DE69124522T2

DE69124522T2 - Sonde zusammensetzungen für chromosom identifizierung und verfahren

Info

Publication number: DE69124522T2
Application number: DE69124522T
Authority: DE
Inventors: Michael Louis Naperville Il 60563 Bittner; Mona Stein Chicago Il 60645 Legator; Larry Edward Glen Ellyn Il 60137 Morrison
Original assignee: Vysis Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 1990-09-20
Filing date: 1991-09-19
Publication date: 1997-09-25
Anticipated expiration: 2011-09-20
Also published as: EP0549709A4; WO1992005185A1; JP4487034B2; ATE148503T1; JP3656651B2; JP2004105178A; EP0549709A1; DE69124522D1; CA2091764A1; JP2005087210A; EP0787805A2; JPH05501809A; EP0549709B1; CA2091764C; JP3656754B2; EP0787805A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Detektion und Identifikation von Chromosomen oder Chromosombereichen durch Hybridisierung einer Mehrzahl von verschiedenen chromosomspezifischen Sonden. Insbesondere betrifft diese Erfindung die in situ-Hybridisierung dieser chromosomspezifischen Sonden zum Zielchromosom. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Detektion von Chromosomen oder Chromosombereichen unter Verwendung von fluoreszierend markierten Reagenzien.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Sonden, die DNA-Sequenzen enthalten, die komplementär zu Ziel- DNA-Sequenzen von spezifischen individuellen gesamten Chromosomen oder Chromosombereichen eines multichromosomalen Genoms sind, sind bekannt (siehe beispielsweise Pinkel et al. in "Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4" bei Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:9138-9142, Dez. 1988; Manuelidis in "Chromosomal Localization of Complex and Simple Repeated Human DNA's" Chromosoma 66:23-32, 1978).
Die überwiegende Mehrheit von bekannten Sonden, die aus solchen Sequenzen präpariert wurden, waren indirekt markierte Sonden und erforderten so eine Posthybridisierungsverarbeitung. Beispielsweise waren solche Sonden mit Biotin derivertisiert und nachfolgend zum Hybridisierungsvorgang wurden Schritte ausgeführt, um eine sandwichartige Struktur von Fluoreszein-markiertem Avidin und biotinylierten Antiavidin-Antikörpern aufzubauen. Im Gegensatz hierzu erfordern die direkt markierten Sonden dieser Erfindung nur einen Sondendurchdringungsschritt einer objektträgergehaltenen Probe während eines in situ-Hybridisie rungsvorgangs.
Bekannte Methoden zum Markieren derartiger bekannter chromosomspezifischer komplementärer DNA-Sequenzen zeigen Schwierigkeiten im Steuern der Anzahl von Markierungsteilen, die an individuelle Sequenzen angehängt werden.
EP-A-0382433 offenbart Methoden und Reagenzien zum Detektieren von Nucleinsäuresequenzen in homogener Lösung unter Verwendung von Fluoreszenzpolarisation, um eine Hybridisierung einer fluoreszierenden Nucleinsäuresonde zu entdecken.
Nucleic Acids Res 12 (1984) 989 - 1002; Biochemistry 19 (1980) 1774 - 1781 bezieht sich auf eine Methode der Transamination von Cytosinresten von Nucleinsäurefolgen.
Verbesserte Sondenzusammensetzungen, die aus (a) Fluorophormarkierungen, die leicht und genau direkt detektiert werden, und (b) DNA-Segmente umfassen, die komplementär zu spezifischen chromosomalen DNA-Segmenten sind, würden als chromosomspezifische Kennzeichnungen in in situ-Hybridisierungsversuchen sehr zweckmäßig sein. Die vorliegende Erfindung liefert sowohl derartige Sonden als auch effiziente, verläßliche Methoden zu ihrer Herstellung und Verwendung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert: (1) Sondenzusammensetzungen für die in situ-Detektion eines Chromosoms oder eines Chromosombereichs, (2) Methoden zum Herstellen derartiger Sondenzusammensetzungen und (3) Methoden zur Verwendung derartiger Sondenzusammensetzungen für die in situ-Detektion eines Chromosoms oder eines Chromosombereichs.
Diese Erfindung liefert Sondenzusammensetzungen für die in situ-Detektion eines vorgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs, umfassend Mehrfach-DNA-Segmente komplementär zu verschiedenen Abschnitten des zu detektierenden Chromosoms oder Chromosombereichs, wobei in der Sondenzusammensetzung DNA-Segmente fluoreszierende Mehrfachmarkierer umfassen, die kovalent hiermit verknüpft sind, wobei etwa 0,3 bis etwa 6,0 Mol-% der gesamten Nucleotidbasen in den DNA-Segmenten fluoreszierend markiert sind.
Die Erfindung umfaßt eine Sondenzusammensetzung, die unhybridisierte DNA-Segmente enthält, die im wesentlichen komplementär zu DNA-Basensequenzen sind, die in verschiedenen Abschnitten des zu erkennenden Chromosoms oder Chromosombereichs existieren und die eine Vielzahl von Cytosinbasen (d.h. Deosxycytidinnucleotide) enthalten. Eine Anzahl von Cytosinbasen besitzen eine kovalent hieran gebundene fluoreszierende Markierung. Die Anzahl von fluoreszierend markierten Cytosinbasen ist ausreichend, um eine erkennbare fluoreszierende Markierung zu erzeugen, und ausreichend, um ein erkennbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen, während die individuell so markierten DNA-Segmente im wesentlichen ihre spezifischen komplementären Bindungs-(Hybridisierungs-)Eigenschaften in bezug auf das zu erkennende Chromosom oder den Chromosombereich behalten.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Herstellen einer Sondenzusammensetzung zur in situ-Erkennung eines besonderen ausgewählten Chromosoms oder eines Bereichs eines derartigen Chromosoms, umfassend ein:
(a) Auseinanderreißen (das heißt Fragmentieren) von DNA komplementär zu dem Chromosom oder Chromosombereich in Fragmente,
(b) Transaminieren der DNA-Fragmente, und
(c) kovalentes Verknüpfen eines fluoreszierenden Farbstoffs mit den transaminierten DNA-Fragmenten, wobei etwa 0,3 bis 6,0 Mol-% der gesamten Nucleotidbasen in den DNA-Fragmenten fluoreszierend markiert sind.
Spezifischer umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Präparieren einer Sondenzusammensetzung zur in situ-Erkennung eines vorgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs, umfassend:
(a) ein Transaminieren einer Verbindungsgruppe einer Anzahl von Desoxycytidinnucleotiden, die in unhybridisierten DNA-Basissequenzen oder Segmenten enthalten sind, die wesentlich repräsentativ für komplementäre Basiszielsequenzen sind, die in dem Chromosom oder Chromosombereich, der zu erkennen ist, existieren; und
(b) ein kovalentes Binden einer fluoreszierenden Markierung zu wenigstens einem Teil der transaminierten Desoxycytidinbasen, wobei der Teil von Desoxycytidinbasen, der daran kovalent gebundene fluoreszierende Markierungen aufweist, ausreichend ist, um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen, während im wesentlichen die spezifischen komplementären Bindungseigenschaften der transaminierten Basen in bezug auf das zu erkennende Chromosom oder den Chromosombereich erhalten bleiben, wobei etwa 0,3 bis etwa 6,0 Mol-% der gesamten Nucleotidbasen in den DNA-Segmenten fluoreszierend markiert ist.
Zusätzlich liefert die Erfindung ein Verfahren zur in situ- Erkennung eines vorgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs, umfassend:
(a) Zusetzen eines Überschusses an blockierenden DNA zu einer erfindungsgemäßen Sondenzusammensetzungen, vorzugsweise unter Hybridisierungsbedingungen, um mit nichtspezifischer Bindung DNA in der Sondenzusammensetzung zu binden, wodurch eine blockierte Sondenzusammensetzung gebildet wird,
(b) Kontaktieren der blockierten Sondenzusammensetzung unter Hybridisierungsbedingungen mit dem Chromosom oder Chromosombereich, der zu entdecken ist, und
(c) Detektieren der Bindung der blockierten Sondenzusammensetzung an dem zu entdeckenden Chromosom oder Chromosombereich durch Fluoreszenztechniken.
Es ist eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sondenzusammensetzungen zu schaffen, die direkt mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind. Die Verwendung derartiger direkt markierter Sondenzusammensetzungen vermeidet die Notwendigkeit von detaillierten und langwierigen Posthybridisierungsvorgängen, wie sie bei indirekt markierten bekannten Sondenzusammensetzungen erforderlich sind, die beispielsweise Biotinmarkierungen, Avidin und biotinylierte Antiavidin- Antikörper verwenden. Die erfindungsgemäße Sondenzusammensetzung erlaubt es dem Verwender, unmittelbar vom Hybridisierungsschritt zur Schlußwaschung und Visualisierung zu schreiten, wodurch der notwendige Betrag an Versuchszeit und Laborbenutzung reduziert wird. Die Anzahl an Reagenzien, die erforderlich sind, um den Versuch durchzuführen, wird ebenfalls reduziert, wodurch sich eine erhöhte Vereinfachung der Verwendung und Herstellung ergibt.
Es ist eine spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Sondenzusammensetzung zur in situ-Erkennung eines vorbestimmten Chromosoms oder vorbestimmten Chromosombereichs zu schaffen, wobei die Sondenzusammensetzung Mehrfach-DNA-Segmente enthält, die komplementär zu verschiedenen Abschnitten von Chromosomen oder Chromosombereichen, die zu entdecken sind, sind. Die Mehrfach-DNA-Segmente in der Sondenzusammensetzung umfassen Mehrfach-Fluoreszenzmarkierungen, die kovalent an die DNA-Segmente gebunden sind. Diese Fluoreszenzmarkierungen erlauben es, die DNA-Segmente, die mit dem zu entdeckenden Chromosom oder Chromosombereich hybridisieren, unter Verwendung von Fluoreszenztechniken zu detektieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fluoreszenzmarkierungen kovalent an eine Anzahl von Desoxycytidinbasen in den DNA-Segmenten durch Verbindungsgruppen angebunden. Die Anzahl von Desoxycytidinbasen, die Fluoreszenzmarkierungen tragen, ist ausreichend, um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen, während zur gleichen Zeit die spezifischen Bindungseigenschaften der markierten DNA- Segmente im wesentlichen in bezug auf das zu entdeckende Chromosom oder den Chromosombereich erhalten wird.
Es ist auch eine Aufgabe dieser Erfindung, vorgewählte Mehrfach-Chromosome oder Chromosombereiche zu detektieren. Dies wird erreicht durch Kennzeichnung einer Bibliothek von DNA-Segmenten, die spezifisch für ein Chromosom oder einen Chromosombereich sind, mit einer Fluoreszenzmarkierung und Markieren einer anderen Bibliothek von DNA- Segmenten, die für ein anderes Chromosom oder anderen Chromosombereich spezifisch sind, mit einer anderen Fluoreszenzmarkierung, so daß die Fluoreszenzmarkierungen unabhängig voneinander durch Fluoreszenztechniken detektiert werden können. DNA-Segmente jedes Chromosoms oder Chromosombereichs von Interesse werden auf diese Weise markiert. Somit können Kombinationen von derartigen resultierenden Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden, um zwei oder mehr Chromosome oder Chromosombereiche zu detektieren.
Diese Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Detektieren einer Vielzahl von vorgewählten Chromosomen oder Chromosombereichen durch Bereitstellen einer Sondenzusammensetzung derartig markierter, spezifisch gebundener DNA-Segmente für jedes Chromosom oder jeden Chromosombereich der ausgewählten Vielzahl. Die Sondenzusammensetzung, die spezifisch für jedes Chromosom oder jeden Chromosombereich ist, wird mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung gekennzeichnet, so daß jede Fluoreszenzmarkierung in Anwesenheit der anderen detektiert werden kann. Diese Sondenzusammensetzungen von markierten DNA werden dann entweder in Mischung oder in Folge unter Hybridisierungsbedingungen mit den zu entdeckenden Chromosomen oder Chromosombereichen in Kontakt gebracht. Die Hybridisierung wird durch Anwesenheit oder Abwesenheit des besonderen Fluoreszenzsignals detektiert, das durch jede der markierten DNA- Segmente, das mit dem besonderen ausgewählten Chromosom oder besonderen ausgewählten Chromosombereich hybridisiert ist, erzeugt.
Die Detektion von Mehrfach-Chromosomen oder Chromosombereichen ist beträchtlich schwieriger bei Verwendung einer indirekten Markierung, da verschiedene indirekte Bindungspartner (beispielsweise Biotin/Avidin oder Antikörper/Antigen) für jedes Chromosom oder jeden Chromosombereich, die zu identifizieren sind, erforderlich sind. Beispielsweise würde die Erkennung von zwei verschiedenen Chromosomen Biotin/Avidin und ein spezifisches Antikörper/Antigen-Bindungspaar zusätzlich zu zwei verschiedenen detektierbaren Markierungen wie Fluorophore erfordern. Die indirekte Markierungstechnik erfordert daher sechs Markierungskomponenten verglichen mit nur zwei Markierungskomponenten, die bei direkter Markierung erforderlich sind. Die Detektion von drei Ereignissen erfordert den Zusatz eines dritten verschiedenen Satzes von Antikörpen Antigen-Partnern und eines dritten Fluorophoren (neun Markierungskomponenten insgesamt, verglichen mit drei Komponenten beim direkten Markieren). Es ist viel schwieriger, ein zusätzliches Paar von Bindungspartnern zu finden und zu adaptieren, als ein zusätzliches Fluorophor aufzufinden. Eine große Anzahl von Fluorophoren sind kommerziell erhältlich in reaktiven Formen, die an das Kennzeichnen von transaminierter DNA anpaßbar sind.
Es ist eine zusätzliche spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Sondenzusammensetzungen zur in situ-Detektion eines vorbestimmten Chromosoms oder vorbestimmten Chromosombereichs zu schaffen. Die erste Stufe eines bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, Plasmid-DNA, erhalten aus einer chromosomalen Phagenbibliothek, in Fragmente zu zerteilen. Diese DNA-Fragmente werden mit einer Verbindungsgruppe transaminiert und Fluoreszenzfarbstoffe werden dann kovalent an die transaminierten DNA- Fragmente angebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Anzahl von transaminierten Desoxycytidinnucleotiden, an die Fluoreszenzmarkierungen kovalent gebunden sind, ausreichend, um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen, während gleichzeitig die spezifischen Bindungseigenschaften der DNA-Segmente im wesentlichen in bezug auf das zu entdeckende Chromosom oder Chromosombereich erhalten werden.
Es ist eine weitere spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bevorzugte Verfahren zur in situ-Erkennung eines vorgewählten Chromosoms oder vorgewählten Chromosombereichs zu schaffen. Im allgemeinen werden die bevorzugten Verfahren ausgeführt durch Kontaktieren einer Sondenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit dem vorgewählten Chromosom oder Chromosombereich, die zu entdecken sind, unter Hybridisierungsbedingungen. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Fluoreszenzsignals, das durch eine Sondenzusammensetzung erzeugt wird, die mit dem Chromosom oder dem Chromosombereich von Interesse hybridisiert wurde, wird dann detektiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein überschuß an blockierender DNA der Sondenzusammensetzung vorzugsweise unter Hybridisierungsbedingungen zugesetzt, wodurch eine blockierte Sondenzusammensetzung gebildet wird. Diese blockierende DNA bindet nichtspezifische Bindungs-DNA in der Sondenzusammensetzung. Die blokkierte Sondenzusammensetzung wird dann mit dem Chromosom oder Chromosombereich von Interesse unter Hybridisierungsbedingungen kontaktiert.
Weitere Aufgaben und bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und Ansprüchen diskutiert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

(A) Definitionen

Der Ausdruck "Sequenz" bezieht sich auf eine Kette oder untereinander verbundene Reihe von DNA-Nucleotiden.
Der Ausdruck "Fragment", "Segment" oder "DNA-Segment" benennt allgemein nur einen Abschnitt eines größeren DNA-Polynucleotids oder -Sequenz, wie es in einem Chromosom oder einem Chromosombereich auftritt. Ein Polynucleotid kann beispielsweise aufgebrochen oder fragmentiert werden in eine Vielzahl von Segmenten oder Fragmenten. Wie bekannt ist, enthält ein Chromosom charakteristischerweise Bereiche, die DNA- Sequenzen haben, die sich wiederholende DNA-Segmente enthalten, Der Ausdruck "wiederholt" nimmt bezug auf die Tatsache, daß ein bestimmtes DNA-Segment eine Mehrzahl (d.h. wenigstens zwei) von Malen als die gleiche DNA-Sequenz oder eine Vielzahl von DNA-Sequenzen auftritt. Die individuelle DNA-Segementgröße und/oder wiederholte DNA-Segmentgröße kann stark variieren. Beispielsweise wird im Falle des menschlichen Genoms angenommen, daß jedes wiederholte DNA-Segment typischerweise einen angenäherten Größenbereich von etwa 5 bis etwa 3.000 bp aufweist. Eine einzelne Chromosomalphoid-DNA-Sequenz kann wenigstens etwa fünf verschiedene wiederholte DNA-Segmente enthalten.
Der Ausdruck "Genom" bezeichnet den vollständigen Einzelkopiersatz genetischer Instruktionen für einen Organismus, wie er in den DNA des Organismus codiert ist. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist das besondere Genom unter Betrachtung typischerweise multichromosomal, so daß solche DNA zellular unter einer Vielzahl von individuellen Chromosomen verteilt ist (welche Zahl beispielsweise bei Menschen 22 Paare plus ein Geschlecht, assoziiert dem XX-Paar oder XY-Paar, ist).
In der Praxis dieser Erfindung ist das Genom, das in irgendeinem gegebenen Fall involviert ist, vorzugsweise von einem Primaten, und die DNA-Sequenzen eines vorgewählten Chromosoms von einem derartigen Genom enthalten wiederholte DNA-Segmente, die entweder in Alphoid-DNA enthalten oder mit dem Centromer des vorgewählten Chromosoms assoziiert ist. Der hier verwendete Ausdruck "Alphoid" oder "Alphasatellit" in bezug auf DNA nimmt Bezug auf die Komplexfamilie von tandemartig wiederholten DNA-Segmenten, die in Genomen von Primaten gefunden werden. Lange Tandemreihen von Alphasatellit-DNA, basierend auf einer Monomer- Repeat-Länge von etwa 171 Basispaaren sind hauptsächlich in Centromeren von Primatenchromosomen lokalisiert.
Der Ausdruck "Chromosom" bezieht sich auf einen erbguttragenden Genträger einer lebenden Zelle, der von Chromatin abgeleitet ist und DNA und Proteinkomponenten (speziell Histone) umfaßt. Das konventionelle international anerkannte Individualhumangenomchromosom-Numerierungsidentifikationssystem wird hier verwendet. Die Größe eines individuellen Chromosoms kann von einem Typ zum anderen in einem gegebenen multichromosomalen Genom und von einem Genom zum anderen variieren. In Falle des (bevorzugten) Humangenoms ist die gesamte DNA-Masse eines gegebenen Chromosoms gewöhnlich größer als etwa 100.000.000 bp. Beispielsweise beträgt die Größe des gesamten menschlichen Genoms etwa 3 x 10&sup9; bp. Das größte Chromosom, Chromosom Nr. 1, enthält etwa 2,4 x 10&sup8; bp, während das kleinste Chromosom, Chromosom Nr. 22, etwa 5,3 x 10&sup7; bp enthält (Yunis, J.J. Science 191:1268-1270 (1976), und Kavenoff, R., et al. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 38:1-8 (1973).
Der Ausdruck "Bereich" bezeichnet einen Abschnitt eines Chromosoms, das wiederholte DNA-Segmente enthält, die vorzugsweise alphoid oder mit den Centromeren assoziiert sind. Die tatsächliche physikalische Größe oder das Ausmaß einer derartigen individuellen Region kann stark variieren. Eine exakte Quantifizierung einer derartigen Region kann nicht für alle möglichen Regionen gemacht werden. Gewöhnlich ist eine Region wenigstens groß genug, um wenigstens eine DNA-Sequenz zu umfassen, die (a) eine Vielzahl von Kopien von wenigstens einem wiederholten DNA-Segment enthält und die (b) identifizierbar und vorzugsweise durch fluoroskopische mikroskopische Prüfung nach Bildung von fluorophormarkierten Hybriden in einem derartigen Bereich nachfolgend einer in situ- Hybridisierung mit einer Direktmarkierungssonde oder Sondenzusammensetzung identifizierbar ist. Derzeit erhältliche Information legt nahe, daß ein Bereich mehr als eine einzelne derartige DNA-Sequenz enthält, wobei jede derartige DNA-Sequenz eine oder mehrere wiederholte DNA-Segmente enthält.
Der Begriff "Bereich" ist typischerweise und charakteristisch ein Chromosomfragment, das weniger DNA-Masse oder Umfang als die gesamte DNA-Masse oder Umfang eines gegebenen Chromosoms enthält. Wie bekannt ist, ist nicht die gesamte DNA eines gegebenen Chromosoms oder Chromosombereichs als DNA-Sequenzen, die aus wiederholten DNA-Segmenten bestehen oder diese enthalten, angeordnet. Beispielsweise kann ein Bereich eine Größe besitzen, die etwa 2 x 10&sup6; bis etwa 40 x 10&sup6; DNA bp umfaßt, welcher Größenbereich beispielsweise Centromere der menschlichen Chromosome einschließt. Eine derartige Bereichsgröße wird derzeit als eine Bereichsgröße in der Praxis dieser Erfindung bevorzugt, obwohl größere und kleinere Bereichsgrößen verwendet werden können. Ein centromerer Bereich selbst eines kleinen menschlichen Chromosoms ist ein mikroskopisch sichtbarer großer Abschnitt des Chromosoms, und ein Bereich, der wiederholte DNA-Segmente (nicht alphoid oder centromerisch) auf dem Y-Chromosom enthält, nimmt den Hauptteil des Chromosoms ein und ist mikroskopisch sichtbar.
Im allgemeinen ist der Ausdruck "Bereich" nicht definitiv für ein oder mehrere besondere Gene, da ein "Bereich" den besonderen Codiersegmenten (Exone) eines einzelnen Gens keine spezifische Rechnung trägt. Er ist ein "Bereich", wie er hier in bezug auf ein Chromosom verwendet wird, einzig für ein gegebenes Chromosom aufgrund der besonderem Kombination von DNA-Segmenten in diesem zur hiesigen Sondenzusammensetzungsformation und Verwendungszwecken.
Der Ausdruck "Centromer" bezieht sich auf einen heterochromatischen Bereich des eukariotischen Chromosoms, wobei es sich um die chromosomale Stelle der Befestigung des Kinetochors handelt. Das Centromer teilt sich unmittelbar, bevor sich replizierte Chromosome trennen und hält so die chromatiden Paare zusammen.
Der Ausdruck "Gen" bezeichnet eine DNA-Sequenz längs eines Chromosoms, die ein funktionales Produkt codiert (entweder RNA oder ihr Übersetzungsprodukt, ein Polypeptid). Ein Gen enthält einen Codierbereich und schließt Bereiche ein, die dem Codierbereich vorhergehen und folgen (als "Leader" bzw. "Trailer" bezeichnet). Der Codierbereich besteht aus einer Vielzahl von Codiersegmenten ("Exone") und Zwischenfolgen ("Introne") zwischen individuellen Codiersegmenten.
Der Ausdruck "Sonde" oder "Sondenzusammensetzung" bezieht sich auf ein Polynucleotid oder eine Mischung von Polynucleotiden wie DNA- Sequenz(en) oder DNA-Segment(e), die (oder das) chemisch mit individuellen markierungsenthaltenden Hälften chemisch kombiniert (d.h. assoziiert) wurde(n). Jedes derartiges Polynucleotid einer Sonde ist typischerweise zur Zeit der Hybridisierung an einem Ziel einzelsträngig.
Der Ausdruck "Markierung" oder "markierungsenthaltender Teil" bezieht sich im allgemeinen Sinn auf einen Teil, etwa ein radioaktives Isotop oder eine dieses enthaltende Gruppe und nichtisotopische Markierungen wie Enzyme, Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin, lumineszierende Mittel, Farbstoffe, Haptene und dergleichen. Lumineszierende Mittel können in Abhängigkeit von der Quelle der Anregungsenergie als radiolumineszierend, chemilumineszierend, biolumineszierend und photolumineszierend (einschließlich fluoreszierend und phosphoreszierend) klassifiziert werden.
Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung enthalten DNA-Segmente, die chemisch an markierungsenthaltende Teile gebunden sind. Jeder markierungsenthaltende Teil enthält wenigstens eine (fluoreszierende) Fluorophorgruppe und jeder markierungsenthaltende Teil wird abgeleitet von einer monofunktionalen reaktiven Substituent-enthaltenden und auch fluorophoren Substituent-enthaltenden Ausgangsfluoreszenzverbindung, wie nachstehend im einzelnen beschrieben.
Der Ausdruck "Direktmarkierungssonde" (oder "Direktmarkierungssondenzusammensetzung") bezeichnet eine Nucleinsäuresonde, deren Markierung nach Hybridbildung mit einem Ziel ohne weitere reaktive Verarbeitung des Hybrids detektierbar ist. Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung sind vom Direktmarkierungstyp.
Der Ausdruck "indirekte Markierungssonde" (oder "indirekte Markierungssondenzusammensetzung") bezeichnet eine Nucleinsäuresonde, deren Markierung nach Hybridbildung mit einem Ziel weiter in nachfolgender Verarbeitung mit einem oder mehreren Reagenzien zu reagieren hat, um hiermit ein oder mehrere Teile zu assozueren, die schließlich in einer detektierbaren Gesamtheit resultieren.
Der Ausdruck "Ziel", "DNA-Ziel" oder "DNA-Zielbereich" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die an einer spezifischen chromosomalen Stelle auftritt. Jede derartige Sequenz oder Abschnitt ist typischerweise und vorzugsweise wenigstens teilweise zur Zeit der Hybridisierung einzelstrangig (d.h. denaturiert). Wenn die Zielnucleotidsequenzen nur in einem einzelnen Bereich oder einer Fraktion eines gegebenen Chromosoms lokalisiert sind, wird manchmal der Ausdruck "Zielbereich" verwendet. Ziele zur Hybridisierung können von Proben erhalten werden, die umfassen, jedoch nicht begrenzt sind auf Chromosome oder Bereiche von Chromosomen in normalen, abgestorbenen oder kranken menschlichen oder tierischen oder Pflanzenzellen, und zwar in einem Zwischenzustand oder in irgendeinem Zustand der Meiose oder Mitose und entweder extrahiert oder erhalten sind aus lebenden oder abgestorbenen Geweben, Organen oder Flüssigkeiten, Keimzellen einschließlich Sperma und Eizellen, Saaten, Pollen oder Zygoten, Embryos, chorionischen oder amniotischen Zellen oder Zellen von irgendeinem anderen keimenden Körper, Zellen, die in vitro gewachsen sind, aus Langzeit- oder Kurzzeitkulturen, und entweder normal, verewigt oder transformiert, inter- oder intraspezifische Hybnde verschiedener Typen von Zellen oder Unterscheidungszuständen dieser Zellen, individuelle Chromosome oder Teile von Chromosomen oder translokatierte, gelöschte oder sonstwie beschädigte Chromosome, isoliert durch irgendeine Anzahl von Mitteln, wie sie dem Fachmann bekannt sind, einschließlich Bibliotheken derartiger Chromosome, geklont oder propagiert in prokaryotischen oder anderen Klonungsvektoren oder in vitro verstärkt durch dem Fachmann bekannte Mittel; oder irgendein forensisches Material, umfassend, jedoch nicht begrenzt auf Samen, Blut, Haar oder andere Proben.
Der Ausdruck "Hybrid" bezieht sich auf das Produkt eines Hybridisierungsvorgangs zwischen einer Sonde und einem Ziel. Typischerweise ist ein Hybrid ein Molekül, das einen doppelsträngigen, schraubenlinienförmig konfigurierten Teil umfaßt, der aus komplementärgepaarten einzeistrangigen Molekülen wie etwa zwei DNA-Molekülen gebildet ist, von denen eines eine Ziel-DNA-Nucleotidsequenz und das andere hiervon die markierte DNA-Nucleotidsequenz einer Sonde ist.
Der Ausdruck "färben", "ausgewählt färben", "ausgewählt gefärbt" oder dergleichen bezieht sich allgemein auf eine lokalisierte Bereichsfarbe, die durch einen Färbevorgang oder dergleichen erzielt wird, welche Farbe Wirkung auf eine ausgewählte Gruppe von Komponenten (oder Konstituenten) einer cytologischen oder histologischen Präparation haben. Typischerweise sind derartige gefärbte Komponenten einer mikroskopischen Prüfung oder dergleichen zu unterziehen, Gewöhnlich kann eine andere oder eine zusätzliche oder Hintergrundfärbung (d.h. Farbe) involviert sein, etwa eine sogenannte Gegenfarbe, die auf alle Komponenten einer größeren Klasse einwirkt, in die eine ausgewählt gefärbte Gruppe von Komponenten fällt, Der Hauptzweck einer Färbung besteht darin, die Identifikation von Komponenten während einer solchen Prüfung zu verbessern oder zu ermöglichen. Eine Sondenzusammensetzung dieser Erfindung unter Hybridisierungsbedingungen erzeugt Hybride, die in der Tat ein Zielchromosom oder einen Zielchromosombereich mit einer fluorophoren Gruppe färben.
Der Ausdruck "fluoreszierend" (und äquivalente Ausdrücke) nimmt allgemein Bezug auf die Eigenschaft einer Substanz (etwa eines Fluorophors), Licht zu erzeugen, während sie Strahlungsenergie, etwa UV-Licht oder Röntgenstrahlung ausgesetzt wird.
Der Ausdruck "fluoreszierende Verbindung" oder "fluorophore Gruppe" bezieht sich allgemein auf einen organischen Teil. Eine fluoreszierende Verbindung ist in der Lage, mit einer Verbindungsgruppe zu reagieren, und eine fluorophore Gruppe kann bereits hiermit reagiert haben. Eine fluoreszierende Verbindung kann einen organischen Chelatbilder umfassen, der ein lumineszierendes anorganisches Ion, etwa von einer seltenen Erde wie Terbium, Europium, Ruthenium oder dergleichen anbindet.
Der Ausdruck "Bindungsverbindung" oder "Bindungsgruppe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich allgemein auf einen Kohlenwasserstoffteil. Eine Bindungsverbindung ist in der Lage, mit einer Nucleotidsequenz (oder einem Nucleotidsegment) zu reagieren, und eine Verbindungsgruppe kann bereits hiermit reagiert haben. Eine Bindungsverbindung ist auch fähig, mit einer Fluorophorverbindung zu reagieren, und eine Bindungsgruppe kann bereits hiermit reagiert haben.
Der Ausdruck "in situ" bedeutet, daß die Chromosome bezüglich des Zellkerns ohne wesentliche Beschädigung oder Verschiebung der Chromosome gegeneinander freigelegt und die Chromosome für die fluoreszierend markierten DNA-Sonden zugänglich sind.
Der Ausdruck "Denaturierung" oder "denaturieren" nimmt Bezug auf die wenigstens teilweise vollständige Konversion eines Polynucleotids aus einem vielsträngigen (oder doppelsträngigen) Zustand in einen einzelsträngigen Zustand. Die Anwesenheit eines Mittels oder von Mitteln, die in der Tat die Temperatur senken, die zur Denaturierung und zu nachfolgenden Hybridisierungsbedingungen zwischen Sonde (oder Sondenzusammensetzung) und Ziel erforderlich sind, ist allgemein wünschenswert, und ein derzeit meistbevorzugtes derartiges Mittel ist Formamid. Bei Verwendung von beispielsweise einem Volumenverhältnis von etwa 50:50 von Wasser und Formamid liegt eine beispielhafte Temperatur für die thermale Denaturierung im Bereich von etwa 70 bis etwa 80 Grad C für Zeiten, die beispielsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Minuten liegen.
Der Ausdruck "in situ-Hybridisierung" hat Bezug auf die Hybridisierung einer Sonde an einem Ziel, das in einer cytologischen oder histologischen Präparation oder Probe existiert. Als ein Ergebnis eines in situ-Hybridisierungsvorgangs werden Hybride zwischen einer Sonde und einem Ziel erzeugt. Dieser Ausdruck "in situ-Hybridisierung" kann Denaturierung einschließen und kann ferner einen Hybrid- oder Sondendetektionsvorgang einschließen, der nach in situ-Hybridisierung einer Sonde an einem Ziel durchgeführt wird. Eine Probe kann als eine Schicht auf einem Objektträger angeheftet werden und eine Probe kann beispielsweise individuelle Chromosome oder Chromosombereiche aufweisen oder enthalten, die behandelt wurden, um ihre Morphologie beispielsweise unter Denaturierungsbedingungen oder Bedingungen, wie sie typischerweise während einer cytometrischen Flußanalyse in einem Sondendetektionsvorgang existieren, zu behalten. Der Ausdruck "in situ-Hybridisierung" kann die Verwendung einer Gegenfärbung einschließen. Im Falle der erfindungsgemäß fluorophormarkierten Sonden oder Sondenzusammensetzungen kann die Detektionsmethode Fluoreszenzmikroskopie, Durchflußcytometrie oder dergleichen umfassen.
Der Ausdruck "Hybridisierungsbedingungen" nimmt generell Bezug auf die Kombinationen von Bedingungen, die in einem gegebenen Hybridisierungsverfahren verwendbar sind, um Hybride zu erzeugen, wobei solche Bedingungen typischerweise kontrollierte Temperatur, Flüssigphase und Kontaktieren zwischen einer Sonde (oder Sondenzusammensetzung) und einem Ziel umfassen. Ublicherweise und vorzugsweise geht ein Denaturierungsschritt einem Schritt voraus, in dem eine Sonde oder Sondenzusammensetzung mit einem Ziel kontaktiert wird. Alternativ kann eine Sonde mit einer Probe, die einen DNA-Zielbereich enthält, kontaktiert und beide zusammen Denaturierungsbedingungen unterworfen werden, wie durch Bhatt et al. in Nucleic Acids Research 16:3951-3961 beschrieben ist. Verwendet man beispielsweise eine Mischung von Wasser und Formamid in einem Volumenverhältnis von etwa 50:50, ist eine beispielhafte Temperatur zum Kontaktieren und Hybridisieren zwischen Sonde (oder Sondenzusammensetzung) und Ziel im Bereich von etwa 35 bis etwa 55ºC, die während einer Zeit angewendet wird, die beispielhaft im Bereich von etwa 1 bis etwa 18 h liegt. Andere Hybridisierungsbedingungen können verwendet werden. Das Verhältnis der Anzahl von Sonden zur Anzahl von Zielfolgen oder Segmenten kann stark variieren, jedoch gilt allgemein, je höher dieses Verhältnis desto höher ist die Wahrscheinlichkeit der Hybridbildung unter Hybridisierungsbedingungen innerhalb der Grenzen.
Der Ausdruck "vollständig" oder "im wesentlichen vollständig" bezieht sich auf die Kapazität einer Direktmarkierungssondenzusammensetzung dieser Erfindung, mit einem Ziel zu hybridisieren, so daß der Zielkörper oder die Zielkörper nach Hybridisierung hiermit in einem Ausmaß, das wenigstens ausreicht, das volle Ausmaß des Ziels (Morphologie) zu zeigen (d.h. färben oder identifizieren), (durch ein Fluoreszenzmikroskop, ein Durchflußcytometer oder dergleichen) hervorgehoben und identifizierbar ist/sind. Daher können Schwankungen in der Fluoreszenz-Färbungsintensität manchmal in einem individuellen hybridisierten chromosomalen Zielkörper vorhanden (d.h. beobachtet) sein, jedoch ist der Zielkörper als Ganzes im wesentlichen hervorgehoben.
Der Ausdruck "niedriger" bezieht sich auf eine individuelle Verbindung, Gruppe oder ein Radikal mit weniger als 6 Kohlenstoffatomen.
Der Ausdruck "Färbungssonde" (oder "Färbungssondenzusammensetzung") bezieht sich auf eine Sonde oder Sondenzusammensetzung wie eine Sondenzusammensetzung dieser Erfindung, die geeignet ist, unter Hybridisierungsbedingungen mit einem Ziel zu hybridisieren, das ein vorbestimmtes (d.h. vorgewähltes) Chromosom eines multichromosomalen Genoms enthält. Wenn es geschieht, daß nur ein fraktionaler Teil eines derartigen Chromosoms in einer Probe vorhanden ist, die einer Hybridisierung mit einer derartigen Sondenzusammensetzung unterzogen wird, dann hybridisiert dieser fraktionale Teil und ist identifiziert. Typischerweise kann eine Färbungssonde dieser Erfindung mit einer zweiten gemischt werden, so daß das gleichzeitige Färben und Erkennen von zwei vorbestimmten Chromosomen möglich gemacht wird.
Der Ausdruck "Klonieren" oder dergleichen bezieht sich auf den Vorgang, bei dem ein besonderes Nucleotidsegment oder -folge in einen geeigneten Vektor eingesetzt wird, der Vektor dann in eine Gastzelle transportiert und in der Gastzelle veranlaßt wird, sich selbst in einem Kultivierungsprozeß zu reproduzieren, wobei zahlreiche Kopien jedes Vektors und die entsprechende nucleotide Sequenz, die er trägt, produziert werden. Klonieren resultiert in der Bildung einer Kolonie oder eines Klons (d.h. Gruppe) von identischen Gastzellen, wobei jede eine oder mehrere Kopien eines Vektors enthält, der ein besonderes Nucleotidsegment oder -folge enthält. Das Nucleotidsegment oder die -folge wird nun als "geklont" bezeichnet und die Produktnucleotidsegmente oder -sequenzen können als "Klone" bezeichnet werden.
Der Ausdruck "blockierende DNA" oder "blockierende DNA-Zusammensetzung" bezieht sich auf eine DNA, die die Fähigkeit besitzt, unter Hybridisierungsbedingungen mit nichtspezifischen Bindungs-DNA, die in einer Sonde vorhanden sind, zu hybridisieren. Eine blockierende DNA- Zusammensetzung besteht aus einer Mischung von DNA-Segmenten, die erhalten sind von, umfassen und vorzugsweise repräsentativ sind für die gesamte genomische DNA eines multichromosomalen Genoms, das untersucht wird und ein Ziel beinhaltet. Derartige Segmente können beispielsweise durch Fragmentieren (wie hierin ausgeführt) von DNA-Sequenzen hergestellt werden, die enthalten oder repräsentativ sind für derartige gesamtgenomische DNA, und solche DNA-Segmente, die so präpariert sind, sind komplementär zu DNA-Segmentabschnitten, die in den Chromosomen (einschließlich der Bereiche) in diesem Genom auftreten, wobei solche Segmente auch beispielsweise aus einem gesamten genomischen DNA durch andere Verfahren hergestellt werden können, etwa durch ein Verfahren, das die Verfahrensschritte des Denaturierens, teilweise Nachtempern oder Rehybridisieren und Behandeln mit Enzymen umfaßt, um die Menge an nicht wiederholten Segmenten hierin zu reduzieren. Blockierende DNA befindet sich zur Zeit der Verwendung mit einer Sondenzusammensetzung vorzugsweise in Form von Segmenten, die eine mittlere Größe im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 Basispaaren besitzen.
Der Ausdruck "Bibliothek" wird hierin in seinem konventionellen Sinn verwendet, um auf einen Satz von geklonten DNA-Fragmenten Bezug zu nehmen, die zusammen ein gesamtes Genom oder ein spezifisches Fragment hiervon, wie etwa ein einzelnes Chromosom, repräsentieren. Verschiedene Bibliotheken sind im Stand der Technik bekannt und von verschiedenen Hinterlegungsstellen verfügbar und Techniken zur Genom- und Genomfragmentpräparation sowie zum Klonen von Bibliotheken hiervon wohlbekannt. Eine derzeitige verfahrensmäßige Präferenz besteht darin, ein bestimmtes ausgewähltes Chromosom, das durch Fließsortieren oder dergleichen separiert wurde, zu fragmentieren. Fragmentierung vor dem Klonieren wird bevorzugt erreicht durch Aufschluß mit Einschränkung auf Endonucleasen oder dergleichen. Dieses Verfahren erzeugt Fragmentenden, die besonders zum Einsetzen in Vektoren zugänglich sind. Jedoch ist es für den Fachmann verständlich, daß irgendeine konventionelle und zweckmäßige Technik zur Fragmentierung verwendet werden kann. Die Fragmente werden dann konventionell kloniert, um eine Chromosombibliothek zu erzeugen.
Der Ausdruck "blockierte Sondenzusammensetzung" bezieht sich auf eine Sondenzusammensetzung dieser Erfindung, die eine Mischung mit einer blockierenden DNA-Zusammensetzung ist.
Der Ausdruck "Verdünnungs-DNA" oder dergleichen bezieht sich auf DNA, die die gleiche oder ähnlich zu der DNA ist, die in eine spezielle Sondenzusammensetzung dieser Erfindung eingearbeitet ist. Verdünnungs-DNA dienen, wenn sie mit transaminierten Polynucleotiden gemischt wird, die eine Zwischenstufe in der Herstellung einer Sondenzusammensetzung der Erfindung bilden, oder wenn sie mit einer Produktsondenzusammensetzung dieser Erfindung gemischt wird, zum Verdünnen der Gesamtzahl von markierten DNA-Segmenten, die in einem vorgegebenen Volumen oder Gewicht einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung vorhanden sind.
Wie für den Fachmann verständlich ist, kann eine Verdünnungs- DNA auch manchmal als blockierende DNA wirken und umgekehrt.
Der Ausdruck "Träger-DNA" bezieht sich auf DNA, die wirkt, um die Menge an Sonden-DNA zu reduzieren, die aufgrund von Effekten wie Absorption von Sonden-DNA an benachbarten Oberflächenabschnitten wie den Oberflächenabschnitten eines Behältergefäßes, in dem eine Sonde aufbewahrt wird, den Oberflächenabschnitten eines Glasobjektträgers, auf dem eine Probe, die einer in situ-Hybridisierung unterzogen wird, aufgebracht ist, oder den Oberflächenabschnitten von Zelltrümmern, die in einer Probe, die einer in situ-Hybridisierung unterworfen wird, vorhanden sind oder dergleichen, zwangsläufig verlorengeht. Träger-DNA setzt sich zusammen aus DNA, erhalten aus einer nichtbezogenen genomischen Spezies, wie etwa Lachssperma in Mischung mit DNA-Segmenten, die vom menschlichen Genom erhalten wurden. Eine Träger-DNA kann gegebenenfalls einer Hybridisierungslösung zugesetzt werden, die eine Sonde dieser Erfindung beinhaltet.
Der Ausdruck "nichtspezifische Bindungs-DNA" bezieht sich auf DNA, die komplementär zu DNA-Segmenten einer Sonde ist, und welche DNA in wenigstens einer anderen Position in einem Genom auftritt, welche andere Position außerhalb eines ausgewählten chromosomalen Zielbereichs in diesem Genom ist. Ein Beispiel von nichtspezifischer Bindungs-DNA umfaßt eine Klasse von wiederholten DNA-Segmenten, deren Mitglieder gemeinsam in mehr als einem Chromosom oder Chromosombereich auftreten. Solche gemeinsamen sich wiederholenden Segmente neigen dazu, in einem größeren Ausmaß als andere DNA-Segmente, die in der Sondenzusammensetzung vorhanden sind, zu hybridisieren.

(B) Ausgangsmaterialien

(1) Die chromosomale Ausgangs-DNA

Wenn chromosomale Ausgangs-DNA in der Praxis dieser Erfindung verwendet wird, geschieht dies typischerweise und vorzugsweise in der Form einer oder mehrerer DNA-Sequenzen, die zusammengenommen eine Vielzahl von DNA-Segmenten enthalten, die individuell an verschiedenen Stellen in und über einem individuellen vorgewählten Chromosom eines gegebenen multichromosomalen Genoms auftreten und die angemessen repräsentativ für DNA, die in dem vorgewählten Chromosom auftritt, ist. Obwohl in ihrem natürlichen auftretenden Zustand, besitzt eine Ausgangs- DNA-Folge typischerweise eine Größe sehr viel größer als etwa eine Million Basispaare zur Zeit der Verfügbarkeit zur Verwendung als Ausgangsmaterial in der Praxis dieser Erfindung, wobei die Ausgangs-DNA- Sequenz bereits etwas fragmentiert sein kann, was von solchen Faktoren wie den Methoden abhängt, die zur Separierung, Isolierung und dergleichen verwendet wurden. Ein derzeit bevorzugtes Genom ist das menschliche Genom.
Zum Zweck der Herstellung einer gegebenen Sondenzusammensetzung dieser Erfindung kann die chromosomale Ausgangs-DNA-Sequenz (oder -Sequenzen) durch verschiedene Techniken erhalten werden. So kann sie beispielsweise erhalten werden aus (a) DNA, die durch Fließsortieren einer Vielzahl eines einzelnen vorgewählten Chromosoms eines multichromosomalen Genoms separiert wird, welche DNA vorzugsweise von Komponenten aus intrazellularem Material eines Organismus gereinigt wird, (b) einer Chromosombibliothek eines vorgewählten Chromosoms und (c) einem Interspezieshybriden, der DNA eines vorgewählten Chromosoms enthält. Eine derzeit bevorzugte chromosomale Ausgangs-DNA ist eine Chromosombibliothek eines vorgewählten Chromosoms, welche Bibliothek durch Standard- Methoden hergestellt wurde und aus traditionellen, im Stand der Technik bekannten Quellen verfügbar ist, wie etwa die American Type Culture Collection (ATCC) oder andere Hinterlegungsstellen von menschlichen oder anderem klonierten genetischen Material. Während eine große Zahl von spezifischen Chromosombibliotheken vom ATCC verfügbar sind, sind repräsentative Bibliotheken in Tabelle I aufgeführt: TABELLE I MENSCHLICHE CHROMOSOMBIBLIOTHEKEN
Die ATCC-Hinterlegungen von Tabelle I sind von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, erhältlich.
Die Erfindung erwägt, daß derartige chromosomspezifische DNA-Sequenzen ebenso in vitro durch irgendeine Anzahl von enzymatischen Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, synthetisiert werden können. Spezifische einzelne chromosomale DNA-Sequenzen, die als Ausgangsmaterial in der Praxis der Erfindung verwendbar sind, werden von einer oder mehr dieser Quellen durch Methoden isolierbar, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiele von bekannten Lehren, die die Präparation von geeigneten Ausgangssequenzen zur Herstellung gesamter Chromosomfarbsonden dieser Erfindung illustrieren, umfassen (sind aber nicht begrenzt auf):
1. Chromosome werden physikalisch separiert, fragmentiert und die Fragmente als Klone propagiert, wie in: M.A. Van Dilla, et al. in Bio/Technology 4, 537-552 (1986) und Cox, D.R., et al. in Science 250, 245-250 (1990).
2. Ein gesamtes Chromosom wird physikalisch von der Oberfläche eines Mikroskopobjektträgers geschabt, fragmentiert und die Fragmente als Klone propagiert, und zwar unter Verwendung der Technik, beschrieben in: Lüdecke, H.J. et al. in Nature 338: 348-350 (1989).
3. Einzelne menschliche Chromosome werden in Nagetierzellinien propagiert. Der gesamte DNA-Gehalt solch einer Linie wird fragmentiert und die Fragmente als Klone propagiert. Eine Methode zur Erzeugung von menschlichen monochromosomalen Hybridlinien wird beschrieben in: Carlock, L.R., et al. in Somatic Cell Mol. Genet. 12: 163-174 (1986).
4. Sequenzen von gereinigten einzelnen Chromosompräparationen werden enzymatisch durch Verwendung Primer-Oligonucleotiden komplementär zu irgendeiner Anzahl von reichlichen polydisperswiederholten DNA- Sequenzen verstärkt, die an vielen Stellen entlang des Chromosoms vorhanden sind. Gereinigte chromosomale Präparationen der obigen Methoden 1, 2 oder 3 werden Verstärkungen des Typs unterworfen, wie er beschrieben ist in: Nelson D.L. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6686- 6690 (1989).

(2) Das chromosomale Ausgangsregional-DNA

Wenn chromosomales Ausgangsregional- DNA in der Praxis dieser Erfindung verwendet wird, ist dieses typischerweise und vorzugsweise entweder direkt oder indirekt von einem ausgewählten Bereich eines vorgewählten Chromosoms eines Genoms abgeleitet, das vorzugsweise multichromosomal ist. Derartige chromosomale Ausgangsregional-DNA ist typischerweise in der Form von wenigstens einer DNA-Sequenz. Es ist derzeit bevorzugt, daß jede solche Sequenz oder Sequenzen eine Vielzahl von wenigstens einem wiederholten DNA-Segment und vorzugsweise eine Vielzahl (d.h. wenigstens zwei) von strukturell differierenden wiederholten DNA- Segmenten enthält. Vorzugsweise ist eine derartige Regional-DNA-Sequenz relativ zu anderen Bereichen des Gesamtgenoms einzig. Die Ausgangsregional-DNA beeinhaltet eine Vielzahl von DNA-Segmenten, die individuell an verschiedenen Stellen in und über dem individuellen vorgewählten Bereich eines Chromosoms auftreten und die genügend repräsentativ für DNA sind, die in dem vorgewählten Bereich auftritt. Ein derzeit bevorzugtes Genom ist das menschliche Genom.
Zur Zeit der Verwicklung in die Methodologie dieser Erfindung kann eine derartige individuelle Regional-DNA-Sequenz in Stücken oder Fragmenten vorliegen, jedoch würde die Summe der Fragmente gleich einer gesamten natürlich auftretenden DNA-Sequenz sein. Eine derartige individuelle Ausgangs-DNA-Sequenz kann sein und ist vorzugsweise eine klonierte oder auf andere Weise erzeugte Kopie einer natürlich auftretenden Regionalsequenz. Eine derartige Ausgangssequenz kann eine Größe haben, die nur eine Fraktion der Größe der natürlich auftretenden gesamten DNA-Sequenz ist, die in dem vorgewählten Bereich vorhanden ist. Jedoch ist eine gegebene chromosomale Ausgangsregional-DNA genügend repräsentativ für DNA, die in dem vorgewählten Bereich vorhanden ist.
Verschiedene chromosomale Regional-DNA-Sequenzen (und ihre Herstellungsmethoden) sind im Stand der Technik bekannt und können als Ausgangs-DNA-Sequenzen in der Präparation von Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung, die mit Fluorophorgruppen direkt markiert sind, verwendet werden, und verschiedene bekannte Techniken können verwendet werden, um solche chromosomalen Ausgangsregional-DNA zu erhalten oder zur präparieren.
Beispiele von bekannten Lehren, die Methoden zum Erhalten geeigneter Ausgangsregional-DNA-Sequenzen illustrieren, die DNA-wiederholte Segmente beeinhalten, umfassen (sind aber nicht begrenzt auf):
5. Sequenzen werden erhalten aus klonierten DNA-Pools, die in wiederholten DNAs angereichert sind, wie beschrieben ist in: Manuelidis, L., Chromosoma 66: 23-32 (1978), in Yang, T.P. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6593-6597 (1982) und in Moyzis, R.K. et al., in Chromosoma 95: 375-386 (1987).
6. Sequenzen, erhalten aus gereinigten Einzelchromosompräparationen, werden enzymatisch durch Verwendung von Primer-Oligonucleotiden verstärkt, die komplementär zu konservierten Abschnitten von chromosomspezifischen wiederholten DNA-Sequenzen sind. Gereinigte chromosomale Präparationen der obigen Methoden 1, 2 oder 3 werden Verstärkungen dieses Typs unterworfen, der beschrieben ist in: Koch, J.E., et al. in Chromosoma 98: 259-265 (1989).
Beispiele von bekannten Lehren, die Methoden zum Erhalten von Ausgangs-DNA-Sequenzen illustrieren, die zur Herstellung von chromosomalen regionalspezifischen Sonden dieser Erfindung sind, umfassen (sind aber nicht beschränkt auf):
8. Viele Sequenzen, die für spezifische Bereiche eines menschlichen Chromosoms spezifisch sind, sind bestimmt worden. Eine öffentlich erhältliche Zusammenstellung solcher Sequenzen ist erhältlich durch das National Institute of Health, siehe: Bilofsky, H.S. et al. in Nucl. Acids Res. 16: 1861-1864 (1988). Derzeit sind 5141 individuelle Sequenzeingänge in dieser Zusammenstellung. Es gibt 6.182.990 Basispaare von Sequenzinformation, die derzeit in diesen Eingängen geliefert werden.
9. Die physikalische Lokalisierung von vielen anonymen DNA- Segmenten auf dem menschlichen Chromosom wurde beschrieben, siehe: Donis-Keller, H. et al. in Cell 51: 319-337 (1987).
10. Bekannte Sequenzen oder DNA-Segmente (vorstehende Referenzen 8 und 9) werden als Ausgangspunkt zum Erhalten weiterer Sequenzen verwendet, die an der erhältlichen Sequenz durch Abschirmen plasmider, kosmider, bakteriophager oder hefiger künstlicher Chromosombibliotheken angebunden werden, wie beschrieben ist in: Wahl, G.M., et al. in Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 2160-2164; Williams, B.G. et al. 1979 in J Virol 29: 555-575 (1982), und Brownstein, B.H. et al. in Science 244: 1348-1351 (1989).
11, Klonierte Sequenzen aus Bereichen von Chromosomen, für die keine bekannte Verbindung zu einer bereits bestimmten Sequenz vorhanden ist, werden durch Mikrodissektion dieses Bereichs, gefolgt von Fragmentation, Verstärkung und Klonierung, erhalten, wie etwa in: Lüdecke, H.J. et al. in Nature 338: 348-350 (1989), oder durch enzymatische Verstärkung menschlicher DNA in interspezifischen Strahlungshybriden, die weniger als ein vollständiges menschliches Chromosom enthalten, wie in: Cox, D.R., et al. in Science 250: 245-250 (1990).
Zum Zwecke der Herstellung einer Direktmarkierungssondenzusammensetzung der Erfindung wird es derzeit bevorzugt, eine chromosomale Ausgangs-DNA zu verwenden, die für die DNA eines ausgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs repräsentativ ist.
Im allgemeinen wird eine chromosomale Ausgangs-DNA oder eine chromosomale Ausgangsregional-DNA nicht gefordert, um DNA-Segmente zu haben, die die gleiche Verteilung oder Auftretungsfrequenz besitzen, die charakteristisch für DNA-Segmente ist, die natürlich (oder normal) auftreten. Beispielsweise durch Verwendung einer chromosomalen Ausgangs-DNA oder einer chromosomalen Regional-DNA, wobei das Auftreten oder die Verteilung der wiederholten DNA-Segmente schräg liegt, wird die Kapazität einer Produktsondenzusammensetzung, um wahlweise chromosomale Ziel- DNA vollständig zu färben, nicht zerstört, sondern kann eher geändert werden. Das Ergebnis besteht darin, daß in einem resultierenden hybridisierten Ziel in einer Probe die gefärbte chromosomale DNA, die in einem Zielbereich vorhanden ist, ungleichmäßig gefärbt erscheinen kann, daß jedoch der Zielbereich noch im wesentlichen vollständig und selektiv gefärbt ist. Die Unterbereiche in einem gefärbten Ziel, die größte Färbungsintensität zeigen, wenn sie nachfolgend unter einem Fluoreszenzmikroskop geprüft werden, entsprechen vermutlich chromosomalen Zielunterregionen, in denen die relative Frequenz des Auftretens segmentaler DNA, die in der Sondenzusammensetzung auftritt, größer als an Stellen ist, wo die Färbung am schwächsten ist. Eine Ausgangs-DNA mit einer schiefliegenden Verteilung von DNA-Segmenten verglichen mit einer normalen oder natürlich auftretenden Verteilung von DNA-Segmenten kann gewünschtenfalls für Test- oder Abschätzungszwecke verwendet werden.
Die Art, Struktur und Größe von individuellen Ausgangs-DNA- Sequenzen, die Anzahl von verschiedenen Sequenzen, die verwendet wird, und dergleichen Variablen, die mit einer chromosomalen Ausgangs- oder chromosomalen Regional-DNA verbunden sind, können wegen der innewohnenden Variationen in den Genomen von einem Organismus zum anderen und ferner, weil die Zusammensetzung einer Ausgangs-DNA-Sequenzpopulation für ein gegebenes Genom von einer Quelle zur anderen und selbst von einem Posten zum anderen einer besonderen Ausgangs-DNA, die von der gleichen Quelle entnommen wurde, variieren kann, in absoluten Werten angegeben werden kann. Nach Fragmentierung einer Ausgangs-DNA wird jedoch beispielsweise, wie nachstehend beschrieben, die Ausgangs-DNA vorzugsweise in eine Mischung von DNA-Segmenten konvertiert, welche Mischung Segmente umfaßt, die näherungsweise und ausreichend repräsentativ für das gesamte ausgewählte Chromosom oder den Chromosombereich sind und die vorzugsweise über ein solches Chromosom oder den Bereich verteilt sind.
Die charakteristische Komplexität einer gegebenen Ausgangs-DNA wird jedoch derzeit vom Standpunkt der vorliegenden Erfindung aus als wünschenswert betrachtet, da eine derartige Komplexität dazu neigt, Direktmarkierungssondenzusammensetzungen der Erfindung möglich zu machen, die aus verschiedenen Ausgangs-DNA aus dem gleichen ausgewählten Chromosom oder Bereich hergestellt werden können, wobei sich außerdem derartige Produktsondenzusammensetzungen in einer im wesentlichen identischen Weise in bezug auf die Färbungskapazität verhalten. Eine chromosomale Ausgangs- oder Regional-DNA enthält typischerweise etwa 18 bis etwa 25 Mol-% Desoxycytidinnucleotide basierend auf der Gesamtzahl von Desoxynucleotiden, die hierin vorhanden sind.

(3) Die Ausgangsanbindungsverbindung

Eine Ausgangsanbindungsverbindung, verwendet in der Praxis dieser Erfindung, ist eine difunktionale organische Verbindung, das heißt, sie enthält zwei Substituenten, funktionale (d.h. reaktive) Substituenten pro Molekül der Ausgangsanbindungsverbindung.
Wenigstens einer dieser funktionalen Substituenten pro Anbindungsverbindungmolekül ist bezüglich Desoxycytidinnucleotiden in einem Polynucleotid unter wässrigen Transaminationsbedingungen und Bisulfit katalysiert (wie beispielsweise hierin vorgeschlagen) reaktiv. Beispiele derartiger Substituenten umfassen Alkylamino- (primär und sekundär), Hydrazido-, Semicarbazido-, Thiosemicarbazidogruppen und dergleichen. Aminogruppen sind derzeit am meisten bevorzugt.
Wenn die Aminogruppe eine sekundäre ist, ist der sekundäre Substituent vorzugsweise eine niedrige Alkylgruppe, jedoch können andere nichtblockierende derartiger sekundärer Substituenten gewünschtenfalls verwendet werden.
Der zweite des anderen von diesen zwei funktionalen Substituenten pro Anbindungsverbindungsmolekül ist bezüglich eines dritten funktionalen Substituenten reaktiv, der selbst in eine Ausgangsfluoreszenzverbindung (wie hierin beschrieben) eingearbeitet ist. Ein derartiger zweiter funktionaler Substituent kann selbst entweder blockiert oder unblockiert sein. Wenn der zweite Substituent unblockiert ist, dann ist er im wesentlichen nicht reaktiv mit anderen Substanzen, die in dem Transaminationsmedium während der Transamination vorhanden sind (insbesondere Polynucleotide). Wenn der zweite Substituent blockiert ist, dann ist er im wesentlichen nicht reaktiv bezüglich anderer Substanzen, die in dem Transaminationsmedium während der Transamination vorhanden sind (insbesondere Polynucleotide). Beispiele von geeigneten unblockierten zweiten funktionalen Substituentengruppen umfassen Amino-, Carboxyl-, Phosphat-, Sulfonat-, Hydroxyl-, Hydrazido-, Semicarbazido-, Thiosemicarbazidogruppen und dergleichen. Derzeit umfassen die meistbevorzugtesten unblockierten zweiten funktionalen Substituenten Amino- (primär oder sekundär) und Carboxylgruppen.
Die Carboxylgruppe ist vorzugsweise entweder in Salzform oder in Säureform, kann jedoch manchmal in Esterform vorliegen. Wenn sie in Salzform vorliegt, sind derzeit bevorzugte Kationen Alkalimetalle wie Natrium und Kalium.
Beispiele von geeigneten blockierten zweiten funktionalen Substituentengruppen umfassen blockiertes Sulfonat, blockiertes Phosphat, blockiertes Sulfhydryl und dergleichen.
Beispiele von geeigneten blockierten Substituenten umfassen niedere Alkylgruppen, wie etwa Methyl-, Ethyl-, Propylgruppen und so weiter.
Die ersten und zweiten funktionalen Substituenten sind miteinander über einen Verbindungs- (oder verbindenden) Abschnitt verbunden. Dieser Verbindungsabschnitt kann irgendeine übliche Struktur aufweisen, die jedoch nicht reaktiv mit anderen Substanzen ist, die im Transaminationsmedium während der Transamination vorhanden sind. Eine derzeitige Präferenz besteht darin, daß der Verbindungsabschnitt eine divalente Kohlenwasserstoffgruppe ist, die azyklisch oder zyklisch ist und die optional andere Atome einverleiben kann.
Die beiden funktionalen Substituenten, die in einer derartigen bifunktionalen Anbindungsverbindung vorhanden sind, können entsprechende Substituenten des Verbindungsabschnitts sein. Solche Substituenten können an relativ zueinander benachbarten Kohlenstoffatomen sein oder sie können voneinander in einem Anbindungsverbindungsmolekül durch eine Vielzahl von zwischenliegenden, miteinander verbundenen Atomen (vorzugsweise Kohlenstoffatomen) voneinander beabstandet sein. Vorzugsweise befinden sich die funktionalen Gruppen in einer Alpha-, Omega-Beziehung zueinander (das heißt jede einem unterschiedlichen gegenüberliegenden Endbereich) in einem gegebenen Anbindungsverbindungsmolekül.
Daher sind die zwei funktionalen Radikalen in einer Anbindungsverbindung jeweils an einen organischen Verbindungsgruppenabschnitt gebunden, der entweder insgesamt kohlenwasserstoffartig ist (das heißt nur aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen zusammengesetzt ist) oder aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen zuzüglich wenigstens einem zusätzlichen Atom oder einer Gruppe besteht, die wenigstens ein Atom ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Phosphor oder dergleichen enthält. Vorzugsweise werden solche zusätzlichen Atome mit diesem Verbindungsabschnitt assoziiert, wenn sie wesentlich weniger reaktiv als jede der oben angegebenen beiden funktionalen Radikalen sind, die in einer vorgegebenen Ausgangsanbindungsverbindung vorhanden sind. Kohlenwasserstoffartige organische Abschnitte, die gesättigte aliphatische Verbindungen sind, werden derzeit bevorzugt, und zwar am meisten bevorzugt wird ein solcher Abschnitt in Form eines divalenten Alkylenradikals, enthaltend 2 bis 12 Kohlenstoffatome. Gewünschtenfalls kann jedoch in ein derartiges gesättigtes aliphatisches Radikal wenigstens eine Äthergruppe (-0-) oder wenigstens eine Thioäthergruppe (-S-) eingebaut werden, jedoch wird derzeit mehr bevorzugt, daß nur eine derartige Äther- oder Thioäthergruppe vorhanden ist. Derzeit wird bevorzugt, daß eine Anbindungsverbindung ein organisches Radikal umfaßt, das wenigstens zwei und nicht mehr als insgesamt etwa 20 Kohlenstoffatome enthält, obwohl mehr Kohlenstoffatome pro Molekül gewünschtenfalls vorhanden sein können.
Derzeit bevorzugt sind Anbindungsverbindungen, in denen jedes derartige funktionale Radikal ein Aminoradikal ist. Sowohl azyklische als auch zyklische Diaminoverbindungen können verwendet werden.
Beispiele von geeigneten aliphatischen primären Diaminen umfassen primäre Alkylenamine, wobei die Alkylengruppe Propylen, Butylen, Pentylen, Hexylen, Nonylen und dergleichen ist.
Beispiele von geeigneten aliphatischen sekundären Diaminen umfassen CH&sub3;NH(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2;, CH&sub3;NH(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub3; und dergleichen.
Diaminoverbindungen, die hydroxylierte Kohlenwasserstoffe enthalten, können verwendet werden. Beispiele von azyklischen derartiger Verbindungen umfassen 1,3-Diamino-2-hydroxypropan; 1,4-Diamino-2,3- dihydroxybutan; 1,5-Diamino-2,3,4-trihydroxypentan; 1,6-Diamino-1,6- dideoxy-D-mannitol (oder D-glucitol oder D-galactitol), 1,6-Diamino-2,3, 4,5-tetrahydroxyhexan und dergleichen.
Beispiele von geeigneten polyhydroxylierten zyklischen Dimensionen umfassen cis- oder trans-zyklische Diaminoverbindungen, wobei die Diamine in einem Ring enthalten sind, etwa 1,4-Diamino-2,3,5,6-tetrahydroxycyclohexan, cis- und trans-1,2-Diaminocyclohexan, cis- und trans-1,2-Diaminocyclopentan, und hydroxylierte Derivative hiervon, wie etwa 1,2-Diamino-3,4,5,6-tetrahydroxycyclohexan, 1,2-Diamino-3,4,5,trihydroxycyclopentan, 3,6-Diamino-3,6-dideoxy-Derivative von myo-Inositol wie etwa
und dergleichen.
Beispiele von geeigneten heterocyclischen Diaminen umfassen Piperazin, N,N'-bis-(3-aminopropyl)piperazin, Derivate hiervon und dergleichen.
Beispiele von geeigneten Äthergruppen enthalten Diamine ein schließlich 3-Oxo-1,5-pentanediamin, 3,6-Dioxo-1,8-diaminooctan und dergleichen.
Beispiele von geeigneten Anbindungsverbindungen, die sowohl ein Aminoradikal als auch ein Carboxylradikal enthalten, umfassen Aminosäuren wie Sarcosin (N-Methyglycin) und Alphaaminosäuren wie Glycin, Alanin, Glutarsäure, Asparaginsäure, Prolin, Pipecolinsäure (Piperidin-2-carboxylsäure), Isopipecolinsäure (Piperidin-4-carboxylsäure), Glucosaminsäure und Derivate hiervon und dergleichen.
Beispiele von Alpha, Omega-Aminocarboxylsäuren (zusätzlich zu den oben angegebenen Aminosäuren) umfassen 4-Aminobuttersäure, 6-Aminocapronsäure, 8-Aminooctylsäure und dergleichen.
Beispiele von phosphorenthaltenen bifunktionalen Anbindungsverbindungen umfassen Alpha, Omega-Aminoalkylphosphorsäuremonoester, wie 0-(2-Aminoethyl) Dinatriumphosphatsalz und dergleichen.
Beispiele von geeigneten schwefelenthaltenen bifunktionalen Anbindungsverbindungen umfassen Alpha, Omega-Aminoalkylsulfonsäuren wie Taurin (2-Aminoethylsulfonsäure) und dergleichen.
Eine derzeit mehr bevorzugte Klasse von bifunktionalen Anbindungsverbindungen wird durch die folgende allgemeine Formel dargestellt:
wobei:
X ein divalentes Radial ausgewählt aus der Klasse bestehend
aus:
wobei:
R ein Alkylenradikal enthaltend 2 bis 12 Kohlenstoffatome inklusive oder einen carbozyklischen Ring, carcarboci hydroxiliert, und R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Klasse bestehend aus Wasserstoff und niedrigem Alkylrest.
Vorzugsweise enthält in Formel (1) R nicht mehr als 7 Kohlenstoffatome, ist X
und R&sub1; und R&sub2; sind Wasserstoffatome und R enthält weniger als 7 Kohlenstoffatome.
Mischungen von verschiedenen Anbindungsverbindungen können verwendet werden, etwa Anbindungsverbindungen enthaltend eine Mischung von Mono- und/oder Diaminen, jedoch sind solche Mischungen wegen der damit verbundenen Probleme bei der Transaminationskontrolle und der Verwendung nicht bevorzugt.
Diamine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen großen Anteil besitzen, der als eine freie unprotonierte Spezies bei pH-Werten von etwa 7 existiert, scheinen die vorliegende Transaminierungsreaktion zu steigern. Ethylendiamin (pH von etwa 7,6) wird derzeit am meisten zur Verwendung als reaktives bifunktionales Amin wegen dieser Eigenschaft bevorzugt.
Wenn beispielsweise eine derartige Anbindungsverbindung an eine DNA-Sequenz unter Verwendung einer Transaminierungsreaktion angebunden wird, wie nachstehend beschrieben wird, wird die Transaminierungsreaktion so ausgeführt, daß ein Aminoradikal in der Anbindungsverbindung an die Sequenz oder das Segment anbindet. Dann bleibt in der resultierenden Anbindungsgruppe eine funktionale Gruppe frei, um eine weitere Reaktion einzugehen. Wenn daher das zweite funktionale Radikal ein Aminoradikal ist, bleibt dieses Radikal frei, um danach eine weitere Reaktion mit einer Fluoreszenzverbindung einzugehen, wie nachstehend beschrieben wird. Wenn das zweite funktionale Radikal ein Carboxylradikal ist, bleibt dieses Radikal frei, um anschließend eine weitere Reaktion mit einer Fluoreszenzverbindung einzugehen, wie nachstehend beschrieben wird.

(4) Die Ausgangsfluoreszenzverbindung

Die Ausgangsfluoreszenzverbindungen, die in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden, beinhalten jeweils wenigstens einen Fluorophorsubstituenten (oder Gruppe) pro Molekül und auch einen funktionalen (d.h. reaktiven) Substituenten (oder Gruppe) pro Molekül.
Der funktionale Substituent wird so gewählt, daß er bezüglich des verbleibenden zweiten funktionalen Substituenten reaktiv ist, der in einer Anbindungsgruppe in einem transaminierten Polynucleotid eingearbeitet ist (so wie hergestellt, wie hierin beschrieben). Die Anbindungsgruppe wird von einer Anbindungsverbindung (wie oben beschrieben) abgeleitet.
Beispielsweise kann in einer Ausgangsfluoreszenzverbindung der reaktive Substituent derart gewählt werden, daß er mit einem Aminosubstituenten (wie oben definiert) oder mit einem Carboxylsubstituenten reaktiv ist, der in Säure- oder Salzform (wie oben definiert) vorliegt.
Für Zwecke der Reaktivität mit einem derartigen Aminosubstituenten in einer Anbindungsgruppe (unter Verwendung einer Reaktion, wie nachstehend beschrieben) kann der reaktive Substituent der Fluoreszenzverbindung eine übliche aminreaktive Funktionalität wie ein Carboxylsubstituent sein, der in Säure- oder Salzform (wie oben definiert) vorliegt, oder ein Aldehydradikal oder dergleichen sein. Ein derartiger derzeit bevorzugter reaktiver Substituent wird ausgewählt aus und beispielhaft gebildet von der Gruppe bestehend aus Isothiocyanaten, N- Hydroxysuccinimidestern, Sulfonylchloriden, Carboxylsäureaziden und dergleichen.
Zu Zwecken der Reaktivität mit einem derartigen Carboxylsubstituenten in einer Anbindungsgruppe kann der reaktive Substituent der Fluoreszenzverbindung eine übliche carboxylreaktive Funktionalität sein, etwa ein Aminosubstituent, der in einer primären oder sekundären Form (wie oben definiert) vorliegt oder dergleichen. Ein derartiger derzeit bevorzugter reaktiver Substituent ist ein primärer Aminosubstituent.
Der reaktive Substituent kann auch manchmal beispielsweise ein Thiol, ein Phosphatester oder dergleichen sein, wobei die Wahl von der Art des Reaktionssubstituenten abhängt, der in einer Anbindungsgruppe vorhanden ist.
Im allgemeinen kann irgendein Fluorophorsubstituent oder Gruppe in einer Ausgangsfluoreszenzverbindung verwendet werden. Wenn mehr als ein Fluorophorsubstituent pro Fluoreszenzverbindung verwendet wird, ist es derzeit bevorzugt, daß jeder Fluorophorsubstituent ähnlich oder identisch in der Struktur zum anderen in einer einzelnen Fluoreszenzverbindung ist. Eine derzeitige Präferenz besteht darin, Fluoreszenzverbindungen zu verwenden, die etwa 1 bis 3 Fluorophorsubstituenten pro Fluoreszenzverbindungsmolekül enthalten, und am meisten bevorzugt enthält eine Fluoreszenzverbindung nur einen Fluorophorsubstituenten pro Fluoreszenzverbindungsmolekül.
Vorzugsweise hat eine Ausgangsfluoreszenzverbindung ein Molekulargewicht, das nicht mehr als etwa 5000 beträgt, und mehr bevorzugt nicht mehr als etwa 1000, da höhere Molekulargewichte möglicherweise einen nachteiligen Effekt auf die Hybridisierungskapazität einer Produktsonde mit einer komplementären Zielfolge besitzt.
Aus Gründen der Detektierbarkeit ist es derzeit bevorzugt, daß eine Ausgangsfluoreszenzverbindung und die darin enthaltenen Fluorophorgruppen einen Extinktionskoeffizienten von wenigstens etwa 6.000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ (und vorzugsweise wenigstens etwa 10.000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹) in dem Wellenlängenbereich des Anregungslichtes, das auf eine gegebene Probe fällt, und ferner eine Quantenausbeute von wenigstens etwa 0,02 aufweist. Der Ausdruck "Extinktionskoeffizient" wird hierin in seinem konventionellen Sinn verwendet, um die Absorptionsfähigkeit von 1 Mol (M) Lösung an Fluoreszenzverbindung enthalten in einer Cuvette mit einer Weglänge von 1 cm zu bedeuten. Ähnlich wird der Ausdruck "Quantenausbeute" hier in seinem konventionellen Sinn verwendet, um die Anzahl von Photonen zu bezeichnen, die durch ein Fluorophor pro Anzahl von durch dieses Fluorophor absorbierten Photonen emittiert werden.
Beispielhafte und derzeit bevorzugte Ausgangsfluoreszenzverbindungen sind in der nachstehenden Tabelle II gezeigt. TABELLE II BEISPIELHAFTE AUSGANGSFLUORESZENZVERBINDUNG¹
¹ Verwendete Abkürzungen, die sich auf diese Verbindungen beziehen, sind in Klammern angegeben. Für einige Verbindungen sind alternative Namen einschließlich Markennamen angegeben. bezieht sich auf Marken von Molecular Probes, Inc. Der Ausdruck "succinimidylester" bezieht sich auf den Ester, der zwischen einem Carboxylsäuresubstituenten des Fluorophors und N-hydroxysuccinimid gebildet ist, und wird ebenfalls als ein "N-hydroxysuccinimidester" oder als ein "N-hydroxysuccinimidylester" oder als ein "NHS Ester: bezeichnet.
² Bestimmte Fluorescein- und Rhodaminderivate enthalten reaktive Substituenten (Carboxy oder Isothiocyanat), die in ihren 5- oder 6-Positionen angebunden sind. Diese Verbindungen können erhalten werden als Mischungen von zwei Isomeren, bezeichnet als "5-(und-6)" oder in einigen Fällen als gereinigte Isomere. Es wird nicht erwartet, daß die Markierungs- und Fluoreszenzeigenschaften sehr stark zwischen den Isomeren oder zwischen einem spezifischen Isomer und der Mischung variieren. Die Isomeren oder Mischungen, die oben angegeben sind, sind diejenigen, die in Kennzeichnungsexperimenten verwendet wurden (siehe Beispiele).
Alle Fluoreszenzverbindungen in Tabelle II wurden von Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, erhalten.
Wie Fachleuten ohne weiteres verständlich ist, wird eine Ausgangsfluoreszenzverbindung vorzugsweise ausgewählt zur Verwendung in der Herstellung einer gegebenen Produktsondenzusammensetzung, die unter den Bedingungen fluorophorer Anregung in einer einzelnen Probe emittiertes Licht einer Farbe erzeugt, die mit der Farbe des emittierten Lichts kontrastiert, das von dem Fluorophorgruppen enthaltenen Kennzeichnungsabschnitt irgendeiner laufend oder sequentiell verwendeten anderen Sonde oder Sondenzusammensetzung emittiert wird, die auf den gleichen oder zugeordneten Karyotyp, wie etwa ein Genom, ein spezifisches Chromosom, eine spezifische Region eines Chromosoms oder dergleichen, das in dem Genom involviert ist, gezielt ist.

(C) Sondenproduktion

(1) Allgemeines

Primär wegen ihrer charakteristischerweise relativ großen typischen Größe und ebenso wegen ihrer Zufallsgrößencharakteristiken neigen die individuellen Ausgangspolynucleotide (die typischerweise eine Durchschnittsgröße im Bereich von etwa 50 bis etwa 4000 bp besitzen) eines spezifischen Ausgangschromosoms oder Chromosombereichs dazu, eine relativ geringe Hybridbildungskapazität (nach Kennzeichnung) zu zeigen.
Auch früher bekannte chemische Synthetisierungsmethoden zum Anhängen von Kennzeichnungsabschnitten an eine Nucleotidsequenz, insbesondere einen Fluorophor-enthaltenden Kennzeichnungsabschnitt, neigen zu Problemen bezüglich der Kontrolle der Stelle und der Anzahl von Kennzeichnungsabschnitten pro Sequenz und ferner zu Problemen der Sequenzänderung. Diese Probleme können die resultierende Sondenhybridisierungskapazität mit dem gewünschten ausgewählten chromosomalen Zielmaterial und ebenfalls letztendlich die Detektion durch Färbung von spezifischer chromosomaler DNA, die in einer Probe vorhanden ist, nachteilig beeinträchtigen.
Es wurde nun entdeckt, daß diese Probleme beseitigt werden können und daß eine Direktmarkierungssondenzusammentzung von exzellenter Hybridbildungskapazität und Sondenverhaltenscharakteristika für selektive Färbungszwecke bei in situ-Hybridisierung für ein induviduelles Chromosom oder einen Chromosombereich existiert, wenn eine Sondenzusammensetzung aus einer Mischung von DNA-Segmenten, wie sie hierin beschrieben ist, besteht, wobei die Segmente für ein vorgewähltes Chromosom oder einen vorgewählten Chromosombereich spezifisch sind, und wobei die Segmente chemisch an Fluorophorgruppen durch Anbindungsgruppen gebunden sind.
Verschiedene Methoden können verwendet werden, um eine derartige Sondenzusammensetzung herzustellen. Eine derzeit bevorzugte und illustrative Herstellungsmethode wird nun beschrieben, bei der die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
(a) Fragmentieren (d.h. Auseinanderreißen) von DNA-Sequenzen, die spezifisch für ein vorgewähltes Chromosom oder einen vorgewählten Chromosombereich sind, in DNA-Fragmente (oder -Segmente);
(b) Transaminieren von Desoxycytidinnucleotiden, die in den Sequenzen existieren (und folglich auch in den abgeleiteten Segmenten), mit einer Anbindungsverbindung (wie oben beschrieben); und
(c) kovalentes Anbinden (d.h. Verbinden) von restlichen Radikalen der so erzeugten transaminierten Anbindungsgruppen mit einer Fluoreszenzverbindung (wie oben beschrieben).
Während Schritt (b) oder Schritte (b) und (c) Schritt (a) vorangehen kann, ist es bevorzugt, daß Schritt (a) Schritt (b) vorangeht. In der folgenden Beschreibung ist die vorstehende Schrittfolge (a), (b), (c) für die derzeitigen Organisationszwecke verwendet.
Andere Kombinationen und Variationen derartiger Schrittfolgen sind zum Zwecke der Herstellung einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung durchführbar. Beispielsweise kann man die Fluoreszenzverbindung an die Anbindungsverbindung kovalent anbinden, danach transaminieren und schließlich die DNA-Sequenzen fragmentieren (unter Verwendung von Schrittkonditionen ähnlich zu den hierin vorgesehenen); jedoch neigt diese Verfahrensweise dazu, in niedrigen Ausbeuten aufgrund der geringen Löslichkeit der Fluorophorgruppe in der Transaminierungsreaktion zu resultieren.

(2) Fragmentieren

Die DNA-Segmente werden von einer speziellen vorgewählten chromosomalen Ausgangs-DNA oder einem chromosomalen Ausgangs-DNA-Bereich (wie oben charakterisiert) durch Fragmentieren erhalten. Vor dem Fragmentieren besitzt die Ausgangs-DNA vorzugsweise eine mittlere Größe bezüglich Polynucleotiden von wenigstens etwa 150 bp. Nach dem Fragmentieren haben die DNA-Segmente vorzugsweise eine mittlere Größe, die innerhalb eines Bereichs von etwa 150 bis etwa 600 bp mit einer stärker bevorzugten mittleren Größe zwischen etwa 200 und etwa 400 bp und einer am meisten bevorzugten mittleren Größe von etwa 300 bp liegt. Es wird angenommen, daß jedes dieser Segmentfragmente komplementär zu einem segmentalen Abschnitt ist, der in einer oder mehr DNA-Sequenzen existiert, die in dem besonderen ausgewählten Chromosom oder ausgewählten Chromosombereich existieren.
Die Anzahl von Fragmenten, die durch Fragmentieren von derartigen spezifischen chromosomalen DNA-Sequenzen oder -Sequenzbereichen in irgendeinem gegebenen Fall existieren, ist unbekannt, vermutlich von einem Posten zum anderen variabel und groß. Auch die Struktur der Nucleotidsequenzen in den individuellen Fragmenten ist unbekannt und vermutlich von einem Posten zum anderen variabel. In der Tat enthält eine Mischung derartiger Segmente von DNA-Sequenzen eines einzelnen Chromosoms Tausende, wenn nicht Zehntausende verschieden strukturierter Segmente. Aus Gründen, die mit der Kapazität einer Produktsondenzusammensetzung verbunden ist, um DNA eines individuellen vorgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs zu färben, und wegen der Helligkeit der Fluoreszenz in hiermit gebildeten Hybriden, wird derzeit angenommen, daß es wünschenswert ist, DNA-Fragmente zu verwenden, die eine relativ gleichförmige mittlere Größe in den oben angegebenen Bereichen aufweisen.
Wie für Fachleute ohne weiteres verständlich ist, können diese DNA-Fragmente aus spezifischen chromosomalen Ausgangs-DNA-Sequenzen durch verschiedene bekannte Techniken hergestellt werden, umfassend beispielsweise eine Enzymbehandlung wie mit Beschränkungsenzymen, oder Polymerasen, begrenzter DNase I Aufschluß, begrenzter Sojabohnennucleaseaufschluß, Sonikation, Scherung von DNA in einer French-Presse, Scherung von DNA durch eine Nadel niedriger Weite und dergleichen.
Jedoch wird es derzeit stark bevorzugt, derartige DNA-Fragmente durch Sonikation aus einer spezifischen chromosomalen Ausgangs-DNA zu bilden. Sonikation kann durch irgendein übliches Verfahren durchgeführt werden. Derzeit bevorzugte Sonikationsbedingungen verwenden eine wässrige Dispersion einer spezifischen chromosomalen Ausgangs-DNA, die vorzugsweise im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 4 mg/ml enthalten ist, obwohl auch kleinere und größere derartige Konzentrationen verwendet werden können. Ultraschallfrequenz wird vorzugsweise im Bereich von etwa 20.000 Zyklen/s und während einer Gesamtzeit im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 min angewendet, wobei das Röhrchen, das die Probe enthält, vorzugsweise in ein gekühltes Bad zum Reduzieren der Erwärmung der Probe eingetaucht ist. Geeignete kühlende Bäder umfassen Eisbäder und Bäder, enthaltend Trockeneis und Ethanol. Die Energiedichte, die auf das DNA- Sequenzmaterial angewendet wird, das der Ultraschalleinwirkung unterworfen wird, ist veränderlich. Beispielsweise liegt im Falle eines Branson Sonifier Model 450 (Danbury, CT), dessen Mikrospitze etwa 2 bis etwa 5 mm vom Boden des Röhrchens in einer wässrigen Lösung angeordnet ist, eine geeignete Ausgangsleistung im Bereich von etwa 25 bis etwa 30 Watt. Vorzugsweise wird derartige Ultraschallenergie angewendet, wobei sie etwa 80% der Gesamtzeit von etwa 5 min eingeschaltet und etwa 20% hiervon ausgeschaltet ist, wie weiter unten beispielhaft dargelegt ist.
Vorzugsweise wird die spezifische chromosomale Ausgangs-DNA fragmentiert, bevor die Komponentensequenzen einer Transaminierung unterworfen werden.
Unabhängig von der Art des Fragmentierens besteht das Ergebnis des Fragmentierens der Vielzahl von Sequenzen, umfassend spezifische chromosomale DNA, darin, einen überfluß an Fragmenten derartiger Ausgangs-DNA-Sequenzen zu erzeugen. Dieser Überfluß umfaßt DNA-Segmente, die individuell an jeder einer Vielzahl von verschiedenen Stellen in einem individuellen vorgewählten Chromosom oder Chromosombereich auftreten. Die fragmentierten DNA-Segmente sind daher Mischungen, die von der sequentiellen Ausgangs-DNA erhalten werden und die näherungsweise hierfür repräsentativ sind.
Wenn beispielsweise die chromosomal- oder regionalspezifische Ausgangs-DNA aus einer kommerziellen Quelle in einem bereits geeignet fragmentierten Zustand erhalten wird, wird offensichtlich ein separater Fragmentierungsschritt nicht benötigt, bevor ein nachfolgender Transaminierungsschritt unternommen wird.

(3) Transamination

Bei der Transamination wird eine kleinere Fraktion der gesamten Desoxycytidinbasen, die in den spezifischen chromosomalen Ausgangs- DNA-Sequenzen und -Segmenten hiervon enthalten sind, mit einer Aminogruppe einer bifunktionalen Anbindungsverbindung (wie oben beschrieben) in der Kohlenstoff 4 (C-4) Atomposition der Aminogruppe von Cytosinstellen (d.h. Desoxycytidinnucleotiden) transaminiert. Das Ausmaß einer derartigen Transamination ist derart, daß zwischen etwa 1 bis etwa 30 Mol-% aller Desoxycytidinnucleotide, die in der Ausgangsmischung von DNA-Segmenten vorhanden sind, die für die gesamte genomische DNA eines vorgegebenen Genoms repräsentativ ist, somit durch eine Anbindungsgruppe substituiert werden, und zwar vorzugsweise etwa 2 bis etwa 24 Mol-% hiervon. Alternativ ausgedrückt, werden etwa 0,2 bis etwa 8 Mol-% aller Nucleotide, die in einer derartigen Mischung von Ausgangs-DNA-Sequenzen oder DNA-Fragmenten enthalten sind, somit transaminiert, und zwar vorzugsweise etwa 0,5 bis 6 Mol-%. Bei allen diesen Transaminationen sind im wesentlichen nur Desoxycytidinnucleotide involviert.
Der effektivste Prozentsatz der Animation in einem gegebenen Fall wird typischerweise durch den besonderen fluoreszierenden Kennzeichnungsabschnitt, der verwendet wird, beeinflußt. Da die durchschnittliche Anzahl von Basispaaren, die in einer Sequenz vorhanden sind, vorzugsweise wenigstens etwa 150 beträgt, wie vorstehend angegeben wurde, wird somit jede Frequenz vorzugsweise durch wenigstens etwa eine derartige Anbindungsgruppe während des Transaminierungsvorgangs, wie gewünscht, substituiert. Eine Transamination in einem größeren Umfang scheint das Potential zur nachteiligen Beeinträchtigung der Spezifizität der Produktsonden zu vergrößern, die (anschließend) mit einigen Fluorophoren wie FITC und Tx Rd beispielsweise gekennzeichnet werden. Hohe Aminationsgrade beeinträchtigen die Spezifizität von beispielsweise durch CTMR- und DECCA-markierten Sonden nicht so stark. Transaminierung in einem geringeren Umfang scheint die Helligkeit des Fluoreszenzlichtes, das in den detektierten Produkthybriden erzeugt wird, nachteilig zu beeinträchtigen.
Die Transamination wird üblicherweise unter wässrigen Bedingungen in Flüssigphase in Anwesenheit eines Bisulfitkatalysators vorgenommen. Die Konzentration von DNA-Sequenzen (oder Segmentfragmenten) wird gewöhnlich im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1 mg/ml durchgeführt, wobei die Konzentration von Bisulfitanionen gewöhnlich im Bereich von etwa 0,4 bis etwa 1,4 Mol/l liegt, während die Konzentration der Anbindungsverbindung gewöhnlich im Bereich von etwa 1 bis etwa 5 Mol/l liegt. Der pH-Wert gewöhnlich im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 8,0 ist, die Temperatur gewöhnlich im Bereich von etwa 20 bis etwa 45ºC und die Kontaktzeit typischerweise und beispielhaft im Bereich von etwa 3 bis etwa 72 h liegt (abhängig von dem gewünschten Aminationsgrad).
Bei dem vorliegenden Transaminationsvorgang wird gewöhnlich das Bisulfit in Form eines Alkalimetailsalzes eingeführt, wobei Natrium und Kalium bevorzugte Alkalimetalle sind.
Während der Transamination wird die Anbindungsverbindung in dem wässrigen transaminierenden Medium gelöst.
Vorzugsweise vor und auch während der Transamination werden die DNA-Sequenzen oder -Segmente vorzugsweise denaturiert, und zwar beispielsweise durch vorheriges Kochen von DNA-Sequenzen oder -Segmenten in Wasser, wie etwa für einen Zeitraum von etwa 1 bis 10 min, gefolgt durch ein Abschrecken auf eine Temperatur unterhalb etwa 4ºC (derzeit bevorzugt) oder durch Ausführen der Transamination in der Anwesenheit eines Chaotrops oder durch eine Kombination beider Verfahrensweisen.
Die Komplexität einer DNA-Fragmentmischung wird dargestellt und beispielhaft erläutert durch das Ausmaß an Amination, die nach einer vorhergehenden Denaturierung der Mischung von DNA-Fragmenten durch Kochen erhalten wird. Da eine Transamination nur in einem merklichen Ausmaß an einsträngiger DNA auftritt und da die Rückbildungsrate im Verhältnis zur Komplexizität der DNA gering ist, wird gefunden, daß die spezifische chromosomale DNA zu einem geringeren Ausmaß aminiert, als für eine relativ komplexere DNA-Mischung charakteristisch ist.
Während der Transaminierung mit dem Bisulfitkatalysator können Reaktionsvariable, wie oben identifiziert, innerhalb der angegebenen Bereiche variiert werden, um einen gewünschten Grad an Transamination mit einem gegebenen Anbindungsverbindungsreaktanten zu erzielen.
Die vorliegende Transaminationreaktion wird ausgeführt oder fortgesetzt, bis ein gewünschtes Ausmaß an Transamination der Ausgangs- DNA-Sequenz oder -Segmentmischung erhalten wird. Im allgemeinen wird das maximale Ausmaß der Transamination durch den Transaminationsgrad bestimmt, der entweder eine nachteilige Wirkung auf den komplementären Charakter der involvierten Nucleotidsequenz oder -segments eine nachteilige Wirkung oder einen Anstieg im Betrag nichtspezifischer Zuordnung der nachfolgend markierten Sonde mit DNA, die kein Ziel darstellt, oder anderen zellularen Komponenten, wie sie in einer Probe, Objektträger präparation oder dergleichen, während einer in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung existieren, auszuüben. Augenscheinlich typisch und bevorzugt ist in einem transaminierten Produkt nur ein geringer Molprozentsatz von insgesamt unmarkierten DNA-Sequenzen. Der minimale Grad der Transamination, der in irgendeinem gegebenen Fall erreicht wird, wird durch das Ziel des Erreichens im wesentlichen vollständiger Färbung eines vorgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs bestimmt, sollte derartiges in einer gegebenen Probe vorhanden sein. Selbst niedrige Aminationsgrade liefern ein solches Resultat.
Niedrige Aminationsgrade können wünschenswert sein, so daß nach Färbung ein vorgewähltes Chromosom oder der Bereich eines Chromosoms ohne Störung durch eine andere Färbung (und zugeordnete Probenkörper), die in einer gegebenen Probe vorhanden sind, beobachtet werden können.
Die Intensität einer spezifischen chromosomalen Färbung, die in einer Probe mit einer spezifischen chromosomalen Färbungssondenzusammensetzung dieser Erfindung erreichbar ist, kann ohne weiteres reguliert oder reduziert werden, wenn dies wünschenswert ist, um so eine gewünschte Färbungsintensität in einer gegebenen Probe oder dergleichen zu erhalten. Eine derartige Reduktion kann durch verschiedene Techniken erzielt werden, so beispielsweise (a) durch Senken des Ausmaßes an Anbindungsgruppentransamination, wodurch schließlich die Menge an markiertem Nucleotid pro Gewichtseinheit reduziert wird, die in einer färbenden Sondenzusammensetzung dieser Erfindung enthalten ist, (b) durch Verdünnen einer transaminierten Mischung mit einer unmarkierten Ausgangs-DNA- Segmentmischung, wodurch eine verdünnende DNA in die Sondenzusammensetzung eingeführt wird, (c) durch Reduzieren der Sondenmenge, die in einer gegebenen Hybridisierungslösung oder dergleichen vorhanden ist. Die Fluoreszenzintensität einer markierten Sondenzusammensetzung kann durch den Zusatz einer vorzugsweise fragmentierten (wie vorstehend beschrieben), unmarkierten genomischen Ausgangsgesamt-DNA hierzu, etwa durch genomische DNA aus dem Genom, aus dem das vorgewählte Chromosom vor der Zeit, als die Fluoreszenzverbindungsanbindung durchgeführt wurde (wie vorstehend beschrieben), reduziert werden.
Der minimale Transaminationsgrad, der in einem gegebenen Fall praktiziert wird, wird gewöhnlich durch den Wunsch bestimmt, wenigstens einen vorbestimmten Molprozentsatz der gesamten Desoxycytidinnucleotide zu transaminieren, die in der Ausgangs-DNA, etwa einer fragmentierten DNA-Segmentmischung, vorhanden sind.
Eine Mischung, die aus einem Transaminationsschritt resultiert, der in übereinstimmung mit den Lehren der vorliegenden Erfindung ist, kann in konventioneller Weise weiter verarbeitet werden. Eine derzeitige Präferenz besteht darin, eine derartige Produktmischung zu dialysieren, und zwar gegen einen verdünnten wässrigen Puffer wie etwa Natriumborat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) oder dergleichen bei einem pH-Wert von etwa 8 unter Verwendung einer konventionellen Dialysemembran und Umgebungstemperaturen.
Die resultierende Mischung von transaminierten Nucleotidsequenzen oder -segmenten wird dann üblicherweise aus der so dialysierten Mischung niedergeschlagen und die Sequenz wird dann vom Überstand durch Filtrieren, Zentrifugieren oder dergleichen getrennt.
Enzymatische Techniken zum Erhalten aminierter DNA werden in Analytical Biochemistry 157:199-207 (1986) beschrieben. Die transaminierten DNA-Sequenzen werden kovalent an irgendeine Anzahl von Fluoreszenzverbindungen angebunden, die eine reaktive funktionale Gruppe aufweisen, die in der Lage ist, eine kovalente Anbindung mit der transaminierten DNA-Sequenz zu bilden.

(4) Fluoreszenzverbindungsbindung

Ein resultierendes transaminiertes und aminsubstituiertes Nucleotidderivat wird dann zum kovalenten Anbinden an eine Fluoreszenzverbindung, enthaltend einen reaktiven Fluorophorsubstituenten, verfügbar, wie oben beschrieben, wobei diese Verbindung mit einem therminalen funktionalen Substituenten reagiert, der den Rest der Anbindungsverbindung (d.h. der Anbindungsgruppe) zugeordnet ist, die nun in einen Desoxycytidinabschnitt transaminiert wurde, wie oben beschrieben. Die Anzahl an Fluoreszenzverbindungen enthaltend Fluorophorsubstituenten, die auf diese Weise pro Sequenz oder Segmentmolekül reagiert haben, wird leicht kontrolliert. Vorzugsweise werden Ausgangs-DNA-Sequenzen fragmentiert, bevor sie an Fluorophorgruppen angebunden werden. Folglich ist in einer Produktsondenzusammensetzung die Anzahl an Kennzeichnungsgruppen pro DNA-Molekül wie gewünscht einstellbar. Die Nucleotidsequenz jedes Segments in der resultierenden Produktsondenzusammensetzung ist, wie angenommen wird, im wesentlichen identisch zu derjenigen, die in der Ausgangs-DNA-Mischung existiert, abgesehen von der zugesetzten Anwesenheit von transaminierten Anbindungsgruppen und den kovalent angebundenen Fluorophorgruppen.
Das kovalente Anbinden einer Fluoreszenzverbindung an ein endständiges Radikal einer Anbindungsgruppe, beispielsweise in transaminierten DNA-Segmenten, wird üblicherweise unter Bedingungen einer wässrigen Flüssigphase unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von etwa 4 bis etwa 50ºC, einer Konzentration von transaminierter DNA im Bereich von etwa 10 bis etwa 500 µg/ml, einem nahezu neutralen pH-Wert für Reaktionen von N-hydroxysuccinimidestern (beispielsweise pH von etwa 6 bis 8) und einem alkalischen pH-Wert für Reaktionen von Isothiocyanaten und Sulfonsäurechlond (beispielsweise pH 8,5 bis 9,5) und einer Zeit, die typischerweise und exemplarisch im Bereich von etwa 2 bis etwa 18 h liegt, ausgeführt.
Typischerweise und bevorzugt ist die Quantität an vorhandener Ausgangsfluoreszenzverbindung ausreichend, um einen wesentlichen molaren Überschuß relativ zur Gesamtmenge von Anbindungsgruppen zu schaffen, die als anwesend in den transaminierten DNA-Sequenzen geschätzt werden. In einer gegebenen Situation kann ein optimierter molarer Überschuß relativ zur Konzentration der transaminierten Desoxycytidinnucleotidreste, die in den Fragmenten vorhanden sind, bequem bestimmt werden.
Während theoretisch der Betrag an fluoreszierender Kennzeichnungsverbindung nur gleich dem Betrag an transaminiertem Desoxycytidin in der DNA-Sonde benötigt wird, wird ein Überschuß üblicherweise stark bevorzugt, da einige der Moleküle der Fluoreszenzverbindung auf anderem Wege reagieren, was nicht zu einer Anhängung einer Kennzeichnung an DNA führt, wie etwa eine Reaktion mit Wasser (Hydrolyse), wodurch eine kennzeichnende Verbindung mit aliphatischen Amingruppen lichtreaktiv wird. Überschüssige Kennzeichnungsverbindung wird auch verwendet, um die Reaktionsrate mit dem transaminierten Desoxycytidin zu erhöhen, so daß die Reaktion in einem kürzeren Zeitraum vollständig ist. Ein größerer Überschuß wird für gegenüber Hydrolyse sensitivere Kennzeichnungsverbindungen wie N-hydroxysuccinimidester und Sulfonsäurechloride relativ zu weniger gegenüber Hydrolyse empfindlichen Verbindungen wie Isothiocyanate erforderlich. Während ein kleiner Überschuß an Kennzeichnungsverbindung gegenüber transaminierten Desoxycytidinen zu geringen Prozentsätzen von Sondenmarkierung führt, kann ein großer Überschuß an Kennzeichnungsverbindung vorteilhaft zum Erhalten hoher Kennzeichnungsprozentsätze sein. Kennzeichnungsverbindungsmengen in Überschuß gegenüber dem, was erforderlich ist, um eine vollständige Kennzeichnung zu erreichen, ist bezüglich der Kennzeichnungsreaktion nicht nachteilig. Sehr hohe Mengen an Kennzeichnungsverbindung können jedoch zu Postreaktions- Reinigungsproblemen führen, da im wesentlichen die gesamte unreagierte Fluoreszenzverbindung vor Verwendung der Produktsondenzusammensetzung bei der in situ-Hybridisierung oder dergleichen entfernt werden sollte. Daher sind sehr große Überschüsse an Fluoreszenzverbindungen zu vermeiden, so etwa Überschüsse größer als etwa das 250-fache des molaren Überschusses.
Wenn beispielsweise die fluoreszierende Markierungsverbindung ein Succinimidylderivat (das heißt ein N-hydroxysuccinimidester eines carboxylsubstituierten Fluorophors oder dergleichen) oder ein entsprechendes Sulfonsäurechloridderivat ist, dann reagieren die transaminierten DNA-Sequenzen, die in der restlichen Anbindungsverbindung enthalten sind, bequem mit etwa dem 100- bis etwa dem 200-fachen molaren Überschuß der fluoreszierenden Kennzeichnungsverbindung relativ zu den intermediären transaminierten Nucleotiden. Aus Bequemlichkeit wird hier angenommen, daß etwa 5% an Gesamtnucleotiden transaminiert ist.
Wenn beispielsweise die fluoreszierende Markierungsverbindung ein Isothiocyanatderivat ist, dann reagieren die transaminierten DNA- Sequenzen bequem mit etwa einem 50-fachen molaren Überschuß der fluoreszierenden Markierungsverbindung.
In der Reaktion, die auftritt, wird angenommen, daß kovalentes Anbinden zwischen der reaktiven Gruppe einer Ausgangsfluoreszenzverbindung und der Endgruppe einer transaminierten Anbindungsgruppe (abgeleitet von einer Anbindungsverbindung), die einer DNA-Sequenz zugeordnet ist, auftritt. Vorzugsweise reagiert wenigstens eine endständige Gruppe einer Anbindungsgruppe pro Molekül mit der verwendeten Fluoreszenzverbindung. Typischerweise reagieren etwa 10 bis etwa 100 Mol-% der endständigen Stellen (oder therminalen Funktionalsubstituenten) der Anbindungsgruppen (und werden kovalent angebunden) und werden daher fluoreszierend markiert. Das Ausmaß der Reaktion zwischen Anbindungsgruppen und Fluoreszenzverbindungen scheint durch die Art der Fluorophorsubstituenten, die in einer bestimmten Fluoreszenzverbindung vorhanden sind, beeinflußt zu werden. Aus Effizienzgründen werden vorzugsweise wenigstens etwa 70 Mol-% der Anbindungsgruppen einer gegebenen transaminierten DNA-Zusammensetzung so markiert, und zwar insbesondere wenigstens etwa 90 Mol-% hiervon derart markiert. Daher werden etwa 0,3 bis etwa 6 Mol-% der gesamten Nucleotide, die in einer derartigen Ausgangsmischung von DNA-Segmenten vorhanden sind, fluoreszierend markiert.
Restliche Kennzeichnungsverbindung, die nicht kovalent an die Sonden am Ende der Reaktionszeit angebunden ist, kann durch eine Vielzahl von Methoden entfernt werden, etwa durch Niederschlagen der DNA, Gelpermeationschromatographie, Affinitätschromatographie, Dialyse, Gelelektrophorese und Kombinationen dieser Methoden. Die Anzahl und Typen an kombinierten Methoden zum Reinigen markierter Sonden hängt von der Größe der Markierungsverbindung einschließlich der Größe von Aggregaten dieser Markierungsverbindungen und ihrer Fähigkeit zum nichtkovalenten Anbinden an markierte DNA wie etwa durch ionische und hydrophobe Wechselwirkungen ab. Eine Methode, die ein adäquates Entfernen von nichtreagierter Markierungsverbindung liefert, umfaßt eine Ethanolniederschlagsstufe, gefolgt durch eine Gelpermeationschromatographiestufe, gefolgt durch eine zweite Ethanolniederschlagsstufe. Die resultierende niedergeschlagene markierte Sonde kann in Wasser gelöst werden, um eine Stammlösung der Sonde zu liefern, die direkt bei in situ-Hybridisie rungsreaktionen verwendet werden kann, wenn sie mit den anderen Hybridisierungskomponenten (beispielsweise Formamid, Dextransulfat, Puffer und dergleichen bekannte spezifische Sondenkomponeten) kombiniert wird.
Das resultierende Reaktionsprodukt der transaminierten DNA- Sequenzen und der ausgewählten Fluoreszenzverbindung führt zu einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung.

(D) Direktmarkierungssondenzusammensetzung

(1) Sondenzusammensetzungen

Somit wird eine Klasse von Direktmarkierungssondenzusammensetzungen geliefert, in denen DNA-Segmente an Fluorophorgruppen gebunden sind. Eine derartige Sondenzusammensetzung, betrachtet als eine Einheit, ist zur Verwendung in spezifischen chromosomalen oder spezifischen regionalen Chromosom-DNA zum Färben und zum Detektieren durch in situ-Hybridisierung oder dergleichen der Anwesenheit eines DNA-Zielbereichs in einer Probe, d.h. entweder eines vorgewählten Chromosoms oder eines vorgewählten Chromosombereichs, wie der Fall auch sein mag, geeignet. Eine derartige Sondenzusammensetzung enthält eine Vielzahl von verschiedenen DNA-Segmenten, die individuell in einem vorgewählten Zielbereich (entweder ein einzelnes Chromosom oder ein einzelner Chromosombereich) auftreten. Diese DNA-Segmente werden zu etwa 1 bis etwa 30 Mol-% der gesamten Desoxycytidinnucleotide hiervon mit einer Anbindungsgruppenstruktur substituiert, die anfänglich eine endständige funktionale (oder reaktive) Gruppe behält. Wenigstens etwa 10 Mol-% aller derartiger behaltener endständiger funktionaler Gruppen wurden kovalent an eine individuelle, ein Fluorophorradikal-enthaltende Gruppe angebunden. Individuelle Segmente einer derartigen so markierten Vielzahl von DNA-Segmenten, die auf diese Weise eine Sondenzusammensetzung dieser Erfindung enthalten, sind zu komplementären segmentartigen DNA-Abschnitten hybridisierbar, die in DNA-Sequenzen des vorgewählten Zielbereichs auftreten.
Vorzugsweise wird in einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung diese bifunktionale Anbindungsgruppe durch die Formel charakterisiert:
wobei:
x ausgewählt ist aus der divalenten Gruppe bestehend aus:
wobei R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und niedrigem Alkylrest;
wobei m und n unabhängig voneinander gewählt eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 6 sind; und wobei
p die ganze Zahl 0 oder 1 ist, und
wobei die Gruppe:
in ein Desoxycytidinnucleotid eines besagten DNA-Segments transaminiert und die Gruppe - - kovalent an einen besagten Kennzeichnungsabschnitt angebunden ist.
Daher umfaßt eine Direktmarkierungssondenzusammensetzung dieser Erfindung eine Mischung von DNA-Segmenten, die von der DNA in einem gegebenen vorgewählten Chromosom oder einem gegebenen vorgewählten Chromosombereich abgeleitet sind und annähernd diese repräsentieren. Eine derzeit bevorzugte Klasse von Chromosomen umfassen diejenigen des menschlichen Genoms. Die DNA-Segmente einer derartigen Mischung werden chemisch durch die intervenierenden Anbindungsgruppen an Fluorophorgruppen gebunden. Die Charakteristika von Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung sind aus Bequemlichkeitsgriinden in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt: TABELLE III Charakteristika von Sondenzusammensetzungen der Erfindung

(2) Formulierungen von Sondenzusammensetzungen

Die Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung können verwendet werden, das heißt hergestellt, verkauft und verwendet, und zwar in verschiedenen Formen einschließlich einer trockenen festen Form, wässrigen Lösungen und wässrigen Formulierungen, die an die direkte Verwendung in einer Hybridisierungsmethode angepaßt sind.
In wässrigem Medium befindet sich eine Sondenzusammensetzung der Erfindung, vorzugsweise in einer im wesentlichen vollständig gelösten Form. Wie ein Fachmann bezüglich DNA-Sonden feststellt, kann der Gehalt an wässriger Formulierung einer Sondenzusammensetzung (einschließlich einer Hybridisierungslösung) in weiten Bereichen abhängig von vielen Variablen und Aufgabenstellungen variieren. Als ein illustratives Beispiel besitzt eine geeignete Klasse von Hybridisierungslösungen eine Zusammensetzung, wie sie in der nachstehenden Tabelle IV charakterisiert ist: TABELLE IV Illustrative Klasse von Sondenzusammensetzungen geeignet zur Verwendung bei In Situ-Hybridisierung
Bei einer derartigen Sondenzusammensetzung von Tabelle IV funktioniert das Denaturierungsmittel zur Unterstützung der Denaturierung von DNA-Segmenten, die in einer Sondenzusammensetzung vorhanden sind. Derart geförderte Denaturierung ist wünschenswert, da sie die Temperatur, die zur Denaturierung und zur Hybridisierung verwendet wird, absenkt. Während die verschiedenen Denaturierungsmittel, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden können, ist ein derzeit am meistens bevorzugtes Denaturierungsmittel Formamid.
Ähnlich können die verschiedenen Hybridisierungsratenunterstützer, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Ein derzeit am meisten bevorzugter Hybridisierungsratenunterstützer ist ein Dextransulfat.
Ähnlich können die verschiedenen wasserlöslichen Puffersalze, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Eine derzeitige Präferenz besteht darin, den pH-Wert einer Sondenzusammensetzungslösung auf einem Wert zu halten, der im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 8,5 liegt. Puffersalze, die geeignet sind, um einen derartigen pH-Wert zu halten, umfassen beispielsweise Zitronensäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Phosphorsäure und dergleichen. Eine derzeit bevorzugte Puffersalzzusammensetzung kann Zitronensäure (oder Natriumcitrat) enthalten.
Ähnlich ist ein Hybridstabilisatorsalz wünschenswert, das die Stabilisierung von während eines Hybridisierungsvorgangs gebildeten Hybriden unterstützt. Die Hybridstabilisatorsalze, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden, so etwa NaCl, KCl, MgCl&sub2; und dergleichen. Jedoch ist das derzeit am meisten bevorzugte derartige Salz Natriumchlorid.
Das verwendete Wasser ist vorzugsweise vorher destilliert oder deionisiert.

(3) Blockierte Sondenzusammensetzungen

Eine optionale, jedoch bevorzugte Komponente einer Sondenzusammensetzung, wie sie in Tabelle IV gezeigt ist, ist eine blockierende DNA-Zusammensetzung.
Die Verwendung einer verdünnten DNA in der Herstellung einer Sondenzusammensetzung der Erfindung wurde oben diskutiert (siehe obigen Unterabschnitt bezüglich Transamination), und zwar als ein Mittel zum Regulieren der Fluoreszenzintensität in einem hybridisierten Ziel. Eine verdünnte DNA kann auch als eine blockierende DNA-Zusammensetzung und als ein Mittel zum Regulieren der Fluoreszenzintensität und Hybridisierungsspezifizität funktionieren. Blockierte Zusammensetzungen dieser Erfindung werden derzeit bevorzugt. Derzeit bevorzugte blockierte DNA- Zusammensetzungen für blockierte Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung, die auf menschliche Chromosome oder Chromosombereiche abzielen, umfassen fragmentierte menschliche placentale DNA und Cot-1.
Cot-1 DNA ist erhältlich als Katalog #52795A von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD. Cot-1 DNA wird, wie berichtet, durch das folgende Verfahren hergestellt: Mechanisch geschertes menschliches genomisches Gesamt-DNA wird auf eine mittlere Sequenzgröße von weniger als 400 bp fragmentiert. Dieses Material wird denaturiert und dann für eine Zeitperiode hybridisiert, die ausreicht, um große Fraktionen von stark wiederholten DNA-Sequenzen zu erhalten, von denen welche doppelsträngig sind. Die Mischung von doppel- und einzeisträngigen DNA-Spezies werden dann mit Nuclease S1 behandelt (aufgeschlossen), eine Nuclease, die spezifisch einzelsträngige DNA in Mono- und Oligo-Nucleotide degradiert. Nichtaufgeschlossene doppelsträngige Cot-1 DNA wird aus der Mischung entfernt. Cot-1 DNA liegt, wie berichtet, in Form von Segmenten vor, die eine mittlere Größe von etwa 191 bp besitzen.
So wird eine derartige zweckmäßige blockierende Ausgangs-DNA- Klasse aus einer genomischen Gesamt-DNA erhalten, die denaturiert, teilweise zurückgekühlt oder rehybridisiert und mit Enzymen behandelt oder anderweitig durch bekannte Verfahren verarbeitet worden ist, um den Betrag an natürlich auftretenden nichtwiederholten Segmenten hierin zu reduzieren.
Das Gesamtgewicht blockierender DNA-Zusammensetzung, das mit einer gegebenen Sondenzusammensetzung der Erfindung gemischt wird, ist vorzugsweise im Überschuß zum Gesamtgewicht der Sondenzusammensetzung. Eine resultierende Mischung einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung und einer blockierenden DNA-Zusammensetzung kann gegebenenfalls Hybridisierungsbedingungen während eines Zeitraums ausgesetzt werden, bevor sie nachfolgend zur Hybridisierung mit einem Ziel und zum selektiven Färben verwendet wird. Alternativ kann man gewünschtenfalls direkt eine denaturierte blockierte Sondenzusammensetzung zur Hybridisierung mit einem Ziel unter Hybridisierungsbedingungen verwenden.
Eine blockierende DNA, gemischt mit einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung, hindert wiederholte gemeinsame DNA-Segmente zum großen Teil an der Hybridisierung mit chromosomaler DNA eines vorgewählten Chromosoms oder chromosomalen Bereichs in einer Probe. Blokkierte Sondenzusammensetzungen sind günstig, da das selektive Färben verbessert wird, wenn beispielsweise spezifische chromosomale Sondenpräparationen in Kombination mit anderen spezifischen Sondenzusammensetzungen verwendet werden.
So werden wiederholte Sequenzen in einer spezifischen blokkierten Sondenzusammensetzung an der Hybridisierung zur gleichen wiederholten Sequenz gehindert, die beispielsweise in nicht zielgerichteten Chromosomen auftreten. Eine solche Hybridisierung tritt auch ein, wenn die blockierende DNA-Zusammensetzung zu der Zeit vorhanden ist, wenn eine blockierte Sondenzusammensetzung dieser Erfindung unter Hybridisierungsbedingungen mit einem Ziel hybridisiert wird. Die Hybridisierung von blockierenden DNA-Zusammensetzungs-DNA-Segmenten an zum Ziel komplementären segmentalen Bereichen tritt wahrscheinlich auch auf. Der Effekt derartiger Hybridisierungen besteht darin, die Intensität der Fluoreszenz zu regulieren, die durch eine gegebene Sondenzusammensetzung nach Hybridisierung bezüglich einer Targetzusammensetzung erzeugt wird. Die Menge an vorhandener blockierender DNA-Zusammensetzung ist umgekehrt proportional zur Hybridintensität, die nach Hybridisierung beobachtet wird, wie angenommen wird; jedoch scheinen viele Variablen vorhanden zu sein, die diese Beziehung beeinflussen.
Die Zusammensetzungen von Tabelle IV können gewünschtenfalls aus vorher präparierten Vorläuferzusammensetzungen hergestellt werden, die zur Zeit der Verwendung in einem Hybridisierungsschritt gemischt werden. Solche Vorläuferzusammensetzungen können als "Kitt" bezeichnet werden.

(E) In situ-Hybridisierung und Färbung

(1) Allgemeines

Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung sind gut geeignet zur Verwendung in Hybridisierungsschritten zum Färben von entsprechenden vorgewählten Chromosomen oder Chromosombereichen.
Die Erfindung liefert daher ein Verfahren zur Identifizierung eines vorgesetzten Chromosoms oder Chromosombereichs in einer Probe. Das Verfahren umfaßt die drei aufeinanderfolgenden Schritte eines (a) Kontaktierens einer Probe, von der angenommen wird, daß sie ein derartiges Chromosom oder einen derartigen Chromosombereich (einschließlich Fragmente hiervon) enthält, unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Sondenzusammensetzung der Erfindung, die diese Ziel-DNA eines Chromosoms oder Chromosombereichs hybridisieren wird, um Hybride zwischen der Ziel- DNA und den Sonden-DNA-Segmenten, die in der Sondenzusammensetzung enthalten sind, zu erzeugen, (b) Separieren von resultierenden Probenrestteilen von der Sondenzusammensetzung und (c) Prüfen der resultierenden Probe.
Das Prüfen der Probe kann verschieden durchgeführt werden, beispielsweise mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem Durchflußzytometer oder dergleichen. Die Untersuchung umfaßt ein Bestrahlen der resultierenden Probe mit Energie, die wenigstens ausreichend ist, um Fluorophorgruppen, die in den Hybriden vorhanden sind, zum Fluoreszieren anzuregen, während gleichzeitig die so erzeugte resultierende Fluoreszenzenergie detektiert wird. Wie Fachleute wahrnehmen, kann abhängig von den besonderen Zielen und verwendeten Bedingungen diese Prüfung oder Identifizierung ohne den Separierungsschritt durchgeführt werden, wenn der Grad an Restsondenzusammensetzung so niedrig ist, daß er nicht mit der Prüfung interferiert.
(2) Objektträgerfärbung Vorzugsweise kann eine übliche oder besondere in situ-Hybridisierung in der Praxis dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine in situ-Hybridisierung kann eine besondere Probe involvieren, die die Gesamtheit oder nur eine Fraktion des vorgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs enthält.
Allgemein besteht eine derzeitige Präferenz darin, eine Sondenzusammensetzung dieser Erfindung bei in situ-Hybridisierungsschritten des Typs zu verwenden, der gemeinhin und üblich bei Proben durchgeführt wird, die vorher präpariert und auf einem Objektträger wie etwa einem Objektträger aus Glas oder dergleichen angeordnet wurden. Konventionelle Objektträgerpräparationsmethoden, wie sie beispielsweise durch: F.T. Bosman et al. in Genetica 5: 425-433 (1975); und Gall et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64: 600 (1969) gelehrt werden; und konventionelle in situ-Hybridisierungsmethoden können verwendet werden, wie sie beispielsweise durch B. Bhatt et al. in Nucleic Acids Research 16: 3951- 3961 (1988); A.H.N. Hopman et al. in Experimental Cell Research 169: 357-368 (1987); NcNeil et al. in Genet Anal Techn Appl 8: 41-58 (1991); und Tkachuk, D.C. et al. in Genet Anal Techn Appl 8: 67-74 (1991) gelehrt werden.
Um eine DNA-Färbung eines vorgewählten Chromosoms oder Chromosombereichs in einer derartigen auf einem Objektträger aufgebrachten und behandelten Probe unter Verwendung einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung vorzunehmen, kann die folgende illustrative Methode durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird eine derartig objektträgermontierte Probe vorher behandelt, um die DNA, die vermutlich hierin vorhanden ist, wenigstens teilweise zu dehydratisieren und auch wenigstens teilweise zu denaturieren Konventionelle Denaturierungs- und Dehydratisierungsmethoden können verwendet werden, wie sie beispielhaft in den Ausführungsformen nachstehend geliefert werden. Danach wird typischerweise eine sequentielle Hybridisierungsschrittsequenz unter Hybridisierungsbedingungen ausgeführt. Zuerst wird die objektträgermontierte Probe mit der Sondenzusammensetzung dieser Erfindung kontaktiert. Danach wird die Kombination der Probe und der behandelnden Sondenzusammensetzung, die hiermit in Kontakt ist, einer Inkubationsperiode unterworfen, die typischerweise und vorzugsweise im Bereich von etwa 60 bis etwa 1.000 min liegt, obwohl gegebenenfalls längere und kürzere Inkubationsperiodenzeiten verwendet werden können. Während der Inkubationsperiode wird die Temperatur vorzugsweise in dem angegebenen Bereich von etwa 30 bis etwa 45ºC gehalten. Während dieser Inkubationsperiode unterliegt die behandelnde Sondenzusammensetzung einer Hybridisierung mit der genomischen DNA, die in der Probe vorhanden ist.
Als nächstes wird die resultierende hybridenthaltende Probe einem flüssigen Waschvorgang unterworfen, der geeignet ist, unreagierte, restliche Behandlungssondenzusammensetzung hiervon zu separieren. Vorzugsweise können Waschvorgänge ähnlich zu den im Stand der Technik der in situ-Hybridisierung bekannten verwendet werden, siehe beispielsweise Bhatt et al. in Nucleic Acids Research 16: 3951-3961 (1988). Gewöhnlich werden mehrere verschiedene Waschbäder verwendet, die NaCl, Puffersalze wie Natriumcitrat und dergleichen und Formamid in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten. Höhere Formamidkonzentrationen und niedrige NaCl-Konzentrationen werden für eine höhere Schärfe (größere Fähigkeit zum Entfernen von restlicher Sonden-DNA) verwendet. Ebenso können Detergenzien insbesondere im letzten Bad verwendet werden. Die Schärfe wird ebenfalls durch Anhebung der Temperatur der Waschbäder über Raumtemperatur erhöht.
Nach Eintauchen in ein letztes Waschbad oder dergleichen läßt man den Objektträger vorzugsweise in einer nahezu vertikalen Position ablaufen und vor dem nachfolgenden Zusatz eines Befestigungsmediums und Bedecken mit einem Deckblatt vollständig oder teilweise lufttrocknen. Das Befestigungsmedium (gewöhnlich eine Lösung) enthält konventionell Glyzerin, Puffersalz und ein Schwundverminderungsmaterial, das die Photooxidationsrate der Fluorophormarkierungen reduziert, wie Fachleute wahrnehmen. Ein chemischer Gegenfarbstoff kann in das Festlegungsmedium eingearbeitet sein.
Die Objektträger können nach der Verarbeitung unmittelbar unter einem Fluoreszenzmikroskop und durch konventionelle Filter betrachtet oder sie können bei Raumtemperatur für mehrere Tage oder dergleichen vor der Prüfung aufbewahrt werden.
Die resultierende objektträgerfestgelegte Probe kann weiter mit anderen Sondenpräparationen hybridisiert werden. Beispielsweise kann die Abdeckung entfernt, der Objektträger in ein Waschbad eingetaucht werden, um Oberflächenablagerungen des Festlegungsmediums zu entfernen. Eine vorzugsweise denaturierte zweite Sondenhybridisierungslösung wird dann (wie oben beschrieben) auf den Objektträger (der Objektträger wird kein zweites Mal denaturiert) angewendet, der resultierende Objektträger zum Erleichtern der Hybridisierung inkubiert und dann der Objektträger gewaschen, wie oben beschrieben ist.
Im Falle des Prüfens einer spezifischen chromosomal gefärbten Probe, die durch eine Sondenzusammensetzung dieser Erfindung erzeugt wurde, wie Fachleute wahrnehmen, ist der speziell verwendete Filter vorzugsweise einer, der zu den spektralen Antwortcharakteristiken paßt, die mit dem besonderen Fluorophor verbunden sind, das als Kennzeichnungsabschnitt in einer gegebenen Sondenzusammensetzung dieser Erfindung involviert ist. Solch ein Filter ist entweder kommerziell erhältlich oder ohne weiteres durch konventionelle Filterherstellungs- oder Filterzusammensetzungstechnologie herstellbar. Die folgende Tabelle V liefert illustrative Spezifikationen für Filter und solche Filter werden im Zusammenhang mit den Fluorophoren, die in den hierin gegebenen Beispielen eingeschlossen sind, verwendet: TABELLE V NOMINALSPEZIFIKATIONEN FÜR FLUORESZENZMIKROSKOPFILTERSÄTZE Filtersatz
+Wellenlängenwerte sind in nm aufgelistet. Bandpassfilter sind mit "BP" markiert, wobei die Mitte des Transmissionsbandes des Filters zuerst und die volle Breite bei halbem Maximum in Klammer angefügt ist. Langpassfilter sind mit "LP" markiert, wobei der Durchtrittsbereich zwischen niedriger und hoher Transmission angegeben ist.
++Wellenlängenwerte sind in nm angegeben und zeigen den Filterdurchlaßbereich zwischen hohem Reflexionsvermögen und hoher Transmission an.
*Filtersatz erhalten von Zeiss.
**Filtersatz erhalten von Omega Optical.
Für Fachleute ist wahrnehmbar, daß bei der in situ-Hybridisierung einer objektträgerfestgelegten Probe die Folge des (a) Kontaktierens und (b) Separierens (wie oben angegeben) vorzugsweise mehr als einmal ausgeführt werden kann, bevor der Schritt (c) (prüfen), wie oben angegeben, ausgeführt wird. Bei jeder derartigen Wiederholung der Schritte (a) und (b) (von denen jeder üblicherweise wie oben beschrieben durchgeführt wird) wird eine verschiedene Sondenzusammensetzung mit einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung, die bei einer Wiederholung verwendet wird, und mit anderen (verschiedenen) Sondenzusammensetzungen, die in anderen Wiederholungen verwendet werden, verwendet, wobei jede derartige andere Sondenzusammensetzung auf einen unterschiedlichen vorbestimmten fraktionalen Bereich des besagten Genoms zielt.

(3) Durchflußzytometrie

Die spezifischen chromosomalen gefärbten Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung können auch für ein anderes Verwendungsbeispiel in einer Methode verwendet werden, die fluoreszenzaktivierte Durchflußzytometrie verwendet. Beispielsweise können anfängliche Chromosome konventionell beispielsweise aus mitotischen Zellen einer Zellkultur isoliert werden, siehe beispielsweise Carrano et al. in Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 76: 1382-1384 (1979).
Als nächstes wird eine wässrige Dispersion der so isolierten Chromosome mit einem Vernetzungsmittel für das Protein (d.h. Histone oder Nichthistone), das in dem chromosomalen Chromatin vorhanden ist, mit der DNA vermischt. Üblicherweise reagiert das Vernetzungsmittel mit einer polaren Gruppe einer oder mehrere polare Gruppen enthaltenden Aminosäuren, die in einem derartigen Protein vorhanden sind, beispielsweise Asparat, Aspargin, Arginin, Glutamat, Glutamin, Histidin, Lysin, Serin, Tyrosin und Tryptophan. Die Sulfhydrogruppe von Cystein kann ebenfalls manchmal vernetzen. Ein geeignetes Vernetzungsmittel und eine geeignete in situ-Hybridisierungsmethode werden beispielsweise in Van Engh Patent-Nr. 4,770,992 (1988) gelehrt.
Eine Sondenzusammensetzung der Erfindung wird mit den vernetzten und vorzugsweise denaturierten Chromosomen gemischt.
Eine resultierende Mischung wird vorzugsweise einem Trennverfahren zum Isolieren unhybridisierter Restsondenzusammensetzung unterworfen. Wie jedoch durch die Fachleute wahrnehmbar ist, kann dann, wenn die Konzentration der Restsondenzusammensetzung genügend niedrig ist, so daß sie nicht oder nicht übermäßig mit der besonderen durchflußzytometrischen Analyse, die ins Auge gefaßt ist, interferiert, eine derartige Trennmethode umgangen werden.
Eine geeignete Trennmethode kann ein Zentrifugieren umfassen. Der resultierende Chromosomkuchen wird in einem wässrigen Medium erneut suspendiert. Eine geeignete resuspendierte Konzentration liegt bei etwa 5 x 10&sup6; Chromosome/ml. Üblicherweise ist in dem Suspensionswasser ein Puffersalz gelöst.
Eine resultierende Suspension wird der durchflußzytometrischen Analyse unterworfen, beispielsweise ein Zweistrahlzytometer, wie es beispielsweise in den vorgenannten Zitaten beschrieben ist.
Die so gemessenen Resultate können beispielsweise verwendet werden, um Chromosome basierend auf der Gesamtprobenmorphologie zu identifizieren oder die Anwesenheit einer spezifischen Chromosomfärbung mit der Anwesenheit irgendeines Chromosommaterials zu korrelieren. Die Korrelation wird durchgeführt, um gegen den Hintergrund zu diskriminieren, der mit der spezifischen Farbe verwechselt werden könnte.
Eine andere Technik, die durchflußzytometrische Detektion mit in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Sondenzusammensetzung dieser Erfindung kombiniert, verwendet Interphasenkerne in Suspensionen in der Art, wie sie beispielsweise durch Trask, et al. in Hum Genet (1988) 78:251-259 gelehrt wird.

(4) Sondenmischungen

Es ist ein Merkmal und ein Vorteil der Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung, daß sie mit anderen Sondenzusammensetzungen und dergleichen gemischt werden können, ohne die chemische Struktur oder die funktionale Kapazität hiervon nachteilig zu beeinträchtigen. Obwohl gemischte Sondenzusammensetzungen komplexe DNA-Segmentmischungen unter Hybridisierungsbedingungen beinhalten, hybridisieren diese individuellen Segmente nur mit komplementären Ziel-DNA, so daß die gewünschte spezifische chromosomale Färbung erreicht wird. Vor dem ersten oben angegebenen Verfahrensschritt kann beispielsweise eine Sondenzusammensetzung dieser Erfindung, die wie oben beschrieben präpariert wurde, gewünschtenfalls mit einer anderen Sondenzusammensetzung gemischt werden, die beispielsweise markierte Segmente enthält, die bezüglich spezifischer Ziele, die in vorbestimmten Chromosomen oder Chromosombereichen vorhanden sind, hybridisierbar sind. Derartige andere Sondenzusammensetzungen sollten vorzugsweise zur Verwendung bei der in situ-Hybridisierung unter vergleichbaren Bedingungen bezüglich Temperatur, Zeit und dergleichen (relativ zur Sondenzusammensetzung dieser Erfindung) geeignet sein.
Beispielsweise kann eine solche andere Sondenzusammensetzung eine direkt markierte oder eine indirekt markierte Sondenzusammensetzung wie etwa (a) eine andere direkt markierte Sondenzusammensetzung dieser Erfindung, (b) eine Sondenzusammensetzung, die durch Umsetzung der DNA dieser Sondenzusammensetzung mit Fluorophor markierten Nucleosidtriphos phaten markiert sind, wie in Wiegant et al. in Nucleic Acids Research 19: 3237-3241 (1991) beschrieben ist; (c) eine indirekt markierte Sondenzusammensetzung, hergestellt durch Einarbeiten von Biotin- oder Digoxygenin-enthaltenden Desoxynucleotidtriphosphaten in die Sonden-DNA, wie in einer Anzahl von Publikationen einschließlich Wiegant et al. (op. cited) und Bhatt et al. in Nucleic Acids Research 16: 3951-3961 (1988) beschrieben ist; und/oder (d) die indirekt markierten Sondenzusammensetzungen, die chemische Gruppen enthalten, die in einer Posthybridisie rungsreaktion mit chemischen Gruppen auf modifizierten Fluorophoren reagieren, um eine Bindung zwischen hybridisierter Sonde und Fluorophormarkierung zu bilden, wie durch Hopman et al. in Experimental Cell Research 169: 357-368 (1987) beschrieben ist, und dergleichen.
Eine derartige resultierende gemischte Sondenzusammensetzung kann dann in einem in situ-Hybridisierungsvorgang in einer objektträgerfestgelegten Probe verwendet werden. Bei dieser Methode wird jedes chromosomale Ziel, das in einer Probe vorhanden ist, mit ihrer vorgewählten Sondenzusammensetzung bis zu einem Ausmaß gefärbt, das wie dieses Ziel in der Probe vorhanden ist. Restsonden werden anschließend von der resultierenden Probe in dem gleichen Waschvorgang entfernt.
Ein anderes Merkmal und Vorteil der Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung besteht darin, daß sie zum aufeinanderfolgend vorgenommenen spezifischen Färben von vorgewählten Chromosomen selbst nach Abschluß eines vorhergehenden Hybridisierungsvorgangs wie eines in situ- Hybridisierungsvorgangs, bei dem ein besonderes unterschiedliches Ziel involviert ist, oder dergleichen verwendet werden kann.
Sondenzusammensetzungen dieser Erfindung sind allgemein mit anderen in situ-Hybridisierungsreagenzien kompatibel. Jedoch im Falle von zwei oder mehr indirekt markierten Sonden in Kombination muß aufgepaßt werden, daß keine Komponenten vorhanden sind, die miteinander in der Mischung reagieren.

Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele illustriert.
Mikroskopuntersuchungen wurden entweder mit einem Zeiss- Axioskop, Axioplan oder Axiophotfluoreszenzmikroskop durchgeführt. Filtersätze, die zur Betrachtung von durch in situ-Hybridisierung gefärbten Proben verwendet wurden, wurden entweder von Carl Zeiss, Inc. (Thornwood, NY) oder Omega Optical, Inc. (Brattleboro, VT) erhalten, wie in Tabelle V dargestellt.

BEISPIEL 1

Isolation von menschlichem Chromosom - Spezifische DNA-Sonden

Menschliche chromosomspezifische DNA wurde als Rekombinantphagenbibliotheken von Lawrence Livermore National Laboratories, konstruiert wie in Van Dilla, et al. (Biotechnology 4: 537-552, 1986) beschrieben, erhalten. Hinterlegungen dieser Bibliotheken wurden gegenüber den Lawrence Livermore National Laboratories (LLNL) gemacht. Diese Bibliotheken wurden durch Wachstum auf einem E. coli Wirtstamm verstärkt. Die verstärkte Phage wurde gereinigt, ihre DNA wurde extrahiert und diese DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Hind III digeriert. Einsatz-DNA wurde von der Lamda-Vektor-DNA gereinigt und in der Hind III- Lage des Plasmidvektors pBS (Strategene, La Jolla, CA) kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden in einen E. coli Stamm, DH5α (Bethesda Research Libraries, Gaithersburg, Maryland) transformiert, wobei rekombinante Plasmidbibliotheken, die Einsatz-DNA spezifisch für menschliche Chromosome enthielten, erzeugt wurden.
Die Phagenbibliotheken, die hier als Beispiel dienen, entsprechen ATCC # 57754 (Chromosome 1); ATCC # 57745 (Chromosome 4); ATCC # 57701 (Chromosome 6); ATCC # 57702 (Chromosome 8) und ATCC #'s 57722 und (Chromosome 7). Die Bibliotheken sind als 1 ml Teilmengen von gefrorenen Zellen aufbewahrt. Diese Fläschchen wurden als die Primärquelle für chromosomale DNA verwendet. Plasmidbibliotheken aus diesen Phagenbibliotheken wurden zur Fermentation verwendet.
Bakterien ließ man durch Fermentation wachsen. Der Impfstoff, erhalten aus ATCC, wurde bei 37ºC während 24 h auf 1,6%igen Agarplatten enthaltend Ampicillin (200 µg/ml) und YT-Brühe kultiviert, die 8 g/l von Bacto Trypton (Difco), 5 g/l Bacto Yeast Extrakt (Difco), 15 g/l Bacto Agar (Difco) und 5 g/l Natriumchlorid enthielt. Die kultivierten Zellen wurden mit 4 ml YT-Brühe enthaltend 16 g/l Bacto Trypton (Difco), 10 g/l Bacto Yeast Extrakt (Difco) und 5 g/l Natriumchlorid geerntet und jeder Ernte wurden 4 ml von 20%igem Glyzerin zugesetzt. Die E. coli Zellkultur wurde in 0,5 ml Teilmengen durch Untertauchen der Fläschchen in flüssigem Stickstoff schnell gefroren und bei -80ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.
Der Fermentierimpfstoff wurde hergestellt in 350 ml durch Kultivieren der Impfkultur in einem Casaminosäuremedium, das 13,2 g/l Na&sub2;HPO&sub4;-7H&sub2;O, 3,0 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,05 g/l NaCl, 1,0 g/l NH&sub4;cl, 10,0 g/l Casaminosäuren (Difco); 0,03 g/l MgSO&sub4;, 0,004 g/l CaCl&sub2;-2H&sub2;O, 3,0 g/l Glucose, 0,025 g/l Thiamin-HCl, 0,0054 g/l FeCl&sub3;, 0,0004 g/l ZnSO&sub4;, 0,0007 g/l CoCl&sub2;, 0,0007 g/l Na&sub2;MoO&sub4;, 0,0008 g/l CuSO&sub4;, 0,0002 g/l H&sub2;BO&sub3; und 0,0005 g/l MnSO&sub4; in einer 2 l geschüttelten Mischflasche bei pH 7 und 37ºC enthielt. Die 350 ml Kultur wurde verwendet, um 4,2 l Fermentationsmedium zu impfen, das 1% Glucose, 13,2 g/l Na&sub2;HPO&sub4;-7H&sub2;O, 3,0 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,05 g/l NaCl, 1,0 g/l NH&sub4;Cl, 10,0 g/l Casaminosäuren (Difco), 0,03 g/l MgSO&sub4;, 0,004 g/l CaCl&sub2;-2H&sub2;O, 0,025 g/l Thiamin-HCl, 0,0054 g/l FeCl&sub3;, 0,0004 g/l ZNSO&sub4;, 0,0007 g/l CoCl&sub2;, 0,0007 g/l Na&sub2;MoO&sub4;, 0,0008 g/l CuSO&sub4;, 0,0002 g/l H&sub2;BO&sub3; und 0,0005 g/l MnSO&sub4; enthielt.
Bakterielle Zellen wurden unter Verwendung eines Membranzellkonzentrators und einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge unmittelbar nach Vervollständigung der Fermentation geerntet. Die fermentierte Zellbrühe wurde von 5 l auf etwa 800 ml unter Verwendung eines 0,45 pm Membranfilters (2 Quadratfuß) konzentriert. Das Zellkonzentrat wurde dann bei 7000 x g für 10 min in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Die bakteriellen Zellpellets wurden nach Abschütten des Überstandes gesammelt.
Die Mengen aller Reagenzien, die bei der Isolation von DNA verwendet wurden, werden relativ zur anfänglichen feuchten Zellmasse der Zellpellets (in g) berechnet. Um die erforderlichen Mengen zu bestimmen, wird ein Multiplikationsfaktor "M" berechnet und dann jedes Reagenz in M-Malen einer festen Menge dieser Komponente zugesetzt. Der Faktor M einer gegebenen Zellmasse wird bestimmt durch Dividieren der Zellmasse in g durch 13. Um daher 130 g Zellmasse zu verarbeiten, wird ein M-Faktor von 10 auf die feste Menge jedes individuellen Reagenz angewendet.
Plasmid-DNA wurde von bakteriellen Zellenpellets extrahiert. Zellenpellets wurden in 40xM ml einer Lösung aus 50 mM Glucose (filtersterilisiert), 10 mM NaEDTA (pH 7,5-8,0) und 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert. Die Zellen wurden durch starkes Verwirbeln nach Zusatz von 80xM ml einer Lösung von 0,2 M NaOH und 1 % (w/v) SDS zerstört. Nach wenigen Minuten nahm die Trübung dieser Lösung, die die Zerstörung der Zellen anzeigt, ab. Der geklärten Lösung wurden 60xM ml einer Lösung enthaltend 55,5 ml Eisessigsäure und 147,5 g Caliumacetat pro 500 ml zugesetzt. Diese Lösungen wurden gründlich gemischt, wodurch die Erzeugung eines flockenden Niederschlages resultierte. Der Überstand wurde von dem flockenden Niederschlag entfernt und dieser Überstand wurde während 15 min bei 7000 x g zum Entfernen von Restniederschlag zentrifugiert.
Nucleinsäure wurde von dem Überstand mit einem Volumen von Ethanol gefolgt durch Zentrifugieren während 10 min bei 7000 x g niedergeschlagen und die Nucleinsäurepellets wurden in insgesamt 7xM ml einer Lösung enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM Natriumacetat resuspendiert. Die Nucleinsäure wurde dann mit 1/2 Volumen neutralisiertem Phenol und 1/2 Volumen Chlorophorm extrahiert und mit zwei Volumen Ethanol niedergeschlagen. Die Nucleinsäure wurde in 4xm ml einer Lösung enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM Natriumacetat resuspendiert. Ein 10xM µl Anteil von 10 mg/ml pankreatischer Ribonuclease A-Lösung (wärmebehandelt zum Inaktivieren von DNase) wurde der resuspendierten Nucleinsäurelösung zugesetzt. Diese Mischung ließ man während 30 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4ºC stehen. Ein 8xM µl Anteil von 20 mg/ml Proteinase K-Lösung wurde dann zugesetzt und bei 55ºC während drei h inkubiert. Die DNA-Lösung wurde dann mit 1/2 Volumen neutralisiertem Phenol und 1/2 Volumen Chlorophorm extrahiert und mit zwei Volumen Ethanol niedergeschlagen. Die niedergeschlagene DNA wurde durch Zentrifugieren während 15 min bei 4500 x g aufgefangen.
DNA wurde in 5,36xM ml Wasser resuspendiert und dann wurden 0,64xm ml an 5 M NaCl und 2xM ml von 50% (w/v) Polyethylenglycol (PEG) (Molekulargewicht 6000-8000) zugesetzt, auf Eiswasser während 1 h inkubiert und durch Zentrifugieren während 15 min bei 4500 x g niedergeschlagen. Die DNA wurde in 0,5xM ml Wasser und 1/10 Volumen von 3M Natriumacetat resuspendiert und mit 1/2 Volumen neutralisiertem Phenol und 1/2 Volumen Chlorophorm extrahiert und mit zwei Volumen Ethanol niedergeschlagen. Die niedergeschlagene DNA wurde durch Zentrifugieren während 15 min bei 4500 x g aufgefangen und unter Vakuum getrocknet. Die gereinigte DNA wurde in 0,6xM ml deionisiertem Wasser resuspendiert. Die DNA- Konzentration wurde durch Fluorometrie bestimmt.
Schließlich wurde die gereinigte DNA in kleine Fragmente von etwa 300 Basispaaren durch Ultraschallbehandlung unter Verwendung eines Branson Sonifier 450 (Danbury, Connecticut) zerteilt. Die Größe der Fragmente wurde empirisch bestimmt als das Optimum für DNA-Sonden, die zur in situ-Hybridisierung verwendet werden. Vier mg der oben hergestellten gereinigten Plasmid-DNA wurde in 2 ml Wasser resuspendiert und in einem Trockeneis/Ethanol-Bad eingetaucht, um ein Kockenwährend der Ultraschallbehandlung zu verhindern. Die Mikrospitze der Ultraschalleinrichtung wurde in diese Lösung eingetaucht, bis die Spitze 2-5 mm vom Boden des Röhrchens entfernt war. Ultraschallbehandlung wurde ausgeführt bei einer Ausgangsleistung von 25-30 Watt, und zwar diskontinuierlich mit einem 80% Arbeitszyklus (80% der Zeit eingeschaltet, 20% der Zeit ausgeschaltet) während eines Zeitraums von 5 min. Der Ultraschallbehandlung folgend wurde die DNA durch Zusatz von 0,2 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 4 ml Ethanol niedergeschlagen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren während 5 min bei 8.000 x g aufgenommen und vakuumgetrocknet.

BEISPIEL 2

Bisulfitcatalysierte Transamination der Sonden-DNA

Sonden-DNA wurde durch Zusatz von Ethylendiamin zum C4-Kohlenstoffatom des Basiscytosins transaminiert. Diese Reaktion wird durch Natriumbisulfit katalysiert. Annähernd 4 bis 24% der verfügbaren Desoxycytidinnucleotidstellen werden zur Fluoreszenzmarkierung aminiert.
Um den Bisulfitpuffer herzustellen, wurden 1,7 ml konzentrierter HCl langsam 1 ml deionisiertem H&sub2;O auf Eis zugesetzt. 1 ml frisches Ethylendiamin (Sigma cat. #E-4379) wurde dann langsam auf Eis zugesetzt. Nach Auflösung des Ethylendiamins wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 0,475 g Natriummetabisulfit (Aldrich Cat. #25,555-6) oder Natriumbisulfit (EM Sciences Cat. #SX0345-1) zugesetzt. Konzentrierte HCl wurde dann langsam zu der Bisulfitmischung zugesetzt, bis ein pH- Wert von 7,0 erreicht war, und das Volumen der Lösung wurde auf 5,0 ml eingestellt.
Um Sonden-DNA zu transaminieren, wurden 1 mg ultraschallbehandelter DNA in 0,3 ml H&sub2;O resuspendiert. Die DNA wurde durch Kochen bei 100ºC während 5 min denaturiert und dann schnell in einem Eiswasserbad abgeschreckt. Die Transaminierungsreaktion wurde durch Zusatz von 0,3 ml dieser DNA-Lösung zu 2,7 ml Bisulfitpuffer initiiert und die Reaktion wurde entweder bei 25 oder 37ºC für mehrere Stunden bis mehrere Tage inkubiert, um den gewünschten Aminationsgrad (siehe Tabelle unten) zu erhalten. Die DNA-Lösung wurde durch Routinedialyse gegen 5-10 mM Natriumborat (pH 8,0) entsalzt. Nach Dialyse wurden 0,3 ml von 3 M Natriumacetat (pH 5,5) dem Dialysat zugesetzt. Die aminierte DNA wurde mit 2,5 Volumen Ethanol niedergeschlagen und durch Zentrifugieren bei 8.000 x g während 10 min aufgenommen. Die Pellets wurden vakuumgetrocknet und bei einer Konzentration von 3 mg/ml DNA rehydratisiert. Diese Lösung wurde bis zur Verwendung bei -20ºC aufbewahrt.
Das Ausmaß der Transaminierung von dC wurde durch enzymatisches Aufschließen der aminierten DNA gefolgt durch Abtrennen der resultierenden Nucleoside auf einem FPLC-Chromatographiesystem (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) bestimmt. 5-10 µg aminierter DNA wurde mit Wasser zu 50 µl verdünnt und die DNA auf einem eine Drehsäule enthaltenden Sephadex G-25 (5Prime T 3 Prime, Inc. Paoli, PA) gereinigt. Die DNA wurde dann getrocknet und 12,5 µl 2X Dnase 1 Puffer (20 mM Tris, 10 mM MgCl&sub2;, pH 7,5) und 0,5 µl des Desoxyribonuclease 1 (DNase 1) (BRL, 2 mg/474 µl, > 10.000 U/mg) wurden der DNA zugegeben und die Lösung in einem 37ºC warmem Wasserbad während 1 h inkubiert. 50 µl 2X PD1/alkalischer Phosphatpuffer (100 mM Tris, 200 mM NaCl, 28 mM MgCl&sub2;, 2 mM ZnCl&sub2;, pH 9,0), 19 µl Wasser, 5,0 µl Phosphodiesterase 1 (PDl) (Pharmacia LKB, 1,000 U/ml gelöst in 1X PDl/alkalischer Phosphatpuffer) und 1,0 µl Alkalinphosphatase aus Kalbeingeweide (Promega, 10.000 U/ml) wurden dann zugegeben und die Lösung während zusätzlicher 2 h bei 37ºC inkubiert. Die aufgeschlossene Probe wurde dann auf eine MinoRPC-Säule (Pharmacia, LKB) gegeben und ein linearer Gradient zwischen Puffer A (97,5:2,5 Ionenpaarungspuffer:Methanol, Ionenpaarungspuffer = 50 mM KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% Hexansulfonsäure, pH 7,0) und Puffer B (50:50 Ionenpaarungspuffer: Methanol) wurden verwendet, um die Probe zu eluieren (ein 0,8%iger Anstieg im Puffer B/min bei einer Durchflußrate von 0,37 ml/min, bis 40% Puffer B erreicht war, gefolgt durch einen 3%igen Anstieg bezüglich Puffer B/min zu 100% Puffer B bei einer Durchflußrate von 0,3 ml/min), während das DNA-Elutionsprofil durch Absorbierung aufgezeichnet wurde. Jedes der 4 natürlichen Desoxynucleoside und das separat eluierte Transaminationsprodukt von Desoxycytidin und der Betrag an transaminiertem Desoxycytidin wurden aus den relativen Bereichen unter den Desoxycytidin- und transaminiertem Desoxycytidinpeaks in dem Elutionsprofil bestimmt. Typische Resultate sind für zwei Präparationen von ultraschallbehandelter Plasmid-DNA enthaltend Sequenzen des menschlichen Chromosoms #4 aufgelistet. TABELLE VI Transaminationsreaktionsbedingungen

BEISPIEL 3 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophor 7-Amino-4-methylcoumarin-3-Essigsäure, succinimidylester (AMCA)

Transaminierte Sondenvorläufer DNA (mittlere Länge 300 bp, 20% aminiertes Desoxycytosin), spezifisch für menschliches Chromosom 1, wurden mit 7-Amino-4-methylcoumarin-3-Essigsäure-succinimidylester (AMCA) konjugiert. Sechzig µg transaminierter DNA wurden getrocknet und dann in 673 µl von 200 mM 3-[N-morpholino] Propansulfonsäure (MOPS) als Puffer bei pH 7,4 resuspendiert. Sechsundzwanzig und acht Zehntel µl einer 50 mM Lösung von AMCA in Dimethylsulfoxid (150-facher molarer Überschuß) wurde der Suspension von transaminierter DNA zugesetzt. Diese Reaktion fand unter Rühren in Dunkelheit beim Raumtemperatur während etwa 18 h statt. Der Überschuß an Fluorophor wurde von der markierten DNA separiert, indem die Reaktion über eine Sephadex G-25-Säule geführt wurde, die 28 cm hoch mit einem Innendurchmesser von 1 cm war. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Zwei Ethanolniederschlagungen der markierten DNA vervollständigten die Reinigung, um die AMCA- Sonde zu liefern. Ein Absorptionsspektrum zeigte, daß 4,8% der Basen gekennzeichnet waren. In nachfolgenden Präparationen wurde einer der Ethanolniederschlagungsschritte als erstes durchgeführt, gefolgt von einer Säulenreinigungsstufe, und der zweite Ethanolniederschlagungsschritt wurde am Ende durchgeführt. Beide Reinigungsprozeduren lieferten gute Ergebnisse.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden für die Präparation von Chromosomverteilungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt wurden, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einem Glasmikroskopobjektträger aus einer Distanz von etwa 3 Fuß fallengelassen, um die Kerne aufzubrechen. Vor der Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in eine Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC gehalten. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf jeweils einem Objektträger (10 µl) plaziert wurde, enthielt 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandeltes Lachssperma DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche placentale DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurden, wurden variiert. Zehn µl der gesamten Hybridisierungsmischung wurden durch Erhitzen auf 70ºC für 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde die überschüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers von jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, dann wurde der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC gewaschen, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, das ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel darstellt, das durch Calbiochem, La Jolla, California, verkauft wird) während 15 min bei 45ºC. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH7)/0,1% NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zur Reduktion der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger gegeben und ein Deckglas über dem Tropfen der Antibleichmittellösung plaziert. Die Antibleichmittellösung ist in J. Immuno, Methods 43: 349 (1981) beschrieben und wird folgendermaßen hergestellt: 100 mg von p-Phenylendiamindihydrochlorid wird in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung gelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 8 mit einer Bicarbonatpufferlösung hergestellt durch Zusatz von 0,42 g NaHCO&sub3; zu 10 ml Wasser eingestellt, wonach der pH-Wert auf 9,0 durch Zusatz von 50% (w/v) NaOH eingestellt wird. Die pH-Wert-Einstellösung von p-Phenylendiamindihydrochlorid wird zu 90 ml Glyzerin gegeben und die resultierende Lösung dann durch eine 0,22 µm Filtriereinrichtung gefiltert. Diese Lösung wird dunkel bei -20ºC aufbewahrt. Die Antibleichlösung enthält gegebenenfalls 0,2 µg Propidiumiodid/ml als ein generelles Chromosomenfärbmittel, um die Visualisierung aller Chromosome zu ermöglichen. Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #1 oder #2 für die AMCA und Satz #10 für das Propidiumiodid betrachtet. TABELLE VII Qualitative Resultate:
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell
AMCA-markierte Sonden zeigen gute Spezifizität sowohl mit placentaler als auch mit Cot1 DNA. Höhere Sondenkonzentrationen werden zum beobachten guter Fluoreszenzintensität bevorzugt.

BEISPIEL 4 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophor Texas Rot Sulfonylchlorid (TexRd)

Zwei verschiedene transaminierte Sondenvorläufer-DNAs (mittlere Länge 300 bp, eine zu 20%, die andere zu 4,6% aminierter Desoxyxytosine), spezifisch für das menschliche Chromosom 7, wurden mit Texas Rot Sulfonylchlorid (TxRd) konjugiert. 40 µg der transaminierten DNA wurden getrocknet und dann in 270 µl von 50 mM Natriumborat, pH 9,3, resuspendiert. 30 µl einer 30 mM Lösung von Texrd in N,N-Dimethylformamid (ein 150-facher molarer Überschuß) wurde den Suspensionen von transaminierter DNA zugesetzt. Diese Reaktionen fanden unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (annähernd 18 h) statt. Der Fluorophorüberschuß wurde von der markierten DNA durch Niederschlagen der DNA aus Ethanol entfernt. Die niedergeschlagenen Materialien wurden in Wasser resuspendiert und jeweils über eine Sephadex G-25-Säule geführt, die bei einem Innendurchmesser von 1 cm 28 cm hoch war. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNA vervollständigte die Reinigung. Absorptionsspektren der markierten Produkte zeigten, daß 3,2% der gesamten Nucleotide in der 5% (Gesamtnucleotide) aminierten DNA-Präparation markiert waren und daß 1,0% der Gesamtnucleotide in den 1,2% (Gesamtnucleotide) aminierten DNA-Präparation markiert waren. Dieses Verfahren liefert die TxRd-Sonde.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Herstellung von Chromosommetaphasenausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt wurden, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmikroskopobjektträger von etwa drei Fuß Höhe getropft, um die Kerne aufzubrechen und die Chromosome zu exponieren. Vor Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in einer Denaturierungslösung von 70% Formamid/ 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die dann auf Objektträgern (10 µl) angeordnet wurde, enthielt jeweils 50% Formamid/10% Dextransulfat/ 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandeltes Lachssperma DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen von blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche Placental- DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurde, wurde variiert. 10 µl der gesamten Hybridisierungsmischung wurde durch Erhitzen auf 70ºC für 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC für 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde die überschüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers von jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, wonach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC gewaschen wurde, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichmittellösung, verwendet um die Rate an Fluorophorphotooxidation zu reduzieren, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel angeordnet (siehe Beispiel 1). Die Antibleichmittellösung enthielt gegebenenfalls 1,0 ug, 4,6-diamidino-2-phenylindolhydrochlond (DAPI)/ml als ein allgemeines Chromosomfärbmittel zum Ermöglichen der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #9 für Tx Rd und Satz #1 oder #2 für DAPI betrachtet. TABELLE VIII Qualitative Resultate:
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
Die Daten zeigen, daß Tx Rd-markierte Sonden sich besser verhalten, wenn sie bis zu einem niedrigeren Grad markiert sind. Die Spezifizität war sehr verbessert, wenn der Aminierungsgrad von 20% auf 4,6% der Desoxycytosine reduziert war. Selbst geringe Sondenkonzentrationen (100 ng/10 µl) lieferten sehr gute Resultate, wenn die 1% markierte Sonde verwendet verwendet wurde.

BEISPIEL 5 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophor 5-(und-6)-Carboxy-X-rhodaminsuccinimidylester (CXR)

Zwei verschiedene transaminierte Sondenvorläufer-DNAs (mittlere Länge 300 bp, einer zu 20%, der andere zu 4,6% aminierter Desoxycytosine), spezifisch für das menschliche Chromosom 4, wurde mit 5-(und -6)-Carboxy-X-rhodamin-succinimidylester (CXR) konjugiert. 35 µg transamininerter DNA wurde getrocknet und dann in 368 µl von 200 mM MOPS, pH 7,4 resuspendiert. Einunddreißig und acht Zehntel µl einer 25 mM Lösung von CXR in N,N-dimethylformamid (einem 150-fachen molaren Überschuß) wurde zu jeder Suspension von transaminierter DNA zugesetzt. Diese Reaktionen fanden unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (näherungsweise 18 h) statt. Der Überschuß an Fluorophor wurde durch Niederschlagen der markierten DNAs aus Ethanol separiert. Die niedergeschlagenen Materialien wurden in Wasser resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule geführt, die bei einem Innendurchmesser von 1 cm 28 cm hoch war. Die gewünschten Fraktionen (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNAs vervollständigte die Reinigung. Absorptionsspektren der markierten Produkte zeigten, daß 4,9% der Gesamtnucleotide in den 5% (Gesamtnucleotide) aminierten DNA-Präparation markiert waren und daß 1,5% der Gesamtnucleotide in den 1,2% (Gesamtnucleotide) aminierten DNA-Präparation markiert waren.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Herstellung von Chromosommetaphasenausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt wurden, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmikroskopobjektträger aus einer Distanz von etwa 3 Fuß fallengelassen, um die Kerne aufzubrechen. Vor Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in einer Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC plaziert. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf Objektträgern (10 µl) angeordnet wurde, bestand immer aus 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (als Träger verwendet). Die Konzentrationen von blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche Placental-DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugegeben wurde, wurden variiert. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurde durch Erhitzen auf 70ºC für 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überschüssige Sonde durch dreimaliges Waschen von jeweils 15 min des Objektträgers bei 45ºC in 50% Formamid/ 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, dann wurde der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC gewaschen, gefolgt durch ein Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC. Schließlich wurde der Objektträger zweifach während jeweils 2 min in 0,1 N Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, benutzt zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichlösung angeordnet (siehe Beispiel 1). Die Antibleichlösung enthielt gegebenenfalls 1,0 µg 4,6-diamidino-2-phenylindolhydrochlorid (DAPI)/ml als ein generelles Chromosomfärbmittel zum Ermöglichen der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Benutzung des Filtersatzes #9 für CXR und Satz #1 oder #2 für DAPI betrachtet.
Qualitative Resultate: TABELLE IX
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
Die Daten zeigen, daß CXR-markierte Sonden sich besser verhalten, wenn sie in geringerem Maße markiert sind. Die Spezifizität wurde verbessert, wenn der Aminationsgrad von 20% auf 4,6% der Desoxycytosine reduziert wurde. Selbst geringe Sondenkonzentrationen (100 ng/10 µl) lieferten gute Resultate unter Verwendung der 1,5% (Gesamtnucleotide) markierten Sonde.

BEISPIEL 6 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophorlissaminrhodamin B Sulfonylchlorid (LisR)

Transaminierte DNA-Sonden (mittlere Länge 300 bp, 20% an aminierten Desoxycytosinen), spezifisch für das menschliche Chromosom 4, wurden mit Lissaminrhodamin B Sulfonylchlorid (LisR) konjugiert. Dreißig µg transaminierter DNA wurden getrocknet und dann in 373 µl von 50 mM Natriumborat, pH 9,3, resuspendiert. Siebenundzwanzig und drei Zehntel µl einer 25 mM Lösung von LisR in N,N-dimethylformamid (ein 150-facher molarer Überschuß) wurden der Suspension an transaminierter DNA zugegeben. Diese Reaktion fand unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (annähernd 18 h) statt. Der Fluorophorüberschuß wurde von der markierten DNA zunächst durch eine Ethanolniederschlagung entfernt. Das niedergeschlagene Material wurde in Wasser resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 28 cm geführt. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNA vervollständigte die Reinigung. Ein Absorptionsspektrum zeigte, daß 3,8% der Basen markiert waren. Dieses Verfahren liefert die LisR-Sonde.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Präparation von Chromosommetaphaseausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt waren, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmiskroskopobjektträger von etwa 3 Fuß Höhe getropft, um die Kerne aufzubrechen. Vor Hybridisierung wurde Objektträger für 2 min in eine Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf Objektträgern angeordnet wurde (10 µl), war jeweils 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen an blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche Placental-DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurden, wurden variiert. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurden durch Erhitzen auf 70ºC während 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überflüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers während jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, danach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel plaziert (siehe Beispiel 1). Die Antibleichmittellösung enthielt gegebenenfalls 1,0 µg 4,6-diamidino-2-phenylindolhydrochlorid (DAPI)/ml als ein generelles Chromosomfärbmittel zur Ermöglichung der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #7, #8 oder #9 für LisR und Satz #1 oder #2 für DAPI betrachtet.
Qualitative Resultate: TABELLE X
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
LisR-markierte Sonden liefern einige Spezifizität und gute Intensität bei dem relativ hohen Grad von 5% Markierung (Gesamtnucleotide).

BEISPIEL 7 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophor 5-(und-6)-Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester, (CTMR)

Zwei verschiedene transaminierte Sondenvorläufer-DNAs (mittlere Länge 300 bp, eine zu 20%, die andere zu 4,6% aminierter Desoxycytosine), spezifisch für das menschliche Chromosom 4, wurden mit 5-(und-6)- Carboxytetramethylrhodamin-succinimidylester (CTMR) konjugiert. Fünfzig ug transaminierter DNA wurden getrocknet und dann in 377 µl 200 mM MOPS, pH 7,4, resuspendiert. Zweiundzwanzig und acht Zehntel µl einer 50 mM Lösung von CTMR in N,N-dimethylformamid (ein 150-facher molarer Überschuß) wurden jeder transaminierten DNA zugesetzt. Diese Reaktion fand unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (annähernd 18 h) statt. Überschüssiges Fluorophor wurde von den markierten DNAs zunächst durch eine Ethanolniederschlagung getrennt. Das niedergeschlagene Material wurde in Wasser resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 28 cm geführt. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNAs vervollständigte die Reinigung. Ein Absorptionsspektrum zeigte, daß 5,5% der Gesamtnucleotide in der 5% (Gesamtnucleotide) aminierten DNA-Präparation markiert waren. Dieses Verfahren liefert die CTMR-Sonde.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Präparation von Chromosommetaphaseausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt waren, um die Zellen Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmiskroskopobjektträger von etwa 3 Fuß Höhe getropft, um die Kerne aufzubrechen. Vor Hybridisierung wurde Objektträger für 2 min in eine Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf Objektträgern angeordnet wurde (10 µl), war jeweils 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen an blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche Placental-DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurden, wurden variiert. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurden durch Erhitzen auf 70ºC während 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überflüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers während jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, danach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel plaziert (siehe Beispiel 1). Die Antibleichmittellösung enthielt gegebenenfalls 1,0 µg 4,6-diamidino-2-phenylindolhydrochlorid (DAPI)/ml als ein generelles Chromosomfärbmittel zur Ermöglichung der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #7 oder #8 für CTMR und Satz #1 oder #2 für DAPI betrachtet.
Qualitative Resultate für 5% aminierte, 5,5% CTMR-markierte (basierend auf den Gesamtnucleotiden) Sonde: TABELLE XI
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
CTMR-markierte Sonden liefern eine sehr gute Spezifizität und Intensität, selbst bei den 5% markierten (Gesamtnucleotide) Sonde. Eine Sonde, hergestellt aus der 4,6% (basierend auf Desoxycytosinen) aminierten DNA zeigte in ähnlicher Weise sehr gute Resultate.

BEISPIEL 8 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophor 5-(und-6)-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFI)

Transaminierte DNA-Sonden (mittlere Länge 300 bp, 20% aminierte Desoxycytosine), spezifisch für das menschliche Chromosom 4, wurden mit 5-(und-6)-Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFI) konjugiert Fünfzig µg transaminierter DNA wurden getrocknet und dann in 377 µl 200 mM MOPS, pH 7,4, resuspendiert. Zweiundzwanzig und acht Zehntel µl einer 50 mM Lösung von CFI in N,N-dimethylformamid (ein 150-facher molarer Überschuß) wurden jeder transaminierten DNA zugesetzt. Diese Reaktion fand unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (annähernd 18 h) statt. Überschüssiges Fluorophor wurde von den markierten DNAs zunächst durch eine Ethanolniederschlagung getrennt. Das niedergeschlagene Material wurde in Wasser resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 28 cm geführt. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNAs vervollständigte die Reinigung. Ein Absorptionsspektrum zeigte, daß 1,6% der Basen markiert waren. Dieses Verfahren liefert die CFI-Sonde.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Präparation von Chromosommetaphaseausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt waren, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmikroskopobjektträger von etwa 3 Fuß Höhe getropft, um die Kerne aufzubrechen. Vor Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in eine Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf Objektträgern angeordnet wurde (10 µl), war jeweils 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen an blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche Placental-DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurden, wurden variiert. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurden durch Erhitzen auf 70ºC während 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überflüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers während jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, danach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel plaziert (siehe Beispiel 1). Die Antibleichmittellösung enthielt gegebenenfalls 1,0 µg 4,6-diamidino-2-phenylindolhydrochlorid (DAPI)/ml als ein generelles Chromosomfärbmittel zur Ermöglichung der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #4, #5 oder #8 für CFI und Satz #1 oder #2 für DAPI betrachtet.
Qualitative Resultate: TABELLE XII
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
*Keine Träger-DNA vorhanden.
CFI-markierte Sonden liefern eine gute Intensität mit einem genügenden Grad an Spezifizität.

BEISPIEL 9 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophorfluorescein-5-isothiocyanat (FITC)

Transaminierte DNA-Sonden (mittlere Länge 300 bp, 20% oder 4,6% aminierte Desoxycytosine), spezifisch für das menschliche Chromosom #7, wurden mit Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) konjugiert. Vierzig µg transaminierter DNA wurden getrocknet und dann in 244 µl von 50 mM Natriumborat, pH 9,3, resuspendiert. Sechs und ein Zehntel µl einer 50 mM Lösung von FITC in Dimethylsulfoxid (ein 50-facher Überschuß) wurde der transaminierten DNA zugesetzt. Diese Reaktion fand unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (annähernd 18 h) statt. Überschüssiges Fluorophor wurde von den markierten DNAs zunächst durch eine Ethanolniederschlagung getrennt. Das niedergeschlagene Material wurde in Wasser resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 28 cm geführt. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNAs vervollständigte die Reinigung. Absorptionsspektren der markierten Produkte zeigte, daß 2,2% der Gesamtnucleotide in der 5% (Gesamtnucleotide) aminierten DNA-Präparation markiert waren und daß 0,42% der Gesamtnucleotide in der 1,2% (Gesamtnucleotide) aminierten DNA-Präparation markiert waren.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Präparation von Chromosommetaphaseausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt waren, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmikroskopobjektträger von etwa 3 Fuß Höhe getropft, um die Kerne aufzubrechen. Vor Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in eine Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf Objektträgern angeordnet wurde (10 µl), war jeweils 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen an blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche Placental-DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurden, wurden variiert. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurden durch Erhitzen auf 70ºC während 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überflüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers während jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, danach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel plaziert (siehe Beispiel 1). Die Antibleichmittellösung enthielt gegebenenfalls 1,0 µg 4,6-diamidino-2-phenylindolhydrochlorid (DAPI)/ml als ein generelles Chromosomfärbmittel zur Ermöglichung der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #4, #5 oder #6 für FITC und Satz #1 oder #2 für DAPI betrachtet.
Qualitative Resultate: TABELLE XIII
Code: Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
FITC-markierte Sonden liefern sehr gute Spezifizität und Intensität, wenn der Markierungsgrad niedrig gehalten wird. Die Spezifizität ist gering, wenn der Markierungsgrad hoch ist.

BEISPIEL 10 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophor 7-Diethylaminocoumarin-3-carboxylsäuresuccinimidylester (DECCA)

Transaminierte DNA-Sonden (mittlere Länge 300 bp, 20% aminierte Desoxycytosine), spezifisch für das menschliche Chromosom 4, wurden mit 7-Diethylaminocoumarin-3-carboxylsäure-succinimidylester (DECCA) konjugiert. Vierzig µg transaminierter DNA wurden getrocknet und dann in 364 µl von 200 mM MOPS, pH 7,4, resuspendiert. Sechsunddreißig und vier Zehntel µl von 25 mM Lösung von DECCA in N,N-dimethylformamid (ein 150-facher molarer Überschuß) wurden der transaminierten DNA zugesetzt. Diese Reaktion fand unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (annähernd 18 h) statt. Überschüssiges Fluorophor wurde von den markierten DNAs zunächst durch eine Ethanolniederschlagung getrennt. Das niedergeschlagene Material wurde in Wasser resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 28 cm geführt. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNAs vervollständigte die Reinigung. Ein Absorptionsspektrum zeigte, daß 1,9% der Basen markiert waren. Dieses Verfahren liefert die DECCA-Sonde.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Präparation von Chromosommetaphaseausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt waren, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmikroskopobjektträger von etwa 3 Fuß Höhe getropft, um die Kerne aufzubrechen Vor Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in eine Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf Objektträgern angeordnet wurde (10 µl), war jeweils 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen an blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche Placental-DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurden, wurden variiert. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurden durch Erhitzen auf 70ºC während 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überflüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objekttragers während jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, danach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel plaziert (siehe Beispiel 1). Die Antibleichlösung enthielt gegebenenfalls 0,2 µg Propidiumiodid/ml als allgemeines Chromosomfärbmittel zur Ermöglichung der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #3 für DECCA und des Satzes #10 für Propidiumiodid verwendet. Es sei angemerkt, daß der Filtersatz #3 nicht besonders gut für DECCA geeignet ist und daß die beobachteten Intensitäten daher geringer als für einen Filtersatz erwartet werden, der besser an die spektralen Eigenschaften von DECCA angepaßt ist.
Qualitative Resultate: TABELLE XIV
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
DECCA-markierte Sonden können gute Spezifizität liefern, und zwar insbesondere, wenn Cot1 DNA verwendet wird, sowie eine vernünftige Intensität, selbst wenn ein nur schlecht angepaßter Filtersatz wie Satz #3 verwendet wird.

BEISPIEL 11 Markierung von transaminierten chromosomspezifischen DNA-Sonden mit dem Fluorophor-Tetramethylrhodamin-5-(und-6)- isothiocyanat (TRITC)

Transaminierte DNA-Sonden (mittlere Länge 300 bp, 20% aminierte Desoxycytosine), spezifisch für das menschliche Chromosom 7, wurden mit Tetramethylrhodamin-5-(und-6)-isothiocyanat (TRITC) konjugiert. Vierzig um transaminierter DNA wurden getrocknet und dann in 244 µl von 50 mM Natriumborat, pH 9,3, resuspendiert. Sechs und ein Zehntel µl von TRITC in Dimethylsulfoxid (ein 50-facher Überschuß) wurden der transaminierten DNA zugesetzt. Diese Reaktion fand unter Rühren in Dunkelheit bei Raumtemperatur über Nacht (annähernd 18 h) statt. Überschüssiges Fluorophor wurde von den markierten DNAs zunächst durch eine Ethanolniederschlagung getrennt. Das niedergeschlagene Material wurde in Wasser resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 28 cm geführt. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung der markierten DNAs vervollständigte die Reinigung. Ein Absorptionsspektrum zeigte, daß 3,4% der Basen markiert waren.
Diese Ausführungsform der Erfindung wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung konventioneller Methoden zur Präparation von Chromosommetaphaseausbreitungen getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt waren, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmikroskopobjektträger von etwa 3 Fuß Höhe getropft, um die Kerne aufzubrechen. Vor Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in eine Denaturierungslösung von 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung, die auf Objektträgern angeordnet wurde (10 µl), war jeweils 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7)/0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (benutzt als Träger). Die Konzentrationen an blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelte menschliche placental-DNA) und der Sonde, die der Basismischung zugesetzt wurden, wurden variiert. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurden durch Erhitzen auf 70ºC während 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel bedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überflüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers während jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, danach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel plaziert (siehe Beispiel 1). Die Antibleichlösung enthielt gegebenenfalls 1,0 µg 4,6-Diamidino-2-phenylindolhydrochlorid (DAPI)/ml als ein allgemeines Chromosomfärbmittel zum Ermöglichen der Visualisierung aller Chromosome. Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Filtersatzes #7 und #8 für TRITC und Satzes #1 oder #2 für DAPI betrachtet.
Qualitative Resultate: TABELLE XV
Code:
Spezifizierung: (-) kein Auftreten, (+) geringer Betrag an Spezifizität, (++) angemessene Spezifizität, (+++) gute Spezifizität, (++++) sehr gute Spezifizität.
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.
TRITC-markierte Sonden können sowohl Spezifizität als auch hohe Intensität liefern, selbst wenn die relativ stark markierten Sonden (3% der Gesamtnucleotide) verwendet werden.

BEISPIEL 12 Verwendung von Mehrfachfluoreszenz-markierten Reagenzien

Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt wurden, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Glasmikroskopobjektträger aus etwa 3 Fuß fallengelassen, um die Kerne aufzubrechen. Vor Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 min in einer Denaturierungslösung von 70% Formamid/ 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC gehalten. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert.
Die Hybridisierungsmischung wurde dann auf jedem Objektträger (10 µl), enthaltend zwei bis fünffluorophormarkierte Sonden, spezifisch für verschiedene Chromosompaare, und 50% Formamid/10% Dextransulfat/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) angeordnet. In einigen Experimenten enthielt die Mischung 0,5 µg ultraschallbehandelte Lachsspermen-DNA (verwendet als Träger). Die Konzentrationen an blockierender DNA (Cot1 DNA oder ultraschallbehandelter menschlicher Placental-DNA), die der Basismischung zugesetzt wurde, wurde variiert. Zehn µl der gesamten Hybridisierungsmischung wurde durch Erhitzen auf 70ºC während 5 min denaturiert und dann erlaubt, bei 37ºC während 1 h zu hybridisieren. Diese Mischung wurde dann direkt auf den Objektträger aufgebracht, mit einem Glasdeckel abgedeckt und erlaubt, über Nacht bei 37ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde überflüssige Sonde durch dreimaliges Waschen des Objektträgers während jeweils 15 min bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) entfernt, danach der Objektträger in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) während 15 min bei 45ºC, gefolgt von einem Waschen des Objektträgers in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40 Detergenz (NP40 ist Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Calbiochem, La Jolla, California) während 15 min bei 45ºC gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal für jeweils 2 min in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1 % NP40 Detergenz bei Raumtemperatur gewaschen und der Objektträger luftgetrocknet. 7,5 µl Antibleichlösung, verwendet zum Reduzieren der Rate an Fluorophorphotooxidation, wurde direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckel über dem Tropfen aus Antibleichmittel plaziert (siehe Beispiel 1). Der Objektträger wurde dann mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung verschiedener Filtersätze betrachtet, um die Emission von verschiedenen unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen zu differenzieren.
Die Kombinationen und Konzentrationen von markierten Sonden, die gleichzeitig in Hybridisierungen verwendet wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet. Jede Kombination von zwei, drei, vier oder fünf Sonden, die getestet wurde, ist in der Tabelle ohne Beabstandung aufgelistet. Einige Filtersätze ermöglichten, daß lediglich ein Fluorophor visualisiert wurde, während andere es ermöglichten, zwei Fluorophore gleichzeitig zu beobachten. Beispielsweise erlaubt der DECCA-Filtersatz (#3), die Beobachtung sowohl von DECCA- als auch CFI- markierten Sonden. Die DECCA- und CFI-gefärbten Chromosome können unterschieden werden, da der CFI-Filtersatz (#5 oder #6) die Visualisierung nur der CFI-gefärbten Chromosome erlaubt. Dies identifiziert dann, welches der beiden gefärbten Chromosompaare von Fluorescein resultiert und welches von DECCA-markierten Sonden resultiert, wenn man den DECCA-Filtersatz verwendet. Ebenfalls waren keine Filter erhältlich, um Tetramethylrhodamin von Rhodamin 101 Derivaten, Texas Rot und CXR individuell zu unterscheiden. Jedoch bei Verwendung von TRITC-Filtersatz #8 erscheinen die CTMR-Markierungen gelb-orange, während die CXR- und Texas Rot- Markierungen deutlicher rot erscheinen, wodurch eine visuelle Unterscheidung zwischen den zwei verschiedenen Färbungen ermöglicht wird. TABELLE XVI
Jede Mehrfachhybridisierung, die in der Tabelle aufgelistet ist, liefert ähnliche Resultate. Visuelle Prüfung der gefärbten Metaphasenausbreitungen zeigte, daß jede markierte Sonde spezifisch ein und nur ein Paar von Chromosomen färbte. Zusätzlich war jedes spezifisch gefärbte Paar von Chromosomen von anderen basierend auf der Färbung des durch die Färbung emittierten Lichtes unterscheidbar. Unter Verwendung der Filtersätze #2,3 (oder vorzugsweise 13), 5 (oder 6), 8 und 9 wurde es für möglich befunden, jeweils das Paar des Zielchromosoms von anderen zu unterscheiden.

BEISPIEL 13 Markierung von chromosomspezifischen DNA-Sondenvorläufern mit verschiedenen Fluorophoren

Transaminierte DNA-Sondenvorläufer, wie sie in den Beispielen 1 und 2 präpariert wurden (jeweils entsprechend eines von derartigen Sondensegmenten mit einer mittleren Länge von 300 bp mit von 1 bis 5% der Gesamtnucleotide hiervon an Desoxycytidinnucleotid aminiert), wobei jedes derartige Sondensegment spezifisch für ein individuelles menschliches Chromosom war, wurde mit einem von verschiedenen Amin-reaktiven Fluorophoren konjugiert. Die Konjugationsreaktionsbedingungen variierten entsprechend der Amino-reaktiven Funktionalität, die bei den Fluorophoren vorhanden war, der Reaktionspuffer war 50 mM (Millimolar) Natriumborat, pH 9,3. Für N-hydroxysuccinimidesterderivate von Fluorophoren war der Reaktionspuffer 200 mM MOPS, pH 7,4. 30 bis 100 µg aminierter DNA wurde in dem Reaktionspuffer gelöst und eine 20 mM Lösung des reaktiven Fluorophors zugesetzt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde dann kontinuierlich über Nacht in Dunkelheit bei Raumtemperatur gemischt. Die endgültige DNA-Konzentration in der Reaktionsmischung war 160 µg DNA/ml für Isothiocyanatreaktionen und 100 µg DNA/ml für N-Hydroxysuccinimidesterreaktionen. Die endgültigen Amin-reaktiven Fluorophorkonzentrationen waren 1,2 mM für Isothiocyanatderivate und 2,3 mM für N-Hydroxysuccinimidester. Die 20 mM Lösungen der Amin-reaktiven Fluorophore wurden durch Lösen des Fluorophors in einem nichtreaktiven aufschließenden Lösungsmittel wie Dimethylformamid (DMF) die Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Reaktionsbedingungen sind in der nachstehenden Tabelle XVII zusammengefaßt. TABELLE XVII Markierungsreaktionsbedingungen
a Fluorophor wird im spezifizierten Lösungsmittel bei einer Konzentration von 20 mM vor Zusatz des Fluorophorvorrats zum Reaktionspuffer enthaltend DNA gelöst.
b Basierend auf 20% Aminierung von dN's ist das molare Verhältnis von Fluorophor zu aminierter dC 50 für Isothiocyanatreaktionen und 150 für Sulfonsäurechlond- und N-Hydroxysuccinimidesterreaktionen.
Die markierten Sonden werden durch Ethanolniederschlagung der DNA und Gelpermeationschromatographie, wie folgt, gereinigt. Markierte DNA in den Reaktionsmischungen wurde niedergeschalgen durch Zusatz von 1/10tel Volumen von 2,6 M Natriumacetat, pH 5,4, und dem 2,5-fachen Volumen an Ethanol. Die resultierende Lösung wurde dann entweder in einem -20ºC-Kühler über Nacht oder in Trockeneis für 15 min ins Gleichgewicht gebracht, bevor die Lösung bei 7.800 xg für 10 min zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abgeschüttet und das markierte DNA-Pellet getrocknet und in etwa 300 µl Wasser resuspendiert. Die DNA-Lösung wurde dann auf eine Sephadex G-25-Säule (1 cm Durchmesser und 28 cm Höhe) gegeben, dann mit Wasser voräquilibriert und die gereinigte markierte DNA in dem Säulenaufnahmevolumen nach Elution mit Wasser gesammelt. Die markierte DNA wurde dann ein zweites Mal mit Ethanol niedergeschlagen, entweder direkt aus der Säulenlösung, die aus der Säule gesammelt wurde, oder nachfolgend einer Volumenreduktion in einem Zentrifugalverdampfer. Die niedergeschlagene, gereinigte, markierte DNA wurde dann in etwa 300 µl Wasser gelöst und bei -20ºC gefroren aufbewahrt.
Cascade Blue-Acetylazid CBAA ließ man dann mit der DNA reagieren und es wurde, wie vorstehend beschrieben, für N-Hydroxysuccinimidester gereinigt, außer daß der Reaktionspuffer 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 8,4, war, wie vom Hersteller empfohlen.
Die Anzahl von Markierungen, die pro Nucleotid für jede Sonde angebracht wurden, wurde durch die gleiche Methode bestimmt, wie sie in den vorstehenden Beispielen 3-11 verwendet wurde. Der Prozentsatz an innerhalb einer Sonde aminierten Nucleotiden wurde vor der Fluorophoranbindung durch enzymatische Digerierungs/FPLC-Chromatographiemethode, wie oben beschrieben, bestimmt. Der Prozentsatz an Nucleotiden, die nach dem Markieren an ein Fluorophor angebunden war, wurde aus dem Absorptionsspektrum unter Verwendung der Absorbanz bei 260 nm und der Absorbanz beim langwelligen Absorbanzmaximum des Fluorophoren bestimmt. Das Verhältnis der Absorbanz bei 260 nm zur Absorbanz bei dem langwelligen Absorbanzmaximum des unkonjugierten Farbstoffs wurde multipliziert mit der langwelligen Absorbanz des konjugierten und das Produkt subtrahiert von der Absorbanz bei 260 nm des konjugierten, um den Absorbanzbeitrag bei 260 nm aufgrund der DNA zu berechnen. Dieser adjustierte Absorbanzwert bei 260 nm wurde durch einen Absorbanzextinktionskoeffizienten durch 10.000 M&supmin;¹cm&supmin;¹ Nucleotid&supmin;¹ dividiert, um die Nucleotidkonzentration der Sonde in der Lösung zu erhalten. Das langwellige Absorbanzmaximum des konjugierten wurde durch den Extinktionskoeffizienten des Fluorophors dividiert, um die Fluorophorkonzentration im konjugierten zu erhalten. Der Prozentsatz an Nucleotiden, die am Fluorophoren in der Sonde angebunden war, wurde als das Verhältnis der Fluorophorkonzentration zur Nucleotidkonzentration multipliziert mit 100 berechnet. Hier ist eine gewisse Unsicherheit in den Werten der Extinktionskoeffizienten des Fluorophoren und der DNA ebenso wie beim Absorptionsverhältnis des unkonjugierten Fluorophoren vorhanden, da die Extinktionskoeffizienten des Fluorophoren durch Konjugation zur DNA geändert werden können. Auch sind die berechneten Markierungsprozentsätze manchmal höher als der Aminierungsprozentsatz aufgrund der Tatsache, daß die Sonden-DNA nicht vollständig frei von unkonjugierten Markierungen sein kann. Dies resultiert entweder, wenn die Markierung nicht kovalent an die DNA anbindet oder wenn der Farbstoff Aggregate bildet, die durch die Sephadex G-25- Säulen ausgeschlossen werden und in den Ethanollösungen mit der DNA niederschlagen. Die Anwesenheit von unkonjugierten Markierungen in der Sondenpräparation bedeutet nicht notwendigerweise, daß die Sonde sich in in situ-Hybridisierungen dürftig verhält.
In situ-Hybridisierungen der gesamten chromosomfärbenden Sonden wurden wie in den Beispielen 3-11 durchgeführt. Filtersätze, die verwendet wurden, um die fluoreszierend gefärbten Chromosome zu betrachten, sind in Tabelle V aufgeführt. Qualitative Resultate der Hybridisierungen, die gesamte Chromosomfärbungssonden verwenden, sind in bezug auf Spezifizität und Intensität der Färbungen von Chromosom 4 in der folgenden Tabelle XVIII gezeigt. TABELLE XVIII QUALITATIVE RESULTATE DER HYBRIDISIERUNGEN UNTER VERWENDUNG GANZER CHROMOSOM- FÄRBUNGSSONDEN
¹ Markierte Sonden werden durch den Fluorophornamen oder Abkürzung gefolgt durch die Anzahl der Chromosome bezeichnet, die durch die gesamte chromosomfärbende Sonde gefärbt werden (beispielsweise C4=Chromosom4).
² Der Prozentsatz der Gesamtnucleotide, die aliphatische Aminanbindunsgruppen erhalten, wird bebestimmt durch enzymatische Digestion und FPLC-Fraktionierung von Nucleosiden.
³ Der Prozentsatz der Gesamtnucleotide, der kovalent angebundene Fluorophore enthält, wird durch Absorbtionsspektroskopie bestimmt.
&sup4; Die Konzentration von markierter Sonde in der Hybridisierungslösung.
&sup5; Spezifizität ist wie folgt angegeben: (-)=kein Auftreten, (+)=geringes Auftreten von Spezifiziät. (++)=ausreichende Spezifizität, (+++)=gute Spezifizität und (++++)=sehr gute Spezifizität. Intensität wird angegeben als: (-)=nicht sichtbar, (+)=kaum sichtbar, (++)=befriedigend sichtbar, (+++)=hell und (++++)=sehr hell.
&sup6; Siehe Tabelle V.
Tabelle XVIII liefert einige qualitative Resultate von in situ-Hybridisierungen unter Verwendung von Fluorophoren, die in diesem Beispiel beschrieben und in Tabelle XVII gezeigt sind, die in Sonden vorhanden sind, die spezifisch an menschliches Chromosom #4 anbinden. Diese Resultate zeigen, daß alle diese Fluoreszenzmarkierungen markierte Sonden liefern, die visuell unter dem Mikroskop erkennbar sind und Spezifizität bezüglich Färbung des Chromosoms #4 zeigen. Die Resultate in Tabelle XVIII (18) zeigen auch, daß die Intensität und die Spezifizität der Färbung durch eine bezüglich Chromosom #4 markierte Sonde abhängig ist vom Grad der Sondenamination (und daher der Markierung). HCCA- und FCHA-markierte Sonden zeigen ähnliche Spezifizität, jedoch erhöhte Intensität, wenn die Sonde bis zu einem Grad von 3% relativ zu 1% aminiert ist. EITC-, FAP- und ErITC-markierte Sonden zeigen ähnliche Intensität bei beiden Aminierungsgraden, jedoch verminderte Spezifizität bei höheren Aminierungsgraden. Für gleiche Markierungen ist der optimale Aminierungsgrad auch abhängig von der Chromosombibliothek DNA. Beispielsweise verhielten sich FAP-markierte Sonden, spezifisch für Chromsom #1 und #7, besser bei 3% aminierten Sonden als bei 1% aminierten Sonden, im Gegensatz zu der für Chromosom #4 spezifischen Sonde, die sich besser bei 1% Amination verhielt (Ergebnisse nicht in der Tabelle dargestellt). Einige Variationen in der Spezifizität oder Klarheit grüner Fluorophorfärbungen wie bei FAP, FCHA und CFL wurden beobachtet, welche Variation größer als diejenige ist, die beispielsweise mit orangenen Fluorophoren wie etwa CTMR beobachtet wird.
Quantitative Analysen von gefärbten Metaphasenausbreitungen wurden durchgeführt, um die Abhängigkeit der Sondenfärbung vom Aminationsgrad für einige der markierten Sonden zu untersuchen. Die Resultate sind in Tabelle XIX aufgeführt. TABELLE XIX QUANTITATIVES VERHALTEN VON VERSCHIEDENEN MARKIERUNGEN BEI VERSCHIEDENEN SONDENAMINATIONSGRADEN
Analysen wurden durchgeführt, indem zunächst ein digitales Bild einer fluoreszenzgefärbten Metaphasenausbreitung unter Verwendung einer gekühlten CCD-Kamera (Photometrics, Tucson, Arizona, Series 200 camera) unter Zwischenschaltung eines Macintosh II fx Computers verwendet wurde. Bildverarbeitungssoftware (IP Labs, Signal Analytics, Vienna, Virginia) wurde verwendet, um getrennt die durchschnittliche Bildpixelintensität der spezifisch gefärbten Chromosome (spezifische Intensität), der verbleibenden Chromosome (nichtspezifische Intensität) und des Nichtchromosombereichs (Hintergrundintensität) zu bestimmen. Spezifizität wird betrachtet als das Verhältnis der spezifisch gefärbten Chromosomintensität zur nichtspezifisch gefärbten Chromsomintensität, entweder vor (Gesamtintensität/nichtspezifische Intensität) oder nach (Nutzintensität/nichtspezifische Intensität) Subtraktion der Hintergrundintensität.
Die Intensitäten und Spezifizitäten (Intensitätsverhältnisse), die in Tabelle XIX aufgelistet sind, zeigen verschiedene signifikante Trends. Im allgemeinen steigen die spezifischen Färbungsintensitäten mit ansteigendem Sondenaminierungsgrad und daher mit dem Prozentsatz der Markierung. Häufig erreicht der Anstieg bezüglich Intensität mit dem Aminierungsgrad einen Maximalwert und nimmt bei weiterem Anstieg des Aminierungsgrads ab. Die Spezifizitäten zeigen ebenfalls ein ähnliches Verhalten. Idealerweise würden Intensität und Spezifizität beim selben Aminierungsgrad maximal sein und dies würde den optimalen Aminierungsgrad für die spezielle Sonden-DNA und Markierung darstellen. Dies ist jedoch nicht immer der Fall und der optimale Aminierungsgrad muß als eine Abwägung zwischen Intensität und Spezifizität ausgewählt werden. Ein weiterer Faktor, der diese Werte beeinträchtigt, ist die Sondenkonzentration. Bei niedrigeren Konzentrationen wird die Spezifizität gewöhnlich verbessert, während die Intensität abnimmt. Einer Sonde, die eine Färbung mit hoher Intensität und eine geringe Spezifizität liefert, kann eine Absenkung der Sondenkonzentration nützen, um die Spezifizität zu verbessern. Wenn die Intensität der Sondenfärbung bereits niedrig ist, kann das Herabsetzen der Sondenkonzentration die Spezifizität verbessern, jedoch die Färbungsintensität auf einen nichtakzeptierbaren Wert reduzieren.
Die in Tabelle XIX aufgelisteten Zahlen reflektieren nur mittlere Intensitäten innerhalb eines Metaphasenbereichs. Intensitätsänderungen längs eines Chromosoms oder außerhalb von Chromosomen sind in diesen Berechnungen vernachlässigt. Daher kann die Spezifizität tatsächlich niedriger als durch die Mittelwerte angegeben sein. Beispielsweise kann eine Sonde für markiertes Chromosom #6 kleine Bereiche von Chromosomen anderer Art als #6 ebenso intensiv färben wie das Chromosom #6. Dies könnte eine kommerziell nichtakzeptable Spezifizität darstellen, jedoch würden die mittleren Intensitäten der nichtspezifisch gefärbten Chromosome aufgrund der Mittelung der hellen "Stellen" über die gesamten Chromosome niedrig sein und der Mangel an Spezifizität würde verfehlt. Daher müssen visuelle Beobachtungen von Hintergrund und Chromosomfärbung mit der digitalen Information betrachtet werden. Betrachtet man die digitale und visuelle Information, sind die optimalen Aminierungsgrade für die verschiedenen Sonden voraussichtlich etwa 3% für HCCA, CBAA, FCHA und DMBP und etwa 1% für EITC und ErITC, und zwar basierend auf den verfügbaren Daten. Dies sind sehr allgemeine Zahlen, da einige Chromosom-zu-Chromosom-Variationen in den optimalen Aminationsgraden beobachtet werden und diese Analysen nur auf der hier beschriebenen Laborarbeit beruhen.

Beispiel 14 Direktmarkierungssondenzusammensetzung spezifisch komplementär zum Centromerbereich des menschlichen Chromosoms #12

Eine klonierte DNA-Folge, von der bekannt ist, daß sie spezifisch komplementär zum Centromerbereich des menschlichen Chromosoms #12 ist (identifiziert als gereinigte plasmid-DNA-klonierte Sequenz #1-1 und einen 3,5 k bp Einsatz aufweisend und bekannt als DNA-wiederholte Sequenzen enthaltend). Diese Sequenz wurde in schmale Fragmente von etwa 300 Basispaaren durch Ultraschallbehandlung unter Verwendung eines Branson Sonifier 450 (Danbury, CT) zerkleinert. DNA von der Plasmidpräparation wurde in 2 ml Wasser bei einer Konzentration von 500 µg/ml ultraschall behandelt. Die Lösung war enthalten in einem 5 ml Polypropylenröhrchen, das in ein Trockeneis/Ethanolbad getaucht war, um während der Ultraschallbehandlung ein Kochen zu verhindern. Die Mikrospitze der Ultraschalleinrichtung wurde in diese Lösung eingetaucht, bis die Spitze 2-5 mm vom Boden des Röhrchens entfernt war. Ultraschallbehandlung wurde mit einer Ausgangsleistung von 25-30 Watt diskontinuierlich mit einem 80%igen Arbeitszyklus (während 80% der Zeit eingeschaltet, während 20% der Zeit ausgeschaltet) während einer Periode von 5-7 min durchgeführt. Der Ultraschallbehandlung folgend wurde die DNA durch den Zusatz von 0,2 ml von 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 4,5 ml Ethanol niedergeschlagen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren während 5 min bei 8.000 x g aufgenommen und vakuumgetrocknet.
Um einen Bisulfitpuffer herzustellen, wurden 1,7 ml konzentrierter HCl langsam zu 1 ml deionisiertem H&sub2;O auf Eis zugesetzt. 1 ml frisches Ethylendiamin (Sigma Cat. #E-4379) wurde dann langsam auf Eiszugesetzt. Nach Auflösung des Ethylendiamins wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 0,475 g Natriummetabisulfit (Aldrich Cat. #25, 555-6) zugesetzt. Konzentrierte HCl wurde dann langsam der Bisulfitmischung zugesetzt, bis der pH-Wert 7,0 erreichte und das Volumen der Lösung wurde auf 5,0 ml eingestellt.
Zum Transaminieren der Sonden-DNA wurde 1 mg ultraschallbehandelter DNA in 500 µl Wasser resuspendiert. Die DNA wurde durch Kochen bei 100ºC für 5 min denaturiert und dann schnell in einem Eiswasserbad abgeschreckt. Die Transaminationsreaktion wurde durch Zusatz von 4,5 ml Bisulfitpuffer initiiert. Die Reaktion in Bisulfitpuffer fand während 2 Tagen bei 37ºC statt. Die DNA-Lösung wurde durch Routinedialyse gegen 5-10 mM Natriumboratpuffer (pH 8,0) entsalzt. Nach Dialyse wurden 0,6 ml 3M Natriumacetat (pH 5,5) zugesetzt. Die aminierte DNA wurde mit 2 Volumen Ethanol niedergeschlagen und nach Zentrifugieren bei 8.000 x g für 10 min aufgenommen. Die Pellets wurden vakuumgetrocknet und in 1 ml Wasser resuspendiert.
Der Umfang der Transaminierung des Desoxycytidins wurde bestimmt durch enzymatische Digestion der aminierten DNA, gefolgt durch Separation der resultierenden Nucleotide durch ein FPLC-Chromatographie system, wie in Beispiel 2 beschrieben. Diese Analyse zeigte, daß 3,4% der Gesamtnucleotiden oder 13,6% der Desoxycytidine transaminiert waren.
Vierzig µg aminierter DNA-Sequenz 1-1, erhalten von menschlichem Chromosom #12, wurde in einem 2 ml Röhrchen getrocknet, dann in 362 µl 0,20 M MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure), pH 7,4, resuspendiert. Die Fluoreszenzverbindung 5-(und-6)-carboxytetramethylrhodamin (CTMR)-succinimidylester wurde in Dimethylformemid zu 30 mM gelöst. Ein 150-facher molarer Überschuß des Fluorphoren relativ zu den intermediären transminierten Nucleotiden (angenommen 5% der Gesamtnucleotide sind transaminiert) wurden der DNA zugesetzt, in diesem Fall 37,9 µl von 30 mM CTMR. Diese Markierungsreaktion fand in Dunkelheit bei Raumtemperatur in dem rotierenden Röhrchen über Nacht statt.
Die Reinigung der markierten Sonde bezüglich des Fluorophorüberschusses fand in drei Schritten statt. Der erste Schritt war eine Ethanolniederschlagung. Irgendwelches verbleibendes Ethanol wurde aus dem niedergeschlagenen Pellet verdampft, dann die Sonde in 300 µl Wasser resuspendiert. Diese Lösung wurde dann über eine Sephadex G-25-Säule, 28 cm hoch und 1 cm Durchmesser, geführt. Die gewünschte Fraktion (das Säulenaufnahmevolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu reduzieren. Eine zweite Ethanolniederschlagung vervollständigte die Reinigung und das getrocknete Pellet wurde in 300 µl Wasser resuspendiert. Ein Absorptionsspektrum der markierten Probe zeigte, daß 3,3% der Gesamtnucleotide markiert war.

Beispiel 15 Detektion des Centromerbereichs von Chromosom #12 durch in situ- Hybridisierung

Die Sondenzusammensetzung des vorhergehenden Beispiels 14 wurde verwendet, um den Centromerbereich des menschlichen Chromosom #12 wie folgt zu identifizieren (detektieren):
Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die behandelt wurden, um die Zellen in Metaphase zu halten. Diese Zellen wurden auf einen Mikroskopobjektträger aus einer Distanz von etwa 2 bis 3 Fuß fallengelassen, um die Kerne aufzubrechen und die Chromosome zu exponieren. Nichtaufgebrochene und Zwischenphasenzellen waren ebenfalls auf der Objektträgeroberfläche vorhanden. Vor Hybridisierung wurde der Objektträger in eine denaturierende Lösung bestehend aus 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat, pH 7,0, für 2 min bei 70ºC angeordnet. Der Objektträger wurde dann durch Hindurchführen durch eine 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert. Der Objektträger wurde dann auf etwa 40ºC erwärmt.
Die Hybridisierungsmischung, die auf jeden Objektträger aufgebracht wurde, bestand jeweils aus 55% Formamid/10% Dextransulfat/0,15 M NaCl/15 mM Natriumcitrat, pH 7,0. Die Konzentrationen an zu der Basishybridisierungsmischung zugesetzten Sonde variierten, um die optimale Konzentration zu bestimmen, die zum Erhalten von akzeptabler Signalintensität und -spezifiziät benötigt werden. Die Reaktionsmischung enthielt ebenfalls 4,5 µg von ultraschallbehandelter menschlicher placentaler DNA, zugesetzt als Träger, und blockierender DNA. Zusätzlich zu der unmarkierten menschlichen placentalen DNA wurden etwa 96 ng fluoresceinmarkierter, ultraschallbehandelter menschlicher placentaler DNA als genomische Gegenfärbung zugesetzt. Zehn µl der vollständigen Hybridisierungsmischung wurde durch Erhitzen auf 70ºC im Bereich von 5 bis 15 min denaturiert und dann bei 37ºC für 5 min inkubiert. Die Mischung wurde direkt auf den Objektträger aufgegeben, mit einem Glasdeckel abgedeckt, dessen Kanten durch einen Gummizement abgedichtet waren, und erlaubt, über Nacht bei 42ºC in einem Feuchtraum zu hybridisieren.
Am nächsten Tag wurde die ungebundene Sonde durch Waschen des Objektträgers (dreimal, jeweils für 15 min bei 45ºC) in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat, 50% Formamid v/v, pH 7,0, entfernt. Ein einzelnes Waschen (15 min bei 45ºC) in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (2XSCC, pH 7,0) folgte. Das endgültige Waschen (15 min bei 45ºC) geschah in 0,1 M Natriumphosphat/0,1% NP40 Detergenz (PN-Puffer). Schließlich wurde der Objektträger zweimal in PN-Puffer (2 min bei Raumtemperatur) gewaschen und luftgetrocknet. Zehn µl Antibleichmittel wurde über den Zielzellen angeordnet und ein Deckel hierüber plaziert. Die Objektträger wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop angesehen.
Resultate sind in der nachstehenden Tabelle XX aufgelistet: TABELLE XX
(1) Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ausreichend sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell, (NE) kann nicht bewertet werden
(2) Spezifizität: (-) nicht augenscheinlich, (+) niedrige Spezifizität; (++) befriedigende Spezifizität, (++++) gute Spezifizität, (NE) kann nicht bewertet werden
(3) Blockierende DNA vorhanden (4,5 µg menschlicher Placental-DNA/10µl)
Auf der Basis der obigen Resultate wird geschlossen, daß die direkte Anlagerung des Fluorophors an der Alphoid-DNA-Sonde von Beispiel 14 eine Sondenzusammensetzung erzeugt, die ohne weiteres zur in situ- Hybridisierungsanalyse von spezifischen Centromeren verwendet werden kann.

Beispiel 16 Direktmarkierungssondenzusammensetzung spezifisch komplementär zum Centromerbereich des menschlichen Chromosoms #8

Eine klonierte DNA-Sequenz, von der bekannt ist, daß sie spezifisch komplementär zum Centromerbereich des menschlichen Chromosoms #8 ist (identifiziert als gereinigte Plasmid-DNA klonierte Sequenz (10-4).
Die DNA-Sequenz des Plasmids 10-4 wurde durch Fermentation hergestellt. Bakterien enthaltend das Plasmid 10-4 wurden auf eine YT- Agarplatte enthaltend 200 µg/ml Ampicillin aufgebracht. Eine einzelne Kolonie von dieser Platte wurde in 2 ml von 2 YT-Brühe überführt und über Nacht unter Rühren bei 30ºC wachsengelassen. Diese Bakteriensuspension diente als Keimvorrat für den Fermentationsprozeß. Fermentation führte zu einer Zelimasse von 204 g. Extraktion von 122 g dieses Pellets führte zu 60 mg von Plasmid-DNA. 1 mg der DNA-Folge des resultierenden Plasmids 10-4 wurde ultraschallbehandelt. 1 mg dieser ultraschallbehandelten DNA wurde in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Die DNA wurde durch Kochen während 5 min denaturiert und auf Eis schnell abgekühlt.
9 ml Bisulfitpuffer wurden zugesetzt und eine Transaminierungsreaktion, wie in Beispiel 14 beschrieben, erfolgte während 2 Tagen bei 37ºC. Das resultierende DNA-Produkt wurde durch Routinedialyse gegen 10 mM Natriumborat (pH 8,0) entsalzt. Die resultierende DNA wurde durch Zusatz von 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 2,5 Volumen Ethanol niedergeschlagen und die niedergeschlagene DNA wurde in Wasser einer Konzentration von 1 mg/ml resuspendiert.
Vierzig µg der resultierenden aminierten DNA-Sequenz 10-4 zum Centromer des Chromosoms #8 wurde in einem 2 ml Röhrchen getrocknet und dann in 362 µl 0,20 M MOPS (3-[N-Morpholino]-propansulfonsäure), pH 7,4, resuspendiert. Die fluoreszierende Verbindung 5-(und-6)-carboxytetramethylrhodamin (CTMR)-succinimidylester wurde in Dimethylformamid zu 30 mM gelöst. Ein 150-facher molarer Überschuß dieses Fluorphoren wurde zu der aminierten DNA zugesetzt, in diesem Falle 37,9 µl von 30 mM CTMR. Diese Markierungsreaktion fand in Dunkelheit bei Raumtemperatur in rotierendem Röhrchen über Nacht statt.
Die Reinigung der markierten Sonde gegenüber überschüssigem Fluorophor wurde anschließend in drei Schritten vorgenommen. Der erste Schritt war eine Ethanolniederschlagung. Irgendwelches verbleibendes Ethanol wurde von dem niedergeschlagenen Pellet verdampft, worauf die Sonde in 300 µl Wasser resuspendiert wurde. Diese Lösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule, 28 cm hoch und 1 cm Durchmesser, geführt. Die gewünschte Fraktion (der Säulenaufnahmeraum) wurde mit Wasser eluiert und zum Reduzieren des Gesamtvolumens getrocknet. Eine zweite Ethanolniederschlagung vervollständigte die Reinigung und das getrocknete Pellet wurde in 300 µl Wasser resuspendiert. Ein Absorptionsspektrum der resultierenden Direktmarkierungssondenzusammensetzung zeigte, daß 3,1% der Gesamtnucleotide markiert war.

Beispiel 17 Detektion des Centromerbereichs von Chromosom #8 durch in situ- Hybridisierung

Die Sondenzusammensetzung des vorhergehenden Beispiels 16 wurde verwendet, um den Centromerbereich des menschlichen Chromosoms #8 wie folgt zu identifizieren (detektieren):
16 ng der Direktmarkierungssondenzusammensetzung von Beispiel 16 wurde in einem 0,5 ml Röhrchen mit einer dichtschließenden Kappe getrocknet. Die Sonde wurde in 10 µl von 55% Formamid/10% Dextransulfat/ 0,15 M NaCl/15 mM Natriumcitrat, pH 7,0, resuspendiert, wobei 4,5 µg ultraschallbehandelter menschlicher placentaler DNA als Blocker zugesetzt wurde. Diese Hybridisierungsmischung wurde durch Anordnen des Röhrchens in einem 70ºC warmen Wasserbad während 5 min denaturiert.
Ein Zielobjektträger, der wie in Beispiel 15 präpariert wurde, wurde während 3 min in einer 70ºC warmen Lösung von 70% Formamid/2XSSC denaturiert und dann durch aufeinanderfolgendes Hindurchführen durch ein 70%iges, 85%iges und 100%iges Ethanolbad (jeweils 2 min) dehydratisiert. Ein Tropfen dieser vorher denaturierten Hybridisierungsmischung wurde auf den Objektträger pipettiert und dann der Tropfen mit einem Deckel bedeckt. Der Deckel war auf dem Objektträger mit Gummizement abgedichtet. Die Hybridisierung fand über Nacht im Dunkeln im Feuchtraum bei 37ºC statt.
Am nächsten Tag wurde die restliche ungebundene Sonde durch Waschen des Objektträgers (dreimal, jeweils 15 min bei 45ºC) in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat, pH 7,0, entfernt. Ein einzelnes Waschen (15 min bei 45ºC) in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (2XSSC, pH 7,0) folgte. Der Objektträger wurde als nächstes in 0,1 M Natriumphosphat/0,1% NP40 Detergenz (PN-Puffer) (15 min bei 45ºC) gewaschen. Schließlich wurde der Objektträger zweimal in PN-Puffer (2 min bei Raumtemperatur) gewaschen und luftgetrocknet. 7,5 µl von 1 µg/ml DAPI in einer Antibleichlösung wurde über den Zielzellen plaziert und hierüber ein Deckel angeordnet.
Die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle XXI tabelliert: TABELLE XXI Resultate der In Situ-Hybridisierung mit Fluorophor- Direktmarkierungssonde
Tabelle X Fußnoten:
(1) Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ausreichend sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell, (NE) kann nicht bewertet werden
(2) Spezifizität: (-) nicht augenscheinlich, (+) niedrige Spezifizität; (++) befriedigende Spezifizität, (++++) gute Spezifizität, (NE) kann nicht bewertet werden
(3) Blockierende DNA vorhanden (4,5 µg menschlicher Placental-DNA/10µl)
Basierend auf den oben angegebenen Resultaten wurde geschlossen, daß die so erzeugte Direktmarkierungsondenzusammensetzung zur Verwendung von in situ-Hybridisierungsaufzählungen von spezifischen Chromosomcentromeren unter Verwendung von Fluoroskopanalyse gut geeignet sind.

Claims

1. Direkt markierende Sondierungszusammensetzung zum Einfärben von DNA in einem Chromosom oder einem Chromosombereich, umfassend Mehrfach-DNA-Segmente komplementär zu verschiedenen Abschnitten besagten, zu erkennenden Chromosoms oder Chromosombereichs, dadurch gekennzeichnet,

(i) besagte DNA-Segmente fluoreszierende Mehrfachmarkierer, die kovalent mit in den DNA-Segmenten enthaltenen Cytosinbasen verknüpft sind, umfassen, und

(ii) etwa 0,3 bis 6,0 Mol-% der gesamten Nucleotidbasen in den DNA-Segmenten fluoreszierend markiert sind.

2. Sondierungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die DNA- Segmente eine durchschnittliche Länge von etwa 150 bis etwa 600 bp aufweisen.

3. Sondierungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die fluoreszierenden Markierungen kovalent mit den DNA-Segmenten über transaminierte Cytosinstellen verknüpft sind.

4. Verfahren zur Herstellung eines Reagenz zur in situ Erkennung eines Chromosoms, umfassend ein

(a) Auseinanderreißen von DNA komplementär zu dem zu detektierenden Chromosom oder Chromosombereich in Fragmente,

(b) Transaminieren besagter DNA-Fragmente und

(c) kovalentes Verknüpfen eines fluoreszierenden Farbstoffs mit den transaminierten DNA-Fragmenten, wobei etwa 0,3 bis etwa 6,0 Mol- % der gesamten Nucleotidbasen in den DNA-Fragmenten fluoreszierend markiert sind.

5. Verfahren zum in situ Erkennen eines Chromosoms oder eines Chromosombereichs, umfassend ein

(a) Kontaktieren besagter Sondierungszusammensetzung von Anspruch 1 mit besagtem, zu erkennenden Chromosom oder Chromosombereich unter Hybridizierungsbedingungen und

(b) Detektieren der An- oder Abwesenheit des fluoreszierenden Signals, das durch besagte Sondierungszusammensetzung nach besagtem Kontaktieren erzeugt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei besagte Sondierungszusammensetzung von Anspruch 1 durch Hinzufügen eines Überschusses an blokkierenden DNA blockiert wird.

7. Verfahren zum Detektieren einer Vielzahl von Chromosomen oder Chromosombereichen, umfassend ein

(a) Bereitstellen einer Sondierungszusammensetzung für jedes zu detektierende Chromosom oder jeden zu detektierenden Chromosombereich besagter Vielzahl, wobei jede Sondierungszusammensetzung aus einer Vielzahl von DNA-Segmenten zusammengesetzt ist, die spezifisch jedes zu detektierende Chromosom oder jeden zu detektierenden Chromosombereich besagter Vielzahl bindet, wobei etwa 0,3 bis etwa 6,0 Mol-% der gesamten Nucleotidbasen in den DNA-Segmenten fluoreszierend markiert sind, und wobei jede besagte Sondierungszusammensetzung mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Markierung markiert ist, und jede fluoreszierende Markierung in Anwesenheit der anderen Markierung(en) detektierbar ist,

(b) Kontaktieren besagter Sondierungszusammensetzungen unter Hybridisierungsbedingungen mit besagten Chromosomen oder Chromosombereichen, die zu detektieren sind, und

(c) Detektieren der An- oder Abwesenheit des durch die fluoreszierend markierten DNA-Segmente, die an besagte Chromosome oder Chromosombereiche, die zu detektieren sind, erzeugten Fluoreszenzsignals.

8. Direkt markierende Sondierungszusammensetzung zum Detektieren der Anwesenheit durch Hybridisierung von DNA nach Anspruch 1, umfassend eine einzelne vorselektierte chromosomale Größe eines Multichromosomgenoms, wobei die chromosomale Größe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einem ganzen Chromosom und (b) einen Chromosombereich, umfassend

(a) eine Mischung aus verschiedenen DNA-Segmenten, die aus den DNA-Sequenzen erhalten sind, die besagte vorselektierte chromosomale Größe umfaßt, und die komplementär zu DNA-Segmentabschnitten sind, die in besagten DNA-Sequenzen auftreten, wobei besagte DNA-Segmente eine durchschnittliche Größe im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 Basenpaaren haben,

(b) wobei besagte DNA-Segmente auf etwa 1 bis etwa 30 Mol-% der gesamten Desoxycytidin-Nucleotide hiervon mit bifunktionalen Verbindungsgruppen substituiert sind, und

(c) wobei wenigstens etwa 10 Mol-% aller besagter, so substituierter Verbindungsgruppen zusätzlich kovalent an eine Fluorophorgruppe gebunden sind, so daß individuelle derartige Fluorophorgruppen, die DNA-Segmente enthalten, an besagte komplementäre DNA-Segmentabschnitte zum Erreichen eines im wesentlichen vollständigen Einfärbens besagter DNA-Sequenzen hybridisierbar sind.

9. Sondierungszusammensetzung nach Anspruch 1, die sich in Mischung mit einer blockenden DNA-Zusammensetzung befindet, die eine Mischung von verschiedenen DNA-Segmenten enthält, die aus insgesamt genomischen DNA besagten Genoms erhalten wurden, wobei besagte DNA-Segmente eine durchschnittliche Größe im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 Basenpaaren haben.

10. Sondierungszusammensetzung nach Anspruch 8, wobei besagte bifunktionale Verbindungsgruppe durch folgende Formel charakterisiert ist:

wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe von Hälften bestehend aus

wobei R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und niedrigem Alkylrest,

m und n jeweils unabhängig eine ausgewählte ganze Zahl von 1 bis 6 einschließlich sind und

p die ganze Zahl 0 oder 1 ist, und

wobei jede Hälfte

an einem unterschiedlichen besagten Desoxycytidin-Nucleotid gebunden und jede Hälfte -X- kovalent an die Fluorophorgruppe angebunden ist, die ein Radikal enthält, das mit -X- reagiert hat, indem eine kovalente Bindungsbildung resultiert.

11. Sondierungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei besagte fluoreszierende Markierer ein Derivat einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe sind, die aus 7-Amino-4-methylcoumarin-3-essigsäuresuccinimidylester, Texasrot-Sulfonylchlorid, 5-(und 6-)-Carboxy-X-rhodaminsuccinimidylester, Lissaminrhodamin-B-sulfonylchlorid, 5-(und 6-)Carboxyfluoresceinsuccinimidylester, Fluorescein-5-isothiocyanat, 7-Diethylaminocoumarin-3-carboxylsäuresuccinimidylester, Tetramethylrhodamin-5- (und -6-)isothiocyanat, 5-(und 6-)Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester, 7-Hydroxycoumarin-3-carboxylsäuresuccinimidylester, 6-[Fluorescein-5-(und-6-)carboxamido]capronsäuresuccinimidylester; 5,7-Dimethyl-BODIPY -propionsäuresuccinimidylester; "aktivierte Fluoresceinderivate" FAP, Eosin-5-isothiocyanat, Kaskadenblau-Acetylizid und Erythrosin-5-isothiocyanat besteht.

12. Sondierungszusammensetzung nach Anspruch 8, wobei jede besagte Fluorophorgruppe an besagte Verbindungsgruppe über eine reaktive Gruppe gebunden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Succinimidylestern, Sulfonsäurechloriden, Acetylaziden und Isothiocyanaten, wobei jede besagte Fluorophorgruppe einen Extinktionskoeffizienten von wenigstens etwa 6000 M&supmin;¹cm&supmin;¹ in dem Wellenlängenbereich des Extinktionslichts, das auf die Probe fällt, und auch eine Quantenausbeute von wenigstens etwa 0,02 besitzt.

13. Verfahren zur Herstellung eines Reagenz nach Anspruch 4, das die in einer einzelnen vorselektierten chromosomalen Größe ausgewählt aus (a) einem ganzen Chromosom und (b) einem Chromosombereich enthaltene DNA färbt, wobei besagtes Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Fragmentieren einer Vielzahl von Ausgangs-DNA-Sequenzen, die aus der DNA erhalten wurden, die in besagter vorselektierter chromosomaler Größe vorhanden ist, in eine Mischung aus Segmenten, wobei besagte DNA-Segmente eine durchschnittliche Größe im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 Basenpaaren besitzen;

(b) Transaminieren besagter Segmente mit einer bifunktionalen Verbindungsgruppe, wobei eine von deren beiden funktionalen Substituenten mit Desoxycytidin-Nukleotiden reaktiv ist, wobei besagtes Transaminieren in einem wässrigen Medium durchgeführt wird, das darin einen Alkalimetallbisulfatkatalysator gelöst hat und einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,5 aufweist, wobei besagtes wässriges Medium auf einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 60ºC gehalten wird, bis etwa 1 bis etwa 30 Mol-% der gesamten in den Segmenten existierenden Desoxycytidin-Nukleotide durch eine der besagten funktionalen Substituenten substituiert ist, wodurch transaminierte Segmente erzeugt werden; und

(c) kovalentes Anbinden an den zweiten verbleibenden funktionalen Substituenten von wenigstens einigen der besagten so transaminierten verbindenden Verbindungen einer fluoreszierenden Verbindung, die sowohl wenigstens einen Fluorophorsubstituenten und auch einen reaktiven Substituenten enthält, der mit besagtem zweiten funktionalen Substituenten reaktiv ist, wobei besagtes kovalentes Anbinden durch Kontaktieren besagter so transaminierter Segmente unter wässriger Flüssigphasenbedingung mit einem wesentlichen molaren Überschuß besagter fluoreszierender Verbindung vorgenommen wird, während eine Temperatur im Bereich von etwa 4 bis etwa 50ºC aufrechterhalten wird.

14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) besagte Chromosome oder Chromosombereiche in zytologischem Material enthalten sind, das als anhaftende Schicht auf einer Oberfläche eines Objektträgers verteilt ist,

(b) besagtes Kontaktieren durch Anwenden einer wässrigen Lösung besagter Sondierungszusammensetzung auf besagte Probe unter hybridisierenden Bedingungen vorgenommen wird,

(c) besagtes Separieren durch Waschen besagter resultierender Probe mit einer wässrigen Flüssigkeit vorgenommen wird, und

(d) besagtes Detektieren mit einem Fluoreszenzmikroskop vorgenommen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) besagte Chromosome oder Chromosombereiche in einer wässrigen Suspension enthaltend besagte Chromosome oder Chromosombereiche enthalten sind,

(b) besagtes Kontaktieren durch Lösen besagter Sondierungszusammensetzung in besagter Suspension vorgenommen wird,

(c) besagtes Separieren durch Zentrifugieren vorgenommen wird, und

(d) besagtes Detektieren mit einem Durchflußzytometer vorgenommen wird.

16. Hybridisierungszusammensetzung umfassend

(a) etwa 2 bis etwa 200 ng/µl einer direkt markierenden Sondierungszusammensetzung gemäß Anspruch 1,

(b) 0 bis etwa 80% (v/v) eines Denaturierungsmittels,

(c) etwa 5 bis etwa 15 % (w/v) eines Hybridisierungsgeschwindigkeitsbeschleunigers,

(d) etwa 5 bis etwa 100 Millimol Puffersalz,

(e) etwa 0,05 bis etwa 1 Mol Hybridstabilisierersalz,

(f) etwa 0 bis etwa 1 µg/µl einer blockierenden DNA und

(g) Rest Wasser.