DE60029042T2 - Festphase Nukleinsäuremarkierung durch Transaminierung - Google Patents
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Description
- Gebiet der Erfindung
- Die Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäuremarkierungs-Chemie.
- Hintergrund der Erfindung
- Die Markierung von Nukleinsäuren mit detektierbaren Sonden war jahrzehntelang eine allgemeine Molekularbiologie-Labortechnik. In den letzten Jahren stützte sich die Entwicklung und der kommerzielle Erfolg von Nukleinsäuren-Mikroarrays (manchmal auch Biochips genannt) oft teilweise auf die Verwendung von markierten Nukleinsäuresonden.
- Viele Nukleinsäure-Markierungstechniken erfordern indirekte Markierung; mit anderen Worten, die Nukleinsäuren werden mit einem Glied eines spezifischen Bindungspaares (z.B. Biotin) markiert, mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert und mit dem anderen Glied des spezifischen Bindungspaars, das detektierbar markiert ist (z.B. Meerrettichperoxidase-markiertes Streptavidin), visualisiert. Kürzlich wurde direkte Markierung von Nukleinsäuren erreicht, mit Hilfe von Bisulfit-katalysierter Transaminierung (BCT) von Cytidin-Resten innerhalb einer Nukleinsäure (U.S. Patente No. 5.506.350 und 5.491.224). Diese direkten, in Lösung durchgeführten Markieungsprozeduren sind aber durch die Zeit limitiert (zwei oder mehrere Tage), die erforderlich ist, um ausreichende Markierung der Nukleinsäure zu erreichen.
- Heutzutage werden Oligonucleotide gemeinhin mit Hilfe einer Festphasen-Methodologie gemacht, in der die Oligos durch sukzessive iterative Additionen von Nucleosidmonomeren hergestellt werden, während die wachsende Oligonucleotidkette an eine Festphase gebunden wird. Es wurden Oligonucleotide mit einzelnen oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffmolekülen modifiziert, während sie noch an der Synthese-Festphase gebunden waren, z.B. wie in Haralambidis et al., Nuc. Acids Res., 18:501-505,1990 beschrieben. Diese Methodologie kann jedoch nicht an komplexen genomischen DNAs angewendet werden, wie jenen, die aus festen Tumorproben oder Blutproben extrahiert werden.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass auf einen festen Träger immobilisierte Nukleinsäuren effizient und schnell mit reaktiven Gruppen durch eine Transaminierungsreaktion (z.B. eine Bisulfit-katalysierte Transaminierungs[BCT]reaktion) funktionalisiert werden können. Nach der Transaminierung können die funktionellen Gruppen (typischerweise primäre Aminogruppen) mit einem Fluoreszenzfarbstoff derivatisiert werden und mit Hilfe einer Vielfalt an chemischen Reaktionen von der Festphase getrennt werden. Im allgemeinen sollten diese Reaktionen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften haben: (1) die Fluoreszenz des Farbstoffs nicht beeinträchtigen, (2) die Hybridisierungseigenschaften der DNA-Sonde nicht beschädigen und (3) hohe Ausbeuten an Fluoreszenz-markierten Nukleinsäure-Produkten geben.
- Ein hervorstechender Aspekt der Erfindung ist die Reversibilität der Bindungs-Chemie. Effiziente Bindung von Nukleinsäuren, zum Beispiel, kann mit Hilfe von Phosphoramidat-Bindungen erreicht werden, die der BCT- und der Farbstoff-Bindungs-Chemie gegenüber stabil sind, aber dennoch effiziente Trennung der Nukleinsäure von dem festen Träger erlauben, unter Bedingungen von erhöhten pH-Werten für die DNA-Stabilität. Weil RNA unter Bedingungen erhöhter pH-Werte hydrolysiert werden kann, könnte der Trennungsschritt bei RNA-Markierung eine alternative Trennungs-Chemie erfordern, wie zum Beispiel thermische Formamid-Behandlung.
- Dementsprechend zeigt die Erfindung ein Verfahren zum Verknüpfen eines detektierbaren Markers mit einer Nukleinsäure durch (1) Bereitstellung einer an einen festen Träger (z.B. ein Kügelchen oder ein verchromter Objektträger aus Glas) gebundenen (z.B. kovalent gebunden) Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Cytidin-Base einschließt; (2) Transaminierung der Cytidin-Base mit einer reaktiven Gruppe, um eine kovalente Bindung zwischen der Cytidin-Base und der reaktiven Gruppe zu bilden; und (3) Verknüpfen eines detektierbaren Markers mit der reaktiven Gruppe, wobei der Transaminierungsschritt eine Bisulfit-katalysierte Transaminierung, Bromierung/Aminierung oder Transaminierung durch eine Platin-koordinierte Verbindung ist.
- Die reaktive Gruppe kann sein a) ein Diamin, b) Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure oder 6-Aminohexansäure oder c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und 10.000 Dalton hat. Das Diamin kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Propylen-, Butylen-, Pentylen-, Hexylen-, Ethylen- und Nonylen-Diamin oder einem Diamin, das einen hydroxylierten Kohlenwasserstoff einschließt. Die reaktive Gruppe kann Ethylendiamin oder Lysin oder Nithin sein.
- In dem Verfahren kann die reaktive Gruppe in einem Lösungsmittel gelöst sein, das ein chaotropes Trihaloacetat-Anion (z.B. Trifluoracetat) einschließt, der detektierbare Marker kann ein fluoreszierendes Molekül sein und die Nukleinsäure kann etwa 1 bis 2 Kilobasen lang sein.
- Das Verfahren schließt optional die Freisetzung der Nukleinsäure vom festen Träger ein.
- Die Nukleinsäure kann durch Reaktion eines terminalen Phosphats einer Nukleinsäure und eines Amino-aktivierten festen Trägers mit 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid an den festen Träger gebunden werden.
- Das Verfahren schließt ein Verfahren zum Verknüpfen eines detektierbaren Markers mit einer Vielzahl von Nukleinsäuren ein, wobei jede der Vielzahl eine einzigartige Sequenz hat.
- In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung eine Zusammensetzung ein, die folgendes hat: (1) einen festen Träger; (2) eine an den festen Träger gebundene Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Cytidin-Base einschließt; (3) eine reaktive Gruppe, die kovalent gebunden ist an die Cytidin-Base, worin die reaktive Gruppe eine von folgenden ist: a) ein Diamin; oder b) Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure oder 6-Aminohexansäure; oder c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und 10.000 Dalton hat; und (4) einen detektierbaren Marker, gebunden an die reaktive Gruppe (z.B. ein Kügelchen oder ein verchromter Objektträger aus Glas), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Molekül, das eine Amino-, Carboxyl-, Aldehydradikal, Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-, Sulfonylhalogenid- oder Carbonsäure-Gruppe oder einen Fluorophor hat.
- Beispiele einer reaktiven Gruppe sind Ethylendiamin, Lysin oder Ornithin.
- Zusätzlich kann der detektierbare Marker ein fluoreszierendes Molekül sein, die Nukleinsäure kann etwa 1 bis 2 Kilobasen lang sein und die Nukleinsäure kann kovalent an den festen Träger gebunden sein. Die Nukleinsäure kann an den festen Träger gebunden werden, durch Reaktion eines terminalen Phosphats einer Nukleinsäure und eines Amino-aktivierten festen Trägers mit 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid.
- In noch einem anderen Aspekt schließt die Erfindung einen Kit ein, der folgendes enthält (1) einen festen Träger (z.B. ein Kügelchen), (2) ein Bisulfit, (3) eine reaktive Gruppe, die eins der folgenden umfasst (a) ein Diamin; oder b) Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure oder 6-Aminohexansäure; oder c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und 10.000 Dalton hat; und (4) einen detektierbarer Marker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Molekül, das eine Amino-, Carboxyl-, Aldehydradikal-, Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-, Sulfonylhalogenid- oder Carbonsäure-Gruppe oder ein Fluorophor hat.
- Die hierin beschriebene Festphasen-BCT-Markierungs-Prozedur kann innerhalb von Stunden durchgeführt werden, ein Zeitrahmen der unerwartet kürzer ist als der, der für BCT-Markierung in Lösung erforderlich ist. Die neuen Markierungs-Techniken sind insbesondere für automatisierte oder roboterbezogene Markierung großer Zahlen von DNA-Proben nützlich. Zusätzlich kann die Leistung der Festphasen-BCT-Markierung von DNA mittels Kits erleichtert werden, die einen festen Träger, einen detektierbaren Marker und zur Markierung benötigte BCT-Reagenzien einschließen.
- Die Entwicklung von Biochips hat die Zeit reduziert, die zur umfassenden Analyse einer DNA-Probe erforderlich ist, durch Ermöglichung simultaner Messung der Expression von Tausenden von Genen. Die Analyse-Gesamtzeit ist aber in vielen Fällen durch die Zeit limitiert, die erforderlich ist, um die Proben-DNA direkt zu markieren. Durch Ermöglichung hoch effizienter und schneller, direkter Markierung von Nukleinsäuren können die Verfahren und Kits der Erfindung somit weiterhin die zur umfassenden DNA-Analyse erforderliche Zeit vermindern.
- Zusätzlich stellen die Zusammensetzungen der Erfindung ein neuartiges Mittel zur Analyse einer DNA-Probe zur Verfügung. Eine fluoreszierend markierte, auf einem festen Träger immobilisierte DNA-Probe kann, zum Beispiel, mit Sonden-DNA hybridisiert werden, die einen unterschiedlichen Fluoreszenzmarker enthält. Die Anwesenheit einer Sequenz, die mit der Sonde hybridisiert, wird dann durch eine Veränderung in der Fluoreszenzfarbe detektiert.
- Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Termini die gleiche Bedeutung, wie von jemandem mit gewöhnlichem Können in dem Fachbereich, zu dem diese Erfindung gehört, gemeinhin verstanden. Obwohl geeignete Verfahren und Materialien zur Durchführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung weiter unten beschrieben werden, können auch andere, im Fachgebiet wohlbekannte Verfahren und Materialien, die denen hierin beschriebenen ähnlich oder ihnen äquivalent sind, verwendet werden.
- Zusätzlich dienen die Materialien, Verfahren und Beispiele nur zur Veranschaulichung und sind nicht beabsichtigt limitierend zu sein.
- Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich sein.
- Ausführliche Beschreibung
- Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Markierung immobilisierter Nukleinsäuren durch Transaminierungsreaktionen, z.B. Bisulfit-katalysierte Transaminierungsreaktionen, Zusammensetzungen, die BCT-markierte Nukleinsäuren einschließen, die an einen festen Träger gebunden sind, und Kits, die zur Durchführung der Markierungsreaktionen ausreichen.
- Allgemeine Methodologie
- Im allgemeinen schließt das neue Verfahren mindestens drei Schritte ein. Im ersten Schritt werden die zu markierenden Nukleinsäuren isoliert und an einen festen Träger gebunden. Im zweiten Schritt werden die Cytosin-Reste innerhalb der immobilisierten Nukleinsäure über eine Transaminierungsreaktion, z.B. eine BCT-Reaktion, an eine reaktive Gruppe gebunden. Andere Nukleinsäure-Transaminierungs-Markierungstechniken schließen Bromierung/Aminierung ein (Keller et al., Anal. Biochem. 170:441-450, 1998) und Chemie, die Platin-koordinierte Verbindungen betrifft (Europäisches Patent 0539466 B1). Im dritten Schritt wird ein detektierbarer Marker an die reaktive Gruppe gebunden, wodurch der detektierbare Marker an die Nukleinsäure geknüpft wird.
- Der zweite und dritte Schritt kann zu jeder Zeit nach Immobilisierung der Nukleinsäure durchgeführt werden. So zum Beispiel können der zweite und dritte Schritt gleichzeitig in einer einzigen BCT/Markierungsreaktion durchgeführt werden, die die immobilisierte Nukleinsäure, einen Bisulfit-Katalysator und ein Fluorophor-Konjugat, das eine reaktive Gruppe enthält, beinhaltet. Die reaktive Gruppe kann auch an das Fluorophor gebunden werden bevor das resultierende Konjugat an die immobilisierte DNA gebunden wird.
- Verknüpfung von Nukleinsäuren mit festen Trägern
- Im allgemeinen werden Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe (z.B. eine Blutprobe) isoliert oder gereinigt, um sie für Markierung geeignet zu machen. So zum Beispiel werden mononukleare Zellen aus peripherem Blut aus einer Blutprobe isoliert. Aus den Zellen wird dann mRNA isoliert und cDNA von der mRNA synthetisiert. Die cDNA kann dann vor Bindung an einen festen Träger durch Ethanolausfällung oder andere Standardverfahren gereinigt werden. Aus den Zellen kann alternativ genomische DNA isoliert werden und wahlweise durch Ultrabeschallung geschert oder mit Endonucleasen verdaut werden, um einen gewünschten Längenbereich von DNA-Fragmenten (z.B. 0,5 Kilobasen bis 5 Kilobasen, insbesondere 1 bis 2 Kilobasen) zu erhalten. Die genomische DNA kann auch chemisch fragmentiert werden, wie in Iverson et al., Nucl. Acids Res., 15:7823, 1987, und Proudnikov et al., Anal. Biochem., 259:34-41, 1998 beschrieben. Es kann Nukleinsäureisolierung aus Zellen und cDNA-Synthese mittels im Fachbereich wohlbekannter Standardtechniken durchgeführt werden. Zusätzlich sind kommerzielle Kits zur Durchführung dieser Prozeduren leicht erhältlich.
- Ist die Probe-Nukleinsäure einmal wie erforderlich isoliert und gereinigt, wird die Nukleinsäure mit einem festen Träger verknüpft. Beispiele für feste Träger schließen Kügelchen, z.B. gemacht aus Polystyren oder quervernetzter Agarose, und Objekt-Träger, z.B. aus Glas oder Plastik, ein. Besonders geeignet sind Kügelchen, weil sie die Oberfläche auf der die Nukleinsäure für nachfolgende BCT-Reaktionen präsentiert wird, maximieren. Zusätzlich sind Amino-alctivierte Kügelchen, wie EAH Sepharose (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Aminofunktionalisierte, magnetische Eisenoxid-Kügelchen (Advaced Magnetics, Inc., Cambridge, MA) und Amino-funktionalisierte Polystyren-Mikrosphären (Polysciences, Inc., Warrington, PA) leicht verfügbar und erleichtern die Anheftung und die darauffolgende Entfernung von Nukleinsäuren.
- Andererseits sind Objekt-Träger aus Glas besonders geeignet, wenn die BCT-markierte Nukleinsäure mit einer anderen Nukleinsäure hybridisiert wird, während sie noch mit dem festen Träger verknüpft ist. Falls nach Hybridisierung irgendwelche fluoreszierende Marker zu detektieren sind, bieten verchromte Objekt-Träger aus Glas den Vorteil niedriger Hintergrund-Fluoreszenz und eine starke nichtkovalente Bindung zwischen der Proben-Nukleinsäure und dem festen Träger. Weitere Einzelheiten bezüglich der Verwendung von verchromten Objekt-Trägern aus Glas als einen festen Träger für Nukleinsäuren können im Europäischen Patent No. 0962772 gefunden werden.
- Zur kovalenten Bindung der Nukleinsäure an den festen Träger kann jede Anzahl an im Fachgebiet wohlbekannten Reaktionen verwendet werden. BCT wird, zum Beispiel, nicht nur zur Markierung von Nukleinsäuren verwendet, sondern auch um Nukleinsäuren an feste Träger zu binden (U.S. Patent No. 5.082.935). Zusätzlich kann 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDAC) verwendet werden, um ein terminales Phosphat einer Nukleinsäure mit einem Amino-funktionalisierten festen Träger, wie Polystyren, (Zammatteo et al., Anal. Biochem., 236:85-94, 1996 und darin enthaltene Referenzen), über eine Carbodiimid-Kondensationsreaktion zu verknüpfen.
- Bisulfit-katalysierte Transaminierung von Nukleinsäuren
- Bisulfit-katalysierte Transaminierung von Nukleinsäuren ist eine spezifische Reaktion, welche eine reaktive Gruppe mit dem N4-Atom im Cytidin verknüpft. Der detektierbare Marker wird vorher, während oder nach der BCT-Reaktion mit der reaktiven Gruppe verknüpft, wodurch die Nukleinsäure markiert wird. BCT-Chemie wird zusätzlich in Schulman et al., Nucl. Acids Res., 9:1203-1216 (1981), Gilliam et al., Anal. Biochem., 157:199-207 (1986), Hayatsu, Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 16:75-124 (1976) und Draper, Nucl. Acids Res., 12:989-1002 (1984) beschrieben.
- Die in BCT verwendete reaktive Ausgangsgruppe kann eine organische Verbindung mit mindestens zwei Substituenten sein. Der erste Substituent ist in der Lage mit Cytidin-Nucleotiden in einer Nukleinsäure zu reagieren. Beispiele für den ersten Substituenten schließen Alkylamino- (primär und sekundär), Hydrazid-, Semicarbazid-, Thiosemicarbazid- und Acylhydrazid-Komponenten ein.
- Der zweite Substituent der reaktiven Gruppe ist in der Lage mit einem detektierbaren Markermolekül zu reagieren. Der zweite Substituent kann blockiert oder nicht blockiert sein, um gegen wahllose Reaktivität während der Verknüpfung des Cytidins mit der reaktiven Gruppe über den ersten Substituenten zu schützen. Ob blockiert oder nicht blockiert, der zweite Substituent sollte in der Transaminierungsreaktion, die die reaktive Gruppe mit dem Cytidin verknüpft, praktisch mit anderen Molekülen nicht reagieren. Beispiele für zweite Substituenten schließen Amino-, Carboxyl-, Phosphat-, Sulfonat-, Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Hydrazid-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazid- ein. Die Carboxylgruppen können entweder in Salz-, Säure- oder Ester-Form sein. Wenn in Salz-Form, kann das Kation ein Alkalimetall sein, wie Natrium oder Kalium.
- In einer organischen reaktiven Gruppe können sich der erste und der zweite Substituent an benachbarten Kohlenstoffatomen befinden oder weiter weg entfernt sein. Die reaktive Gruppe kann ein gerader, verzweigter oder cyclischer Kohlenwasserstoff sein und schließt eine Ether- oder Thioether-Verknüpfung ein.
- Ein Diamin ist ein anderes Beispiel einer geeigneten reaktiven Gruppe. Als ein Diamin kann die reaktive Gruppe Propylen-, Butylen-, Pentylen-, Hexylen- und Nonylen- Gruppen einschließen, wie CH3NH(CH2)2NH2 und CH3NH(CH2)2NHCH3. Diamine, die hydroxylierte Kohlenwasserstoffe einschließen, sind ebenfalls geeignete reaktive Gruppen, einschließlich 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, 1,4-Diamino-2,3-dihydroxybutan, 1,5-Diamino-2,3,4-trihydroxypentan, 1,6-Diamino-1,6-dihydroxy-D-mannitol, 1,6-Diamino-2,3,4,5-tetrahydroxyhexan, trans-1,2-Diamino-3,4,5,6-tetrahydroxycyclohexan.
- Andere geeignete reaktive Gruppen schließen bestimmte Aminosäuren, Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure und 6-Aminohexansäure ein. Die reaktive Gruppe kann ein Molekulargewicht unter 1000 Dalton haben (z.B. unter 500, 250, 100 oder 50 Dalton). Nicht alle Aminosäuren sind geeignet, weil einige Funktionalitäten enthalten, die in der BCT-Reaktion beschädigt werden könnten. Zum Beispiel könnten Schwefelenthaltende Aminosäuren wie Cystin oder Cystein ungeeignet sein. Andererseits können Methionin-Reste geeignet sein, weil der Schwefel in Form eines Sulfids vorzufinden ist. Sicherlich enthalten einige Aminosäuren, z.B. Alanin, Glycin, Valin und Isovalin Seitenketten, welche keine weitere Aufarbeitung erlauben. Lysin oder Ornithin sind besonders nützliche Aminosäuren.
- Besonders geeignete reaktive Gruppen sind Peptide, weil Peptidketten ein vorgebundenes Farbstoffmolekül enthalten können, dessen Fluoreszenz durch die chemische Umgebung, die durch das verknüpfende Peptid bereitgestellt ist, verstärkt wird. Diese Farbstoffmoleküle können Molekulargewichte zwischen 500 und 10.000 Dalton haben. Die Löslichkeit ist ein einschränkender Faktor, weil relativ hohe Konzentrationen an reaktivem Ligand notwendig sind (0.02 bis 2 M, insbesondere 0,2 bis 2 M), damit BCT bei einer nützlichen Geschwindigkeit stattfindet.
- Um die Effizienz der Chemie zu erhöhen kann die BCT-Reaktion in einem chaotropen anionischen Lösungsmittel, wie Trihaloacetat, durchgeführt werden. Es ist bekannt, dass Nukleinsäuren, welche Sekundärstrukturen bilden, gegenüber BCT weniger anfällig sind. Weil chaotrope Agenzien helfen können die Nukleinsäure in einer denaturierten oder einzelsträngigen Struktur zu erhalten, ist ihr Einschluß in die BCT-Reaktionsmischung eine wünschenswerte Option. Es wurde festgestellt, dass Trifluoressigsäure (TFA) für die Nukleinsäure-Transaminierungsreaktionen besonders geeignet ist.
- Verknüpfung detektierbarer Marker mit reaktiven Gruppen
- Die in der Praxis dieser Erfindung benutzten detektierbaren Ausgangs-Markermoleküle enthalten mindestens eine Markerkomponente, die in der Lage ist, mit dem zweiten Substituenten der reaktiven Gruppe zu reagieren. Die Markerkomponente kann eine Amino-, Carboxyl-, Aldehydradikal-, Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-, Sulfonylhalogenid- oder Carbonsäure-Gruppe sein. Die gewünschte spezifische Markerkomponente hängt von der Natur des zweiten Substituenten der reaktiven Gruppe ab und ähnlicherweise hängt die Wahl eines zweiten Substituenten von der zu benutzenden Markerkomponente ab. Um Interferenz mit der Hybridisierung der Proben- Nukleinsäure mit einem „Target" zu minimieren sollte das Markermolekül kleiner als 5000 Dalton sein (z.B. kleiner als 2500, 1000 oder 500 Dalton).
- Ist das detektierbare Markermolekül ein Fluorophor, kann das Fluorophor einen Extinktionskoeffizienten von mindestens etwa 6.000 M–1cm–1 haben (z.B. mindestens 10.000 M-1cm–1) bei einer Anregungswellenlänge und einer Quantenausbeute von etwa mindestens 0,02. Beispiele von detektierbaren Markermolekülen schließen Amino-funktionalisierte Fluorophore ein, erhältlich von Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, wie 7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure, Succinimidylester (AMCA); Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas RedTM); 5- (und 6-) Carboxylrhodamine 101, Succinimidylester; Lissamin Rhodamin B Sulfonylchlorid; 5- (und 6-) Carboxylfluorescein, Sucinimidylester; 7-Diethylaminocumarin-3-carbonsäure, Succinimidylester; Tetramethylrhodamin-5-(und 6-)isothiocyanat; N-(4,4-Difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-3-indacenpropionsäure, Succinimidylester; aktiviertes Fluorescein-Derivat (FAP); Eosin-5-isothiocyanat; Erythrosin-5-isothiocyanat und ein O-Acetylazid-Dervat der 1-Hydroxy-3,6,8-pyrentrisulfonsäure (Cascade BlueTM Acetylazid).
- Die Reaktionsbedingungen zur Verknüpfung der reaktiven Gruppe mit dem detektierbaren Marker sind im Fachgebiet wohl bekannt (siehe, z.B. U.S. Patent No. 5.506.250).
- Verwendungen
- Die Verfahren der Erfindung können von Laborpersonal mit gewöhnlichen Fähigkeiten im Fachgebiet der Biochemie oder Molekularbiologie durchgeführt werden. Der Laborarbeiter kann, zum Beispiel, einen Kit der Erfindung verwenden, der einen festen Träger (z.B. Amino-aktivierte Sepharose-Kügelchen), eine Bisulfit-Lösung, eine reaktive Gruppe (z.B. Ethylendiamin) und einen detektierbaren Marker (z.B. ein Amino-aktiviertes Fluorophor) umfaßt, um die Aminosäure mit irgendeinem von verschiedenen Fluorophoren chemisch zu markieren, in einem Maßstab von z.B. 5,0 μg bis 1,0 mg. Ist die zu markierende Nukleinsäure-Probe einmal gereinigt und/oder isoliert, wird die Nukleinsäure mit den Kügelchen verknüpft und wie oben beschrieben markiert. Jeder Schritt der Reaktion wird durch die Verwendung der Kügelchen erleichtert, was schnelle Waschschritte mit Hilfe von Zentrifugation erlaubt.
- Der Kit kann alternativ eine 96-„well"-Mikrotiterplatte aus Polystyren einschließen, wovon jedes „well" mit Hilfe von Standardtechniken Amino-funktionalisiert werden kann. Vielfache Nukleinsäure-Proben können dann mit den „wells" verknüpft werden und parallel markiert werden, während jede Nukleinsäure-Probe von den anderen getrennt gehalten wird.
- Zusätzlich können eher automatische oder Roboter-Geräte zur Verrichtung der Reaktionsschritte verwendet werden, als dass ein Laborarbeiter sie durchführt, um eine große Anzahl (Hunderte bis Tausende) von Nukleinsäure-Proben parallel und/oder in Serien zu bearbeiten und zu markieren. Geeignete Geräte und Systeme zur Automatisierung der Verfahren der Erfindung schließen das Biomek 2000 System (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) und das BioRobot 9600 System (Qiagen, N.V., Venlo, Holland) ein. Sowohl die Biomek 2000 als auch die BioRobot 9600 Produkte verwenden integrierte Computer-Steuerung und -Monitoring, als notwendig zur Durchführung der Verfahren der Erfindung.
- Die Zusammensetzungen und Kits der Erfindung schließen auch Mikrochips ein, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden können. Der Begriff Mikrochip oder „Chip" wird hierin zur Beschreibung von Mikroarray-Geräten für DNA-Analyse verwendet. Diese Mikrogeräte bestehen aus zweidimensionalen Arrays von Locus-spezifischen DNA-Sequenzen, die auf einem geeigneten Glas oder einer verchromten Glasoberfläche immobilisiert sind. Die Arrays aus oberflächengebundenen DNA-Fragmenten können zur simultanen Analyse von Hunderten von genetischen Loci in einer Untersuchungsprobe (für gewöhnlich grün-fluoreszierend markiert) durch Hybridisierung verwendet werden, wenn diese Untersuchungs-DNA auf die Chipoberfläche mit z.B., einer rot-fluoreszierend markierten Referenz-DNA co-hybridisiert wird. Dann stellt grün/rote Fluoreszenzverhältnis-Messung ein Maß der relativen Kopienzahl an den konkreten Loci bereit, dargestellt von dem Oberflächen-Array aus als Punkte aufgetragene DNAs. Auf dem MEMS- (miniaturisierte elektromechanische Systeme) Gebiet im allgemeinen wird aber der Begriff Mikrochip in einem viel weiteren Sinne verwendet, um irgendeines einer Anzahl von Geräten zu beschreiben, die in der Lage sind eine Vielfalt von mechanischen oder chemischen Abtast-Operationen auszuführen, wie Bewegungs-Abtasten (Airbag-Ausbreitungs-Sensoren), Tintenstrahldruckköpfe oder biochemische Sensoren (tragbare Blutanalysiergeräte). Diese MEMS-Geräte sind typischerweise in Silikonwafern mikrobearbeitet durch hochauflösende Oberflächenätzungsverfahren, die von diejenigen im Fachgebiet routinemäßig praktiziert werden. Aus Glas oder Plastik gebaute MEMS-Geräte können auch hergestellt werden. In vielen chemischen Abtastungs-Anwendungen werden Flüssigkeiten mittels Miniaturmembranpumpen in Silikon-geätzte Kanäle bewegt oder in Glaskanäle mittels elektroosmotischem Fluß (EOF), der durch Anlegen einer Spannung quer durch den Kanal erzeugt wird. Jene Geräte, in denen Flüssigkeiten entlang Mikrokanälen fließen, werden „microfluidics"-Geräte genannt. Eine zeitgerechte Besprechung des aktuellen Stands der „microfluidics-System-Entwicklung" kann in Chemical & Engineering News, February 22, 1999, pp27-36 (American Chemical Society, Washington DC, USA) gefunden werden.
- Automatisierte direkte Markierung kann auf einem „microfluidics"-Gerät oder „pillar chip" (Säulenchip) praktiziert werden, hergestellt von Cepheid Inc., Sunnyvale, CA (www.cepheid.com) und beschrieben in Petersen et al., IVD Technol. 4:43-49, 1998. Diese Säulenchips (ungef. 5 × 5 mm2) sind aus Tausenden von Silikonfingern (200 μm hoch und 34 μm im Zentrum) gemacht, die in eine kleine Kammer (3,5 mm2 mit einer Gesamtinnenoberfläche von 36 mm2) hervorragen, die in eine Silikonwafer geätzt ist. Die Kammer wird von einer Glaslasche, die mit der Wafer verbunden ist, versiegelt. Über Eintritts- und Auslaßöffnungen die in den Chip diagonal gegenüber eingearbeitet sind, werden Flüssigkeiten in den Chip eingeführt.
- Wie zuerst hergestellt, ist der Chip reines Silikon, das nicht zu Bindung von biologischen Liganden führt. Wird die Oberfläche aber oxidiert, um eine dünne Schicht Siliziumdioxid zu erzeugen, können eine Anzahl verschiedener chemische Verfahren zur Oberflächenmodifizierung verwendet werden. Durch Verwendung von, zum Beispiel, Silan-aktivierenden Agenzien, kann die Siliziumoxid-Oberfläche mit, zum Beispiel, Amino-, Sulfhydryl, Hydroxyl- oder Epoxid- reaktiven Gruppen funktionalisiert werden, die nachher verwendet werden können um biochemische Liganden an die Oberfläche zu binden. So zum Beispiel wird durch die Reaktion der Siliziumdioxid-Chipoberfläche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan eine Oberfläche produziert, die mit Aminogruppen modifiziert ist, an die doppelsträngige oder einzelsträngige DNA-Oligunucleotide, die eine terminale Phosphomonoester-Gruppe enthalten, kovalent gebunden werden können, durch die EDAC Carbodiimid Kopplungseinrichtung, die verwendet wird, um diese Nukleinsäuren an Polymerkügelchen zu binden, wie hierin beschrieben. Siehe auch Joos et al., Anal. Biochem. 247:96-101, 1997, der Carbodiimid-aktivierte Bindung von carboxylierten Oligonucleotiden an Aminopropylsilan-modifizierte Glas-Festphasen beschreibt.
- Die Amino-modofizierte Chipoberfläche kann mit Nukleinsäuren auch durch die Mittel der in U.S. Patent No. 5.091.519 beschriebenen BCT-Reaktion reagieren. Für In-situ-Synthese von Oligos auf einer Epoxid-modifizierten Glas-Mikroskop-Objektträger-Oberfläche, siehe Madkos et al., Nuc. Acids Res. 20:1679-1684, 1992, und darin enthaltene Referenzen. Falls die Epoxid-modifizierte Glasoberfläche in eine Hydroxyl-Oberfläche umgewandelt wird, wie von Maskos et al., weiter oben, gezeigt, dann ist Bindung von Nukleinsäuren mittels Bromcyan-Aktivierung möglich. Zur Bindung von Oligos an eine Sulfhydrylmodifizierte Glas-Objektträger-Oberfläche, siehe, z.B., Rogers et al., Anal. Biochem. 266:23-30, 1999.
- Reversible Bindung von DNA kann mit Hilfe der oben beschriebenen EDAC/Phosphoramidat-Prozedur erreicht werden. Eine Sulfhydryl-Festphase und Disulfid-Verknüpfung der DNA mit dem Träger ist mit reduzierenden Agenzien spaltbar, aber eine Disulfid-Bindung ist gegenüber den BCT-Bedingungen nicht stabil.
- Mit einer Gesamtfläche der inneren Oberfläche von ungefähr 0,3 cm2 und einer theoretischen maximalen Bindungseffizienz von 1014 Molekülen/cm2 (ungef. 5 × 10–11 Mol/Chip) ist der Chip in der Lage ungefähr 8 μg eines 500 bp langen doppelsträngigen genomischen DNA-Fragments zu binden. Auch wenn die tatsächliche Ladungskapazität 1-5% der theoretischen ist, würde der Chip dann in der Lage sein genügend genomische DNA für die Analyse auf einem DNA-Mikroarray zu markieren.
- Ein anderer Ansatz der mit dem Säulenchip (oder mit Kügelchen) verwendet werden kann ist, die DNA enzymatisch zu markieren, zum Beispiel durch Bruchstellen-Translation mit fluoreszierenden Nucleotiden, während die DNA noch an die Festphase gebunden ist. Die DNA kann von der Festphase freigesetzt werden, mit der Referenz-DNA gemischt und auf ein Mikroarray gekippt werden. Die Zukunft könnte das Mikroarray als eine Komponente eines integrierten Microfluidics-Analysesystems halten, das in der Lage ist DNA zu isolieren, zu markieren, zu hybridisieren und zu analysieren.
- BEISPIELE
- Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen beschrieben werden, die den Schutzumfang der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindung nicht einschränken.
- Beispiel 1: Bisulfit-vermittelte Fluoreszenz-Markierung einer Nukleinsäure auf einem festen Träger
- Fünfzig Mikroliter kommerziell aminierter Diaminodipropylamin (DADPA)-Kügelchen (Pierce Catalog No. 53147) wurden mit 50 μg ultrabeschallter, Hitze-denaturierter genomischer DNA aus humaner Plazenta gemischt, in Anwesenheit von 0,2 M 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) und 0,1 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES; pH 6,0). Die Mischung wurde eine Stunde lang bei 50°C inkubiert. In einem separaten Experiment war über-Nacht Inkubation bei Raumtemperatur ebenfalls ausreichend, um die DNA an die Kügelchen zu binden.
- Es wurde festgestellt, dass diese Festphasen-Bindeprozedur etwa 35 μg der 50 μg Ausgangs-DNA stark gebunden hat. Das Verknüpfen war bei einer Inkubation in 0,2 M MOPS (pH 7,4) oder 50 mM NaCl bei 65°C bis zu 310 Minuten lang stabil. Etwa 10 μg der 50 μg Ausgangs-DNA war schwach an die Kügelchen gebunden und konnte freigesetzt werden, durch Inkubation der DNA/Kügelchen Mischung in 62,5 mM Natriumborat und 1,25 M NaCl (pH 8,5) bei 65°C, sechs oder mehr Minuten lang.
- Die Kügelchen wurden dann fünfmal gewaschen, eine Minute jede Waschung, mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O). Die Waschung wurde durch Zentrifugation, Entfernung des Überstands und dann wieder Suspendieren in Wasser durchgeführt. Die DNA wurde bei 95°C fünf Minuten lang denaturiert, gefolgt von rascher Kühlung durch Eintauchen in ein Eisbad. Es wurde festgestellt, dass etwa 33 μg von den 50 μg Ausgangs-DNA nach Denaturierung und Kühlung immer noch an den Kügelchen gebunden waren.
- Es wurde ein Transaminierungs-Puffer hergestellt durch Hinzufügen von 1,53 ml Trifluoressigsäure (TFA) zu 2,5 ml deionisiertem Wasser. Dem Puffer wurde erlaubt 10 Minuten lang auszukühlen. 0,87 ml Ethylendiamin (freie Base; Sigma Catalog No. E 4397) wurden dann langsam zu dem Puffer auf Eis hinzugefügt. Nach Auflösung des Ethylendiamins wurde der Puffer auf Raumtemperatur erwärmt. 0,475 g Natriummetabisulfit (Aldrich Catalog No. 25.555-6) wurden zum Puffer hinzugefügt und der Puffer wurde auf 45°C erwärmt, um das Bisulfit aufzulösen. Der pH-Wert des Puffers wurde durch Zugabe von TFA auf 7,0 eingestellt und das Volumen des Puffers wurde auf 5 ml eingestellt. 50 μl einer 100 mg/ml Hydrochinon-Lösung wurden dann zum Puffer hinzugefügt.
- Um die immobilisierte DNA zu transaminieren, wurden 125 μl eines Bisulfit-Transaminierungs-Puffers zu der DNA/Kügelchen Mischung hinzugefügt und die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 65°C inkubiert, um das Ethylendiamin an die Cytosin-Reste in der DNA zu binden. In einem getrennten Experiment wurde die Transaminierung der DNA bei Raumtemperatur über Nacht ebenfalls als akzeptabel befunden. Die Kügelchen wurden erneut 5X mit ddH2O gewaschen, um überschüssigen Puffer zu entfernen.
- Die Kügelchen wurden dann in 550 μl CarboxyXRhodamin-NHS-Ester – Markierungspuffer (2-5 mM Fluorophor in 62,5 mM Natriumborat, 1 M NaCl [pH 8,5] und 15 % [v/v] DMF) suspendiert. Die Kügelchen wurden im Markierungspuffer eine Stunde lang bei 50°C inkubiert, dann 5X mit ddH2O gewaschen, um den Markierungspuffer zu entfernen. In einem separaten Experiment wurde Markierung bei Raumtemperatur nach 16 Stunden erreicht.
- Um die markierte DNA freizusetzen wurden die Kügelchen in 0,1 ml 50 mM NaOH bei 65°C eine Stunde lang inkubiert. (Obwohl zeitaufwändig, könnte die DNA auch durch Inkubation in Formamid bei 75°C, 72 Stunden lang, von den Kügelchen freigesetzt werden. Die Formamid-Denaturierungs-Lösung wurde durch Zusammenmischen von 49 ml Formamid, 7 ml 20 × SSC, 14 ml Wasser hergestellt, was eine 70%ige Foramidlösung bei einem pH-Wert von 7,5 als Ergebnis hat.) Durch diese erste Inkubation wurden etwa 15 μg markierte DNA wiedergewonnen. Durch eine zusätzliche, eine Stunde lange Behandlung in 50 mM NaOH bei 65°C wurden weitere etwa 10 μg DNA wiedergewonnen. Im allgemeinen kann die Effizienz der DNA-Freisetzung durch Änderung von Zeit, Temperatur, pH-Wert oder Zugabe eines Katalysators optimiert werden. Die markierte DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat neutralisiert, um den pH-Wert auf 6,0 einzustellen. Die DNA wurde dann mittels Ethanolausfällung isoliert.
- Die obige Prozedur wurde wiederholt, um humane genomische Plazenta-DNA mit 6-(Fluoirescein-5- (und-6)-carboxamido) hexansäure – NHS – Ester und 5,6-Carboxytetramethylrhodamin – NHS – Ester zu markieren.
- Beispiel 2: Verwendung von Fluoreszenz-markierter Nukleinsäure zur Visualisierung von Metaphase-Chromosomen
- Die mit 5,6-CarboxyXRhodamin -NHS – Ester, 6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido)hexansäure – NHS – Ester und 5,6-Carboxytetramethylrhodamin – NHS -Ester markierte DNA, wie in Beispiel 1 oben hergestellt, wurde jeweils getrennt mit humanen primär-Lymphozyt-Metaphase-Chromosomen In-situ hybridisiert, wie in U.S. Patent No. 5.776.688 beschrieben. Die Marker waren für Chromosomstrukturen spezifisch und die Signalintensitäten waren für alle drei Marker mäßig bis gut.
- Beispiel 3: Verwendung von Fluoreszenz-markierter Nukleinsäure auf AmpliOnc® Biochip
- Mit 6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido)hexansäure – NHS – Ester markierte Versuchs-DNA von humanen Colonkrebszellen (colo 320) und mit 5,6-CarboxyXRhodamin -NHS – Ester markierte normale humane Vergleichs-DNA wurden wie folgt hergestellt.
- Ultrabeschallte colo 320 – DNA (50μg in 50 μl; durchschnittliche Fragmentgröße 300 bis 3000 bp) wurde bei 95°C 5 Minuten lang Hitze-denaturiert und auf Eis rasch gekühlt. 50 μl DADPA Kügelchen-Suspension (Pierce) wurde wiederholt in Wasser gewaschen und in Wasser suspendiert, so dass das Endvolumen von Kügelchen plus Überstand 25 μl war. Die DNA-Lösung wurde zur Kügelchen-Supension hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 25 μl 0,5 M MES Puffer und 25 μl 0,5 M EDAC. Die Mischung wurde eine Stunde lang bei 50°C erhitzt. Die Kügelchen wurden durch Filtration isoliert und 5 Mal mit 250 μl Wasser gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen in 100 μl Wasser suspendiert. Ein 10 μl Aliquot dieser Kügelchen-Suspension setzte 3,1 μg DNA frei, wenn für eine Stunde mit 50 mM NaOH bei 65°C behandelt.
- Zehn Mikroliter Kügelchen-Suspension wurden entfernt (nominell äquivalent mit 5 μg DNA, angenommen die ganze Input-DNA hatte gebunden) und in 50 μl Wasser suspendiert. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 95°C erhitzt und auf Eis rasch gekühlt. Die Kügelchen wurden mittels Zentrifugation isoliert, der Überstand entfernt und frisch hergestellte TFA-Aminierungs-Mischung (125 μl), die auf 65°C vorgewärmt worden war, wurde hinzugefügt. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 65°C erhitzt. Die Aminierungsreaktion wurde unverzüglich auf Eis gekühlt und die Kügelchen wiederholt in Wasser gewaschen.
- Die Kügelchen wurden in 110 μl Markierungs-Puffer (0,1 M Natriumborat, 1 M Natriumcitrat, pH 8,2) suspendiert. Dann wurden 22 μl 6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido)hexansäure – NHS – Ester (FCHA-NHS, 20 mM in DMF) hinzugefügt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 50°C erhitzt. Die Kügelchen wurden mittels Zentrifugation isoliert und wiederholt mit Wasser gewaschen.
- Die Kügelchen wurden in 100 μl 50 mM NaOH suspendiert und eine Stunde lang bei 65°C erhitzt. Die Kügelchen wurden mittels Zentrifugation durch einen Zentrifugenfilter entfernt und das Filtrat, das die fertige markierte Sonde enthielt, wurde aufgefangen.
- Dem Filtrat wurden 0,1 Volumen Natriumacetat und 2,0 Volumen Ethanol hinzugefügt. Die Mischung wurde bei –20°C 15 Minuten lang gekühlt und die DNA mittels Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wurde mit 70%igem wäßrigem Ethanol gewaschen und weiter durch Auflösen in 60 μl Wasser, gefolgt von Durchlauf über eine Biospin 30 Säule (BioRad, Hercules, CA), gereinigt. Das Endvolumen von Sonden-Lösung war 65 μl.
- Fünfzehn Mikroliter der Sonden-Lösung wurden mit 100 μg Cot 1 – DNA (Blocker- DNA; siehe weiter unten) und 200 ng 5,6-CarboxyXRhodamin -markierter männlicher Vergleichs-DNA kombiniert. Die DNA-Mischung wurde dann wie oben beschrieben mit Ethanol ausgefällt. Die Cot-blockierte colo 320 – DNA wurde auf Mikroskop-Objektträgern, die mit Hilfe von Standardprotokollen mit humanen Lymphozyten beschichtet waren (siehe Beispiel 2), hybridisiert. Der amplifizierte c-myc Locus auf Chromosom 8, der in der colo 320 Zelllinie vorhanden war, erschien als zwei grünfluoreszierende Punkte in Methaphase-Nuclei, mit guter Signalintensität und gutem Hintergrund.
- Fünfzehn Mikroliter FCHA-markierte colo 320 – Sonde und 5 μl (500 ng) 5,6-CarboxyXRhodamin -markierte männliche Vergleichs-DNA wurden in einem SpeedVac-Konzentrator zur Trockenheit verdampft. Zu 5,4 μl Wasser wurden 5,4 μl (100 μg) Cot 1 – DNA und 16,2 μl Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 2 X SSC, 10% Dextransulfat) hinzugefügt. Die Sonden-DNA Mischung wurde bei 80°C 10 Minuten lang Hitze-denaturiert, 2 Stunden lang bei 37°C vorhybridisiert, auf das AmpliOncTM -Mikroarray aufgetragen und bei 37°C über Nacht hybridisiert. Die Chips wurden aus dem 37°C – Inkubator entfernt und gewaschen. Die Chips wurden dreimal 2 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1 X SSC gewaschen, gefolgt von dreimal 10 Minuten lang Waschen bei 40°C in 50% Formamid/2 X SSC und schließlich dreimal 2 Minuten lang Waschen bei Raumtemperatur in 1 X SSC. Dem Mikroarray wurde erlaubt einige Minuten lang an der Luft zu trocknen. DAPI-Kontrastfärbung enthaltende Gel-Fassung wurde hinzugefügt und die grün/rot Fluoreszenzverhältnisse wurden mit einem betriebseigenen Fluoreszenz-Abbildungsinstrument (siehe weiter unten) quantitativ bestimmt.
- Es ist bekannt, dass die Krebszellen-DNA ein amplifiziertes c-myc Gen hat. Die markierten DNAs wurden zur Hybridisierung mit einem AmpliOncTM (Vysis, Inc.) -DNA-Biochip verwendet.
- Der AmpliOncTM-Chip enthält ein Mikroarray aus Nukleinsäuren, das Gene darstellt, von denen bekannt ist, dass sie an humanen Krebsarten beteiligt sind. Es sind auch Negativkontroll-Punkte, die z.B. lambda-Phagen-DNA enthalten, eingeschlossen. Jedes Krebsgen wird von fünf identischen Flecken am Mikroarray dargestellt. Bei Verwendung wird der AmpliOncTM-Chip mit einer normalen Probe Vergleichs-DNA, die mit einem Fluorophor von einer bestimmten Farbe markiert ist, und mit einer Probe Versuchs-DNA, die mit einem Fluorophor von einer anderen Farbe markiert ist, hybridisiert. Um ein amplifiziertes Krebsgen zu detektieren werden alle Punkte, die jenes Gen darstellen, von dem mit der Versuchs-DNA assoziierten Fluorophor unverhältnismäßig gefärbt. Die Punkte, welche nicht amplifizierte Gene darstellen, sollten etwa gleiche Mengen von beiden Fluorophoren haben.
- Ein AmpliOncTM-Chip wurde mit 25 μl Hybridisierungspuffer bei 37°C 16 Stunden lang hybridisiert. Der Hybridisierungspuffer war 2 X SSC, mit Zusatz von 50% (v/v) Formamid, 4 μg/μl Cot 1 – DNA, 500 ng von 6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamid)hexansäure – NHS – Ester markierter Colo 320 – DNA und 500 ng SpectrumRed-Humane-Vergleichs-DNA. Die Cot 1 – DNA ist eine Fraktion humaner genomischer DNA, reich an repetitiven Elementen, und wird zur Suppression oder Block-Hybridisierung von repetitiven Elementen verwendet, die in der markierten DNA-Sonde, die aus einem humanen Versuchs-Exemplar isoliert wird, immer vorhanden sind. Von den repetitiven Elementen ausgehende Signale würden undeutlich sein und das Signal von DNA mit einzigartiger Sequenz überdecken. Der Chip wurde dann mit Hilfe von Standardprotokollen gewaschen und abgebildet.
- Quantitative Bestimmungen von Signalen, die vom Chip herrühren, wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Abbildungssytem durchgeführt, das bei Vysis, Inc. (Downers Grove, IL) entwickelt wurde. Das Abbildungssystem bestand aus einer 450 W Xenon-Bogenlampe (SLM Instruments Inc., Champaign Urbaba, IL), einem Detektor mit ladungsgekoppelter Vorrichtung (CH200, Photometrics, Tucson, AR) und einem Filtersatz (Chroma Technology, Brattleboro, VT) für drei gemeinhin verwendete Fluoreszenzfarbstoffe – DAPI für blau, Fluoresceinisothiocyanat („FITC") für grün und Texas red („TRED") für rot. Das Abbildungssystem wurde von einem Power Macintosh 7100/80 mit einer Abbildungs-Erfassungs/Analyse-Software (IpLab, Signal Analytics Corp., Wien, VA) gesteuert.
- Der Fluoreszenz-Hintergrund des hybridisierten Chips war schwach und vergleichbar mit Bruchstellen-Tranlations-markierter DNA. Es wurden die grüne und rote Fluoreszenz für jeden Punkt quantitativ bestimmt und die Daten wurden in Tabelle 1 zusammengefaßt.
- Jeder Wert in Tabelle 1 ist mit seiner Standardabweichung angegeben. Die blaue Fluoreszenz ist von DAPI – einem allgemeinen DNA-Kontrastfarbmittel, das zur Bestätigung der Anwesenheit von DNA an der Fleck-Stelle erforderlich ist. Die erwartete Amplifizierung des c-myc Onkogens in Colo 320 – DNA wurde von der hohen grünen Fluoreszenz (755 gezählte Impulse) für Colo 320 – DNA angezeigt, im Vergleich zur relativ niedrigen roten Fluoreszenz (39 gezählte Impulse) für normale humane DNA, was eine 24-fache Amplifizierung (Ziel 17 in Tabelle 1) ergibt. Zusätzlich zeigte das niedrige Niveau an markierter DNA, die an die lambda-Phagen-Punkte gebunden war, eine niedrige unspezifische Bindung an.
- Andere Ausführungsformen
- Es soll verstanden werden, dass während die Erfindung in Verbindung mit deren ausführlicher Beschreibung beschrieben worden ist, die vorhergehende Beschreibung beabsichtigt ist, den Schutzumfang der Erfindung, der durch den Schutzumfang der Ansprüche definiert ist, zu veranschaulichen und nicht zu limitieren.
Claims (31)
- Ein Verfahren zum Anknüpfen eines detektierbaren Markers an eine Nukleinsäure, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Bereitstellen einer Nukleinsäure, gebunden an einen festen Träger, wobei die Nukleinsäure eine Cytidin-Base umfasst; Transaminieren der Cytidin-Base mit einer reaktiven Gruppe, um eine kovalente Bindung zwischen der Cytidin-Base und der reaktiven Gruppe zu bilden; und Verknüpfen eines detektierbaren Markers mit der reaktiven Gruppe, worin der Transaminierungsschritt eine Bisulfit-katalysierte Transaminierung, Bromierung/Aminierung oder Transaminierung durch eine Platin-koordinierte Verbindung ist.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der feste Träger ein Kügelchen oder ein verchromter Objekt-Träger ist.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die reaktive Gruppe ein Diamin ist.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das Diamin gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Propylen-, Butylen-, Pentylen-, Hexylen-, Ethylen- und Nonylen-Diamin oder einem Diamin, das einen hydroxylierten Kohlenwasserstoff einschließt.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die reaktive Gruppe Ethylen-Diamin ist.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das Diamin Lysin oder Ornithin ist.
- Das Verfahren gemäß Ansprüchen 1 oder 2, worin die reaktive Gruppe Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure oder 6-Aminohexansäure ist.
- Das Verfahren gemäß Ansprüchen 1 oder 2, worin die reaktive Gruppe ein Peptid ist mit einem Molekulargewicht von zwischen 500 und 10.000 Dalton.
- Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die reaktive Gruppe in einem Lösungsmittel aufgelöst ist, das ein Trihaloacetat chaotropes Anion umfasst.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 9, worin das Trihaloacetat chaotrope Anion Trifluoracetat ist.
- Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, worin der detektierbare Marker ein fluoreszierendes Molekül ist.
- Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Nukleinsäure ungefähr 1 bis 2 Kilobasen lang ist.
- Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, das weiterhin die Freisetzung der Nukleinsäure aus dem festen Träger umfasst.
- Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Nukleinsäure kovalent an den festen Träger gebunden ist.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die Nukleinsäure an den festen Träger durch Reaktion eines terminalen Phosphats einer Nukleinsäure und eines Amino-aktivierten festen Trägers mit 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid gebunden ist.
- Eine Zusammensetzung, die folgendes umfasst einen festen Träger; eine Nukleinsäure, gebunden an den festen Träger, wobei die Nukleinsäure eine Cytidin-Base umfasst; eine reaktive Gruppe, die kovalent an die Cytidin-Base gebunden ist, worin die reaktive Gruppe eine der folgenden ist (a) ein Diamin; oder (b) Isopipecolinsäure, Glycosaminsäure oder 6-Aminohexansäure; oder (c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und 10.000 Dalton hat; und einen detektierbaren Marker, gebunden an die reaktive Gruppe, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Molekül, das eine Amino-, Carboxyl-, Aldehydradikal-, Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-, Sulfonylhalogenid- oder Carbonsäuregruppe hat, oder einem Fluorophor.
- Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, worin das Diamin gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Propylen-, Butylen-, Pentylen-, Hexylen-, Ethylen- und Nonylen-Diamin oder einem Diamin, das einen hydroxylierten Kohlenwasserstoff einschließt.
- Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, worin das Diamin Ethylen-Diamin ist.
- Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, worin das Diamin Lysin oder Ornithin ist.
- Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 16 bis 19, worin der detektierbare Marker ein fluoreszierendes Molekül ist.
- Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 16 bis 20, worin die Nukleinsäure ungefähr 1 bis 2 Kilobasen lang ist.
- Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 16 bis 21, worin die Nukleinsäure kovalent an den festen Träger gebunden ist.
- Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, worin die Nukleinsäure an den festen Träger durch Reaktion eines terminalen Phosphates einer Nukleinsäure und eines Amino-aktivierten festen Trägers mit 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimid gebunden ist.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin eine Vielzahl von Nukleinsäuren an einen detektierbaren Marker gebunden ist, wobei jede der Vielzahl eine einzigartige Sequenz hat.
- Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 und 24, worin die reaktive Gruppe H2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2 umfasst, worin n = 1-4, X ist O, SO oder SO2.
- Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 16 bis 23, worin die reaktive Gruppe H2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2 umfasst, worin n = 1-4, X ist O, SO oder SO2.
- Ein Kit, der folgendes umfasst: einen festen Träger; ein Bisulfit; eine reaktive Gruppe, die eines von folgendem umfasst: (a) ein Diamin; oder (b) Isopipecolinsäure, Glucosaminsäure oder 6-Aminohexansäure; oder (c) ein Peptid, das ein Molekulargewicht von zwischen 500 und 10.000 Dalton hat; und einen detektierbaren Marker, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Carboxyl-, Aldehydradikal-, Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimidester-, Sulfonylhaligenid- oder Carbonsäuregruppe oder einem Fluorophor.
- Der Kit gemäß Anspruch 27, worin das Diamin gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Propylen-, Butylen-, Pentylen-, Hexylen-, Ethylen- und Nonylen-Diamin oder einem Diamin, das einen hydroxylierten Kohlenwasserstoff einschließt.
- Der Kit gemäß Anspruch 27, worin das Diamin Ethylen-Diamin ist.
- Der Kit gemäß Anspruch 28, worin das Diamin Lysin oder Ornithin ist.
- Der Kit gemäß Ansprüchen 27 bis 30, worin der feste Träger ein Kügelchen ist.
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DE10112387B4 (de) * | 2001-03-15 | 2004-03-25 | Bruker Daltonik Gmbh | Massenspektrometrische Genotypisierung |
US8895311B1 (en) | 2001-03-28 | 2014-11-25 | Handylab, Inc. | Methods and systems for control of general purpose microfluidic devices |
US7829025B2 (en) | 2001-03-28 | 2010-11-09 | Venture Lending & Leasing Iv, Inc. | Systems and methods for thermal actuation of microfluidic devices |
US6645719B2 (en) * | 2001-06-05 | 2003-11-11 | Advanced Gene Technology Corporation | Herbal chip |
WO2004019276A1 (en) * | 2002-08-20 | 2004-03-04 | Cyvera Corporation | Diffraction grating-based optical identification element |
US7923260B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-04-12 | Illumina, Inc. | Method of reading encoded particles |
US7872804B2 (en) * | 2002-08-20 | 2011-01-18 | Illumina, Inc. | Encoded particle having a grating with variations in the refractive index |
US7441703B2 (en) * | 2002-08-20 | 2008-10-28 | Illumina, Inc. | Optical reader for diffraction grating-based encoded optical identification elements |
CA2496296A1 (en) * | 2002-08-20 | 2004-03-04 | Cyvera Corporation | Diffraction grating-based encoded micro-particles for multiplexed experiments |
US7508608B2 (en) * | 2004-11-17 | 2009-03-24 | Illumina, Inc. | Lithographically fabricated holographic optical identification element |
US7126755B2 (en) * | 2002-09-12 | 2006-10-24 | Moon John A | Method and apparatus for labeling using diffraction grating-based encoded optical identification elements |
US7900836B2 (en) * | 2002-08-20 | 2011-03-08 | Illumina, Inc. | Optical reader system for substrates having an optically readable code |
US7164533B2 (en) | 2003-01-22 | 2007-01-16 | Cyvera Corporation | Hybrid random bead/chip based microarray |
US20050227252A1 (en) * | 2002-08-20 | 2005-10-13 | Moon John A | Diffraction grating-based encoded articles for multiplexed experiments |
US7901630B2 (en) * | 2002-08-20 | 2011-03-08 | Illumina, Inc. | Diffraction grating-based encoded microparticle assay stick |
CA2499046A1 (en) * | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Cyvera Corporation | Diffraction grating-based encoded micro-particles for multiplexed experiments |
US7092160B2 (en) * | 2002-09-12 | 2006-08-15 | Illumina, Inc. | Method of manufacturing of diffraction grating-based optical identification element |
WO2004025561A1 (en) * | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Cyvera Corporation | Chemical synthesis using diffraction grating-based encoded optical elements |
AU2003267192A1 (en) * | 2002-09-12 | 2004-04-30 | Cyvera Corporation | Method and apparatus for aligning elongated microbeads in order to interrogate the same |
WO2004025560A1 (en) * | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Cyvera Corporation | Assay stick comprising coded microbeads |
US20100255603A9 (en) * | 2002-09-12 | 2010-10-07 | Putnam Martin A | Method and apparatus for aligning microbeads in order to interrogate the same |
EP2402089A1 (de) | 2003-07-31 | 2012-01-04 | Handylab, Inc. | Verarbeitung partikelhaltiger Proben |
US20060057729A1 (en) * | 2003-09-12 | 2006-03-16 | Illumina, Inc. | Diffraction grating-based encoded element having a substance disposed thereon |
US20050074900A1 (en) * | 2003-10-07 | 2005-04-07 | Morgan Nicole Y. | Microfluidic flow-through immunoassay for simultaneous detection of multiple proteins in a biological sample |
US7433123B2 (en) | 2004-02-19 | 2008-10-07 | Illumina, Inc. | Optical identification element having non-waveguide photosensitive substrate with diffraction grating therein |
US7387877B2 (en) * | 2004-04-06 | 2008-06-17 | Oro Grande Technology | Bio-sensor and bio-sensor reporting system |
US8852862B2 (en) | 2004-05-03 | 2014-10-07 | Handylab, Inc. | Method for processing polynucleotide-containing samples |
WO2006020363A2 (en) * | 2004-07-21 | 2006-02-23 | Illumina, Inc. | Method and apparatus for drug product tracking using encoded optical identification elements |
US7602952B2 (en) | 2004-11-16 | 2009-10-13 | Illumina, Inc. | Scanner having spatial light modulator |
WO2006055736A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Illumina, Inc. | And methods and apparatus for reading coded microbeads |
US7604173B2 (en) * | 2004-11-16 | 2009-10-20 | Illumina, Inc. | Holographically encoded elements for microarray and other tagging labeling applications, and method and apparatus for making and reading the same |
US7623624B2 (en) * | 2005-11-22 | 2009-11-24 | Illumina, Inc. | Method and apparatus for labeling using optical identification elements characterized by X-ray diffraction |
US11806718B2 (en) | 2006-03-24 | 2023-11-07 | Handylab, Inc. | Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system |
US7998708B2 (en) | 2006-03-24 | 2011-08-16 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
WO2007112114A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Handylab, Inc. | Integrated system for processing microfluidic samples, and method of using same |
US10900066B2 (en) | 2006-03-24 | 2021-01-26 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
US7830575B2 (en) * | 2006-04-10 | 2010-11-09 | Illumina, Inc. | Optical scanner with improved scan time |
US8709787B2 (en) | 2006-11-14 | 2014-04-29 | Handylab, Inc. | Microfluidic cartridge and method of using same |
WO2008060604A2 (en) | 2006-11-14 | 2008-05-22 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
US8287820B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-10-16 | Handylab, Inc. | Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system |
US9186677B2 (en) | 2007-07-13 | 2015-11-17 | Handylab, Inc. | Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples |
US8105783B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-01-31 | Handylab, Inc. | Microfluidic cartridge |
US8182763B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-05-22 | Handylab, Inc. | Rack for sample tubes and reagent holders |
JP5651011B2 (ja) | 2007-07-13 | 2015-01-07 | ハンディーラブ インコーポレイテッド | ポリヌクレオチド捕捉材料およびその使用方法 |
US9618139B2 (en) | 2007-07-13 | 2017-04-11 | Handylab, Inc. | Integrated heater and magnetic separator |
US20130130917A1 (en) * | 2011-01-13 | 2013-05-23 | Halgen Corporation | Method for specific enrichment of nucleic acid sequences |
WO2012142516A1 (en) | 2011-04-15 | 2012-10-18 | Becton, Dickinson And Company | Scanning real-time microfluidic thermo-cycler and methods for synchronized thermocycling and scanning optical detection |
USD692162S1 (en) | 2011-09-30 | 2013-10-22 | Becton, Dickinson And Company | Single piece reagent holder |
CN106996984B (zh) | 2011-09-30 | 2018-11-27 | 贝克顿·迪金森公司 | 组合试剂条 |
WO2013067202A1 (en) | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Handylab, Inc. | Polynucleotide sample preparation device |
JP6262152B2 (ja) | 2012-02-03 | 2018-01-17 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーBecton, Dickinson And Company | 分子診断試験の分布及び試験間のコンパチビリティ判断のための外部ファイル |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5082935A (en) | 1988-12-15 | 1992-01-21 | Amoco Corporation | Diagnostic reagents made by attaching cytidine containing nucleic acid probes to amino functionalized solid supports by bisulfite mediated transamination |
US5215882A (en) * | 1989-11-30 | 1993-06-01 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of immobilizing nucleic acid on a solid surface for use in nucleic acid hybridization assays |
US5541307A (en) * | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
US5491224A (en) | 1990-09-20 | 1996-02-13 | Bittner; Michael L. | Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture |
US5506350A (en) | 1990-09-20 | 1996-04-09 | Bittner; Michael L. | Production of chromosome region specific DNA sequences and transamination |
JP3469238B2 (ja) * | 1991-09-19 | 2003-11-25 | ヴァイシス・インコーポレーテッド | 染色体領域特異性dna配列の調製およびアミノ基転移 |
US5736626A (en) | 1996-01-29 | 1998-04-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides |
-
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