinzugefügt. Nach Auflösung des
Ethylendiamins wurde der Puffer auf Raumtemperatur erwärmt. 0,475
g Natriummetabisulfit (Aldrich Catalog No. 25.555-6) wurden zum
Puffer hinzugefügt
und der Puffer wurde auf 45°C
erwärmt, um
das Bisulfit aufzulösen.
Der pH-Wert des Puffers wurde durch Zugabe von TFA auf 7,0 eingestellt
und das Volumen des Puffers wurde auf 5 ml eingestellt. 50 μl einer 100
mg/ml Hydrochinon-Lösung
wurden dann zum Puffer hinzugefügt.
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Um
die immobilisierte DNA zu transaminieren, wurden 125 μl eines Bisulfit-Transaminierungs-Puffers zu
der DNA/Kügelchen
Mischung hinzugefügt
und die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 65°C inkubiert, um das Ethylendiamin
an die Cytosin-Reste in der DNA zu binden. In einem getrennten Experiment
wurde die Transaminierung der DNA bei Raumtemperatur über Nacht
ebenfalls als akzeptabel befunden. Die Kügelchen wurden erneut 5X mit
ddH2O gewaschen, um überschüssigen Puffer zu entfernen.
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Die
Kügelchen
wurden dann in 550 μl
CarboxyXRhodamin-NHS-Ester – Markierungspuffer
(2-5 mM Fluorophor in 62,5 mM Natriumborat, 1 M NaCl [pH 8,5] und
15 % [v/v] DMF) suspendiert. Die Kügelchen wurden im Markierungspuffer
eine Stunde lang bei 50°C
inkubiert, dann 5X mit ddH2O gewaschen,
um den Markierungspuffer zu entfernen. In einem separaten Experiment
wurde Markierung bei Raumtemperatur nach 16 Stunden erreicht.
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Um
die markierte DNA freizusetzen wurden die Kügelchen in 0,1 ml 50 mM NaOH
bei 65°C
eine Stunde lang inkubiert. (Obwohl zeitaufwändig, könnte die DNA auch durch Inkubation
in Formamid bei 75°C,
72 Stunden lang, von den Kügelchen
freigesetzt werden. Die Formamid-Denaturierungs-Lösung wurde
durch Zusammenmischen von 49 ml Formamid, 7 ml 20 × SSC, 14
ml Wasser hergestellt, was eine 70%ige Foramidlösung bei einem pH-Wert von
7,5 als Ergebnis hat.) Durch diese erste Inkubation wurden etwa
15 μg markierte DNA
wiedergewonnen. Durch eine zusätzliche,
eine Stunde lange Behandlung in 50 mM NaOH bei 65°C wurden
weitere etwa 10 μg
DNA wiedergewonnen. Im allgemeinen kann die Effizienz der DNA-Freisetzung durch Änderung
von Zeit, Temperatur, pH-Wert oder Zugabe eines Katalysators optimiert
werden. Die markierte DNA-Lösung wurde
mit 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat neutralisiert, um den pH-Wert
auf 6,0 einzustellen. Die DNA wurde dann mittels Ethanolausfällung isoliert.
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Die
obige Prozedur wurde wiederholt, um humane genomische Plazenta-DNA
mit 6-(Fluoirescein-5- (und-6)-carboxamido) hexansäure – NHS – Ester
und 5,6-Carboxytetramethylrhodamin – NHS – Ester zu markieren.
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Beispiel 2: Verwendung
von Fluoreszenz-markierter Nukleinsäure zur Visualisierung von
Metaphase-Chromosomen
-
Die
mit 5,6-CarboxyXRhodamin -NHS – Ester,
6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido)hexansäure – NHS – Ester
und 5,6-Carboxytetramethylrhodamin – NHS -Ester markierte DNA,
wie in Beispiel 1 oben hergestellt, wurde jeweils getrennt mit humanen
primär-Lymphozyt-Metaphase-Chromosomen
In-situ hybridisiert, wie in U.S. Patent No. 5.776.688 beschrieben.
Die Marker waren für
Chromosomstrukturen spezifisch und die Signalintensitäten waren
für alle
drei Marker mäßig bis
gut.
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Beispiel 3: Verwendung
von Fluoreszenz-markierter Nukleinsäure auf AmpliOnc® Biochip
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Mit
6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido)hexansäure – NHS – Ester markierte Versuchs-DNA
von humanen Colonkrebszellen (colo 320) und mit 5,6-CarboxyXRhodamin
-NHS – Ester
markierte normale humane Vergleichs-DNA wurden wie folgt hergestellt.
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Ultrabeschallte
colo 320 – DNA
(50μg in
50 μl; durchschnittliche
Fragmentgröße 300 bis
3000 bp) wurde bei 95°C
5 Minuten lang Hitze-denaturiert und auf Eis rasch gekühlt. 50 μl DADPA Kügelchen-Suspension (Pierce)
wurde wiederholt in Wasser gewaschen und in Wasser suspendiert,
so dass das Endvolumen von Kügelchen
plus Überstand
25 μl war.
Die DNA-Lösung wurde
zur Kügelchen-Supension
hinzugefügt,
gefolgt von der Zugabe von 25 μl
0,5 M MES Puffer und 25 μl
0,5 M EDAC. Die Mischung wurde eine Stunde lang bei 50°C erhitzt.
Die Kügelchen
wurden durch Filtration isoliert und 5 Mal mit 250 μl Wasser
gewaschen. Schließlich
wurden die Kügelchen
in 100 μl
Wasser suspendiert. Ein 10 μl
Aliquot dieser Kügelchen-Suspension
setzte 3,1 μg DNA
frei, wenn für
eine Stunde mit 50 mM NaOH bei 65°C
behandelt.
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Zehn
Mikroliter Kügelchen-Suspension
wurden entfernt (nominell äquivalent
mit 5 μg
DNA, angenommen die ganze Input-DNA
hatte gebunden) und in 50 μl
Wasser suspendiert. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 95°C erhitzt
und auf Eis rasch gekühlt.
Die Kügelchen
wurden mittels Zentrifugation isoliert, der Überstand entfernt und frisch
hergestellte TFA-Aminierungs-Mischung
(125 μl),
die auf 65°C
vorgewärmt
worden war, wurde hinzugefügt.
Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 65°C erhitzt. Die Aminierungsreaktion
wurde unverzüglich
auf Eis gekühlt
und die Kügelchen
wiederholt in Wasser gewaschen.
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Die
Kügelchen
wurden in 110 μl
Markierungs-Puffer (0,1 M Natriumborat, 1 M Natriumcitrat, pH 8,2) suspendiert.
Dann wurden 22 μl
6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido)hexansäure – NHS – Ester (FCHA-NHS, 20 mM in
DMF) hinzugefügt.
Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 50°C erhitzt. Die Kügelchen wurden
mittels Zentrifugation isoliert und wiederholt mit Wasser gewaschen.
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Die
Kügelchen
wurden in 100 μl
50 mM NaOH suspendiert und eine Stunde lang bei 65°C erhitzt.
Die Kügelchen
wurden mittels Zentrifugation durch einen Zentrifugenfilter entfernt
und das Filtrat, das die fertige markierte Sonde enthielt, wurde
aufgefangen.
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Dem
Filtrat wurden 0,1 Volumen Natriumacetat und 2,0 Volumen Ethanol
hinzugefügt.
Die Mischung wurde bei –20°C 15 Minuten
lang gekühlt
und die DNA mittels Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wurde
mit 70%igem wäßrigem Ethanol
gewaschen und weiter durch Auflösen
in 60 μl
Wasser, gefolgt von Durchlauf über eine
Biospin 30 Säule
(BioRad, Hercules, CA), gereinigt. Das Endvolumen von Sonden-Lösung war
65 μl.
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Fünfzehn Mikroliter
der Sonden-Lösung
wurden mit 100 μg
Cot 1 – DNA
(Blocker- DNA; siehe weiter unten) und 200 ng 5,6-CarboxyXRhodamin
-markierter männlicher
Vergleichs-DNA kombiniert. Die DNA-Mischung wurde dann wie oben
beschrieben mit Ethanol ausgefällt.
Die Cot-blockierte colo 320 – DNA
wurde auf Mikroskop-Objektträgern,
die mit Hilfe von Standardprotokollen mit humanen Lymphozyten beschichtet
waren (siehe Beispiel 2), hybridisiert. Der amplifizierte c-myc
Locus auf Chromosom 8, der in der colo 320 Zelllinie vorhanden war,
erschien als zwei grünfluoreszierende
Punkte in Methaphase-Nuclei, mit guter Signalintensität und gutem
Hintergrund.
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Fünfzehn Mikroliter
FCHA-markierte colo 320 – Sonde
und 5 μl
(500 ng) 5,6-CarboxyXRhodamin -markierte männliche Vergleichs-DNA wurden
in einem SpeedVac-Konzentrator zur Trockenheit verdampft. Zu 5,4 μl Wasser
wurden 5,4 μl
(100 μg)
Cot 1 – DNA
und 16,2 μl
Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 2 X SSC, 10% Dextransulfat)
hinzugefügt.
Die Sonden-DNA Mischung wurde bei 80°C 10 Minuten lang Hitze-denaturiert,
2 Stunden lang bei 37°C
vorhybridisiert, auf das AmpliOncTM -Mikroarray
aufgetragen und bei 37°C über Nacht
hybridisiert. Die Chips wurden aus dem 37°C – Inkubator entfernt und gewaschen.
Die Chips wurden dreimal 2 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1
X SSC gewaschen, gefolgt von dreimal 10 Minuten lang Waschen bei
40°C in
50% Formamid/2 X SSC und schließlich
dreimal 2 Minuten lang Waschen bei Raumtemperatur in 1 X SSC. Dem
Mikroarray wurde erlaubt einige Minuten lang an der Luft zu trocknen.
DAPI-Kontrastfärbung enthaltende
Gel-Fassung wurde hinzugefügt
und die grün/rot
Fluoreszenzverhältnisse
wurden mit einem betriebseigenen Fluoreszenz-Abbildungsinstrument
(siehe weiter unten) quantitativ bestimmt.
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Es
ist bekannt, dass die Krebszellen-DNA ein amplifiziertes c-myc Gen
hat. Die markierten DNAs wurden zur Hybridisierung mit einem AmpliOncTM (Vysis, Inc.) -DNA-Biochip verwendet.
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Der
AmpliOncTM-Chip enthält ein Mikroarray aus Nukleinsäuren, das
Gene darstellt, von denen bekannt ist, dass sie an humanen Krebsarten
beteiligt sind. Es sind auch Negativkontroll-Punkte, die z.B. lambda-Phagen-DNA
enthalten, eingeschlossen. Jedes Krebsgen wird von fünf identischen
Flecken am Mikroarray dargestellt. Bei Verwendung wird der AmpliOncTM-Chip
mit einer normalen Probe Vergleichs-DNA, die mit einem Fluorophor
von einer bestimmten Farbe markiert ist, und mit einer Probe Versuchs-DNA,
die mit einem Fluorophor von einer anderen Farbe markiert ist, hybridisiert.
Um ein amplifiziertes Krebsgen zu detektieren werden alle Punkte,
die jenes Gen darstellen, von dem mit der Versuchs-DNA assoziierten
Fluorophor unverhältnismäßig gefärbt. Die
Punkte, welche nicht amplifizierte Gene darstellen, sollten etwa
gleiche Mengen von beiden Fluorophoren haben.
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Ein
AmpliOncTM-Chip wurde mit 25 μl Hybridisierungspuffer
bei 37°C
16 Stunden lang hybridisiert. Der Hybridisierungspuffer war 2 X
SSC, mit Zusatz von 50% (v/v) Formamid, 4 μg/μl Cot 1 – DNA, 500 ng von 6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamid)hexansäure – NHS – Ester
markierter Colo 320 – DNA
und 500 ng SpectrumRed-Humane-Vergleichs-DNA.
Die Cot 1 – DNA
ist eine Fraktion humaner genomischer DNA, reich an repetitiven
Elementen, und wird zur Suppression oder Block-Hybridisierung von
repetitiven Elementen verwendet, die in der markierten DNA-Sonde,
die aus einem humanen Versuchs-Exemplar isoliert wird, immer vorhanden
sind. Von den repetitiven Elementen ausgehende Signale würden undeutlich
sein und das Signal von DNA mit einzigartiger Sequenz überdecken.
Der Chip wurde dann mit Hilfe von Standardprotokollen gewaschen
und abgebildet.
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Quantitative
Bestimmungen von Signalen, die vom Chip herrühren, wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Abbildungssytem
durchgeführt,
das bei Vysis, Inc. (Downers Grove, IL) entwickelt wurde. Das Abbildungssystem
bestand aus einer 450 W Xenon-Bogenlampe
(SLM Instruments Inc., Champaign Urbaba, IL), einem Detektor mit
ladungsgekoppelter Vorrichtung (CH200, Photometrics, Tucson, AR)
und einem Filtersatz (Chroma Technology, Brattleboro, VT) für drei gemeinhin
verwendete Fluoreszenzfarbstoffe – DAPI für blau, Fluoresceinisothiocyanat
(„FITC") für grün und Texas
red („TRED") für rot. Das
Abbildungssystem wurde von einem Power Macintosh 7100/80 mit einer
Abbildungs-Erfassungs/Analyse-Software (IpLab, Signal Analytics Corp.,
Wien, VA) gesteuert.
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Der
Fluoreszenz-Hintergrund des hybridisierten Chips war schwach und
vergleichbar mit Bruchstellen-Tranlations-markierter DNA. Es wurden
die grüne
und rote Fluoreszenz für
jeden Punkt quantitativ bestimmt und die Daten wurden in Tabelle
1 zusammengefaßt.
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Jeder
Wert in Tabelle 1 ist mit seiner Standardabweichung angegeben. Die
blaue Fluoreszenz ist von DAPI – einem
allgemeinen DNA-Kontrastfarbmittel, das zur Bestätigung der Anwesenheit von
DNA an der Fleck-Stelle erforderlich ist. Die erwartete Amplifizierung
des c-myc Onkogens in Colo 320 – DNA
wurde von der hohen grünen
Fluoreszenz (755 gezählte
Impulse) für
Colo 320 – DNA
angezeigt, im Vergleich zur relativ niedrigen roten Fluoreszenz
(39 gezählte
Impulse) für
normale humane DNA, was eine 24-fache Amplifizierung (Ziel 17 in
Tabelle 1) ergibt. Zusätzlich
zeigte das niedrige Niveau an markierter DNA, die an die lambda-Phagen-Punkte
gebunden war, eine niedrige unspezifische Bindung an.
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Andere Ausführungsformen
-
Es
soll verstanden werden, dass während
die Erfindung in Verbindung mit deren ausführlicher Beschreibung beschrieben
worden ist, die vorhergehende Beschreibung beabsichtigt ist, den
Schutzumfang der Erfindung, der durch den Schutzumfang der Ansprüche definiert
ist, zu veranschaulichen und nicht zu limitieren.
