DE69228529T2

DE69228529T2 - Herstellung von chromosomenregion spezifischen dns-sequenzen und transaminierung

Info

Publication number: DE69228529T2
Application number: DE69228529T
Authority: DE
Inventors: Michael Bittner; Kenneth Cruickshank; Clarissa Prorok; Lucy Stols
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1992-09-21
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2012-09-22
Also published as: DE69228529D1; WO1993006246A1; EP0558732B1; JP3469238B2; JPH07505044A; EP0558732A1; ATE177154T1

Description

Die Erfindung betrifft klonierte DNA-Sequenzen, welche spezifisch komplementär zu ausgewählten Zielregionen innerhalb individueller Chromosome eines typischerweise multi-chromosomalen Genoms sind, Prozesse zum Herstellen derselben, Prozesse, um aus diesen Sonden herzustellen, und die Verwendung solcher Sonden.
Sonden mit DNA-Sequenzen, welche komplementär zu einer chromosomal spezifischen Alphoid-DNA sind, sind bekanntermaßen als Numerierer bei in situ-Hybridisierungsproben nützlich. Die bekanntesten Verfahren des Standes der Technik zur Präparation von Alphoid-DNA-Sequenzen verwenden denselben Weg zum Isolieren der Alphoid-DNA-Sequenzen. Eine auf physikalischen Merkmalen basierende Anreicherung einer repetitiven DNA wird verwendet, aus dem angereicherten Pool wird DNA kloniert, und individuelle Klone aus dem angereicherten Pool werden individuell auf Verwendbarkeit bei in situ-Hybridisierungsproben analysiert. Das Durchsuchen eines solchen Pools hat sich als ein ineffizientes und unzuverlässiges Verfahren zum Erhalten einer Sequenz mit einer hohen chromosomalen Spezifität für ein vorbestimmtes Chromosom erwiesen. Das erste derartige Projekt zum Erhalten einer klonierten Alphoid-DNA verwendete die Schwimmdichte von Alphoid-DNA, um einen angereicherten Pool mit DNA-Sequenzen herzustellen. (Siehe Manuelidis, L., et al. in Chromosoma 66 : 23-32 (1978)). Dieser Weg wird in dem Flußdiagramm zusammengefaßt, welches in der selbsterklärenden Fig. 1 dargestellt ist. Andere Projekte zum Erhalten von Alphoid-DNA-Klonen haben die Verteilung der DNA-Restriktions-Schnittstellen oder die schnelle Renaturierung von Alphoid-DNA im Vergleich zu nicht repetitiven Spezien im Genom als Basis für die Erstellung angereicherter Pools mit Alphoid-DNA genutzt. (Siehe Yang, T. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 6593-6597 (1982), und Moyzis, R. K., et al., Chromosoma 95 : 375-386 (1987)). Jedoch sind diese Verfahren von sich aus relativ ineffizient und nicht gut für die schnelle kommerzielle Entwicklung von Numerier-Sonden geeignet.
Ebenso waren die Sonden des Standes der Technik, welche aus solchen Sequenzen präpariert wurden indirekte Label-Sonden, so daß eine Verarbeitung nach der Hybridisierung erforderlich war, um einen Hybridnachweis zu erreichen, im Gegensatz zu den direkten Label-Sonden, welche beispielsweise nur einen einzigen Sondendurchdringungsschritt bei einer auf einem Glasträger angeordneten Probe während der in situ- Hybridisierung benötigen. Indirekte Label-Sonden benötigen die erfolgreiche Diffusion in die auf einem Glasträger angeordnete Probe der verschiedenen Protein-Reagenzien (Antikörper, Avidine, Enzyme und dergleichen) während eines mehrschrittigen Verfahrens zur in situ-Hybridisierung.
Verfahren des Standes der Technik zum Labeln derartiger Chromosomen des Standes der Technik, welche regional spezifische, komplementäre DNA-Sequenzen aufweisen, machen Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Anzahl von Label-Anteilen, welche an den individuellen Sequenzen angefügt sind.
Verbesserte DNA-Segmente, welche komplementär zu spezifischen, chromosomalen, repetitiven DNA-Segmenten sind, welche in einer speziellen chromosomalen Region vorliegen, wie z. B. Alphoid-DNA in einem spezifischen Chromosom, so wie eine verbesserte Methodik, um aus diesen direkt gelabelte Sonden herzustellen, wären sehr nützlich. Die vorliegende Erfindung stellt sowohl derartige Segmente als auch derartige Methodiken zur Verfügung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung schafft (a) eine neue und sehr nützliche Klasse klonierter DNA-Sequenzen, welche repetitive DNA-Segmente enthalten und welche spezifisch komplementär zu vorgewählten Regionen individueller Chromosome eines Genoms sind, welches typischerweise multi-chromosomal ist, sowie (b) Verfahren zum Herstellen und zum Konvertieren derselben zu Sonden-Kompositionen, insbesondere chaotrope Transanimierung.
Die Erfindung vermeidet das Problem, eine große Anzahl von Klonen, die aus einem großen Pool abgeleitet wurden, individuell zu testen, und sie verbessert die Kapazität zum Herstellen spezifischer Sequenzen, welche komplementär zu einem gewünschten, vorgewählten Chromosom sind.
Insbesondere schafft die Erfindung in einer Ausführungsform (a) eine Methodik zum Herstellen individueller klonierter DNA-Sequenzen, welche repetitive DNA-Segmente enthalten und welche komplementär zu sequentiellen DNA-Sequenzen sind, welche nur in einer ausgewählten Region eines ausgewählten Chromosoms eines multi-chromosomalen Genoms vorliegen, sowie (b) die so hergestellten klonierten DNA-Sequenzen. Diese Methodik verwendet spezifische Kombinationen von:
(a) enzymatische Amplifikation einer DNA-Matrize, welche DNA-Sequenzen aufweist, die zusammen ein ausgewähltes, einzelnes, vollständiges Startchromosom eines multichromosomalen Genoms aufweisen, wobei als Primer synthetisierte Oligonukleotide verwendet werden, von denen bekannt ist, daß sie zusammen und repetitiv innerhalb von oder zwischen benachbarten repetitiven DNA-Segmenten existieren, welche in einer ausgewählten Region einer derartigen Chromosomen-Matrize vorhanden sind;
(b) Herstellen und Probenehmen von Klonkolonien, wobei entweder die derart enzymatisch amplifizierten repetitiven DNA-Segmente oder repetitive DNA-Segmente verwendet werden, die von Genom-DNA nach ihrer Identifizierung abgetrennt wurden, wobei eine Hybridisierung unter Verwendung von Sonden erfolgt, die mit den derart enzymatisch amplifizierten repetitiven DNA-Segmenten gebildet wurden; und
(c) Hybridisierung von Sonden, die durch das Labeln als Probe entnommener, kultivierter und extrahierter, kolonieabgeleiteter Vektor-DNA-Sequenzen mit ausgewählten Proben von Genom-DNA-Zielsequenzen gebildet wurden.
Aus den resultierenden Hybriden wird wenigstens eine individuelle klonierte DNA-Sequenz ausgewählt, welche eine Vielzahl von Kopien wenigstens eines repetitiven DNA-Segmentes enthält, das in einer DNA-Sequenz oder in DNA-Sequenzen auftritt und zu dieser komplementär ist, die in der einen ausgewählten Region des ausgewählten, einzelnen Startchromosoms enthalten ist oder sind. Jede ausgewählte, klonierte DNA-Sequenz wird dann kultiviert, um eine Vielzahl von Replikaten aus dieser herzustellen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung eine neue Klasse klonierter DNA-Sequenzen zur Verfügung, wobei jede hergestellte Sequenz, wie oben erwähnt, komplementär zu einer vorbestimmten Region eines vorgewählten Chromosoms ist. Ebenso enthält jede solche Sequenz wenigstens ein repetitives DNA-Segment, welches in einer solchen Region auftritt.
Diese neuen, klonierten und replizierten komplementären DNA- Sequenzen können gelabelt werden, um neue und nützliche Sonden für Hybridisierungsproben von Mustern herzustellen, bezüglich derer eine karyotypische Information erwünscht ist. Allgemein können Sonden, welche aus diesen klonierten DNA-Sequenzen hergestellt sind, als Sonden auf Basis repetitiver Sequenzen klassifiziert werden.
Bei einer anderen Ausführung stellt die vorliegenden Erfindung eine Methodik zur Verfügung, um nützliche Zwischenprodukte für die Herstellung einer direkten Label-Sonden-Komposition herzustellen. Die Methodik verwendet als Startmaterialien (1) wenigstens eine Start-DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Lehre, (2) Kupplungsgruppen-Verbindungen und (3) Verbindungen mit Fluorophorgruppen. Diese Methodik zum Herstellen von Sonden-Kompositionen verwendet vorzugsweise eine Kombination von:
(a) Fragmentieren der Start-DNA-Sequenz(en) in DNA- Segmente;
(b) Transaminieren der DNA-Segmente, um Kupplungsgruppen in diese einzufügen; und
(c) kovalentes Binden von Fluorophorgruppen an die so eingefügten Kupplungsgruppen.
Bei einem vorliegenden Verfahren zum Transaminieren ist die Kupplungsverbindung difunktionell. Eine ihrer funktionellen Anteile ist eine Aminogruppe, die andere eine Gruppe, welche mit einer anderen in der fluoreszierenden Startverbindung vorliegenden reaktiven Gruppe reagiert. Dieses Verfahren zum Transaminieren wird unter Bedingungen einer wässrigen flüssigen Phase, bei Raumtemperatur und in Anwesenheit eines Hydrogensulfit-Katalysators ausgeführt. Die kontrollierte Transaminierung der Desoxycytidin-Nukleotide, welche in den ausgewählten regionalen DNA-Sequenzen und/oder in deren Fragmenten vorliegt, wird im wesentlichen ohne eine andere Veränderung der Sequenzstruktur oder des komplementären Charakters erreicht, so daß die resultierenden transaminierten Polynukleotide ihre Fähigkeit zum Hybridisieren zu komplementären Ziel-DNA-Sequenzen beibehalten, welche in den Segmenten in der ausgewählten chromosomalen Region eingebaut sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue Technik zum Transaminieren zur Verfügung gestellt, bei welcher Polynukleotide in einem Einzelstrang-Zustand während eines solchen Prozesses zur Transaminierung verbleiben. Diese Technik macht sich die Anwesenheit von chaotropen Trihalogenacetat-Anionen in dem mit Hydrogensulfit katalysierten wässrigen Reaktionsmedium zusammen mit den Reaktionsteilnehmern zu Nutze. Solche chaotropen Anionen induzieren und erhalten teilweise eine nukleotide Sequenzdenaturierung, wie sie während der Transaminierung erwünscht ist, ohne eine Kristallisation der Reaktionsteilnehmer zu induzieren und ohne mit den Reaktionsteilnehmern zu reagieren. Diese Technik ist ebenfalls aus dem Grunde vorteilhaft, da sie die Synthese relativ großer Mengen transaminierter DNA-Sequenzen und/oder -Segmente gestattet, falls dies erwünscht ist, ohne die hohen Kosten und die geringe Verläßlichkeit der enzymatischen Label-Verfahren des Standes der Technik.
Eine Klasse neuer und sehr nützlicher transaminierter DNA- Segmente wird durch das erwähnte Verfahren der chaotropen hydrogensulfitkatalysierten Transaminierung hergestellt.
Kompositionen direkter Label-Sonden, insbesondere jener, welche aus einer solchen neuen Klasse chaotrop transaminierter Segmente präpariert wurden, zeigen eine exzellente Hybridisierungskapazität, und die hergestellten Hybride weisen dabei eine ausgezeichnete Fähigkeit zur Erzeugung starker Signale auf.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transaminieren eines Polynukleotids zur Verfügung, welches wenigstens ein Desoxycytidin-Nukleotid pro Molekül enthält, unter Bedingungen einer wässrigen flüssigen Phase in Gegenwart eines Hydrogensulfit-Katalysators und einer reaktiven Verbindung, welche eine Aminogruppe aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Transaminierung in Gegenwart eines gelösten chaotropen Trihalogenacetat-Anions durchgeführt wird, während eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 60º C und ein pH im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,5 beibehalten werden.
Die frühere Veröffentlichung Genomics 7, (1990) 257- 262; Abstract; Seite 257 beschreibt die Isolierung von DNA- Sonden durch enzymatische Amplifikation; es ist nicht offenbart, eine hydrogensulfitkatalysierte Transaminierung in Gegenwart eines Chaotrops durchzuführen.
Die früheren Anmeldungen EP-A-0 511 750 und WO-A-92/05185 sind keine Vorveröffentlichungen, jedoch sind sie aufgrund der Bestimmungen des Artikels 54(3) EPÜ zu berücksichtigen. Diese Anmeldungen beziehen sich ebenfalls auf Zusammenstellungen von DNA-Sonden, jedoch wird die hydrogensulfitkatalysierte Transaminierung gemäß der vorliegenden Erfindung nicht beschrieben.
Die frühere Veröffentlichung Biochemical and Biophysical Research Communications 170 (1990), Seite 243 beschreibt eine hydrogensulfitkatalysierte Transaminierung, jedoch nicht in Gegenwart eines Chaotrops in der Art und Weise der vorliegenden Erfindung.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Zu den Zeichnungen:
Fig. 1 ist ein Flußdiagramm, welches das auf der Schwimmdichte basierende Zentrifugenverfahren des Standes der Technik zum Herstellen einzelner Klone einer chromosomenspezifischen Alphoid-DNA darstellt;
Fig. 2A und 2B zeigen zusammen ein Flußdiagramm, welches das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Herstellen einzelner Klone repetitiver chromosomenspezifischer DNA-Sequenzen veranschaulicht;
Fig. 3 ist ein Flußdiagramm, welches verschiedene Verfahren zum Labeln repetitiver DNA-Sequenzen veranschaulicht, welche durch die vorliegende Erfindung hergestellt wurden, um Sonden zu bilden, wobei sich eines dieser Verfahren das erfinderische Verfahren zu Nutze macht, welches die Transaminierung der Sequenz mit einer Kupplungsverbindung und einem Hydrogensulfit beinhaltet; und
Fig. 4, 5 und 6 sind jeweils Photomikrographien, welche Chromosomen darstellen, die mit einer direkten Label-Sonden-Komposition hybridisiert wurden, welche mit Fluorophorgruppen gelabelte, regionalspezifische DNA-Segmente umfaßt, die durch das Ausführen dieser Erfindung hergestellt wurden.

Detaillierte Beschreibung

(A) Definitionen

Der Begriff "Sequenz" bezieht sich auf eine Kette oder eine miteinander verbundene Serie von DNA-Nukleotiden.
Die Begriffe "Fragment", "Segment" oder "DNA-Segment" bezeichnen im allgemeinen nur einen Anteil eines größeren DNA-Polynukleotids oder einer DNA-Sequenz, wie sie z. B. in einem Chromosom oder in einer Region desselben auftritt. Ein Polynukleotid kann beispielsweise in eine Mehrzahl Segmente aufgebrochen oder fragmentiert werden.
Der Begriff "repetitives DNA-Segment" betrifft die Tatsache, daß ein bestimmtes DNA-Segment oder zumindest ein ähnliches Segment, mehrmals (d. h. wenigstens zweimal) in einer bestimmten DNA-Sequenz oder in einer bestimmten Mehrzahl von DNA-Sequenzen auftritt. Individuell kann die Größe von DNA-Segmenten und/oder von repetitiven DNA-Segmenten stark variieren. Beispielsweise wird angenommen, daß im Falle des Humangenoms jedes repetitive DNA-Segment typischerweise in einer Größenordnung von etwa 5 bis etwa 3000 bp auftritt. Anschaulich kann eine einzelne Alphoid-DNA-Se quenz wenigstens etwa fünf verschiedene verschiedene repetitive DNA-Segmente beinhalten. Bekanntermaßen umfaßt ein Chromosom in charakteristischer Weise Regionen, welche DNA- Sequenzen enthalten, die repetitive DNA-Segmente umfassen. Kleine sequentielle Variationen in individuellen Segmentwiederholungen können möglicherweise auftreten; siehe z. B. Waye, J. S. et al., Molecular and Cellular Biology 6: 3156-3165 (1986).
Der Begriff "Genom" bezeichnet oder benennt den gesamten Satz einer einzelnen Kopie genetischer Instruktionen für einen Organismus, wie er in der DNA des Organismus codiert ist. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ist das spezielle betrachtete Genom typischerweise multi-chromosomal, so daß eine solche DNA zellulär über mehrere individuelle Chromosomen verteilt ist (wobei die Zahl beim Menschen z. B. 22 Paare plus einem geschlechtsassoziierten XX-Paar oder einem XY-Paar beträgt).
Bei der Ausführung dieser Erfindung ist das involvierte Genom in jedem Moment vorzugsweise von einem Primat, und die DNA-Sequenzen, welche die repetitiven DNA-Segmente aufweisen, sind vorzugsweise alphoid, oder sie sind mit den Centromeren eines Chromosomtypus assoziiert. So wie sie hier verwendet werden, haben die Begriffe "alphoid" oder "Alpha- Satellit" mit Bezug auf die DNA eine Beziehung zur komplexen Familie von repetitiven DNA-Segmenten in Tandemanordnung, welche in Genomen von Primaten gefunden werden. Lange Tandemanordnungen von Alpha-Satellit-DNA, welche auf einer Monomer-Wiederholungslänge von etwa 171 Basenpaaren basieren, sind hauptsächlich an den Centromeren der Primatenchromosome angeordnet.
Der Begriff "Chromosom" bezieht sich auf den die Erbmasse enthaltenden Genträger einer lebenden Zelle, welcher von Chromatin abgeleitet ist und DNA sowie Proteinkomponenten (speziell Histone) aufweist. Vorliegend wird das konventionelle, international anerkannte, individuelle Identifikationssystem für die Numerierung der Chromosome des Humangenoms verwendet. Die Größe eines individuellen Chromosoms kann von einem Typ zu einem anderen mit einem gegebenen multi-chromosomalen Genom und von einem Genom zu einem anderen variieren. Im Falle des (bevorzugten) Humangenoms ist die gesamte DNA-Masse eines gegebenen Chromosoms gewöhnlich größer als etwa 100 Mio. bp. Beispielsweise beträgt die Größe des gesamten Humangenoms etwa 3 · 10&sup9; bp. Das größte Chromosom, Chromosom Nr. 1, umfaßt etwa 2,4 · 10&sup8; bp, während das kleinste Chromosom, Chromosom Nr. 22, etwa 5,3 · 10&sup7; bp umfaßt (Yunis, J. J. in Science 191 : 1268-1270 (1976), und Kavenoff, et al. in Cold Spring Harbor Symposia on Qualitative Biology 38 : 1-8 (1973)).
Der Begriff "Region" bezeichnet einen Abschnitt, welcher repetitive DNA-Segmente aufweist, die vorzugsweise alphoid oder mit Centromeren assoziiert sind. Die tatsächliche physikalische Größe oder das Ausmaß einer solchen individuellen Region kann in großem Maße variieren. Eine exakte Quantifizierung einer solchen Region kann bis jetzt nicht für alle möglichen Regionen angegeben werden. Gewöhnlich ist eine Region wenigstens groß genug, um mindestens eine DNA- Sequenz zu umfassen, die (a) eine Mehrzahl von Kopien von wenigstens einem repetitiven DNA-Segment beinhaltet und welche (b) identifizierbar und vorzugsweise durch fluoroskopische, mikroskopische Beobachtung nach der Ausbildung von Fluorophor-Label-Hybriden in einer solchen Region numerierbar ist, nachfolgend einem in situ-Hybridisierungs verfahren mit einer direkten Label-Sonde oder Sonden-Komposition. Die derzeit erhältliche Information schlägt vor, daß eine Region mehr als eine einzelne dieser DNA-Sequenzen aufweist, wobei jede dieser DNA-Sequenzen eine oder mehrere repetitive DNA-Segmente umfaßt. Jede DNA-Sequenz, welche in einer Region auftritt, kann typischerweise von etwa 70.000 bis etwa 20 Mio. bp umfassen, wobei eine vorliegende bevorzugte regionale DNA-Sequenzgröße schätzungsweise im Bereich von etwa 80.000 bis etwa 225.000 bp liegt und wobei die vorliegend am meisten bevorzugte regionale DNA-Sequenzgröße schätzungsweise im Bereich von etwa 100.000 bis etwa 200.000 bp liegt. Jedoch können größere und kleinere DNA- Sequenzen in einer einzelnen Region eines Chromosoms auftreten.
Der Begriff "Region" bezeichnet typischerweise und in charakteristischer Weise ein Chromosom-Fragment, welches eine geringere DNA-Masse oder -Größe aufweist als die gesamte DNA-Masse oder -Größe eines gegebenen Chromosoms. Wie bekannt ist, ist nicht die gesamte DNA eines gegebenen Chromosoms einer Chromosomregion in Form von DNA-Sequenzen angeordnet, die repetitive DNA-Segmente enthalten oder aus diesen aufgebaut sind. Eine Region kann beispielsweise eine Größe aufweisen, welche bei etwa 2 · 10&sup6; bp bis etwa 40 · 10&sup6; bp liegt, wobei dieser Größenbereich beispielsweise die Centromere des menschlichen Chromosoms umfaßt. Eine solche Größe ist somit ein wesentlicher Bruchteil der Größe eines einzelnen menschlichen Chromosoms. Eine solche Regiongröße wird vorliegend bei der Ausübung der Erfindung als Regiongröße bevorzugt, wenngleich auch größere und kleinere Regionen verwendet werden können. Eine centromere Region von selbst einem kleinen menschlichen Chromosom ist ein Abschnitt des Chromosoms, welcher in mikroskopisch sichtbarer Größe vorliegt, und eine Region, welche repetitive DNA-Segmente (nicht alphoid oder centromer) am Y-Chromosom umfaßt, besetzt den Großteil des Chromosoms und ist mikroskopisch sichtbar.
Im allgemeinen ist der Begriff "Region" nicht definitiv für ein spezielles Gen (oder für mehrere Gene), da eine "Region" nicht in spezifischer Weise die speziellen Codierungssegmente (Exons) eines individuellen Gens berücksichtigt. Vielmehr ist eine "Region" wie hier mit Bezug auf ein Chromosom verwendet, für ein gegebenes Chromosom, aufgrund der speziellen, darin festgelegten DNA-Segmente für die vorliegende Ausbildung einer Sonden-Komposition und die Verwendungszwecke, einzigartig.
Der Begriff "Centromer" bezieht sich auf eine hetero-chromatische Region des eukaryotischen Chromosoms, wobei dies der chromosomale Anheftungspunkt des Kinetochors ist. Das Centromer teilt sich unmittelbar bevor die replizierten Chromosomen sich trennen und hält somit die gepaarten Chromatiden zusammen.
Der Begriff "Gen" bezeichnet oder benennt eine DNA-Sequenz entlang einem Chromosom, welches für ein funktionelles Produkt codiert ist (entweder RNA oder sein Translations-Produkt, ein Polypeptid). Ein Gen umfaßt eine Codierungsregion und enthält Regionen, die der Codierungsregion vorangehen und dieser folgen ("Leader" bzw. "Trailer" genannt). Die Codierungsregion umfaßt eine Mehrzahl von Codierungssegmenten ("Exons") und intervenierender Sequenzen ("Introns") zwischen den individuellen Codierungssegmenten.
Der Begriff "Sonde" oder "Sonden-Komposition" bezieht sich auf ein Polynukleotid oder eine Mischung von Polynu kleotiden, wie z. B. auf eine DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen oder auf ein DNA-Segment oder DNA-Segmente, welche mit individuellen, labelaufweisenden Anteilen chemisch kombiniert (d. h. assoziiert) sind. Jedes dieser Polynukleotide einer Sonde liegt zu dem Zeitpunkt der Hybridisierung zu einem Ziel typischerweise als Einzelstrang vor.
Der Begriff "Label" oder "labelaufweisender Anteil" betrifft in einem allgemeinen Sinn einen Anteil, wie z. B. ein radioaktives Isotop oder eine Gruppe, welche dergleichen aufweist, sowie nichtisotopische Label, wie z. B. Enzyme, Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin, lumineszierende Agentien, Farbstoffe, Haptene ("haptens") und dergleichen. Lumineszierende Agentien können in Abhängigkeit der Anregungsenergiequelle als radiolumineszierend, chemolumineszierend, biolumineszierend und photolumineszierend (oder fluoreszierend) klassifiziert werden.
Bevorzugte Sonden-Kompositionen, welche aus den hier zur Verfügung gestellten chromosomalen Bereichssequenzen erstellt sind, enthalten DNA-Segmente, welche chemisch an labelaufweisende Anteile gebunden sind. Jeder labelaufweisende Anteil umfaßt wenigstens eine (fluoreszierende) Fluorophorgruppe, und jeder labelaufweisende Anteil ist von einer monofunktionellen, einen Rest aufweisenden und ebenso eine Fluorophorgruppe enthaltenden fluoreszierenden Startverbindung abgeleitet. Eine solche Fluorophorgruppe ist kovalent an eine Kupplungsgruppe gebunden, welche ihrerseits entsprechend der vorliegenden Lehre zu einem DNA-Segment transaminiert wird.
Der Begriff "direkte Label-Sonde" (oder "direkte Label-Sonden-Komposition") bezeichnet oder benennt eine Nuklein säure-Sonde, deren Label nach der Bildung eines Hybrids mit einem Ziel ohne weitere reaktive Verarbeitung des Hybrids nachweisbar ist. Konventionell beinhaltet eine direkte Label-Sonde entweder eine Fluorophorgruppe oder ein Radioisotop als individuellen Label-Anteil.
Der Begriff "indirekte Label-Sonde" (oder "indirekte Label- Sonden-Komposition") bezeichnet oder benennt eine Nukleinsäure-Sonde, deren Label nach der Bildung eines Hybrids mit einem Ziel weiter in einer nachfolgenden Verarbeitung mit einer oder mehreren Reagenzien umgesetzt werden muß, um mit ihnen einen oder mehrere Anteile zu assoziieren, welche letztlich im Ergebnis eine nachweisbare Einheit bilden.
Der Begriff "Ziel", "DNA-Ziel" oder "DNA-Zielregion" betrifft wenigstens eine Nukleotidsequenz, wie etwa eine DNA-Sequenz oder ein DNA-Segment, wobei diese insgesamt oder in einem Bereich komplementär zu und hybridisierbar mit der Nukleotidsequenz oder den Nukleotidsequenzen einer gegebenen Sonde ist. Jede solche Sequenz bzw. Region liegt zum Zeitpunkt der Hybridisierung typischerweise als Einzelstrang vor. Wenn die Ziel-Nukleotidsequenzen nur in einer einzelnen Region oder in einem Bruchteil eines gegebenen Chromosoms lokalisiert sind, wird gelegentlich der Begriff "Zielregion" verwendet. Wenn ein gegebenes Muster oder eine Probe nur im Verdacht steht, eine oder mehrere dem Ziel komplementäre Nukleotidsequenzen mit Bezug auf eine Sonden-Komposition aufzuweisen, wird ein allgemeiner Begriff, wie etwa "Ziel" oder "Zielzusammensetzung" gelegentlich verwendet.
Der Begriff "Hybrid" bezieht sich auf ein Produkt eines Hybridisierungsvorganges zwischen einer Sonde und einem Ziel. Typischerweise ist ein Hybrid ein Molekül, welches einen Bereich aufweist, der als Doppelstrang in Helix-Konfiguration vorliegt, und der komplementär gepaarte Einzelstrang-Moleküle, wie etwa zwei DNA-Moleküle, aufweist, von denen eines eine Ziel-DNA-Nukleotidsequenz und das andere eine gelabelte DNA-Nukleotidsequenz einer Sonde ist.
Der Begriff "fluoreszierend" (und äquivalente Begriffe) bezieht sich allgemein auf die Eigenschaft eines Stoffes (wie etwa eines Fluorophors) Licht zu produzieren, während er mit Strahlungsenergie, wie etwa ultraviolettem Licht oder Röntgenstrahlen, beaufschlagt wird.
Der Begriff "fluoreszierende Verbindung" oder "Fluorophorgruppe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich allgemein auf einen organischen Anteil. Eine fluoreszierende Verbindung ist in der Lage, mit einer Kupplungsgruppe zu reagieren, und eine Fluorophorgruppe kann bereits reagiert haben.
Der Begriff "Kupplungsverbindung" oder "Kupplungsgruppe" bezieht sich auf einen hydrocarbonhaltigen Anteil. Eine Kupplungsverbindung ist in der Lage mit einem Nukleotid (oder einer Nukleotidsequenz) zu reagieren, und eine Kupplungsgruppe kann bereits reagiert haben. Eine Kupplungsverbindung ist ebenfalls in der Lage mit einer fluoreszierenden Verbindung zu reagieren, und eine Kupplungsgruppe kann bereits reagiert haben.
Der Begriff "in situ-Hybridisierung" bezieht sich auf eine Hybridisierung und vorzugsweise auf den Nachweis einer Sonde bezüglich eines Ziels, welches innerhalb der zytolo gischen oder histologischen Probe existiert. Als Ergebnis des Vorgangs einer in situ-Hybridisierung, werden Hybride zwischen einer Sonde (oder einer Sonden-Komposition) und einem Ziel oder Zielen erzeugt. Der Begriff "in situ-Hybridisierung" kann hier ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis eines Hybrids oder einer Sonde beinhalten, welches nach der Hybridisierung einer Sonde zu einem Ziel ausgeführt wird. Eine Probe kann als Schicht auf einer Glasträgeroberfläche anhaften, und ein Muster kann beispielsweise individuelle Chromosomen oder chromosomale Regionen aufweisen oder aus diesen bestehen, welche so behandelt wurden, daß sie ihre Morphologie unter z. B. Denaturierungskonditionen und Konditionen, die typischerweise während des Ablaufs zytomerer Analysen im Anschluß an die Hybridisierung einer Probe zu einem Ziel existieren, beibehalten.
Der Begriff ",in situ-Hybridisierung" kann die Verwendung eines Gegenfärbemittels beinhalten. Im Falle der erfindungsgemäßen gelabelten Fluorophor-Sonden oder -Sonden- Komposition kann das Nachweisverfahren Fluoreszenz-Mikroskopie, Fließzytometrie und dergleichen enthalten.
Der Begriff "Hybridisierungsbedingungen" nimmt allgemein Bezug auf die Kombinationen der Bedingungen, welche bei einem gegebenen Hybridisierungsverfahren zur Herstellung von Hybriden einsetzbar sind, wobei derartige Bedingungen typischerweise eine kontrollierte Temperatur, eine flüssige Phase und ein Inkontaktbringen der Sonde (oder der Sonden-Komposition) und einer Zielkomposition beinhalten. Geeigneterweise und vorzugsweise geht wenigstens ein Denaturierungsschritt einem weiteren Schritt voraus, bei dem eine Sonde oder eine Sonden-Komposition mit einem Ziel in Kon takt gebracht wird. Alternativ kann eine Sonde mit einer Probe in Kontakt gebracht werden, welche eine DNA-Zielregion aufweist, wobei beide zusammen Denaturierungsbedingungen unterworfen werden, wie sie von Bhatt et al. in Nucleic Acids Research 16 : 3951-3961 beschrieben sind. Die Anwesenheit eines Agens oder von Agenzien, welche eine Erniedrigung der Temperatur bewirken, die für die Denaturierung und die nachfolgende Hybridisierung zwischen der Sonde (oder der Sonden-Komposition) und einem Ziel erforderlich ist, ist allgemein erwünscht, wobei Formamid das derzeit am meisten bevorzugte Agens ist. Verwendet man beispielsweise eine Mischung aus Wasser und Formamid in einem Gewichtsverhältnis von etwa 50 : 50, so wird beispielsweise eine Temperatur für die thermische Denaturierung im Bereich von etwa 35 bis etwa 70 ºC verwendet, über Zeiten, welche beispielsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Minuten liegen, und die Temperatur zum Inkontaktbringen und für die Hybridisierung zwischen der Sonde (oder der Sonden-Komposition) und dem Ziel liegt beispielsweise im Bereich von etwa 35 bis 55 ºC über Zeiten, welche beispielsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 16 Stunden liegen. Andere Hybridierungsbedingungen können eingesetzt werden. Das Verhältnis der Anzahl von Sonden zur Anzahl von Zielsequenzen oder -segmenten kann stark variieren; je höher jedoch dieses Verhältnis ist, um so höher ist im allgemeinen die Wahrscheinlichkeit einer Hybridbildung unter Hybridisierungsbedingungen innerhalb dieser Grenzen.
Der Begriff "kohlenstoffarm", welcher hier mit Bezug auf eine individuelle Verbindung, Gruppe oder einen Rest verwendet wird, bedeutet, daß eine solche Verbindung, Gruppe oder ein solcher Rest weniger als sechs Kohlenstoffatome aufweist.
Der Begriff "klonieren" oder ähnliche Begriffe betreffen den Vorgang, bei dem ein spezielles Nukleotid-Segment oder eine spezielle Nukleotid-Sequenz in einen geeigneten Vektor eingeführt wird, der Vektor daraufhin in eine Wirtszelle transportiert wird und der Vektor in der Wirtszelle daraufhin veranlaßt wird, sich selbst in einem Kulturprozeß zu reproduzieren, wobei zahlreiche Kopien eines jeden Vektors und der von ihm getragenen Nukleotid-Sequenzen hergestellt werden. Das Klonieren führt zur Bildung einer Kolonie oder eines Klons (d. h. Gruppe) identischer Wirtszellen, wobei jede eine oder mehrere Kopien eines Vektors enthält, der ein spezielles Nukleotid-Segment oder eine spezielle Nukleotid-Sequenz enthält. Das Nukleotid-Segment oder die Nukleotid-Sequenz wird nun als "kloniert" bezeichnet, und die Produkte der Nukleotid-Segmente oder -Sequenzen können als "Klone" bezeichnet werden.
Der Begriff "Bibliothek" wird hier in seinem herkömmlichen Sinne verwendet, um auf einen Satz klonierter DNA-Fragmente zu verweisen, welche zusammen ein vollständiges Genom oder ein spezifisches Fragment desselben repräsentieren, wie z. B. ein einzelnes Chromosom. Im Stand der Technik sind verschiedene Bibliotheken bekannt und aus verschiedenen Depots erhältlich, und Techniken zum Präparieren von Genomen und Genomfragmenten, aus welchen Bibliotheken kloniert werden, sind gut bekannt. Derzeit ist als Verfahren bevorzugt, ein ausgewähltes Chromosom zu fragmentieren, welches durch eine Fließsortierung oder dergleichen separiert wurde. Eine Fragmentierung vor dem Klonieren wird vorzugsweise durch einen Verdauungsprozeß mit Restriktions-Endonukleasen oder dergleichen erreicht. Dieser Vorgang stellt Fragmentenden her, welche insbesondere für das Einfügen in Vektoren geeignet sind. Jedoch werden die Fachleute erkennen, daß be liebige konventionelle oder geeignete Techniken zur Fragmentierung verwendet werden können. Die Fragmente werden dann in konventioneller Weise kloniert, um Chromosomen-Bibliotheken zu erzeugen.

(B) Startmaterialien

(1) Die Start-Oligonukleotide

Geeigneterweise und vorzugsweise wird wenigstens ein Oligonukleotid beim Herstellen einer regional spezifischen, klonierten DNA-Sequenz gemäß dieser Erfindung verwendet. Jedes dieser Oligonukleotide ist zu einem Ort in einer DNA-Sequenz komplementär, welcher in einer vorgewählten Region eines Chromosoms auftritt und welcher etwa zwischen benachbarten, in diesen vorgewählten Regionen auftretenden repetitiven DNA-Segmenten, lokalisiert ist. Wenngleich ein einziges Oligonukleotid ausreichend ist, so ist doch eine Mischung aus Oligonukleotiden mit wenigstens zwei kurzen strukturell verschiedenen (d. h. oligomer) gemeinsamen repetitiven DNA-Segmenten, welche repetitive DNA-Segmente binden (d. h. beenden), die bezüglich einer vorgewählten Region eines gegebenen Chromosoms spezifisch sind, derzeit bevorzugt.
Für individuelle menschliche Chromosome sind die Strukturen solcher degenerierter (d. h. synthetisierbarer) gemeinsam auftretender Oligonukleotid-Segmente, welche in einer solchen DNA-Sequenz auftreten allgemein bekannt, sowie Verfahren zu deren Identifizierung. Siehe beispielsweise Koch J. E., et al., Chromosoma 98 : 259-265 (1989). Typischerweise können geeignete synthetisierte Oligonukleotide, welche zu derartigen repetitiven DNA-Segmenten komplementär sind, etwa 17 bis etwa 50 bp enthalten und vorzugsweise etwa 15 bis etwa 30 bp; jedoch können größere sowie kleinere Oligonukleotide hergestellt und verwendet werden, wenn dies erwünscht ist.
Die bekannten Identifizierungsverfahren können ohne weiteres zur Identifizierung von repetitiven DNA-Segmenten verwendet werden, welche in einer gegebenen Region eines Chromosoms vorhanden sind, wie etwa in der Centromerregion einer Alphoid-DNA, in beliebigen multi-chromosomalen Genomen, wie es für Fachleute ohne weiteres verständlich sein wird. Aus einer solchen Identifizierung können die erwünschten komplementären Oligonukleotid-Segmente abgeleitet und für ein gegebenes Chromosom synthetisiert werden. Die gesamte Nukleotid-Struktur der DNA-Sequenz, in welcher derartige repetitive DNA-Segmente natürlicherweise auftreten, müssen nicht bekannt sein und sind in der Tat normalerweise nicht bekannt, was für Fachleute verständlich sein sollte.
Sobald abgeleitet (d. h. identifiziert), werden die Oligonukleotide ohne weiteres unter Verwendung konventioneller und kommerziell erhältlicher Vorrichtungen und Verfahren zum Erzeugen von Nukleotid-Sequenzen synthetisiert. Siehe beispielsweise M. H. Caruthers, in Science, 281-285 (1985). Eine derzeit bevorzugte Vorrichtung zum Synthetisieren von DNA ist das "Applied Biosystems Model 38D H DNA Synthesizer", welcher kommerziell von Applied Biosystems (Foster City, Ca) erhältlich ist. Eine solche Vorrichtung wurde für die Synthese der Start-Oligonukleotide für die vorliegend beschriebenen Beispiele verwendet.

(2) Die chromosomale Start-DNA-Matrize

Die chromosomalen Start-DNA-Matrizen-Sequenzen, welche bei der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden, umfassen DNA aus einem vorgewählten ganzen Chromosom (eines multichromosomalen Genoms), wobei eine vorgewählte Region auftritt. Diese DNA-Matrize liegt typischerweise in Form einer Mehrzahl DNA-Sequenzen vor, welche zusammengenommen eine Multiplizität aus DNA-Segmenten aufweisen, die individuell an verschiedenen Orten in und überall bei derartigen Chromosomen auftreten und welche sinnvollerweise repräsentativ für DNA sind, welche in den vorgewählten Chromosomen auftritt. Wenngleich eine solche Start-DNA-Sequenz in ihrem natürlich auftretenden Zustand typischerweise eine Größe aufweisen kann, welche zur Zeit der Erhältlichkeit zur Verwendung als Startmaterial bei der Ausführung dieser Erfindung sehr viel größer als etwa 1 Mio. Basenpaare ist, können solche Sequenzen doch sogleich etwas fragmentiert werden, abhängig von Faktoren wie den Verfahren, die bei der Separation, der Isolierung und dergleichen verwendet werden. Vorzugsweise stammt ein solches Chromosom aus dem Humangenom.
Zum Zwecke des Herstellens einer klonierten DNA-Sequenz dieser Erfindung kann oder können die chromosomale(n) Start-DNA-Sequenz(en) durch verschiedene Techniken erhalten werden. Entsprechend können sie abgeleitet oder erhalten werden aus (a) DNA eines vorgewählten Chromosoms, welches durch Fließsortierung oder dergleichen separiert wird und aus Komponenten intrazellulären Materials eines Organismus isoliert wird; (b) einer Bibliothek vorgewählter Chromosome und (c) einem Interspezies-Hybrid, welches DNA aus einem vorgewählten Chromosom enthält. Eine derzeit bevorzugte chromosomale Start-DNA ist eine Chromosomen-Bi bliothek, welche durch Standardverfahren hergestellt wurde und welche aus traditionellen Quellen erhältlich ist, die in der Technik bekannt sind, wie etwa der "American Type Culture Collection" (ATCC) oder anderen Depots von menschlichem oder anderem kloniertem genetischen Material. Wenngleich eine große Anzahl spezifischer Chromosomen-Bibliotheken von der ATCC erhältlich sind, so wird doch eine repräsentative Bibliothek in der nachfolgenden Tabelle I gezeigt: TABELLE I Menschliche Chromosomen-Bibliotheken
Die ATCC-Hinterlegungen der Tabelle I sind erhältlich von American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland.
Beispiele der Lehren des Standes der Technik, welche die Präparation geeigneter, vorgewählter chromosomaler Start- Sequenz-Matrizen zum Herstellen regionalspezifischer DNA- Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulichen, umfassen (jedoch nicht ausschließlich):
1. Physikalisch separierte Chromosomen oder Bibliotheken, die aus denselben abgeleitet sind, wie in M. A. Van Dilla et al. in Bio/Technology 4 : 537-552 (1986) beschrieben.
2. Ein in einem Mikroverfahren zerlegtes Chromosom, Fragment eines Chromosms oder eine klonierte Bibliothek, welche aus demselben abgeleitet ist, wie in Ludecke, H. J. et al. in Nature 338 : 348-350 (1989) beschrieben.
3. Einzelne menschliche Chromosomen oder Fragmente derselben, welche in Nagetier-Zellinien vermehrt werden. Ein Verfahren zum Erzeugen menschlicher, mono-chromosomaler Hybridlinien ist beschrieben in: Carlock, L. R. et al. in Somatic Cell Mol. Gent. 12 : 163-174 (1986).
Die chromosomale Start-DNA enthält typischerweise etwa 18 bis etwa 25 Mol-% Desoxycytidin-Nukleotide, basierend auf der Gesamtzahl darin vorhandener Desoxynukleotide. Typischerweise zeigt die chromosomale Start-DNA-Matrize des vorgewählten einzelnen Chromosoms, in welchem der vorgewählte Bereich existiert, eine große Variation bezüglich der molekularen Größe; beispielsweise können die Größen in dem Bereich von etwa 150 bis etwa 20 Mio. bp liegen.

(3) Die Start-Kupplungsverbindung

Eine Start-Kupplungsverbindung, welche bei der Ausführung dieser Erfindung verwendet wird, ist eine difunktionelle organische Verbindung, d. h., sie enthält zwei funktionelle (d. h. reaktive) Substituenten pro Start-Kupplungsverbindungs-Molekül.
Wenigstens einer dieser funktionellen Substituenten pro Kupplungsverbindungs-Molekül ist mit Desoxycytidin-Nukleotiden in ein Polynukleotid umsetzbar, unter wässrigen Bedingungen mit einem Hydrogensulfit-Katalysator zur Transaminierung (wie beispielsweise vorliegend vorgesehen). Beispiele solcher Substituenten umfassen Alkyl-Amino- (primär und sekundär)-Hydrazid, Semicarbazid, Thiosemicarbazid und dergleichen. Aminogruppen sind derzeit am meisten bevorzugt.
Wenn die Aminogruppe sekundär ist, so ist der sekundäre Substituent vorzugsweise eine kohlenstoffarme Alkylgruppe, jedoch können auch andere dieser sekundären Substituenten, welche nicht blockierend sind, verwendet werden, wenn dies gewünscht ist.
Die zweite dieser beiden funktionellen Substituenten pro Kupplungsverbindungs-Molekül ist mit einem dritten funktionellen Substituenten umsetzbar, welcher in eine fluoreszierende Startverbindung (wie vorliegend beschrieben) eingebaut ist. Ein solcher zweiter funktioneller Substituent kann selbst entweder geblockt oder ungeblockt sein. Wenn der zweite Substituent ungeblockt ist, so ist er im wesentlichen nicht mit anderen Substanzen umsetzbar, welche in dem Transaminierungs-Medium (insbesondere Polynukleotide) während des Transaminierens vorliegen. Wenn der zweite Substituent geblockt ist, so ist er mit den anderen Substanzen nicht umsetzbar, welche in dem Transaminierungs-Medium (insbesondere Polynukleotide) während der Transaminierung vorliegen.
Beispiele einer geeigneten ungeblockten zweiten funktionellen Substituentengruppe umfassen Amino, Carboxyl, Phosphat, Sulfonat, Hydroxyl, Hydrazid, Semicarbazid, Thiosemicarbazid und dergleichen. Vorliegend umfassen die bevorzugtesten ungeblockten zweiten funktionellen Substituenten Amino- (primär oder sekundär) und Carboxylgruppen.
Die Carboxylgruppen liegen entweder in Salzform oder in Säureform vor, jedoch auch gelegentlich in der Esterform. Wenn sie in der Salzform vorliegen, so sind als Kationen die Alkalimetalle, wie z. B. Natrium und Kalium, derzeit bevorzugt.
Beispiele geeigneter, geblockter zweiter funktioneller Substituentengruppen umfassen geblocktes Sulfonat, geblocktes Phosphat, geblocktes Sulfhydryl und dergleichen.
Beispiele geeigneter Blockierungs-Substituenten umfassen kohlenstoffarme Alkylgruppen wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl etc.
Die ersten und zweiten funktionellen Substituenten sind miteinander über einen Koppler oder Kupplungsanteil verbunden. Dieser Kupplungsanteil kann jegliche geeignete Struktur haben, jedoch ist er mit anderen Substanzen, welche in dem Transaminierungs-Medium während der Transaminierung vorliegen, nicht umsetzbar. Derzeit wird bevorzugt, daß der Kupplungsanteil eine kohlenwasserstoffhaltige divalente Gruppe ist, welche azyklisch oder zyklisch ist und welche möglicherweise andere Atome beinhaltet.
Die beiden funktionellen Substituenten, welche in einer solchen difunktionellen Kupplungsverbindung vorliegen, können jeweils Substituenten des Kupplungsanteils sein. Solche Substituenten können an zueinander benachbarten Kohlenstoffatomen vorliegen, oder sie können in einem Kupplungsverbindungs-Molekül einen Abstand um eine Mehrzahl zwischengeschalteter, miteinander verbundener Atome (vorzugsweise Kohlenstoffatome) zueinander aufweisen. Vorzugsweise stehen diese funktionellen Gruppen in Alpha-Omega- Beziehung zueinander, (d. h. jede befindet sich an einer anderen, entgegengesetzten Endregion) in einem gegebenen Kupplungsverbindungs-Molekül.
Somit sind die beiden funktionellen Reste in einer Kupplungsverbindung beide an einen organischen Kupplungsgruppenanteil gebunden, welcher entweder insgesamt kohlenwasserstoffhaltig (d. h. nur aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen aufgebaut) ist oder welcher aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen plus wenigstens einem zusätzlichen Atom oder einer Gruppe aufgebaut ist, welche wenigstens ein Atom enthält, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Phosphor oder dergleichen besteht. Vorzugsweise sind solche zusätzlichen Atome (oder ein solches zusätzliches Atom) in der Weise mit einem derartigen organischen Anteil assoziiert, daß sie wesentlich weniger reaktiv sind als einer der oben dargestellten beiden funktionellen Reste, welche in einer gegebenen Start- Kupplungsverbindung vorliegen. Kohlenwasserstoffhaltige organische Anteile, welche aliphatisch gesättigt sind, sind derzeit bevorzugt, und ein noch bevorzugterer Anteil ist ein divalenter Alkylenrest, welcher zwischen zwei und zwölf Kohlenstoffatomen enthält. Jedoch, wenn erwünscht, kann ein solcher gesättigter aliphatischer Rest entweder wenigstens eine Ethergruppe (-0-) oder wenigstens eine Thioethergruppe (-S-) enthalten, während derzeit aber eher bevorzugt ist, daß nur eine dieser Ether- oder Thioethergruppen vorliegt. Es ist derzeit bevorzugt, daß eine Kupplungsverbindung einen organischen Rest umfaßt, welcher wenigstens zwei und nicht mehr als insgesamt etwa zwanzig Kohlenstoffatome enthält, wenngleich auch mehr Kohlenstoffatome pro Molekül vorliegen können, wenn dies erwünscht ist.
Derzeit sind Kupplungsverbindungen bevorzugt, bei denen jeder dieser funktionellen Reste ein Aminorest ist. Sowohl azyklische als auch zyklische Diamino-Verbindungen können verwendet werden.
Beispiele geeigneter aliphatischer primärer Diamine umfassen primäre Alkylenamine, wobei die Alkylengruppe Polypropylen, Butylen, Pentylen, Hexylen, Nonylen und dergleichen ist.
Beispiele geeigneter sekundärer aliphatischer Diamine umfassen
CH&sub3;NH(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2;,
CH&sub3;NH(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub3;
und dergleichen.
Diaminoverbindungen, welche hydroxylierte Hydrocarbone enthalten, können verwendet werden. Beispiele derartiger azyklischer Verbindungen umfassen 1, 3-Diamino-2-hydroxypropan; 1, 4-Diamino-2, 3-dihydroxybutan; 1, 4-Diamino-2, 3, 4-trihydroxypentan; 1, 6-Diamino-1, 6-didesoxy-D-mannit (oder D-Sorbit oder D-Galactit), 1, 6-Diamino-2, 3,4, 5-tetrahydroxyhexan und dergleichen.
Beispiele geeigneter polyhydroxylierter zyklischer Anordnungen umfassen cis- oder trans-zyklische Diaminoverbindungen, wobei die Diamine als Ring vorliegen, wie z. B. 1, 4-Diamino-2, 3, 5, 6-tetrahydroxycyclohexan, cis- und trans-1,2-Diaminocyclohexan, cis- und
trans-1,2-Diaminocyclopentan und hydroxylierte Derivate derselben, wie z. B. 1,2-Diamino-3,4,5-tetrahydroxycyclohexan, 1,2-Diamino-3,4,5-trihydroxycyclopentan, 3,6-Diamino-3,6-didesoxy-Derivate von myo-Inosit, wie etwa
und dergleichen.
Beispiele geeigneter heterozyklischer Diamine umfassen Piperazin, N, N'-Di-(3-aminopropyl)-piperazin, Derivate derselben und dergleichen.
Beispiele geeigneter Ethergruppen mit Diaminen umfassen 3-Oxo-1,5-Pentandiamin, 3, 6-Dioxo-1,8-diaminooktan und dergleichen.
Beispiele geeigneter Kupplungsverbindungen mit sowohl einem Aminorest als auch einem Carboxylrest umfassen Aminosäuren, wie etwa Sarkosin (N-Methylglycin) und Alpha-Aminosäuren, wie etwa Glycin, Alanin, Glutarsäure, Asparginsäure, Prolin, Pipecolinsäure (Piperidin-2-carbonsäure), Isopipecolinsäure (Piperidin-4-carbonsäure), Glucosaminsäure sowie Derivate derselben und dergleichen:
Beispiele von Alpha-Omega-Aminocarbonsäuren (zusätzlich zu den oben genannten Aminosäuren) umfassen 4-Aminobuttersäure, 6-Aminohexansäure, 8-Aminooktansäure und dergleichen.
Beispiele difunktioneller Kupplungsverbindungen mit Phosphor umfassen Alpha-Omega-Aminoalkyl-Phosphorsäure, Monoester, wie etwa O-(2-Aminoethyl)-phosphat-Dinatriumsalz und dergleichen.
Beispiele geeigneter difunktioneller Kupplungsverbindungen mit Schwefel umfassen Alpha-Omega-Aminoalkyl-Sulfonsäuren, wie etwa Taurin (2-Aminoethyl)-Sulfonsäure und dergleichen.
Eine derzeit eher bevorzugte Klasse difunktioneller Kupplungsverbindungen wird durch die folgende grundlegende Formel repräsentiert:
wobei:
X ein divalenter Rest ist, welcher aus der Klasse ausgewählt ist mit:
wobei:
R ist ein Alkylenrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein carbozyklischer Ring aus hydroxyliertem Carboxy ist, und R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig aus der Klasse ausgewählt werden, welche Wasserstoff und kohlenstoffarme Alkylgruppen enthält.
Vorzugsweise enthält R in der Formel (1) nicht mehr als 7 Kohlenstoffatome, R&sub1; und R&sub2; sind jeweils Wasserstoff,
X ist, und R&sub1; und R&sub2; sind jeweils Wasserstoff, wobei R weniger als 7 Kohlenstoffatome enthält.
Es können Mischungen verschiedener Kupplungsverbindungen verwendet werden, wie etwa Kupplungsverbindungen mit einer Mischung aus Mono- und/oder Diaminen, jedoch sind solche Mischungen nicht bevorzugt, da sie mit Problemen bei der Transaminierungskontrolle und der Verwendung verbunden sind.
Diamine, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen großen Anteil aufweisen, welcher als freie, unprotonierte Spezies bei pH-Werten von etwa 7 existiert, erweisen sich förderlich für die vorliegende Transaminierungs-Reaktion. Ethylendiamin (pK etwa 7,6) ist wegen dieser Eigenschaft vorliegend am meisten bevorzugt, um es als reaktives difunktionelles Amin zu verwenden.
Wenn beispielsweise eine solche Kupplungsverbindung unter Verwendung einer Transaminierungs-Reaktion an eine DNA-Sequenz gebunden wird, wie im folgenden beschrieben, wird die Transaminierungs-Reaktion so ausgeführt, daß sich ein Aminorest in der Kupplungsverbindung an die Sequenz oder das Segment bindet. Daraufhin verbleibt in der resultierenden Kupplungsgruppe eine freie funktionelle Gruppe, um an anderen Reaktionen teilzunehmen. Wenn somit der zweite funktionelle Rest ein Aminorest ist, so bleibt dieser Rest frei, um danach an weiteren Reaktionen mit der fluoreszierenden Verbindung teilzunehmen, wie im folgenden beschrieben. Wenn der zweite funktionelle Rest ein Carboxylrest ist, so bleibt dieser Rest frei, um danach an einer weiteren Reaktion mit der fluoreszierenden Verbindung teilzunehmen, wie im folgenden beschrieben.

(C) Herstellung einer klonierten, regionalen chromosomalen Sequenz

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen einer klonierten DNA-Sequenz zur Verfügung, welche (a) komplementär zu einer DNA-Sequenz ist, die in einer ausgewählten Region eines ausgewählten Chromosoms auftritt, das vorzugsweise ein multi-chromosomales Genom ist und welche ebenso (b) eine Mehrzahl von Kopien des wenigstens einen repetitiven DNA-Segmentes enthält, welches in einer solchen ausgewählten Region auftritt.
Kurz gesagt umfaßt dieses Verfahren einen ersten Schritt, bei dem wenigstens ein Start-Oligonukleotid (wie oben beschrieben) synthetisiert wird. Jedes derartige Oligonukleotid umfaßt eine Nukleotid-Sequenz, welche komplementär zu wenigstens einem repetitiven DNA-Segment ist, welches in einer solchen Region existiert. Als nächstes verwendet man ein solches Start-Oligonukleotid oder solche Start-Oligonukleotide, um die chromosomale Start-DNA des gesamten Chromosoms enzymatisch zu amplifizieren, in welcher die ausgewählte Region auftritt, wobei diese chromosomale Start- DNA so vorliegt, wie oben beschrieben. Das/die Oligonukleotid(e) wird/werden als Primer-Komposition verwendet, und die gesamte chromosomale DNA wird als Matrize verwendet.
Somit wird eine amplifizierte Klasse von Kopien der repetitiven DNA-Segmente hergestellt, welche in einer solchen Region existieren. Daraufhin wird eine solche Klasse amplifizierter, repetitiver DNA-Segmentkopien und eine Gruppe separierter Probekopien dieser hergestellt. Diese separierten Probekopien werden individuell gelabelt und mit jeweiligen Proben eines Ziels hybridisiert, welches DNA-Komponenten aufweist, die für das gesamte Genom repräsentativ sind, so daß Hybride hergestellt werden. Von solchen Hybriden wird eine DNA-Sequenz, welche nur in einer ausgewählten Region auftritt, identifiziert und ausgewählt, wobei Kopien dieser kultiviert und zur Verwendung extrahiert werden.
Die verschiedenen aufeinanderfolgenden Schritte, welche verwendet werden, um eine klonierte in einem ausgewählten Bereich eines Chromosoms auftretende DNA-Sequenz gemäß dieser Erfindung herzustellen, sind in den im wesentlichen selbsterklärenden Fig. 2a und 2b veranschaulicht, wobei Verfahrensschritte in durchgezogen umrandeten und bezeichneten Kästen dargestellt sind und worin gewisse spezielle Materialien ("Genom" und "DNA-Sequenz") jeweils in mit unterbrochenen Linien gezeichneten Kästen individuell dargestellt sind. In den Fig. 2A und 2B (2A/2B) zeigt die Anwesenheit des Buchstabens "A" an bestimmten Orten auseinanderlaufender Verbindungslinien, daß alternative Wege vorliegen (zu unterscheiden von Kombinationen, Mischungen von Wegen oder dergleichen). Die jeweiligen individuellen Boxen sind ebenso numeriert, um auf diese in der folgenden Beschreibung Bezug zu nehmen.
Eine klonierte DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, welche wie vorliegend beschrieben hergestellt wird, wie vorliegend beschrieben, ist komplementär zu (d. h. sie ist im wesentlichen ein exaktes und vollständiges Replikat von) einer DNA- Sequenz, welche in einer ausgewählten Region eines Chromosoms eines speziellen Genoms auftritt, welches typischerweise multi-chromosomal ist (d. h. es ist bezüglich seines biologischen Ursprunges eukaryotisch). Ebenfalls enthält jede dieser klonierten DNA-Sequenzen wenigstens eine darin enthaltene und vorzugsweise mehrere (d. h. wenigstens zwei) repetitive DNA-Segmente und noch bevorzugter wenigstens fünf verschiedene repetitive DNA-Segmente. Die Größe (d. h. die Anzahl an Nukleotiden oder Basenpaaren darin) einer solchen klonierten DNA-Sequenz und das darin enthaltene individuelle repetitive DNA-Segment oder die DNA-Segmente, sowie andere Variablen, wie z. B. die Segment-Nukleotid-Sequenzen die Segmentanordnung in jeder Sequenz und die Anzahl an repetitiven DNA-Segmenten in der DNA-Sequenz und dergleichen sind typischerweise nicht bekannt; jedoch benötigt man diese Informationen, um die vorliegende Erfindung ausführen zu können. Eine einzelne dieser klonierten DNA-Sequenzen kann eine Nukleotid-Sequenz mit wenigstens etwa 1000 bp und gewöhnlich nicht mehr als etwa 100.000 bp sein. Beispielsweise kann eine einzelne Alphoid-DNA-Sequenz, welche in einer einzelnen Region eines Chromosoms auftreten kann, von etwa 20.000 bp bis zu mehreren 100.000 Basenpaaren aufweisen. In einem ausgewählten Chromosomregion kann mehr als eine DNA-Sequenz vorliegen.
Um insbesondere eine klonierte DNA-Sequenz gemäß dieser Erfindung herzustellen, synthetisiert man vorläufig wenigstens ein gemeinsam auftretendes Oligonukleotid (wie oben erwähnt), welches komplementär zu einer Region von wenigstens einem repetitiven DNA-Segment ist, das in wenigstens einer DNA-Sequenz einer ausgewählten Region eines ausgewählten Chromosoms vorliegt (siehe Box 10 in Fig. 2A/2B). Das Humangenom wird derzeit bevorzugt, und eine chromosomale Region mit einer Mehrzahl repetitiver Alphoid-DNA-Segmente wird derzeit bevorzugt.
Wenngleich nur ein einzelnes Start-Oligonukleotid bei der Ausführung dieser Erfindung als Primer bei der enzymatischen Amplifikation verwendet werden kann, ist es derzeit bevorzugt, eine Mischung aus Oligonukleotiden zu verwenden, welche wenigstens zwei, wenigstens fünf sind eher bevorzugt, jedoch im allgemeinen nicht mehr als etwa 64 verschiedene Oligonukleotide enthält. Verschiedene Anzahlen von Oligonukleotiden können in einer solchen Start-Oligonukleotid-Mischung verwendet werden. Das Gewichtsverhältnis dieser individuellen verschiedenen Oligonukleotide untereinander in einer gegebenen Oligonukleotidmischung ist typischerweise, als Folge der bekannten Verfahren, durch welche sie synthetisiert werden, etwa ausgeglichen. Liegt keine Vorabinformation bezüglich der Sequenz der repetitiven DNA-Segmente in irgendeiner gegebenen ausgewählten Region vor, so gibt es derzeit keinen bekannte Weg, genau abzuschätzen, wie viele Kopien des Komplements eines gegebenen Oligonukleotids in irgendeiner Sequenz oder einer Chromosomregion vorliegt. Das generelle Erfordernis der enzymatischen Amplifikation besteht darin, daß Primer, welche in ausreichendem Maße zu der Zielmatrize komplementär sind und unter den Reassoziationsbedingungen hybridisieren, welche in der Reaktion verwendet werden, in einem ausreichenden Maße vorhanden sind, um die Synthese einer ausreichend großen Anzahl nützlicher Kopien der Matrize zu gestatten und dabei eine Reproduktion und eine nachweisbare Amplifikation einer Matrizensequenz zu erreichen.
Wenn strukturelle Unterschiede aufgrund örtlicher Degenerierungen in den Start-DNA-Sequenzen auftreten, so besteht die am meisten bevorzugte Praxis darin, ein Primer-Set für einen Strang zu verwenden, welcher etwa 8 verschiedene Oligonukleotide enthält, sowie ein Primer-Set für den anderen Strang, welcher etwa 12 verschiedene Oligonukleotide enthält. Repetitive Alphoid-DNA-Segmente sind im allgmeinen bevorzugt. Somit sind derzeit die am meisten bevorzugten Start-Oligonukleotide in spezifischer Weise komplementär zu repetitiven DNA-Segmenten in der repetitiven Alpha-Satellit-DNA-Segment-Region des Centromers eines speziellen ausgewählten Chromosoms eines ganzen multi-chromosomalen Genoms, vorzugsweise eines Humangenoms.
Zur Verwendung bei der Ausführung dieser Erfindung ist es derzeit geeignet und bevorzugt, anfänglich eine oder mehrere solcher Oligonukleotide als wässrige Dispersion oder Komposition herzustellen, bei welcher die Konzentration der Oligonukleotide der bei dem Verfahren entspricht, welches zur Ausführung einer enzymatischen DNA-Amplifikationsreaktion verwendet wird, was für Fachleute verständlich sein wird.
Solch eine Start-Oligonukleotid-Komposition wird als Primer-Komposition bei einem enzymatischen DNA-Amplifikationsverfahren verwendet, bei dem die Matrize eine DNA-Komposition ist, welche stellvertretend für ein gesamtes ausgewähltes Chromosom ist, in welchem die ausgewählte Region auftritt. Die DNA-Matrize wird aus dem ausgewählten Genom ausgewählt und hergestellt (siehe Box 11 in Fig. 2A/2B). Somit kann beispielsweise eine chromosomale Matrizenkomposition gemäß einer der folgenden Möglichkeiten vorliegen und darauf basieren: (a) das eine Chromosom, welches aus dem Genom durch Fließsortierung oder dergleichen isoliert werden kann (siehe Box 12, Fig. 2A/2B), (b) DNA-Fragmente, welche zusammengenommen das eine Chromosom enthalten, wobei die Fragmente mechanisch hergestellt werden können (d. h. durch Schall oder dergleichen) oder enzymatisch (siehe Box 13 in Fig. 2A/2B) hergestellt werden können oder (c) eine Bibliothek des einen Chromosoms, wobei die Bibliothek durch Klonieren von DNA-Fragmenten des Chromosoms hergestellt werden kann (siehe Box 14 in Fig. 2A/2B). Die Start-Matrizenkomposition ist vorzugsweise eine wässrige Dispersion, bei der die Matrizen-DNA-Konzentration und der Zustand in ähnlicher Weise mit denen bei dem speziellen Verfahren übereinstimmt, welches zur Ausführung eines enzymatischen Amplifikationsverfahrens verwendet wird, was für Fachleute verständlich sein wird.
Derzeit ist es bevorzugt, als Matrize eine Chromosomen-Bibliothek zu verwenden, in welcher die chromosomalen DNA- Fragmete im Größenbereich von 150 bis etwa 600.000 bp liegen und eher bevorzugt im Bereich von etwa 150 bis 35.000 bp und am meisten bevorzugt zwischen etwa 150 bp bis etwa 10.000 bp. Solche Bereiche der DNA-Fragmentgröße können mit verschiedenen Mitgliedern der nunmehr kommerziell erhältlichen Vektortypen verwendet werden, um sich entweder in bakteriellen oder Pilz-Wirtszellen zu vermehren, was für Fachleute verständlich sein wird.
Bei dem enzymatischen Amplifikationsverfahren werden Primer als "Baublöcke" zur Herstellung repetitiver DNA-Segmente verwendet, welche die exakten Kopien repetitiver DNA-Segmente sind, die in den Matrizen Nukleotid-Sequenz-Gebieten gefunden werden, wie etwa den Gebieten, die komplementär zu den Primer-Sequenzen sind. Das enzymatische DNA-Amplifikationsverfahren (siehe Box 15 in Fig. 2A/2B) kann ausgeführt werden, indem beispielsweise das gut bekannte sogenannte Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren ("Polymerase chain reaction procedure" (PCR)) verwendet wird. Beispielsweise sind geeignete kommerziell erhältliche PCR-Geräte und -Ver fahren von Perkin Elmer-Cetus (Norwalk, CT) erhältlich, wie der "Perkin Elmer-Cetus DNA Thermal Cycler" und die mitgelieferten Arbeitsanweisungen. Die verwendeten Reagenzien können in der Form des sogenannten "Perkin Elmer Cetus "Gene Amp" kit" vorliegen. Ein solches Equipment und derartige Reagenzien werden in den im folgenden beschriebenen Beispielen verwendet. Siehe auch K. B. Mullis, et al. in Methods in Enzymology 155 : 335-350 (1987).
Derzeit ist bevorzugt, das enzymatische DNA-Amplifikationsverfahren automatisch oder halbautomatisch auszuführen und bei einem gegebenen Verfahren wenigstens etwa 20 Amplifikationszyklen zu verwenden, wobei jeder Zyklus eine Zeitdauer im Bereich von etwa 2 bis etwas 6 Minuten aufweist. Vorzugsweise ist der letzte Zyklus relativ zu den vorangehenden Zyklen etwas verlängert. Das amplifizierte Produkt ist charakteristisch eine Mischung (oder Klasse) von DNA- Polynukleotiden mit Kopien repetitiver DNA-Segmente, die hauptsächlich in der einen ausgewählten Region eines Chromosoms vorliegen. Die ausgewählte Region wird somit tatsächlich durch die Lokalisierung des stärksten Auftretens der Oligonukleotide in dem Chromosom bestimmt.
Eine solche resultierende, enzymatisch amplifizierte Klasse von Kopien repetitiver DNA-Segmente des einen Chromosoms werden geeigneterweise herkömmlich separiert, beispielsweise durch Extraktion mit einer Lösemittelmischung, wie etwa Phenol und Chloroform oder dergleichen, und nachfolgender Ausfällung mit Ethanol oder dergleichen. Die Mischung kann fragmentiert werden. Eine Produktmischung wird geeigneterweise und vorzugsweise in einem passenden sterilen, wässrigen Trägermedium suspendiert, bei einer Konzen tration, die vorzugsweise für die nachfolgende hier beschriebene Verwendung geeignet ist. Bei einer solchen Produktmischungs-Komposition können die DNA-Segmente typisch und vorzugsweise jedes etwa 170 bis etwa 3.000 bp aufweisen, wenngleich größere und geringere Segmente verwendet werden können.
Als nächstes wird ein Lokalisierungsverfahren ausgeführt, um eine Gruppe (d. h. eine Mehrzahl) individueller DNA- Segmente auszuwählen, welche charakteristisch in der einen ausgewählten Region des ausgewählten einen Chromosoms gefunden werden, und um von diesen eine Probe zu nehmen. Dieses Lokalisierungsverfahren wird ausgeführt, indem die enzymatisch amplifizierte Klasse von DNA-Segmenten verwendet wird. Das Verfahren verwendet eine Klasse von Klonkolonien, deren individuelle Koloniemitglieder der Wirtszelle wenigstens individuelle repetitive Vektor-DNA-Segmente des einen ausgewählten Chromosoms aufweisen. Fachleuten wird verständlich sein, daß verschiedene Lokalisierungsverfahren verwendet werden können. Zwei dieser Lokalsierungsverfahren werden derzeit bevorzugt, und jedes der jeweiligen Verfahren wird nun beschrieben und ebenso durch zwei jeweils alternative in Fig. 2A/2B beschriebene Wege veranschaulicht, wobei ein Verfahren und Weg (d. h. Mehrzahl von Verfahrensschritt- Boxen) durch die vorangestellte Ziffer 1 und das/der andere durch die vorangestellte Ziffer 2 identifiziert ist.
Bei den derzeit verwendeten, bevorzugten Lokalisierungsverfahren werden die individuellen Mitglieder der Klonkolonien einer Klasse von Klonkolonien einzeln (d. h. getrennt voneinander) gehalten, vorzugsweise in abgeflachten Oberflächenregionen eines verfestigten Zell-Kultur-Mediums. Jede individuelle Kolonie enthält somit eine Mehrzahl von im wesentlichen identischen Wirtszellen.
Da ein solches enzymatisch amplifiziertes Produkt selbst eine Mischung verschiedener unterschiedlicher Nukleotid-Sequenzen ist und da jeder Vektor typischerweise nur eine einzige Nukleotid-Sequenz enthält, ist eine Gruppe von Vektoren, welche solch ein enzymatisch amplifiziertes Produkt enthält, selbst eine Mischung oder Klasse. Jedoch sind die Vektoren in den Zellen jeder individuellen Kolonie identisch. Die Klonierverfahren, welche in dem gemäß dieser Erfindung eingesetzten Auswahlverfahren verwendet werden, sind geeignet, die Fähigkeit, die erwünschte Auswahl individueller Vektor-DNS-Sequenzen zu erreichen, zu erhöhen.
Somit wird durch ein derzeit bevorzugtes Lokalisierungsverfahren die enzymatisch amplifizierte Klasse von Kopien repetitiver DNA-Segmente kloniert (siehe Box 1.16 in Fig. 2A/2B). Das eingesetzte Klonierverfahren verwendet die Schritte:
a) Einfügen individueller Mitglieder der enzymatisch amplifizierten repetitiven DNA-Segmenteklasse in jeweilige individuelle Vektoren,
b) Transportieren der Vektoren in Wirtszellen mit einer Rate von etwa einem Vektor pro Wirtszelle,
c) Impfen der so transportierten Wirtszellen auf ein festes Zellen-Kolonie-Kultur-Medium und
d) Züchten der geimpften Wirtszellen, um eine Klasse aus Wirtszellen herzustellen, welche getrennte klonierte Kolonien verteilt auf der Oberfläche des Mediums aufweist, wobei jede Kolonie hauptsächlich individuelle, repetitive Vektor-DNA-Segmente enthält.
Zur Vereinfachung sind diese Schritte beim Klonieren nicht detailliert durch getrennte Boxen in Fig. 2A/2B beschrieben, wobei die Box 1.16 verwendet wird, um das gesamte Verfahren zu zeigen.
Um eine enzymatisch amplifizierte Klasse aus DNA-Segmenten zum Klonieren vorzubereiten, können die dazugehörigen DNA- Segmente vorläufig mit Restriktions-Enzymen verdaut werden, um Nukleotid-Sequenz-Fragmente herzustellen, welche von individuellen Vektoren aufgenommen werden können. Es ist derzeit bevorzugt, Segmentfragmente zu verwenden, die eine Größe im Bereich von etwa 170 bis etwa 3.000 bp und am meisten bevorzugt zwischen etwa 1.500 und etwa 3.000 bp aufweisen, wenngleich größere und kleinere Größen verwendet werden können. Die Auswahl der Fragmentgröße ist in einem beliebigen Moment durch viele Variablen beeinflußt, wie dem verwendeten Vektor, der Maximalgröße der erhaltenen Produkte, den Restriktionsstellen, welche zum Einfügen des enzymatisch amplifizierten Produktes verfügbar sind, und dergleichen, wie für Fachleute verständlich sein wird.
Wenn erwünscht, kann man beispielsweise ein Klonierverfahren verwenden, wie das Verfahren, welches von der Invitrogen Corporation of San Diego, California beworben wird und "TA cloning" genannt wird; dies erlaubt ein direktes Klonieren enzymatisch amplifizierter Nukleinsäuren aus Genom-DNA ohne einen Zwischenprozeß mit Restriktionsenzymen oder dergleichen (siehe die Werbung der Invitrogen Corp. in Science 251, 609 (8. Feb. 1991)).
Es ist derzeit bevorzugt, als Kloniervektoren Plasmide zu verwenden, wie etwa die Plasmide, welche durch die Identifizierungs-Codes pUC18, pUC19, pBS1, pGEM3 und dergleichen identifiziert sind, wobei alle über verschiedene kommerzielle Quellen erhältlich sind. Das Einfügen individueller Glieder der enzymatisch amplifizierten Klassen repetitiver DNA in jeweilige individuelle Vektoren und die Transformation solcher Vektoren in Wirtszellen wird auf konventionelle Weise erreicht.
Als Wirtszelle ist derzeit ein Bakterium bevorzugt, wobei aktuell das besonders bevorzugte Bakterium E. coli ist; dies aus Gründen der Bequemlichkeit, Erhältlichkeit und Verläßlichkeit. Das Impfen der transportierten Wirtszellen wird in herkömmlicher Weise erreicht, und das verfestigte Zell-Kolonie-Kultur-Medium kann herkömmlich sein. Verfahren zur Präparation und Transformation kompetenter E.coli-Wirtszellen und das nachfolgende Aufbringen auf Agar-Platten sowie die Züchtungsschritte, welche erforderlich sind, um Zellpopulationen zu isolieren, die mit einem einzelnen Typ eines rekombinanten Plasmids oder einer Filament-Phage transformiert werden, sind beispielsweise beschrieben in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ed. Seiten 1.35-1.84 und 4.21-4.36 von J. Sambrook et al., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N. Y. (1989).
Es wird somit eine Wirtszellen-Klasse von Kolonien hergestellt, welche über Oberflächenregionen des feststoffähnlichen Kulturmediums verteilt sind und deren Koloniemitglieder zusammengenommen Vektor-DNA-Sequenzen enthalten, die identisch zu jenen der Mitglieder der Klasse enzymatisch amplifizierter DNA-Sequenzen sind. Jedoch enthalten die Wirtszellen von jeder Mitgliederkolonie hauptsächlich nur eine spezielle Vektor-DNA-Sequenz, welche statistisch von der Vektor-DNA-Sequenz strukturell verschieden ist, die in den anderen Kolonien der Kolonieklassen enthalten ist.
Der Kolonieklasse wird dann eine Probe entnommen (siehe Box 1.17 in Fig. 2A/2B). Eine kleine repräsentative Probe von Wirtszellen wird jeder Anzahl von Kolonien entnommen, und jede dieser Zellproben wird dann individuell kultiviert (d. h. fermentiert) (siehe Box 18 in Fig. 2A/2B). Eine konventionelle zufällige Kolonie-Probenentnahme-Technik ist anwendbar. Das Kultivierungsverfahren sowie das Kultivierungsmedium können beide denjenigen entsprechen, die in der oben zitierten Arbeit von Sambrook et al. beschrieben sind.
Somit wird eine Mehrzahl selektierter und separat multiplizierter (d. h. klonierter) individueller repetitiver Vektor-DNA-Seqmente zur Verfügung gestellt.
Bei dem zweiten der derzeit bevorzugten Auswahlverfahren wird die enzymatisch amplifizierte Klasse repetitiver DNA- Segmente gelabelt (siehe Box 2.19 in Fig. 2A/2B), so daß eine Sonden-Komposition hergestellt wird. Beispielsweise kann das Labeln mit etwa Radioisotopen, Biotin, Hapten-Antigenen oder dergleichen erreicht werden, so daß eine Proben-Komposition hergestellt wird, welche eine Mischung gelabelter DNA-Sequenzen enthält.
Ein solches Labeln kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren erreicht werden, einschließlich Nick-Translation, zufälliges Oligonukleotid-Priming und ähnliche Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Das derzeit bevorzugte Verfahren, welches bei der Ausführung dieser Erfindung verwendet wird, beinhaltet das Aufnehmen eines direkten Labels in die enzymatisch amplifizierte Klasse repetitiver DNA-Segmente durch Aufnahme von Alpha- ³²P-dCTP während des enzymatischen Ampflifikationsverfahrens. Somit kann man beispielsweise 100 Mikrocurie (uCi) von Alpha- ³²P-dCTP (Desoxycytidin-5'-triphosphat, tetra-Triethyl ammoniumsalz, (Alpha- ³²P-dCTP) einer herkömmlichen Perkin Elmer Cetus PCR-Reaktionsmischung zufügen, so wie sie kommerziell erhältlich ist und wie sie in der Literatur beschrieben ist, die dem PCR-Gerät beigefügt ist und von dem Unternehmen geliefert wird. Im wesentlichen sollte keine Interferenz mit sequenzkomplementären Charakteristiken als Ergebnis des Labelns oder des Label-Verfahrens auftreten, was für Fachleute verständlich sein wird.
Als Teil des vorliegenden Lokalisierungs- oder Auswahlverfahrens erhält oder stellt man eine kolonisierte Genom- Bibliothek des Genoms her, welches das eine ausgewählte Chromosom enthält. Das verwendete Präparationsverfahren verwendet die Schritte:
a) Fragmentieren des Genoms in eine Klasse von DNA- Sequenzen und/oder -Segmenten (siehe Box 2.20 in Fig. 2A/2B); und
b) Klonieren der Fragmente, um eine Bibliothek der Genome zu bilden (siehe Box 2.21 in Fig. 2A/2B).
Das Klonverfahren kann dieselben Schritte und Bedingungen aufweisen, welche oben mit Bezug auf das Klonverfahren genannt wurden, das für die enzymatisch amplifizierte Klasse repetitiver DNA-Segmente verwendet wurde, oder andere, wenn es erwünscht ist.
Die kolonisierte Genom-Bibliothek wird in getrennte Ausschnitte von DNA-Einzelstrang-Sequenzen (oder -Fragmente) getrennt, welche auf einem Trägersubstrat angeordnet (d. h. darüber verteilt) sind, wie etwa Nitrozellulose oder dergleichen (siehe Box 2.22 in Fig. 2A/2B). Ein herkömmliches Anordnungsverfahren ("Arraying Procedure") kann eingesetzt werden. Somit wird eine Originalkopie der Bibliotheksanordnung ausgebildet. Darauf werden vorzugsweise die folgenden weiteren bevorzugten Verfahrensschritte genutzt:
a) Replizieren der Originalkopie-Bibliotheksanordnung kolonisierter Zellen auf einem Trägersubstrat (siehe Box 2.23 in Fig. 2A/2B); und
b) Verarbeiten der DNA-Kopien in der replizierten Bibliotheksanordnung (siehe Box 2.24 in Fig. 2A/2B).
Das Verarbeiten der replizierten Kopie umfaßt das Lysieren von Wirtszellen, das Denaturieren der DNA in jedem Koloniegebiet und das Befestigen der DNA an der Trägermatrix, wie in Box 2.24 angezeigt.
Herkömmliche Trägersubstrate in Blattform können verwendet werden, und die derzeit am meisten bevorzugten Träger-Substratblätter umfassen Nitrozellulose, derivatisiertes Nylon oder ein äquivalentes Material. Beispielsweise kann DNAaus E.coli-Kolonien, die auf Agar-Nährplatten wachsen, lysiert, denaturiert und an Nitrozellulose-Membranen befestigt werden, wobei das Verfahren verwendet wird, welches von Sambrook et al. in der oben zitierten Arbeit auf den Seiten 1.90-1.104 beschrieben ist.
Als nächstes wird bei dem vorliegenden Lokalisierungsverfahren die Sonden-Komposition, welche im Schritt gemäß Box 2.19 hergestellt wurde, mit einem Ziel mit der DNA in jedem der so verarbeiteten Gebiete der derart replizierten und verarbeiteten Bibliothek unter Hybridisierungs-Konditionen hybridisiert, wie in den Schritten gemäß Box 2.25 in Fig. 2A/2B angezeigt ist. Ein beliebiges geeignetes Protokoll kann eingesetzt werden, Beispielsweise kann das Screening- Protokoll ähnlich demjenigen sein, welches bei den sogenannten Kolonie-Hybridisierungs-Verfahren verwendet wird, die im Stand der Technik bekannt sind; siehe z. B. die Ver fahren, die bei Sambrook et al. in ihrer oben zitierten Arbeit auf den Seiten 1.90-1.104 und bei P. J. Mason et al. auf den Seiten 119-121 von "Nucleic Acid Hybridization", herausgegeben von B. D. Hames und S. U. Higgins, 1985 erstmals IRL Press veröffentlicht, beschrieben sind.
Die resultierende hybridisierte DNA und die Hybride werden dann überprüft (siehe Box 2.26 in Fig. 2A/2B). Von den resultierenden Hybriden werden insbesondere die repetitiven DNA-Segmente, welche in der replizierten und verarbeiteten Bibliothek vorliegen, identifiziert. Diese repetitiven Segmente treten charakteristisch hauptsächlich nur in der ausgewählten einen Region des einen Chromosoms auf, Die Identifizierung basiert auf jenen Bibliothek-Ziel-DNA-Fragmenten, welche DNA-Segmente enthalten oder aus diesen bestehen, welche komplementär zu DNA-Segmenten in der Sonden-Komposition sind, welche in dem Schritt gemäß Box 2.19 hergestellt wurden, wie durch die Hybridbildung gezeigt. Das Überprüfungs-Identifikations-Verfahren des Schrittes gemäß Box 2.26 verwendet:
a) Autoradiographie des derart hybridisierten Substrates mit einem Röntgenfilm, wobei individuelle geschwärzte Gebiete auf dem resultierenden derart belichtet und entwickelten Film erzeugt werden, welche den Orten der Hybride entsprechen;
b) Erstens: Identifizieren der speziellen getrennten DNA- Fragmente in der replizierten Anordnung, welche mit individuellen geschwärzten Gebieten auf dem Film assoziiert sind; und dann
c) Zweitens: Identifizieren jener Wirtszellenkolonien innerhalb der Originalkopie der kolonisierten Genom-Bibliothek, welche die speziellen jeweiligen zuerst identifizierten DNA-Fragmente enthalten.
Beispielsweise können das erste und zweite Identifizieren bewerkstelligt werden, indem der derart belichtete und entwickelte Film über die Originalkopie gelegt wird.
Das Überprüfungs- und Identifikationsverfahren verwendet vorzugsweise einen konventionellen käuflichen Röntgenfilm, welcher anfänglich über das derart hybridisierte, replizierte Substrat gelegt und geeignet belichtet wird. Verschiedene Belichtungsbedingungen können eingesetzt werden, was Fachleuten verständlich sein wird.
Nachdem die Wirtszellen-Kolonie-Mitglieder, welche komplementäre repetitive DNA-Segmente enthalten, somit identifiziert sind, wird eine geeignete Probe von Wirtszellen aus jeder derart identifizierten Kolonie entnommen (siehe Box 2.27 in Fig. 2A/2B).
Statt des Verwendens einer Bibliothek, die aus einem gesamten Genom abgeleitet ist, welches durch die Verfahrensschritte der Box 2.20 bis zur Box 2.24 zur Hybridisierung in dem Verfahrensschritt der Box. 2.25 unter Verwendung der Sonden-Zusammensetzung, welche durch den Verfahrensschritt nach Box 2.19 hergestellt wurde, hergestellt ist, kann man, wenn erwünscht, nur einen spezifischen Teil eines solchen Genoms verwenden, wobei der spezifische Teil das eine ausgewählte Start-Chromosom enthält. Beispielsweise kann man im Fall des Humangenoms einen genomspezifischen Bereich verwenden, welcher fließsortierte Chromoso men, chromosomale DNA von Inter-Spezies-Hybriden oder dergleichen aufweist.
Beispielsweise kann der spezifische Teil ein einzelnes menschliches Chromosom sein, welches vom Humangenom durch Fließsortierung getrennt wurde (siehe Box 12 in Fig. 2A/2B; d. h. derselbe Chromosomentyp, welcher anfänglich ausgewählt wurde). Dieses Chromosom wird dann fragmentiert (siehe Box 13 in Fig. 2A/2B) beispielsweise in einer ähnlichen Weise, wie in dem Verfahrensschritt gemäß 2.20 verwendet, und die Fragmente werden zu einer Bibliothek kloniert (siehe Box 14 in Fig. 2A/2B) in z. B. ähnlicher Weise, wie im Verfahrensschritt nach Box 2.21 verwendet. Die Chromosomen-Bibliothek wird dann angeordnet (siehe Box 2.28 in Fig. 2A/2B) in z. B. einer ähnlicher Weise, wie im Verfahrensschritt gemäß 2.22 verwendet, repliziert (siehe 2.29 in Fig. 2A/2B) in z. B. ähnlicher Weise, wie im Verfahrensschritt nach Box 2.23 verwendet wird und schließlich lysiert, denaturiert und fixiert (siehe Box 2.30 in Fig. 2A/2B) in z. B. einer ähnlicher Weise, wie - im Verfahrensschritt nach Box 2.24 verwendet. Daraufhin wird die in den Schritt nach Box 2.30 hergestellte Matrix als Ziel-Komplex für die Hybridisierung unter Hybridisierungsbedingungen im Verfahrenschritt nach Box 2.25 mit der Sonden-Zusammenstellung, welche im Schritt nach Box 2.19 hergestellt wurde, verwendet. Darauf wird der Überprüfungs- und Identifikations Schritt nach Box. 2.26 eingesetzt und Proben-Klone werden durch den Prozeß nach Schritt 2.27 rückgewonnen.
Jedes dieser individuellen als Probe entnommenen Klone wird dann kultiviert (siehe Box 18 nach Fig. 2A/2B). Günstigerweise kann das Kultivierungsverfahren und das Kultivierungsmedium ähnlich jenem sein, welches zum Kultivieren der als Probe entnommenen Klone verwendet wurde, die aus dem Schritt nach Box 1.17 (oben) resultieren. Indem entweder Weg 1 oder Weg 2 gefolgt wird, wird somit eine Mehrzahl ausgewählter und separat multiplizierter, individueller repetitiver DNA-Segmente zur Verfügung gestellt. Jeder Weg verwendet günstigerweise dasselbe abschließende Kultivierungsverfahren (siehe Box 18 in Fig. 2A/2B).
Individuelle Klon-Zell-Kolonien, welche in dem Kultivierungsschritt (Fermentierung) nach Box 18 hergestellt wurden, werden einem günstigerweise herkömmlichen Plasmid-Extraktions-Verfahren unterworfen, welches beispielsweise dasjenige sein kann, welches von Sambrook et al. in ihrer oben zitierten Arbeit auf den Seiten 125-128 beschrieben wurde (siehe Box 31 in Fig. 2A/2B). Die so aus jeder Klonkolonie gewonnene Plasmid-DNA wird dann gelabelt, so daß jedes individuelle, extrahierte Plasmid-DNA-Material in eine getrennte Sonde oder Sonden-Komposition konvertiert wird (siehe Box 32 in Fig. 2A/2B).
Verfahrensmäßig wird bevorzugt, daß die in diesen Sonden- Zusammensetzungen verwendeten Label-Anteile ohne weiteres durch Einbau unter Verwendung enzymatischer Amplifikation eingeführt werden. Somit werden beispielsweise indirekte Label von biotinderivatisierten Nukleotiden derzeit bevorzugt. Wenn es jedoch erwünscht ist, können andere haptenderivatisierte Nukleotide eingesetzt werden. Allgemein können beliebige geeignete und nützliche, gemäß dem Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden, um ein solches Labeln zu bewerkstelligen.
Ein anderes derzeit bevorzugtes Label-Verfahren ist dasjenige, welches im folgenden in dem "Sonden-Produktions"- Abschnitt beschrieben ist und welches direkte Fluorophor- Label verwendet.
Vorzugsweise liegt die Anzahl direkter oder indirekter Label-Anteile, welche pro individueller DNA-Sequenz verwendet werden, im Bereich von etwa 5 bis etwa 25 Gew.-% (basierend auf dem Gesamtgewicht der Sonden-Komposition), wenngleich diese Zahl geringer oder größer sein kann, wenn dies erwünscht ist. Im wesentlichen sollte keine Interferenz mit sequenzkomplementären Charakteristika als Ergebnis eines solchen Labelns auftreten. Vorzugsweise sind alle Sonden-Kompositionen und deren Sequenzen im wesentlichen identisch gelabelt, wobei dasselbe Label-Verfahren bezüglich anderen einer Klasse solcher Sonden-Kompositionen verwendet wird.
Eine Genom-DNA-Ziel-Komposition wird vorbereitet (siehe Box 33 in Fig. 2A/2B), welche das gesamte Genom repräsentiert, daß das eine ausgewählte Chromosom enthält. Die Ziel-Komposition umfaßt eine der folgenden Möglichkeiten:
a) das gesamte vollständige multi-chromosomale Genom, dessen eine Komponente das eine Chromosom der ausgewählten Regionen ist;
b) DNA-Fragmente, welche zusammen die DNA des gesamten Genoms enthalten;
c) wenigstens ein Fragment oder Bereich des Genoms, welches das eine Chromosom oder Sequenzfragmente enthält, welche zusammengenommen das eine Chromosom enthalten;
d) eine Bibliothek, welche aus dem gesamten Genom abgeleitet ist; oder
e) eine Bibliothek, welche aus wenigstens einem Fragment (oder Teil) eines Genoms abgeleitet ist, wobei das Fragment das eine Chromosom enthält.
Es ist derzeit sehr bevorzugt, die (obige) Möglichkeit (a) als Ziel-Komposition zu verwenden; dies aus Gründen, die mit der Einfachheit bei der Beobachtung, der Charakterisierung und der genauen Quellenidentifikation der hiermit hergestellten Hybride zusammenhängen.
Jede der Sonden-Kompositionen, welche in dem Verfahrensschritt nach Box 32 hergestellt wurde, wird dann unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Probe der Ziel-Komposition hybridisiert (siehe Box 34 in Fig. 2A/2B), welche im Schritt nach Box 33 präpariert wurde.
Beispielsweise kann man durch das Binden von fluoreszierend gelabeltem Avidin an die hybridisierte biotinderivatisierte Sonde Hybride direkt beobachten, und durch mikroskopische Untersuchung unter einem mit Fluoreszenz-Auswertung ausgestattetem Miskroskop läßt sich bestimmen, wo entlang einer gegebenen Chromosomenstruktur Hybridisierung aufgetreten ist. Die Kenntnis eines solchen Ortes ist erwünscht, um den Charakter der DNA-Sequenz in der speziellen auszuwertenden Sonde herauszufinden und um ferner herauszufinden, ob die Sequenz komplementär zu einer DNA-Sequenz in der ausgewählten Region des einen Chromosoms ist.
Während ein Hybridisierungsverfahren durch eine beliebige geeignete Technik ausgeführt werden kann, ist es derzeit bevorzugt, ein Hybridisierungsverfahren vom in situ- Typ einzusetzen. Ein derzeit bevorzugtes in situ-Hybridisierungsverfahren ist beschrieben von D. Pinkel et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 9138-9142 (1988), wobei die RNAse-Behandlung fortgelassen wird sowie die Proteinase-K-Behandung und die Formaldehyd-Fixierung.
Somit wird die Ziel-Komposition als Probenschicht auf einem zentralen Bereich einer Seite eines herkömmlichen mikroskopischen Glasträgers angeordnet. Es können Verfahren zur Trägerpräparation verwendet werden, die in der Technik gut bekannt sind; beispielsweise sind geeignete Verfahren beschrieben bei J. M. Trent, et al. in Methods in Enzymology 151 : 267-279 (1987).
Individuelle Charakteristika von Ziel-Kompositionen auf Trägerschichten können selbstverständlich stark variieren. Es ist bequem und derzeit bevorzugt, eine Träger-Zielregion zu verwenden, in welcher die Zellkerne und die Metaphasen gut verteilt sind. Typischerweise wird eine Region auf der Trägerfläche von etwa 400² mm verwendet, wenngleich Träger-Proben-Flächen mit verschiedenen Charakteristika im Hinblick auf die Größe verwendet werden können. Jede Zielschicht bzw. jede Zielregion ist vorzugsweise im wesentlichen identisch zu den anderen Schichten, welche gleichzeitig bei einem gegebenen Hybridisierungsverfahren zur Auswertung aller Sonden-Kompositionen einer gegebenen Sonden-Kompositionen-Klasse verwendet werden.
Bevorzugt sollte auch jede individuelle Sonden-Komposition unter Verwendung von mehr als einer individuellen aufgebrachten Trägerschicht ausgewertet werden, um Fehler zu vermeiden und die Verläßlichkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Derzeit ist es bevorzugt, jede Sonden-Komposition bezüglich zweier Schichten auszuwerten.
Nachfolgend wird ein Überprüfungs- und Identifikationsverfahren bezüglich aller Hybride, die in dem Schritt nach Box 34 hergestellt wurden, durchgeführt (siehe Verfahrensschritt Box 35 in Fig. 2A/2B), um zu identifizieren, welche Sonden-Zusammenstellungen komplementär zu den Ziel-DNA-Sequenzen sind, welche sich innerhalb der ausgewählten chro mosomalen Region befinden. Somit wird aus den derart hergestellten Hybriden wenigstens eine einzelne DNA-Sequenz einer Sondenkomposition identifiziert, welche zu wenigstens einem repetitiven DNA-Segment komplementär ist und welche in der ausgewählten Region vorliegt. Vorzugsweise wird nur eine DNA-Sequenz ausgewählt.
Die Anzahl der Fluorophorreste an einer einzelnen optischen Punktquelle, welche zur Sichtbarmachung erforderlich ist, variiert stark, hauptsächlich basierend auf vier Charakteristika:
1. Die Absorption und die Quantenausbeute des verwendeten Fluorophors. Verschiedene Fluorophorreste weisen starke Differenzen sowohl bezüglich der Absorption als auch der Ausbeute auf.
2. Die Stärke der Anregungsbeleuchtung. Es werden im allgemeinen viele Lampen mit variierender Gesamtleistung und intensität bei gegebenen Wellenlängen verwendet. Die Effizienz der optischen Anordnung, welche das Licht zur Probe überträgt, variiert stark bei den verschiedenen Mikroskopmarken und -modellen.
3. Die Effizienz, mit welcher das emittierte Licht gesammelt und an den Beobachter übertragen wird. Wiederum variiert die Qualität der zum Erzeugen der beobachteten Bilder verwendeten optischen Anordnung bei den verschiedenen Mikroskopmarken und -modellen stark.
4. Die Sensitivität des Beobachters. Das durchschnittliche menschliche visuelle Ansprechen auf verschiedene Farben variiert über das Spektrum, wobei diese bei den unteren und den oberen Wellenlängen relativ stark abfällt. Der Beobachter kann Zugriff auf das elektronische Abbildungs-Equipment haben oder nicht, was in starkem Maße seine Sensivität bezüglich des Nachweises verstärken kann.
Wegen all dieser Gründe wird nun angenommen, daß es keinen befriedigenden Weg gibt, genaue und sinntragende quantitative Daten bezüglich der Beziehung zwischen der Anzahl an vorhandenen Fluorophoren an einem Ort und der Fähigkeit des Beobachters, diese Fluorophore zu sehen, bereitzustellen. Es wird derzeit bevorzugt, einen empirischen Weg zur Auswertung der Signalstärke zu gehen. Somit können Reagenzien von einer Anzahl von Beobachtern getestet werden, welche alle wahrgenommene Signalstärken auswerten.
Derzeit wird ein indirektes Labeln bei diesem Sequenz-Auswahlschritt bevorzugt, da die Bedingungen zum Ausführen dieses Labelns und der Auswahl im Stand der Technik bereits funktionieren. Das direkte Labeln mit Fluorophoren ist ebenfalls erwünscht, wie vorliegend gelehrt.
Geeigneterweise wird eine Sequenzauswahl unter Verwendung eines Hybridisierungsverfahrens verwendet, vorzugsweise ein in situ-Hybridisierungsverfahren, wie es etwa von Pinkel et al. (oben zitiert) gelehrt ist.
Alternativ können Hybridisierungen zu Membranen ausgeführt werden, wo Probenpunkte vorliegen, die aus DNA eines Ziel- Chromosoms zusammengesetzt sind sowie andere Probenpunkte, die aus DNA von den Nicht-Ziel-Chromosomen zusammengesetzt sind. Eine Auswahl kann so erfolgen, daß eine Hybridisierung einer derartigen Gruppe von Proben ausgeführt wird, wobei die Sonden, welche zu dem Ziel hybridisieren, identifiziert werden, jedoch nicht die Nicht-Ziel-Probenorte.
Auf Grundlage einer solchen Prüfung und Identifizierung (Verfahrensschritte Box 35) wird die Quellen-Klon-Kolonie für jede derart ausgewählte DNA-Sequenz ausgewählt, und es wird eine Probe entnommen (siehe Verfahrensschritte Box 36 in Fig. 2A/2B). Ein solches Verfahren wird in einfacher Weise mit Verfahrensaufzeichnungen ausgeführt, welche die Quellenkolonie identifizieren, die zum Herstellen jeder individuellen Sonden-Komposition verwendet wird.
Zellen der als Probe entnommenen Kolonien, welche die ausgewählten DNA-Sequenzen enthalten, werden fermentiert (d. h. kultiviert; siehe Verfahrensschritt Box 37 in Fig. 2A/2B). Jede Kolonieprobe kann separat kultiviert werden. Wenn erwünscht, können die Bedingungen zum Kultivieren so wie oben beschrieben gewählt werden.
Wenn mehr als eine DNA-Sequenz identifiziert und ausgewählt wird, ist es bevorzugt, daß jede Sequenz separat, so wie hier beschrieben, weiter behandelt wird. Fachleute werden ohne weiteres verstehen, daß dies für zwei oder mehr DNA- Sequenzen möglich ist, indem die vorgenannten Verfahrensschritte ausgeführt werden, wenngleich die Auswahl von nur einer derzeit bevorzugt ist.
Die resultierenden, kultivierten (fermentierten) Kolonien werden dann extrahiert (siehe Verfahrensschritt Box 38 in Fig. 2A/2B), wobei ein Verfahren, wie etwa oben erwähnt, verwendet wird, um so eine verwendbare Menge von jeder ausgewählten klonierten DNA-Sequenz zu isolieren. Diese klonierte DNA-Sequenz ist einer einzelnen ausgewählten Region des einen Chromosoms komplementär, und sie enthält wenigstens ein repetitives DNA-Segment, welche in dieser Region vorliegt.
Typischerweise und vorzugsweise enthält ein solches ausgewähltes, kloniertes repetitives DNA-Segment etwa 1.000 bis etwa 12.000 bp, wenngleich das Maß größer oder kleiner sein kann als oben erwähnt.
Typischerweise enthält ein kloniertes DNA-Sequenz-Produkt wenigstens etwa 18 Molprozent an Nukleotiden, welche Desoxycyxtidin-Rückstände sind (basierend auf der gesamten Sequenz-Nukleotid-Komposition). Im Falle des Humangenoms haben diese DNA-Sequenzen typischerweise einen höheren A/T- Anteil als bei den durchschnittlichen Genom-Sequenzen beobachtet wird.
Ein solches kloniertes DNA-Sequenzprodukt, welches derart hergestellt ist, ist mit Bezug auf alle Chromosomen eines multichromosomalen Genoms einzigartig bezüglich einer ausgewählten Region des einen Chromosoms desselben, und es hat die oben erwähnten Charakteristika.
Alle Verfahren zum Isolieren chromosomspezifischer repetitiver DNA-Regions-Sonden sind letztlich durch die Erhältlichkeit divergenter repetitiver Sequenzen im interessierenden Genom beschränkt. Um eine Sequenz zu isolieren, welche als Sonde in einer Hybridisierungsprobe dienen kann, muß eine repetitive Sequenz für das erwünschte Chromosom existieren, welche sich ausreichend von ähnlichen Wiederholungen bei beliebigen anderen Chromosomen unterscheidet, welche bei der Hybridisierung zu unterdrücken sind. Es ist derzeit nicht bekannt, ob derartige Sequenzen bei allen menschlichen Chromosomen existieren. Es ist bekannt, daß für einige Chromosomen, z. B. 13 und 21 eine große Anzahl von Alphoid-Sequenzen bei beiden Chromosomen vorliegt. Abgesehen von der Isolierung einer Anzahl an Alphoid-Sequenzen, die bei den Chromosomen 13 und 21 vorliegen, gibt es keinen Beitrag in der Literatur bezüglich einer Alphoid- DNA, die von einem der Chromosome 13 oder 21 abgleitet ist und welche spezifisch nur zum ursprünglichen Chromosom in einer in situ-Hybridisierungsprobe hybridisiert werden kann.

(D) Sondenherstellung

(1) Allgemein

Für Fachleute ist es verständlich, daß es im Stand der Technik viele Verfahren zum Assoziieren einer Nukleotid- Sequenz oder mehrerer Nukleotid-Sequenzen, die in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurden, mit einem Label oder mit Labeln zum Herstellen einer Sonde gibt. Derartige verschiedene Verfahren des Standes der Technik sind beispielhaft in der selbsterklärenden Fig. 3 veranschaulicht und zusammengefaßt.
Sonden aus derartigen Sequenzen weisen vorzugsweise Label auf, die zum direkten Nachweis geeignet sind.
Eine direkte Label-Sonden-Komposition mit exzellenter Fähigkeit zum Ausbilden eines Hybrids und exzellentem charakteristischem Sonden-Verhalten für regionale, chromosomale, selektive Färbezwecke bei der in situ-Hybridisierung wird zur Verfügung gestellt, wenn eine Sonden-Komposition eine Mischung aus DNA-Segmenten aufweist, welche aus einer klonierten DNA-Sequenz dieser Erfindung abgeleitet ist. Die Segmente sind chemisch an Fluorophorgruppen über Kupplungsgruppen gebunden.
Somit werden bei einem derzeit bevorzugten und beispielhaften Herstellungsverfahren die folgenden Schritte ausgeführt:
(a) Fragmentieren von Sequenzen mit einer regionsmäßig ausgewählten chromosomalen DNA in DNA-Fragmente (oder -Segmente);
(b) Transaminieren von Desoxycytidin-Nukleotiden, die in den Sequenzen vorliegen (und folglich ebenso in den abgeleiteten Segmenten) mit einer Kupplungsverbindung (wie oben beschrieben); und
(c) kovalentes Binden restlicher Reste der so hergestellten transaminierten Kupplungsgruppen mit einer fluoreszenten Verbindung (wie oben beschrieben).
Dieses Verfahren und die damit hergestellten Direkt-Label-Sonden-Kompositionen sind bei Bittner et al. (WO-A- 9205185) beschrieben (siehe oben).

(2) Fragmentieren

Die DNA-Segmente, welche bei den Sonden-Kompositionen dieser Erfindung verwendet werden, werden von einer klonierten, regionalen, chromosomalen Start-DNA (präpariert wie hier beschrieben) abgeleitet, wobei ein Verfahren verwendet wird, welches in den oben zitierten Anmeldungen von Bittner et al. gelehrt wird. Die DNA-Segmente weisen bevorzugt eine durchschnittliche Größe auf, welche im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 bp liegt, wobei derzeit die bevorzugte Durchschnittsgröße bei etwa 200 bis etwa 400 bp liegt; derzeit am meisten bevorzugt liegt die Segmentgröße bei etwa 300 bp.

(3) Transaminierung

Bei der Transaminierung von Polynukleotiden wird nur ein geringer Prozentsatz aller Desoxycytidin-Hasen, welche in den chromosomalen, regionalen Start-DNA-Sequenzen und ihren -Segmenten enthalten sind, mit einer Aminogruppe einer di funktionellen Kupplungsverbindung (wie oben beschrieben) in der Kohlenstoff-4-Atom-Position (C-4) der Aminogruppe der Desoxycytosin-Nukleotide transaminiert. Das Ausmaß einer solchen Transaminierung ist derart, daß zwischen etwa einem und etwa 30 Molprozent aller Desoxycytidin-Nukleotide, welche in einer Startmischung eines DNA-Segments vorliegen, welches stellvertretend für eine bestimmte regionale chromosomale DNA ist, auf diese Weise durch eine solche Kupplungsgruppe substituiert. Vorzugsweise werden etwa 2 bis etwa 24 Molprozent aller Desoxycytidin-Nukleotide, welche in einer solchen Mischung aus Start-DNA-Sequenzen oder DNA- Fragmenten auf diese Weise transaminiert. Somit werden im allgemeinen etwa 0,2 bis etwa 8 Molprozent und vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 6 Molprozent aller Nukleotide, die in den DNA-Fragmenten oder Sequenzen vorliegen transaminiert. All diese Transaminierungen betreffen im wesentlichen nur Desoxycytidin-Nukleotide.
Der effektivste Prozentsatz der Transaminierung in einem beliebigen Moment ist typischerweise durch den speziellen fluoreszierenden Labelanteil beeinflußt, welcher zu verwenden ist. Da die Durchschnittsanzahl an Hasenpaaren, welche in einer Sequenz vorliegt, vorzugsweise wenigstens etwa 150 beträgt, wie oben erwähnt, wird jede dieser Sequenzen wie erwünscht somit vorzugsweise durch wenigstens eine Kupplungsgruppe während des Transaminierungs-Verfahrens substituiert.
Die Transaminierung kann in geeigneter Weise unter Bedingungen einer wässrigen flüssigen Phase in Gegenwart eines Hydrogensulfit-Katalysators erfolgen, wie in den oben zitierten Anmeldungen von Bittner et al. gelehrt.
Bei dem vorliegenden Transaminierungs-Verfahren wird das Hydrogensulfit geeigneterweise in Form eines Alkalimetall- Salzes zugeführt, wobei die bevorzugten Alkalimetalle Natrium und Kalium sind.
Die vorliegende Transaminierungsreaktion wird ausgeführt oder fortgeführt bis ein erwünschtes Ausmaß an Transaminierungen der Start-DNA-Sequenz-Mischung oder der Start- DNA-Segment-Mischung erhalten wurde. Im allgemeinen wird das maximale Ausmaß an Transaminierungen durch das Niveau der Transaminierungen bestimmt, welche entweder einen Gegeneffekt zu dem komplementären Charakter der beteiligten Nukleotid-Sequenzen oder -Segmente verursacht oder beginnt, diesen zu verursachen, oder durch eine Zunahme der Menge nichtspezifischer Assoziationen der nachfolgend gelabelten Sonde mit Ziel-DNA oder anderen Bestandteilen einer Ziel- DNA, wie sie in einer Probe, einem Trägerpräparat oder dergleichen vorliegen, während der Hybridisierung unter Verwendung einer Sonden-Komposition dieser Erfindung.
Eine Mischung, welche aus einem Transaminierungs-Verfahren resultiert, das der Lehre der vorliegenden Erfindung entspricht, kann geeigneterweise weiterverarbeitet werden. Derzeit ist bevorzugt, eine solche Produktmischung gegen einen verdünnten wässrigen Puffer, wie etwa Natriumborat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) oder dergleichen mit einem pH von etwa 8 mit einer gewöhnlichen dialysierenden Membran bei Raumtemperatur zu dialysieren.
Die resultierende Mischung transaminierter Nukleotid-Sequenzen oder -Segmente wird dann geeigneterweise aus der so dialysierten Mischung ausgefällt, woraufhin die Sequenz aus der obenstehenden Substanz durch Filtrieren, Zentrifugieren oder dergleichen getrennt wird.

(4) Transaminierung mit Chaotropen

Diese Erfindung stellt ein bevorzugtes Transaminierungs- Verfahren zur Verfügung, welches in Anwesenheit eines chaotropen Anions in dem wässrigen Transaminierungs-Medium ausgeführt wird. Ein solches chaotropes Anion hält die Denaturierung der Nukleotidsequenz während des Transaminierens aufrecht oder verlängert diese. Das chaotrope Anion, welches von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt wird, ermöglicht es, die DNA-Sequenzen, die der wässrigen hydrogensulfitkatalysierten Transaminierung unterzogen werden, in einem im wesentlichen einstrangigen oder denaturierten Zustand zu erhalten. Wenn ein solcher Zustand nicht existiert, ist es sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, DNA einförmig und kontrollierbar zu transaminieren und die Anzahl der Orte in DNA-Sequenzen oder -Segmenten zu regulieren, an denen die Kupplungsgruppe an den Desoxycytidin-Nukleotiden substituiert wird.
Während das vorliegende Verfahren zum Erreichen einer Transaminierung mit den hier bereitgestellten Chaotropen mit Bezug auf die Erzeugung der vorliegenden erfindungsgemäßen Sonden-Kompositionen veranschaulicht ist, ist es verständlich, daß dieses Verfahren allgemein zum Transaminieren von Desoxycytidin-Zellkernen in Polynukleotid-DNA geeignet ist, welche wenigstens ein Desoxycytidin-Nukleotid pro Molekül enthalten, unter Bedingungen einer wässrigen flüssigen Phase mit einer Hydrogensulfit-Anionen-Katalyse mit einer einen Aminrest enthaltenden Verbindung, wie etwa einer oben beschriebenen Kupplungsverbindung, welche wenigstens einen funktionellen (d. h. reaktiven) Rest aufweist, wobei einer dieser Reste eine Aminogruppe ist.
Somit verwendet die Technik zum chaotropen Transaminieren, welche durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt wird, eine Start-DNA-Nukleotid-Sequenz, welche wenigstens ein Desoxycytidin-Nukleotid pro Nukleotid-Sequenzmolekül aufweist. Die Technik wird in einem wässrigen Medium ausgeführt, in dem die Sequenz mit gelöstem Hydrogensulfit, gelösten chaotropen Trihalogenacetat-Anionen sowie gelösten funktionellen Verbindungen mit Aminogruppen in Kontakt gebracht wird. Durch das Regulieren der Kontaktbedingungen und der Menge vorliegender chaotroper Anionen kann der Grad der Sequenz-Transaminierung so kontrolliert werden, daß ein statistisch erwünschter Prozentsatz von allen Desoxycytidin-Nukleotidanteilen, die in jeder Sequenz vorliegen, transaminiert wird. Vorzugsweise wird ein zu tansaminierendes Polynukleotid in Gegenwart der chaotropen Anionen vorläufig einem thermalen Denaturierungsverfahren unterworfen. Beispielsweise wird das Start-Polynukleotid in Wasser über einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 12 Minuten gekocht, gefolgt von einem Abkühlen auf eine Temperatur, welche vorzugsweise unter etwa 4 C liegt. Das chaotrope Anion hält darauf das Polynukleotid während der nachfolgenden Transaminierungs-Reaktion in einem denaturierten Zustand.
Wenngleich DNA bereits mit wässrigem Hydrogensulfit und Amin transaminiert wurde, wurde eine Transaminierung von DNA mit einem solchen chaotropen Anion bisher, so weit bekannt, niemals ausgeführt.
Im vorliegenden Zusammenhang ist ein Chaotrop ein Ion, welches einen relativ großen Radius aufweist, eine negative Ladung und eine geringe Ladungsdichte und welches die Konfiguration einer Nukleinsäure effektiv ändert. Bei einer Transaminierung unter Verwendung einer wässrigen Hydrogensulfit-Lösung arbeitet das Chaotrop so, daß das Vorliegen einer DNA-Sequenz in wenigstens einer teilweise einstrangigen (d. h. denaturierten) Form gefördert, aufrechterhalten und/oder verlängert wird.
Beim Transaminieren einer Mischung aus DNA-Sequenzen oder -Segmenten mit einer wässrigen Hydrogensulfit-Lösung kann gemäß einer allgemeinen Theorie ein chaotropes denaturierendes Salz oder ein organisches denaturierendes Lösungsmittel erwünscht sein, jedoch ist in der Praxis ein solches Denaturierungsmittel schwer aufzufinden oder zu verwenden, entweder, weil es die Kristallisation einer oder mehrerer in dem wässrigen Transaminierungs-Medium enthaltenen Komponenten induziert und somit deren effektive Konzentration in unerwünschter Weise vermindert, oder weil es mit einer oder mehreren der vorliegenden Komponenten reagiert. Überraschenderweise weisen die chaotropen Anionen der vorliegenden Erfindung nicht diese Nachteile auf.
Bei einer DNA-Transaminierung mit wässrigem Hydrogensulfit wurde festgestellt, daß überraschenderweise nur Trihalogenacetate eine ausgeglichene Balance der Eigenschaften zur Verwendung als DNA-denaturierende chaotrope Anionen aufweisen. Während ein Trifluoracetatanion als Chaotrop über einen großen Konzentrationsbereich nützlich ist, ist ein Trichloracetatanion nur bei Konzentrationen unter etwa 1M nützlich, da die Tendenz dieses Anions vorliegt, bei einer oder mehreren Komponenten, die in dem wässrigen Transaminierungsmedium bei höheren Konzentration vorliegen, eine Kristallisation zu bewirken. Jedoch kann das Trichloracetatanion als Beimischung zu dem Trifluoracetatanion verwendet werden. Es sind keine anderen geeigneten denaturierenden transaminierenden Chaotrope bekannt.
Die bei dem vorliegenden Transaminierungs-Verfahren verwendeten Trihalogenacetatanionen als Chaotrope werden geeigneterweise als Alkalimetall-Salze in das wässrige Transaminierungs-Medium gegeben, wobei Natrium- und Kalium-Kationen die bevorzugten Alkalimetalle sind. Die Trihalogenacetatanionen werden aus der Gruppe mit Trichloracetat, Trifluoracetat und Mischungen derselben ausgewählt. Trifluoracetatanionen sind aus Gründen der Löslichkeitscharakteristika und der relativ geringen Anionengröße bevorzugt.
Nach dem Transaminieren zwischen der DNA und der Kupplungsverbindung verbleibt eine funktionelle Gruppe der Kupplungsverbindung frei, um weiter mit einer Label-Gruppe zu reagieren, die eine Verbindung aufweist, welche selbst eine reaktive Gruppe enthält, die mit einer solchen verbleibenden funktionellen Gruppe reagieren kann.
Aufgrund des Vorliegens der zugefügten chaotropen Trihalogenacetatanionen zu dem Hydrogensulfit, können die Reaktionsvariablen über Regionen variiert werden, wie sie veranschaulichend unten in Tabelle II gezeigt sind. Somit läßt sich ein erwünschter Transaminierungsgrad mit einem vorgegebenen Kupplungsverbindungs-Reaktionspartner bei einem beliebigen erwünschten Niveau erreichen, welches zwischen vollständiger (100%) bis teilweiser (z. B. etwa 0,5 Molprozent oder weniger) Transaminierung von Desoxycytidin-Nukleotidrückständen, die in einer Nukleotid-Sequenz vorhanden sind, liegt. Jedoch liegt für die vorliegenden transaminierten Zwischensequenzen, welche dem Zwecke der Sonden- Produktion dienen sollen, das Maximalniveau der Transaminierung gewöhnlich nicht höher als etwa bei 30 Molprozent eines solchen Rückstandes. TABELLE II Variablen bei der DNA-Transaminierung mit Amin, Hydrogensulfit und Trihalogenacetat
Während die vorliegende Tansaminierungs-Reaktion mit den Chaotropen über einen relativ großen pH-Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,5 ausgeführt werden kann, wurde festgestellt, daß ein pH im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 6,0 eine konkurrierende Seitenreaktion bewirkt, welche eine Konvertierung einiger Desoxycytidin-Rückstände zu Desoxyuridin-Rückständen bewirkt. Eine solche Konversion ist im allgemeinen unerwünscht, da sie dazu tendiert, eine Produkt- DNA-Sequenz nach sich zu ziehen, welche nicht mehr vollständig komplementär zur selben Ziel-DNA-Sequenz ist. Daher ist es in der Praxis der Sondenherstellung bevorzugt, wäh rend einer bevorzugten Transaminierung, welche der Lehre der Erfindung entspricht, pH-Werte im Bereich von etwa 6,5 bis 7,5 und bevorzugt einen pH von etwa 7 +/- 0,2 zu verwenden.
Die vorliegende Transaminierungs-Reaktion mit Chaotropen wird ausgeführt oder fortgesetzt, bis ein erwünschtes Maß an Transaminierung der Start-Sequenz oder Segmentmischung vorliegt. Im allgemeinen wird das maximale Maß einer erreichten Transaminierung durch das Niveau der Transaminierung bestimmt, welches einen Gegeneffekt bezüglich des komplementären Charakters der beteiligten Nukleotid-Sequenz(en) veranlaßt bzw. damit beginnt. Typischerweise und beispielhaft liegt die Zeitdauer im allgemeinen in dem in der obigen Tabelle II gezeigten Bereich.
Eine Mischung, welche aus einer Transaminierung resultiert, die der vorliegenden Erfindung entspricht, kann geeigneterweise, wie oben beschrieben, weiterverarbeitet werden. Derzeit ist es vorteilhaft, eine solche Produktmischung gegen ein kohlenstoffarmes Alkalimetall-Monoalkanoat zu dialysieren, um daraus im wesentlichen alle vorliegenden Nicht-Alkanoat-Salz-Anionen abzutrennen. Bevorzugte Alkalimetalle sind wiederum Natrium und Kalium, und bevorzugte kohlenstoffarme Monoalkanoate enthalten jeweils weniger als 5 Kohlenstoffatome.
Die resultierende transaminierte Nukleotid-Sequenz wird dann geeigneterweise aus der derart dialysierten Mischung ausgefällt, und die Sequenz wird daraufhin aus der oben stehenden Substanz durch Filtrieren, Zentrifugieren oder dergleichen abgetrennt.
Im allgemeinen wird eine Transaminierung, welche gemäß der Erfindung zum Zwecke der Herstellung einer Sonden-Komposi tion ausgeführt wird, fortgesetzt, bis der Gew.-% -Satz der vorliegenden aminierten Nukleotide innerhalb der oben gezeigten Bereiche liegt.
Es wurde herausgefunden, daß es eine hier gelehrte hydrogensulfitkatalysierte Transaminierung von Polynukleotiden (d. h. DNA-Sequenzen und/oder DNA-Segmenten) mit chaotropen Anionen ermöglicht, eine neue und bisher nicht erhältliche Klasse transaminierter Polynukleotide zu erzeugen. Diese Klasse umfaßt:
(a) eine wässrige Lösung mit wenigstens etwa 20 ug/ml an darin gelösten Polynukleotiden,
(b) die Polynukleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie nicht weniger als etwa 1 · 10¹&sup0; komplementäre sequentielle DNA-Kopien pro ug der Polynukleotide enthalten (auf Trockengewichtsbasis), und
(c) die Polynukleotide sind bei etwa 12 bis etwa 30 Molprozent ihrer Desoxycytidin-Nukleotide mit einer Kupplungsgruppe substituiert.
Bei dieser Klasse wird ein höherer Prozentsatz bei der Transaminierung konzentrierter segmentierter DNA in wässriger Lösung für Polynukleotide erreicht, welche eine relativ geringe Komplexität aufweisen, was durch die genannte Anzahl an komplementären sequentiellen Kopien pro Mikrogramm (ug) der Polynukleotide gezeigt wird, im Vergleich zu dem was durch Lehren des Standes der Technik erreichbar ist. Somit ist die Verwendung einer thermische Denaturierung, wie oben beschrieben, nützlich, um Denaturierungen zu erreichen, jedoch tendieren solche denaturierten Polynukleotide dazu, sich wieder zusammenzufügen und den Start- oder den anfänglichen doppelstrangigen Zustand wieder recht schnell während der nachfolgenden Transaminierung auszubilden. Somit wird angenommen, daß das Maximalniveau der Transaminierung mit Kupplungsverbindungen, welches bei Desoxycytidin-Nukleotiden mit thermische Denaturierung (ohne die vorliegenden Chaotrope) und Hydrogensulfit-Katalyse erreichbar ist, bei nur etwa 7 bis nicht mehr als etwa 12 Molprozent liegt (basierend auf allen Desoxycytidin-Nukleotiden, die bei den derart transaminierten Polynukleotiden vorliegen).
Das Vorliegen zu dem Transaminierungsmedium addierter Chaotrope nach der anfänglichen thermalen Denaturierung dient dazu, die Polynukleotide in einem einstrangigen Zustand während der Transaminierungs-Reaktion zu halten, wodurch nicht nur die Kontrolle der Transaminierung gestattet wird, sondern auch höhere erwünschte Transaminierungs-Niveaus mit Kupplungsverbindungen an Desoxycytidin-Nukleotiden erreichbar sind als bislang möglich war.
Da hohe Konzentrationen transaminierter Polynukleotide erwünscht sind, um es zu gestatten, Produkte wässriger Sonden-Kompositionen herzustellen, welche hohe Sonden-Konzentrationen aufweisen, und da die klonierten DNA-Sequenzen, welche aufgrund der Lehre der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, im allgemeinen (vor oder nach der Fragmentierung) etwa 30 · 10¹&sup0; bis etwa 40 · 10¹&sup0; komplementäre sequentielle DNA-Kopien pro ug solcher Sequenzen aufweisen (auf Basis des Trockengewichtes), sind dieses chaotrope Aminierungsverfahren und das resultierende neue transaminierte Zwischenprodukt (wie oben beschrieben) wichtige Gesichtspunkte dieser Erfindung.
Somit liegt bei einer derzeit bevorzugten hydrogensulfitkatalysierten Transaminierung mit Chaotropen das Polynukleotid, welches in dem wässrigen Reaktionsmedium transaminiert wird, in Form von DNA-Segmenten vor, die eine Durchschnittsgröße im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 bp aufweisen. Die Konzentration solcher Segmente beträgt wenigstens etwa 20 ug/ml, und derartige Segmente umfassen nicht weniger als etwa 1 · 10 komplementäre, sequentielle Kopien pro pg der Segmente (auf Trockengewichtsbasis). Vorzugsweise werden solche Segmente durch das Fragmentieren einer klonierten DNA-Sequenz hergestellt, welche durch das Ausführen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde und komplementär zu einer Region eines Chromosoms ist.

(5) Verbindung mit eines fluoreszierenden Verbindung

Ein resultierendes transaminiertes, aminsubstituiertes Nukleotid-Derivat, welches wie oben beschrieben hergestellt wurde, ist erhältlich, um sich, wie oben beschrieben, mit einer reaktiven fluoreszierenden Verbindung, welche einen Fluorophor-Rest aufweist, zu verbinden, wobei eine solche fluoreszierende Verbindung mit einem endständigen, funktionellen Amino- oder Carboxyl-Rest, welcher mit dem Rest der Kupplungsverbindung (d. h. der Kupplungsgruppe) assoziiert ist, welche nunmehr, wie oben beschrieben, in einen Desoxycytidin-Anteil transaminiert wurde. Das kovalente Bindungsverfahren, welches in den oben zitierten Anmeldungen von Bittner et al. beschrieben ist, ist geeignet und derzeit bevorzugt.
Es wird angenommen, daß bei der Reaktion eine kovalente Verbindung zwischen einer reaktiven Gruppe, die in einer fluoreszierenden Startverbindung vorliegt, und der end ständigen reaktiven Gruppe einer transaminierten Kupplungsgruppe (abgeleitet von einer Kupplungsverbindung) auftritt, welche mit einer DNA-Sequenz assoziiert ist. Wenigstens eine endständige Gruppe einer Kupplungsgruppe pro Molekül reagiert mit der verwendeten fluoreszierenden Verbindung. Typischerweise reagieren etwa 20 bis etwa 100 Molprozent der endständigen Stellen der transaminierten Kupplungsgruppen, wobei sie fluoreszierend gelabelt werden. Vorzugsweise werden aus Gründen der Effizienz wenigstens etwa 80 Gew.-% derselben gelabelt, und am meisten bevorzugt ist es, daß etwa 90 Gew.-% derselben gelabelt werden.
Restliche Labelverbindungen, die am Ende der Reaktionszeit nicht kovalent an die Sonden angefügt sind, können durch eine Vielzahl von Verfahren entfernt werden, wie beispielsweise in den oben zitierten Anmeldungen von Bittner et al. gelehrt ist.
Das resultierende Reaktionsprodukt der transaminierten DNA- Sequenzen und er ausgewählten fluoreszierenden Verbindung umfaßt eine Sonden-Zusammensetzung.

(E) Verwendung

Diec Mikrofotographien der Fig. 4, 5 und 6 veranschaulichen Vorteile der klonierten Sequenzen dieser Erfindung und ebenfalls der chaotrop transaminierten Sequenzen, welche aus denselben mittels dieser Erfindung hergestellt wurden. Somit werden Sonden, welche aus solchen Sequenzen hergestellt wurden, durch diese Figuren beispielhaft dargestellt.
Die in der Mikrofotographie nach Fig. 4 verwendete Probe umfaßte gelabelte DNA-Segmente, welche spezifisch mit den Centromeren des menschlichen Chromosoms #8 hybridisierbar sind, wobei solche Segmente durch Fragmentieren (durch Schall, wie hier gelehrt) einer DNA-Sequenz hergestellt wurden, welche für das Centromer des menschlichen Chromosoms #8 spezifisch ist. Diese DNA-Sequenz wurde durch einen Klonierprozeß hergestellt, welcher von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt wird und welcher spezifisch in Beispiel 12 unten beschrieben wird. Die fragmentierten Segmente (durchschnittlich je 300 bp) wurden daraufhin mit Ethylendiamin transaminiert, wie hier beschrieben und wie unten im Beispiel 16 veranschaulicht. Daraufhin wurde die Mischung transaminierter DNA-Segmente mit Biotin gelabelt, wie unten in Beispiel 17 beschrieben. Das Hybridisierungsverfahren wurde so ausgeführt, wie es in Beispiel 17 unten beschrieben ist, und der nachfolgende Nachweis wurde durch eine auf die Hybridisierung folgende Inkubation mit Fluoreszein erreicht, welches mit Streptavidin konjugiert ist, wobei das unten in Beispiel 4 beschriebene Verfahren verwendet wurde. Die Fotographie wurde mit einem Filter aufgenommen, welches spezifisch für eine Fluoreszein-Fluoreszenz ist (bei Bittner et al., WO-A-92 05 185, als Filter 4 in TaTabelle V identifiziert), wobei keine Färbung (d. h. Lichtemission von Fluorophoren, die bei anderen Lichtfrequenzen emittieren) sichtbar ist, wie etwa von einem fluoreszierenden Gegenfarbstoff oder dergleichen.
Diese Fotographie veranschaulicht die Sichtbarkeit von Hybriden, die mit einer klonierten DNA-Sequenz gemäß der Erfindung gebildet sind, für die Centromerregion des Chromosoms #8 mit einem indirekten Labelanteil, wie er vom Stand der Technik zur Verfügung gestellt wird. Ebenso de monstriert die Fotographie den exzellenten komplementären Charakter dieser Start-Sequenz zum Zwecke der Hybridisierung mit dem Centromer des menschlichen Chromosoms #8, selbst wenn es mit einem indirekten Label gelabelt ist. Somit ist diese Start-Sequenz zur Verwendung als Sonde geeignet, selbst wenn sie indirekt gelabelt ist.
Es wird nun auf Fig. 5 Bezug genommen; es ist eine Ansicht einer anderen Trägerprobe zu erkennen, welche zwei menschliche Metaphase-Zellkerne und einen menschlichen Interphase-Zellkern zeigt. Die Metaphase-Chromosomen sind verteilt. Hier sind diese Chromosomen und Zellkerne nach einer in situ-Hybridisierung mit Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonden-Komposition dieser Erfindung dargestellt, welche spezifisch mit der Centromerregion des menschlichen Chromosoms #8 hybridisierbar ist. Das Hybridisierungsverfahren, welches unten im Beispiel 17 beschrieben ist, wurde danach ausgeführt. Diese Sonden-Komposition verwendet dieselbe DNA-Segment-Mischung, welche bei der indirekt gelabelten Sonden-Zusammenstellung verwendet wurde, die bei der Präparation der in Fig. 4 gezeigten Probe eingesetzt wurde. Diese Segmentmischung wurde identisch transaminiert, jedoch dann mit dem Fluorophor CTMR gelabelt, wobei das in Beispiel 17 unten beschriebene Verfahren verwendet wurde. Die in Fig. 5 gezeigte Fotographie wurde nach der Hybridisierung und dem Waschen aufgenommen. Keine Weiterverarbeitung, um eine Fluorophor-Entwicklung herzustellen, wurde durchgeführt, während diese bei indirekten Labelsonden erforderlich ist. Diese Fotographie wurde mit einem Filter aufgenommen, welches spezifisch für CTMR- Fluorophore ist. (Filter Nr. 7 in Tabelle V der zitierten, ebenfalls anhängigen Anmeldung von Bittner et al.).
Wie man in der Fotographie in Fig. 5 erkennen kann, sind nur die fluoreszierenden Sonden-Signale (4 Punkte) in einem im wesentlichen schwarzen Feld gut sichtbar. Der Unterschied zwischen den Bildern der Fig. 4 und 5 fällt auf, und der Vergleich ist angemessen, da die Proben identisch sind, abgesehen von ihren Labeln und den entsprechenden assoziierten Verwendungsverfahren.
Es wird nun auf Fig. 6 Bezug genommen; dort ist eine zweifach belichtete Mikrofotographie derselben Mikroskopträgerprobe dargestellt, welche in Fig. 5 gezeigt ist. Die hellen Punkte, welche eine Sondenbindung anzeigen, die in Fig. 5 zu sehen sind, sind nun gegen die Hintergrundfärbung des gesamten Genoms erkennbar, welches zu Vergleichszwecken von dem chemischen, fluoreszierenden DNA-Gegenfärbemittel DAPI erzeugt wurde, welches ebenfalls in Fig. 6 fotografiert ist. DAPI wurde verwendet, um diese Probe, so wie unten in Beispiel 17 beschrieben, zu behandeln. Der bei dieser Fotographie verwendete Filter war die Nr. 1 in Tabelle V der ebenfalls anhängigen Anmeldung von Bittner et al. Dieses DAPI-Gegenfärbemittel zeigt deutlich die Lokalisierung sowohl der Metaphase- als auch der Interphase-Zellkerne. Die Position der in Fig. 6 gezeigten Signalkerne fällt mit dem chromosomalen Material zusammen, welches mit DAPI gegengefärbt ist. Es ist weiterhin zu erkennen, daß die Färbung an den Centromeren der Chromosome lokalisiert ist. Im Vergleich zu Fig. 4 wird nur eine geringe Trübung (aufgrund von nichtspezifischer Färbung) beobachtet.

Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung wird weiterhin mit Bezug auf die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1. Matrize zur enzymatischen Ampflifikation von DNA, die aus einer Chromosomen-Bibliothek abgeleitet ist

Eine Plasmid-Bibliothek für das menschliche Chromosom 8 wurde von den Lawrence Livermore National Laboratories (LLNL) erhalten. Es handelt sich um ein Derivat der Hakteriophage-Lambda-Bibliothek, die bei der ATCC als #57702 hintergelegt ist. Das Klonieren dieser chromosomenspezifischen Bibliothek in Bakteriophage-Vektoren ist ausführlich beschrieben bei M. A. Van Dilla et al. in Bio/Technology 4: 37-552 (1986). Die Bakteriophage-Bibliotheken für die verschiedenen menschlichen Chromosomen sind von der American Type Culture Collection erhältlich. Die resultierenden Bibliotheken wurden daraufhin durch das Züchten eines E. coli-Wirtsstranges amplifiziert. Die amplifizierte Phage wurde gereinigt, und ihre DNA wurde extrahiert. Diese DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Hind III verdaut. Die eingefügte DNA wurde reinigend von der Lambda-Vektor-DNA entfernt und in die Hind-III-Stelle ("Hind III Site") der Plasmid-Vektor-pBS kloniert (Stratagene, La Jolla, CA). Dies ist ein ampicillinresistentes Plasmid-Derivat von pBR 322 mit einer hohen Kopienzahl. Die resultierenden Plasmide wurden zu einem E. coli-Strang, DH5α transformiert (Bethesda Research Libraries, Gaithersburg, Maryland). Die abgeleitete Plasmid-Bibliothek wurde in Form von 1-ml-Aliquoten gefrorener Zellen gespeichert. Diese Glasflächen wurden als primäre Quelle für die Herstellung von Samenstämmen für die Fermentierung verwendet.
Es wurde eine Erweiterung durch Fermentierung der Original- Bibliothek, welche von den LLNL erhalten wurde, erstellt, um Arbeitsstämme sowohl für die Fermentierung als auch für das Bibliothek-Screening zur Verfügung zu stellen. Die Her stellung der erweiterten Impfstämme aus der von den LLNL zur Verfügung gestellten Original-Bibliothek wird so erreicht, wie es im Beispiel 1 von Bittner et al. (WO-A-92 05185) beschrieben ist. Die Herstellung großer Mengen an DNA durch Fermentierung und Extraktion aus dieser Bibliothek wird so erreicht, wie es im Beispiel 1 der WO-A-92 05185 beschrieben ist.

Beispiel 2. Synthese von Oligonukleotid Primern

Eine degenerierte Mischung synthetischer Oligonukleotide wurde präpariert. Das Ausmaß der Degenerierung ist ausreichend, um es den Oligonukleotiden zu gestatten, als Primer für die meisten bekannten Alphoid-DNA-Sequenzen zu wirken, und es wurde daher erwartet, daß sie als Primer auf die Alpha-Satellit-Region des Centromers von Chromosom 8 wirken.
Diese Oligonukleotid-Mischung war aus zwei Oligonukleotiden zusammengesetzt, welche jeweils wie folgt identifiziert werden:
Primer 1: GAA GCT TA (A/T) (G/C)T(C/A) ACA GAG TT(G/T)AA
Primer 2: GCT GCA GAT C(A/C)C (A/C)AA G(A/C/T)A GTT TCT

Beispiel 3. Enzymatische Amplifikation unter Verwendung von Einzel-Chromosom-Matrizen

Unter Verwendung der Chromosom-8-Bibliothek, welche, wie im (obigen) Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, als Matrize und der Oligonukleotid-Mischung, welche, wie im (obigen) Beispiel 2 beschrieben, hergestellt wurde, als Primer-Komposition, wurde eine enzymatische Amplifikation wie folgt ausgeführt:
Alpha-Satellit-DNA-Regionen der aus der pHS8-Bibliothek extrahierten DNA wurden enzymatisch amplifiziert und durch eine sogenannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) biotinyliert, wie beschrieben in Mullis, K. H. et al. in Methods in Enzymology 155 : 355-350 (1987). Die Polymerase, die Nukleotide und die verwendeten Salze stammen aus dem "Perkin Elmer-Cetus GeneAmp kit", und sie werden in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen verwendet. Die Primer (siehe Beispiel 2) waren aus 7 Nukleotiden am 5'-Ende zusammengesetzt, welche eine Restriktions-Enzym-Erkennungsstelle spezifizieren, und aus 17,3'-Nukleotiden, basierend auf Alphoid-Sequenz-Mischungen, welche die 170-Hasenpaar- Alpha-Satellit-Wiederholungsregion des Centromers flankieren. Die Primer waren in der Reaktionsmischung (100u1) mit einer Konzentration von 1 uM vorhanden. Die Primer wurden mit 2,5 Einheiten Taq -Polymerase in einem Puffer gebunden, welcher 20 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2; und 0,01 · Gelatine enthielt.
Zwei Matrizen mit verschiedenen Größen wurden aus der pBS8-Bibliothek hergestellt; eine umfaßte mit Schall behandelte Dopelstrang-DNA (in einer Größe mit etwa 300-500 Basenpaaren), und die andere war eine Hind-III-Restriktions- Verdauung. Die restriktionsverdaute DNA-Matrize wurde durch Inkubation von 5 ug pBS8-Bibliotheks-DNA in eine 50 ul-Lösung hergestellt, welche aufwies: 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM CaCl und 20 Einheiten des Restriktionsenzyms Hind III (New England Biolabs, Beverly, MA) für eine Stunde bei 37º C. Die verdaute DNA wurde extrahiert.
25 ul Phenol und dann 25 ul Chloroform wurden addiert, und die Lösung wurde wiederum extrahiert. Die wässrige Phase wurde nach einminütiger Zentrifugierung bei 10.000 · g rückgewonnen, und die DNA wurde aus dieser Lösung durch den Zusatz von 5 ul 3M Natriumacetat und 150 ul Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren über 5 Minuten bei 10.000 · g rückgewonnen und vakuumgetrocknet. Die resultierende DNA-Verdauung wurde in 50 ul Wasser resuspendiert. Mechanisch gescherte DNA-Matrize wurde durch Schall hergestellt. Ein Branson-Sonifier 450 (Danbury, CT) wird für diesen Schritt verwendet. Vier Milligramm der im obigen Beispiel 1 hergestellten Plasmid- DNA werden in zwei ml Wasser in einer 12 · 75 mm Polypropylen-Röhre resuspendiert. Die Röhre wird in ein Trockeneis/- Ethanol-Bad eingeführt, um ein Sieden während der Behandlung mit Schall zu verhindern. Die Mikrospitze der Schallvorrichtung wird in diese Lösung eingeführt, bis die Spitze 2-5 mm von der Unterseite der Röhre entfernt ist. Die Schallbehandlung wird diskontinuierlich mit einem 80 prozentigen Arbeitszyklus (80% der Zeit eingeschaltet, 20 % der Zeit ausgeschaltet) über einen Zeitraum von 5 Minuten ausgeführt. Nach der Behandlung mit Schall wird die DNA- Lösung in eine 16 · 100 mm Polypropylen-Röhre mit Schraubkappe überführt. Die DNA-Fragmente werden zur Zufügung von 0.2 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 4 ml Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wird durch Zentrifugieren für 5 Minuten mit 8000 · g rückgewonnen. Die obenstehende Substanz wird entfernt und das Pellet wird vakuumgetrocknet. Die mit Schall behandelte DNA wird in Wasser mit einer Konzentration von 3 mg/ml resuspendiert.
Die Reaktionsmischungen bestanden aus einem 100 ul-Volumen unter Verwendung von 0,75 ug der jeweiligen DNA- Matrize, jede mit 200 um dCTP, dGTP, dATP, 100 uM dTTP, 100 uM Biotin-11-dUTP, 1 uM von jeder der beiden synthetischen Oligonukleotid-Primer-Mischungen. Das Reaktionsgemisch wurde mit 100 ul sterilem Mineralöl versetzt, und die Amplifikation wurde automatisch unter Verwendung des "Perkin Elmer Cetus (PEC) DNA-Thermal Cycler" durchgeführt. Fünfundzwanzig Amplifikationszyklen wurden verwendet. Jeder der ersten vierundzwanzig Zyklen bestand aus einer Minute Denaturierung bei 92º C, 2 Minuten Matrizen-Priming bei 37ºC und 3 Minuten Polymerisierung bei 72º C. Der abschließende Zyklus war eine 7-minütige Polymerisierungsperiode bei 72º C, gefolgt von einem Kühlen auf 4º C: Die PCR-Produkte wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 100 ul steriles Wasser resuspendiert.

Beispiel 4. Auswertung

Jedes PCR-Produkt wurde durch in situ-Hybridisierung getestet. Die Ziel-DNA stammte aus normalen weißen Blutkörperchen, welche in Metaphase gehalten und auf einem Mikroskopträger fixiert wurden. Jeder Träger wurde in eine Denaturierungslösung gegeben mit 70% Formamid/0,3 NaCl/30 mM Natriumcitrat pH 7 bei 70º C für fünf Minuten. Die Träger wurden darauf dehydriert, indem sie durch 70%ige 85%ige und 100%ige Ethanolbäder (jedes 2 Minuten) geführt und luftgetrocknet wurden.
Jede 10 ul Hybridisierungsmischung enthielt 1 ul PCRamplifiziertes Produkt in 55% Formamid/10% Dextransulfat/- 0,15 M NaCl/15 mM Natriumcitrat/l ug mit Schall behandelte Lachs-Sperma-DNA (als Träger verwendet). Die Hybridisierungsmischung wurde bei 70º C für fünf Minuten denaturiert und auf Eis gegeben. Der Träger wurde auf 37º C vorgewärmt, und die Hybridmischung wurde direkt auf den Träger gegeben, mit einem Deckglas abgedeckt, versiegelt und über Nacht bei 37º C in einer Feuchtkammer inkubiert. Die nicht umgesetzte amplifizierte DNA wurde durch drei fünfzehnminütige Wäschen in einer Lösung mit 50 % Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat pH 7 entfernt, gefolgt von einer einzelnen fünfzehnminütigen Wäsche in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat und dann einer fünfzehnminütigen Wäsche in 0,1 M Natriumphosphat/0,1% NP40 Reinigungsmittel (Oktylphenoxypolyethoxyethanol; ein nichtionisches Tensid, welches von Calbiochem, La Jolla, CA verkauft wird) alles bei 45º C. Der Träger wurde in einer Lösung mit fluoreszeingelabeltem Streptavidin (5 ug/ml) in einem 0,1 M Natriumphosphat-Puffer mit 5 % (v/w) Carnation Instant Milk über 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Der Träger wurde drei Mal mit zwei Minuten pro Waschung in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer bei Zimmertemperatur gewaschen. 7,5 ul eines Gegenfärbemittels mit 0,2 ug/ml Propidiumiodid in einer kompensierenden Lösung wurden eingesetzt, wobei eine Sichtbarmachung der Zellkern- und Chromosomenverteilung gestattet wurde. Ein Deckglas wurde über die gegengefärbte Region gebracht, und der Träger wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Die kompensierende Lösung wird hergestellt wie beschrieben in J. Immuno. Methods, 43 349 (1981). 100 Milligramm p-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma P 1519) wird in 100 Millilitern phosphatgepufferter Salzlösung gelöst. Der pH dieser Lösung wird mit einer Hydrogencarbonat-Pufferlösung auf pH 8 eingestellt, indem 0,42 g NaHCO&sub3; in 10 Milliliter Wasser gegeben werden, woraufhin der pH auf 9,0 durch das Zufügen von 50% (w/v) NaOH eingestellt wird. Die p-Phenylendiamindihydrochlorid-Lösung mit eingestelltem pH wird 90 Millilitern Glyzerin zugefügt, und die resultierende Lösung wird durch eine 0,22 u Filtriervorrichtung gefiltert. Diese Lösung wird im Dunkeln bei -20º C gelagert.
Die Ergebnisse der Hybridisierung zeigten etwa 8 diskrete Signale variierender Intensität innerhalb der Zellkerne als auch in der Metaphase der verteilten Chromosome. Die nichtspezifische Hybridisierung dar PCR-Produkte zu anderen Chromosomen als dem menschlichen Chromosom 8 könnte aus zwei sehr verschiedenen Gründen stattfinden. Die Nichtspezifität könnte eine echte Funktion der hergestellten Sequenzen sein. Dies würde man erwarten, wenn die amplifizierten Sequenzen tatsächlich bei anderen Chromosomen als dem Chromosom 8 vorlägen, jedoch weniger häufig als bei den anderen Chromosomen. Die anderen Mittel zum Erzeugen einer nichtspezifischen Hybridisierung könnte die Herstellung von PCR-Produkten sein, welche das Ergebnis einer unvollständigen Synthese der Matrize waren. Derartige kurze Produkte würden keine ausreichende Menge an DNA enthalten, um sicherzustellen, daß sie zuverlässig an das erwünschte Ziel gebunden würden. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, hat man sich entschlossen, kleine (< 170 bp) DNAs aus dem Reaktionsprodukt zu entfernen und die verbleibenden größeren DNA-Produkte auf ihre Spezifität zu testen. Um kurze Produkte aus der Sondenmischung zu entfernen, wurden die PCR-Produkte in einer Säule gereinigt, welche DNA auf Grundlage ihrer Größe fraktioniert. Jedes der Polymerase-Kettenreaktions-DNA-Produkte wurde individuell mit einer Mono-Q-Säule (eine Anionen-Austauschsäule, hergestellt durch Pharmazia) gereinigt, wobei ein automatisiertes "Fast Performance Liquid Chromatography"-System (FPLC) verwendet wurde. Eine 40 ul-Probe wurde unter Verwendung eines 0.075%/min-Gradienten analysiert, wobei mit 60% 0,4 M NaCl/20 mM Tris pH 8,3 begonnen wurde bis 75 % 1,4 M NaCl/20 mM Tris pH 8,3. Die Fließrate betrug 0,25 ml/min. es wurden Fraktionen zu einem Milliliter gesammelt und im Hinblick auf ihre Absorption bei 260 nm überwacht.
Drei DNA-Populationen - größer als monomer - wurden aus dem PCR-Produkt isoliert, wobei mit Schall behandelte DNA als Matrize verwendet wurde (171 bp, 513 pb und 1026 bp). Die PCR-Produkte, welche von der mit Hind III verdauten DNA abgeleitet wurden, hatten nur zwei Größen (513 bp und 1026 bp). Jede Population aus dem PCR-Produkt wurde mit Ethanol ausgefällt und in 25 ul steriles Wasser resuspendiert. Jede der isolierten DNA-Populationen wurden auf Chromosom- 8-Spezifität getestet, wobei eine in situ-Hybridisierung verwendet wurde.
Eine 2,5 ul-Probe eines fraktionierten PCR-Produktes wurde als Sonde bei einer in situ-Hybridisierungsprobe verwendet, wie oben in dem vorliegenden Beispiel beschrieben.
Alle amplifizierten DNA-Populationen, welche aus der PCR- Reaktion unter Verwendung einer mit Schall behandelten DNA als Matrize isoliert wurden, zeigten ein spezifisches Signal für die Centromere des Chromosom 8, sowohl in den Zellkernen als auch in den verteilten Chromosom-Metaphasen, wobei die Intensitäten der Signale variierten. Nur die Komponente mit 1026 bp, welche aus der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung einer Hind III verdauten DNA- Matrize erzeugt wurde, lieferte ein spezifisches Signal für Chromosom 8. Es war daher eindeutig möglich, über dieses Verfahren eine Mischung aus repetitiven DNA-Sequenzen zu erzeugen, welche spezifisch für Chromosom 8 sind. Im weiteren sollen individuelle DNA-Sequenzen gefangen werden.

Beispiel 5. Klonieren von Centromeren des Chromosom 8 unter Verwendung enzymatisch amplifizierter Produkte

DNA-Sequenzen, welche spezifisch für das Centromer des menschlichen Chromosoms 8 sind, wurden unter Verwendung eines enzymatischen Amplifikationsverfahrens mit der mit Schall behandelten pBS8-Bibliothek als Matrize erzeugt, welche so hergestellt wurde, wie im (obigen) Beispiel 3 beschrieben. Das Reaktionsvolumen hatte 100 ul 20 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2; mit 0,75 ug schallbehandelter pBS8-Doppelstrang-DNA, 200 uM an jeweils dCTP, dGTP, dATP und dTTP, 1 um von jeweils den synthetischen Oligomer-Primern des (obigen Beispiels 2) welche zu der Alpha-Satellit-Region des Centromers hybridisieren und 2,5 Einheiten von Taq-Polymerase. Die Reaktionsmischung wurde mit 100 ul eines sterilen Mineralöls versetzt, und die Amplifikation wurde automatisch unter Verwendung eines "Perkin Elmer Cetus (PEC) DNA Thermal Cycler" ausgeführt. Es wurden fünfundzwanzig Amplifikationszyklen verwendet. Jeder der ersten vierundzwanzig Zyklen wies eine Minute Denaturierung bei 92º C, zwei Minuten Matrizen-Priming bei 37º C und drei Minuten Polymerisierung bei 72º C auf. Der Endzyklus enhielt eine siebenminütige Polymerisierungsperiode bei 72º C, gefolgt von Abkühlen auf 4º C. Das amplifizierte Material wurde mit Phenolchlorophorm extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 100 ul steriles Wasser resuspendiert. Ein 5 ul-Aliquot wurde auf einem 1%-Agarose-Gel analysiert, mit 0,04 M Tris-Acetat, 1 mM EDTA und 1 ug/ml Ethidiumbromid bei 150 V über eine Stunde analysiert. Drei DNA-Produkte mit verschiedenen Größen wurden identifiziert; DNA mit 180 bp, 369 bp und 738 bp.
Ein 40 ul-Aliquot des amplifizierten DNA-Produktes wurde gereinigt und auf einer Mono-Q-Säule (Anionensäule, hergestellt von Pharmacia) fraktioniert, wobei das automatisierte "Fast Performance Liquid Chromatography"-System (FPLC) verwendet wurde, wie im (obigen) Beispiel 4 beschrieben wurde. Drei Populationen wurden wiederum aus der Polymerase-Kettenreaktions-Mischung separiert. Die dritte Population mit der größten Stoffmenge wurde mit Ethanol ausgefällt und in 20 ul steriles Wasser resuspendiert.
Ein 10 ul-Aliquot der dritten Population wurde verdaut, unter Verwendung von jeweils 10 Einheiten Pstl und Hind III in 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl bei 37º C über eine Stunde. Das Material wurde mit Phenolchlorophorm extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 10 ul steriles Wasser resuspendiert. 10 ul Pstl und Hind-Ill-Restriktions-verdauter M13mp18-Vektor wurden ebenfalls in derselben Weise hergestellt.
Die resultierenden, gereinigten Restriktionsprodukte der enzymatisch amplifizierten Reaktion wurden zu dem M13mp18- Restriktionsvektor durch Verfahren kloniert, wie sie beschrieben sind bei Sambrook, et al. in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Seiten 4.2-4.33, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Die klonierte DNA wurde durch Elektroporation in dem JM101-E. Coli-Wirtsbakterium unter Verwendung eines "Gene-Pulser"-Gerätes (Bio-Rad, Richmond, CA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers zugefügt. Im einzelnen:
Das restriktionsverdaute PCR-Produkt wurde daraufhin mit dem verdauten M13mp18-Vektor ligasiert. 50 ul der Ligasur-Reaktion enthielten 0,5 ug des Restriktions- Enzym-verdauten M13mp18-Vektor in 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM mgCl&sub2;, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (w/v) Polyethylenglycol 8000, 2 Einheiten T4-Ligase mit entweder 0,5 ul, 1 ul oder 2 ul des verdauten PCR-Produktes. Die Reaktion wurde bei 37 C über zwei Stunden inkubiert. Das Ligationsprodukt wurde mit Phenolchlorophorm extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und in 15 ul steriles Wasser resuspendiert.
JM101 E. Coli-Zellen wurden für die Elektroporation vorbereitet. Eine Kolonie JM101 von einer Ausstreichplatte wurde in 100 ml TYE-Flüssigkeit über Nacht in einem belüfteten Wasserbad mit 37 C gezüchtet, mit 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 3 g/l KCl. 500 ml der TYE-Flüssigkeit wurde mit 5 ml der über Nacht entstandenen JM101-Kultur geimpft. Die Zellen wurden belüftet bei 37º C gezüchtet, bis die Absorption bei 600 nm 0,5 bis 1,0 OD betrug. Die Zellen wurden für dreißig Minuten auf Eis gegeben. Die Kultur wurde für fünfzehn Minuten bei 4000 xg zentrifugiert, um die Zellen pelletförmig auszubilden. Das Zellpellet wurde dann in 500 ml 1 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfon, hergestellt von Gibco Laboratories) bei pH 7 resuspendiert und wiederum zentrifugiert. Die Zellen wurden in 20 ml 1 mM HEPES/10%-Glyzerin resuspendiert und wiederum zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in 1 mM HEPES/10%-Glyzerin mit einer Konzentration von etwa 3 · 10 -Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden in Aliquote überführt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei 80 C gespeichert, bis sie für die Elektrotransformation benötigt wurden.
Eine Elektrotransformation wurde für alle der oben bezeichneten Ligasuren mit einem "Gene Pulser"-Gerät (Bio-Rad, Richmond, CA) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die präparierte Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und dann auf Eis gelagert, bis sie benötigt wurde. 40 ul der Zellsuspension und 1 ul einer speziellen Ligasur wurden gemischt und für eine Minute auf Eis gegeben. Die Zellmischung und die ligasierte DNA wurden einer kalten Elektroporations-Küvette mit 0,2 cm zugeführt. Das "Gene Pulser"-Gerät (Bio-Rad, Richmond, CA) wurde auf 25 uF und 2,5 kV gesetzt. die Pulssteuerung wurde auf 200 Ohm festgesetzt. Die Probe wurde einmal bei den festgesetzten Einstellungen gepulst. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden 0,5 ml eines Mediums mit 2% Bactotrypton, 0,5% Bactohefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM MgSO&sub4;, 20 mM Glucose der Küvette zugeführt. Die Zellsuspension wurde aus der Küvette entfernt und bei 37º C inkubiert, bis sie plattiert war.
Die resultierenden transformierten Zellen wurden auf Schichten einer E. coli-Bakterienverteilung auf der Oberfläche einer Nähr-Agarplatte gezüchtet, durch Verfahren, welche beschrieben sind in Sambrook, J., et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Seiten 4.2-4.33.
250 ul der elektroporierten Zellen wurden in 3 ml eines Mediums mit 7 g/l Bacto-Agar, 8 g/l Typton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 200 ug X-Gal (5-Brom-4Chlor-3-Indoly- B-D-Galactosid (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) und einigen Tropfen einer über Nacht entstandenen JM101-Kultur gegeben. Die gesamte Mischung wurde auf eine 15 % Bacto-Agarplatte mit 16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt und 5 g/l M NaCl (YT-Agarplatte) gegeben. Der Mischung wurde gestattet, sich bei Raumtemperatur zu verfestigen, woraufhin sie über Nacht bei 37 C inkubiert wurde.
Plaquebildende Zellkolonien zeigen eine erfolgreiche Ligasur des enzymatischen und fixierten Produktes in den Vektor. Kolonieerzeugendes Plaque wurde von jeder Platte zufällig aufgenommen und in 2 ml eines 2 YT-Mediums gegeben (16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl). Zwei Tropfen einer über Nacht entstandenen JM101-Kultur wurden dem Medium zugegeben, und der Kultur wurde gestattet über Nacht belüftet bei 37º C zu inkubieren. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle III dargestellt. TABELLE III Beziehung zwischen Insertion und Plaqueanzahl

Beispiel 6. Prüfen von Plaque

Da der Vektor eine Phage ist, ist die Kolonie der Abkömmlinge der Original-Transformation nach der Terminologie ein Plaque. Die Ergebnisse sind formal dieselben wie für ein Plasmid. Somit gibt es Kopien episomaler genetischer Elemente, welche dasselbe Fragment einer klonierten DNA tragen.
Das Bakteriophage-Plaque, welches die rekombinierte DNA mit den Inserionen enthält und welches aus dem Verfahren resul tiert, das im (obigen) Beispiel 5 angewendet wurde, wurde geprüft, indem ein steriler Zahnstocher in das Plaque eingeführt wurde, woraufhin die Phage und die infizierten Zellen von dem Plaque in eine Röhre mit 2 ml eines sterilen 2- YT-Mediums überführt wurde.

Beispiel 7. Getrenntes Züchten und Extrahieren als Probe entnommener Vektor-DNA

Die als Probe entnommenen Wirtszellen, welche in Beispiel 6 erhalten wurden, durften über Nacht unter Bewegung bei 37º C inkubieren. Die Kulturen wurden in einer Eppendorf-Mikrofuge für zehn Minuten zentrifugiert. Ein Milliliter der obenstehenden Substanz wurde bei 4º C als Phagenstamm gespeichert. 250 ul eines Puffers mit 2,5 M NaCl, 10% Polyethylenglycol-6000, 0,015 M NaEDTA pH 8,0, 40 ug einer durch Hitze inaktivierten RNase wurde dem zweiten Milliliter der obenstehenden Substanz zugefügt und bei 4 C über zwei Stunden inkubiert. Die Proben wurden für zehn Minuten in der Eppendorf-Mikrofuge zentrifugiert, und die obenstehende Substanz wurde entsorgt. Das Pellet einer jeden Probe wurde in 50 ul eines "Phage Coat Digestion"-Puffers mit 0,2 % Sarkosyl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM NaEDTA, 10 ug Proteinase K resuspendiert und für eine Stunde bei 55-65 C inkubiert. Jede Probe wurde mit Phenolchlorophorm extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und in 10 ul steriles Wasser resuspendiert.

Beispiel 8. Labeln jeder eine Sondenklasse bildenden Vektor-DNA

Das gesamte derart fermentierte und extrahierte Vektor-DNA- Material, welches gemäß der Beschreibung in Beispiel 7 her gestellt wurde, wurde dadurch gelabelt, daß 2,5 ul jeder isolierten DNA einer enzymatischen Verstärkung und Biotinylierung unterworfen wurde, wie oben in Beispiel 3 beschrieben. Sonden-Kompositionen wurden für fünfzehn individuelle Kolonien präpariert.
5 ul jeder Komposition wurde auf einem 1% Agarosegel analysiert, mit 0,04 M Tris-Acetat, 1 mM EDTA und 1 ug/ml Ethidiumbromid. Eine DNA-Leiter mit 123 bp (hergestellt von Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD) wurde als Standard für die Größenbestimmung verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle IV dargestellt: TABELLE IV Beziehung der Sequenzgröße zur Klonanzahl

Beispiel 9. Hybridisierung jeder Sonde mit Proben des Genoms als Ziel

Jede der Sonden-Kompositionen nach Beispiel 7 wurde zu einer Zielprobe des Humangenoms hybridisiert. Ein ul von jeder der Sonden-Kompositionen wurde bei einer in situ- Hybridisierung ausgewertet, wie sie im (obigen) Beispiel 4 beschrieben ist.
Die produkthybridisierten Sonden-Proben des Beispiels 1 wurden überprüft, und Klone, welche Sonden erzeugten, die für ein spezielles Chromosomenpaar spezifische Signale ergaben, wurden vermerkt. Die in situ-Hybridisierung ergab, daß dreizehn von fünfzehn Klonen spezifisch für Chromosom 8 waren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V dargestellt. TABELLE V In situ-Hybridisierungsergebnisse unter Verwendung eines PCR-Produktes mit Biotin aus indivuduellen M13-Klonen als Sonde
Aufgrund der in der vorstehenden Tabelle V gezeigten Information, wurden drei Klone ausgewählt, welche eine gute Signalintensität und -spezifität ergaben. Diese Klone enthielten jeweils 550, 1100 und 3000 Basenpaar-Insertionen.
Es wurde gefolgert, daß enzymatisch amplifizierte Sequenzen, welche auf die oben beschriebene Weise kloniert wurden, in den meisten Fällen zumindest als Matrizen zur Erzeugung von DNA-Sequenzen verwendet werden können, welche gelabelt werden, und als centromerspezifische Sonden für spezielle Chromosomen verwendet werden können.
Zwei dieser M13-Klone, 1-1 und 2-2, wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, als Sonden zu dienen, wenn sie durch die hier zur Verfügung gestellten chemischen Verfahren transaminiert und biotinyliert wurden (siehe untenstehende Beispiele).

Beispiel 10. Isolieren repetitiver DNA-Sequenzen, Probenehmen, Fermentieren und Extrahieren

Sobald Kolonien bekannt sind, welche primär Signale für ein einzelndes Chromosomenpaar ergeben (was einfach durch Aufzeichnungen erkannt wird) fährt man mit einer Züchtung einer zusätzlichen Menge des Vektors fort. Dies wurde folgendermaßen erreicht:
Kulturen der M13-Klone 1-1 und 2-2 wurden wie folgt präpariert. E coli JM101 wurde über Nacht bei 37 C in YT-Nährmedium gezüchtet. Die JM101-Kultur wurde im Verhältnis 1 : 100 in 3 ml 2YT-Nährmedium verdünnt, und man ließ sie über drei Stunden wachsen. 10&sup7; Phagen wurden zu 0,5 ml dieser Kultur zugegeben und über drei Stunden wachsen gelassen, woraufhin sie in 500 ml 2YT-Nährmedium in einem 2,4 l Fernbach-Kolben transferiert wurden. Dieser Kultur wurde gestattet, über Nacht bei 37 C mit konstanter Bewegung zu wachsen. Zu diesem Zeitpunkt enthalten die Bakterienzellen signifikante Mengen der zirkulären doppelstrangigen (replikativen Form) der Bakteriophage-DNA. Diese Form der DNA kann durch dasselbe Verfahren rückgewonnen werden, wie es für die Rückgewinnung der Plasmid-DNA verwendet wird.
DNA wurde aus allen gezüchteten Zellmassen unter Verwendung des folgenden Protokolls extrahiert. Die Zellen wurden aus dem Züchtungsmedium durch Zentrifugieren in 500 ml Polypropylen-Zentrifugenflaschen rückgewonnen. Die Flaschen wurden verschlossen und mit 7.000 g über 10 min in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Die nassen Kuchen wurden nach der Entsorgung der obenstehenden Substanz rückgewonnen. Die Zellpaste wurde in 40 ml 50 mM Glucose, 10 mM NaEDTA (pH 7,5-8,0) und 25 mM Tis-HCl (pH 8,0) resuspendiert (filtersterilisiert). Die resuspendierten Zellen wurden in 80 ml 0,2 M NaOH und 1% (w/v) SDS lysiert. Das Zellenlysat wurde mit 60 ml einer Lösung behandelt, welche 55,5 ml wasserfreie Essigsäure und 147,5 g Kaliumacetat pro 500 ml enthielt. Diese Lösungen wurden gründlich gemischt, was zur Erzeugung einer flockigen Fällung führte. Die obenstehende Substanz wurde von der flockigen Fällung entfernt, und diese obenstehende Substanz wurde für fünfzehn Minuten bei 7000 · g zentrifugiert, um die rückständige Fällung zu entfernen.
Nukleinsäure wurde aus der obenstehenden Substanz mit 180 ml Ethanol ausgefällt, woraufhin für zehn Minuten mit 7000 x g zentrifugiert wurde. Die Nukleinsäurepellets wurden in eine Gesamtmenge von 10 ml einer Lösung mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM Natriumacetat resuspendiert. Die Nukleinsäure wurde dann mit 5 ml neutralisiertem Phenol und 5 ml Chlorophorm extrahiert und mit 20 ml Ethanol wiederum ausgefällt. Die sorgfältig entwässerten Nukleinsäurepellets wurden in 5,36 ml Wasser resuspendiert. Die Lösung wurde in eine 15 ml Polypropylenröhre transferiert, und 0,64 ml 5 M NaCl und 2,0 ml 50% (w/v) PEG (M. W. 6000-8000) wurden zugefügt und gründlich untergemischt. Die Lösung wurde auf Eiswasser für eine Stunde inkubiert und für zehn Minuten mit 10.000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml einer Lösung resuspendiert, welche 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM Natriumacetat enthielt. Dieser Lösung wurden 10 Mikroliter von 10 Milligramm/Milliliter Pankrease-Ribonuclease-A-Lösung zugefügt (wärmebehandelt, um die DNase zu inaktivieren). Ein enzymatischer Abbau der RNA wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gestattet. Ein 10-Mikroliter- Anteil einer 20 Milligramm/Milliliter Proteinase-K-Lösung wurde daraufhin zugefügt und bei 55º C über drei Stunden inkubiert. Die DNA-Lösung wurde dann mit 2,5 ml neutralisiertem Phenol und 2,5 ml Chloroform extrahiert und wiederum mit 10 ml Ethanol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde durch Zentrifugieren über fünfzehn Minuten bei 4500 · g gesammelt. Das resultierende Pellet wurde vakuumgetrocknet und dann in 0,5 ml Wasser resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde durch Fluorometrie bestimmt.
Die DNA, welche aus der Fermentierung von MI3mp18-Klonen 1-1 und 2-2 resultierte, enthielt etwa 7400 Basenpaare der M13mp18-Vektor-DNA und etwa 1100 Basenpaare von Insertionen in Klon 1-1 sowie etwa 550 Basenpaaren Insertionen in Klon 2.

Beispiel 11. Labeln amplifizierter DNA-Sequenzen, welche Sondenzusammenstellungen ausbilden

Die in Beispiel 3 hergestellten, enzymatisch amplifizierten Produkte wurden gelabelt, um durch das folgende Verfahren eine Sonden-Komposition herzustellen:
Die Polymerase-Kettenreaktion wurde verwendet, um die ³²P-markierten Sonden herzustellen, welche zur Identifizierung von Kolonien verwendet wurden, die eine plasmidtragende repetitive DNA enthielten. Die Reaktionsmischungen hatten ein Volumen von 100 ul unter der Verwendung von 0,75 u Hind III-verdauter Chromosom-8-Bibliothek-DNA-Matrize, 200 um von jeweils dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 100 uCl Alpha- ³²P dCTP, 1 uM von jeweils den beiden vorstehend beschriebenen alphoidspezifischen synthetischen Oligonukleotid-Primer-Mischungen des Beispiels 2 und 2,5 Einheiten der Taq-Polymerase in einem Puffer mit 20 mM Tris HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2; und 0,01% Gelatine. Auf die Reaktionsmischung wurden 100 ul steriles Mineralöl gegeben, und die Amplifikation wurde automatisch unter Verwendung des Perkin Elmer Cetus (PEC) DNA Thermal Cycler ausgeführt, wie oben beschrieben. Die enzymatisch amplifizierten Produkte wurden auf einer Bio-Spin-30-Säule (BioRad, Richmond, CA) gelgefiltert, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen, wobei den Anweisungen des Herstellers gefolgt wurde, mit Phenolchloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 100 ul steriles Wasser resuspendiert. Die radiogelabelte Sondenmischung wurde über 5 Minuten auf 100º C erwärmt, gefolgt von einer Schnellkühlung auf Eis. Die Hybridisierungsmischung enthielt 4,5 · 10&sup6; cpm der denaturierten Probe, verdünnt in 10 ml frisch präparierter Hybridisierungslösung (unten beschrieben), welche daraufhin jeder Einheit ("bag") mit einem einzelnen, vorhybridisierten Filter zugefügt wurde.

Beispiel 12. Klonieren einer kolonisierten Chromosomen- Bibliothek, Formen von Hybriden, Identifizieren von Seguenzen, Probenehmen aus Kolonien, Züchten und Extrahieren

Das Screening der Bibliothek-DNA mit fließsortierter Hind III-Restriktions-Chromosom-8-DNA, welche zu dem Bluescribe (pBS)-Plasmid-Vektor (Stratagene) kloniert wurde, begann mit der Präparation einiger Nitrozellulose-Filtermembranen, welche Bakterienkolonien enthielten, die in der Bibliothek- DNA enthalten sind. Das Verfahren zum Herstellen dieser Filter- oder Kolonie-Lifts wurde bereits beschrieben (Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Seiten 1.90-1.104). Zehn Kolonie-Lifts mit etwa 1.000 Bakterienkolonien pro Filter wurden über Nacht bei 68ºC unter kontinuierlicher Bewegung in individuellen "seal-a-mealbags" vorhybridisiert, welche eine Hybridisierungslösung enthielten, die 1,5 &sub1; SSPE (0,27 M NaCl, 15 mM Natriumphosphat (pH 7,7), 1,5 mM EDTA), 0,5% (w/v) BLOTTO (Carnation fettloses Milchpulver) und 1% (w/v) SDS aufwies.
Nach der Zugabe der im Beispiel 11 beschriebenen gelabelten Sonde konnte eine Hybridisierung über Nacht bei 68ºC unter kontinuierlicher Bewegung stattfinden. Am nächsten Tag wurde die nichthybridisierte Sonde durch Auswaschen der jeweiligen Filtermembran-Batches (dreimal, jeweils für fünf Minuten bei Raumtemperatur mit starker Bewegung) in einer Lösung geringer Stringenz mit 2X SSC (0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat), pH 7,0 und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) entfernt. Die Stringenz wurde durch das Auswaschen der Filter (zweimal jeweils für zehn Minuten bei 55-60º C mit starker Bewegung) in einer Lösung mit 1X SSC (pH 7,0) und 0,1% SDS erhöht. Im Anschluß an die letzte Waschung mit hoher Stringenz wurden die Filter in einem Saran-Wringer gewrungen, und ein Röntgenfilm (KAR-5, Eastman Kodak, Rochester, NY) wurde über Nacht bei -70º C belichtet.
Jedes der zehn Filter erzeugt einige diskrete, intensive Hybridisierungssignale. Nachdem die Orientierungen der Filter auf die jeweilige Original-Nähr-Agarplatte ausgerichtet waren, wurden 60 Bakterienkolonien zur weiteren Analyse ausgewählt, welche starke Hybridisierungssignale erzeugt hatten. Um die DNA aus jedem der möglichen Klone zur Größencharakterisierung zu isolieren, wurde eine einzelne Kolonie auf der Agarplatte herausgegriffen und verwendet, um zwei ml 2YT-Nährmedium (1,6% (w/v) Trypton, 1% (w/v) Hefeextrakt, 0,5% (w/v) NaCl), welche 200 ug/ml Ampicillin zur Auswahl enthielt, zu impfen. Die Kulturen wurden bei 37 C über Nacht mit starker Bewegung gezüchtet.
Um die Anzahl der Klonkandidaten weiter zu erniedrigen und um jene Klone mit dem höchsten Alphoid-Inhalt anzureichern, wurden die Klonkandidaten auf eine eher quantitative Weise auf ihre Hybridisierungsstärke bezüglich einer Alphoid- Sonde überprüft.
Plasmid-DNA wurde aus jeder der sechzig Zellkulturen, welche aus durch das Bibliothek-Screening ausgewählten Zellkolonien gezüchtet waren, extrahiert und gereinigt (Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", S. 1.25 -1.28). Es wurde eine Dot-Blot-Analyse verwendet, um nur jene Klone auszuwählen, welche echte Hybridisierungssignale erzeugten, wenn sie mit den gelabelten amplifizierten Alpha-Satellit-Sequenzen geprüft wurden. Ein Aliquot (3 ul) einer alkalinlysierten, gereinigten Plasmid-DNA wurde in Anwesenheit von 50 mM Natriumhydroxid denaturiert und daraufhin auf einen Nitrozellulose-Membran-Filter getupft (Schleicher und Schuell, Keene, NH) welcher mit 10 · SSC (150 mM Natriumcitrat, 1,5M NaCl) vorbefeuchtet war. Das Filter wurde in der Luft getrocknet und daraufhin bei 80º C im Vakuum für 15 Stunden ausgeheizt.
Das Filter oder das Dot-Blot wurde über Nacht mit kontinuierlicher Bewegung bei 68 C in einer Hybridisierungslösung vorhybridisiert, mit 1,5X SSPE (0,27 M NaCl, 15 mM Natriumphosphat (pl 17,7), 1,5 mM EDTA), 0,5% (w/v) HLOTTO (Carnation fettfreies Milchpulver) und 1% (w/v) SDS. Biotinylisierte amplifizierte Alpha-Satellit-DNA-Sequenzen, durch das oben beschriebene PCR-Verfahren, erzeugt aus Hind III-Restriktions-pBS-Chromosom-8-Bibliothek-DNA als Matrize. wurde erzeugt, um die Blot-DNA zu prüfen. Die biotinylierten Sonden (40 ul einer 100 ul PCR-Reaktion) wurden bei 70 C für fünf Minuten in Gegenwart von 5 ug Träger-DNA (mit Schall behandelte Lachs-Sperma-DNA) und 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat/10 · Dextransulfat, pH 7,0 bei 70º C denaturiert. Die denaturierte Sonden-Mischung wurde auf Eis schnell abgekühlt, 20 Milliliter einer frisch hergestellten Hybridisierungslösung (oben beschrieben) zugefügt und nachfolgend einer "seal-ameal-bag" zugefügt, welche den vorhybridisierten Dot-Blot enthielt. Die Hybridisierung wurde über 2,5 Stunden mit kontinuierlicher Bewegung bei 65º C fortgesetzt. Ungebundene Sonden wurden durch Auswaschen der Filtermembran (dreimal, jeweils für fünf Minuten bei Raumtemperatur mit starker Bewegung) in einer Lösung geringer Stringenz mit 2X SSC (0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat), pH 7,0 und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) ausgewaschen. Die Stringenz wurde durch das Auswaschen der Filter (zweimal, jeweils für zehn Minuten bei 55-60º C mit starker Bewegung) in einer - Lösung mit 1X SSC (pH 7,0) und 0,1 % SDS erhöht.
Es folgte der Nachweis der hybridisierten biotinylierten Alpha-Satellit-Sequenzen als homologe, in der Blot-DNA vorhandene Ziel-Sequenzen. Dieses Verfahren zum Nachweis von Signalen basiert auf der starken Bindung von Streptavidin an Biotin. Das Filter wurde kurz in TTBS (0,1% (v/v) Tween 20, 100mM Tris-HCl (pH 7,5t), 0,9% NaCl) gereinigt, um die vorhergehende Waschlösung zu entfernen. Um zu verhindern, daß Nicht-Ziel-Stellen auf dem Filter mit Nachweisreagenzien reagieren, wurde das Filter blockiert, indem es für dreißig Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in frischer TTBS inkubiert wurde. Während dieser Zeit wurde eine zu Meerrettich-Peroxidase (HRP)-streptavidinkonjugierte Verbindung (Vectastain ABC Kit, Vector Labs, Burlingame, CA) entsprechend der bereitgestellten Anweisungen präpariert. Die HRP-streptavidinkonjugierte Verbindung wurde dem vorblockierten Filter zugefügt und über dreißig Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Überschüssige konjugierte Verbindung wurde durch eine Reihe von Waschungen in TTBS enfernt (vier Wechsel des Puffers über eine Zeitdauer von 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln). Im Anschluß an die letzte Waschung wurde eine frisch präparierte Substratlösung (0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,8 mg/ml Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), 0,01% Wasserstoffperoxid, 0,4 mg/ml Nickelchlorid) zugefügt, und eine schnelle Signalentwicklung folgte. Der entwickelte Dot-Blot wurde unter zweimaligem Wechseln von destilliertem H&sub2;O gereinigt, um die Reaktion zu beenden, und daraufhin an der Luft getrocknet. Mehr als die Hälfte der Klone, welche durch dieses Verfahren geprüft wurden, erzeugten ein Signal, jedoch wurden nur 21 Klone zur weiteren Analyse ausgewählt. Diese Klonen erzeugten starke Hybridisierungssignale bei der Dot-Blot-Analyse, wobei jeder einzelne deutlich die Anwesenheit von Alphoid-Sequenzen anzeigte.
Diese 21 Klonkandidaten wurden weitergehend charakterisiert, indem die Größe des enthaltenen menschlichen DNA-Restriktions-Fragmentes bestimmt wurde. Die Charakterisierung der Insertionsgrößen in den 21 Klonen wurde möglich ge macht. Die pBS-Chromosom-8-Bibliotheks-DNA wurde präpariert, indem eine Vielzahl geschnittener Hind III-Chromosom-8-DNA-Fragmente mit verschiedenen Größen an geschnittene Hind III-Blue-Scribe-Plasmid-Vektoren ligasiert wurde. Die Restriktionsverdauungen der mit Hind III isolierten Klone entlassen die Chromosom-8-DNA-Fragmente aus dem Vektorgerüst. Die Verdauungen enthielten 5 ul einer alkalinlysierten, gereinigten Plasmid-DNA, einen Niedrigsalzpuffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;) und 2 ul Hind III (20 Einheiten/ul, New o England Biolabs). Die Verdauungen durften bei 37 C über zwei Stunden fortschreiten. Die Hind III-Restriktions-DNA wurde einer Gelelektrophorese unterworfen (1% Agarose in 1 X TAE Laufpuffer) (Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Seiten 6.3-6.13) in Anwesenheit von Standardgrößen. Die Hind III-Verdauung dieser Plasmide identifizierte die Anwesenheit eines oder mehrerer Chromosom-8-DNA-Fragmente pro Klon, welche eine Größe von etwa 120 Hasenpaaren bis 9.000 Basenpaaren enthielten.
Einige der Klone mit Centromer-Sequenzen, welche spezifisch für Chromosom 8 sind, enthielten mehr als eine einzelne Hind III-Insertion, weshalb identifiziert werden mußte, welche dieser klonierten Fragmente für die Hybridisierung zu den gelabelten, amplifizierten Alpha-Satellit-DNA-Sonden verantwortlich war. Die Southern-Analyse ermöglichte es, den Alphoidinhalt in jedem der Klone zu bestimmen. Da die Insertionsgrößen eine weite Region abdeckten (etwa 120 Hasenpaare bis 9.000 Basenpaare) und die Effizienz des Transfers von DNA-Fragmenten, welche der Gen-Elektrophorese unterworfen waren, auf eine Filtermembran stark von der relativen Größe der Fragmente abhängt, erforderte dieses Verfahren, daß zwei verschiedene Filtermembrantypen verwendet wurden. Große DNA-Fragmente (> 1000 Basenpaaren) wurden aus jedem der einundzwanzig Klone auf einem Agarosegel abgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Filtermembran übertragen (Schleicher and Schuell, Keene, NH) mit relativ großer Effizienz, während kleinere DNA-Fragmente (< 1000 Basenpaare), die nur in 11 Klonen gefunden wurden, auf einem Polyacrylamidgel abgetrennt wurden und auf eine Nylon-Filtermembran transferiert wurden (Zetaprobe, Bio-Rad, Richmond, CA).
Die Restriktions-Verdauungen von jedem Klon enthielten ein Aliquot (3 ul) von alkalinlysierter, gereinigter Plasmid-DNA, einen Niedrigsalzpuffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris- HCl (pH 7,5), 10mM MgCl&sub2;) und 2 ul Hind III (20 Einheiten/ul, New England Biolabs, Beverly, MA). Die Reaktion wurde für einige Stunden bei 37º C fortgesetzt und dann einer Gel-Elektrophorese unterworfen, entweder in 1% Agarose/l X TAE Laufpuffer (Maniatis et al., Cold Spring Harbor), oder in 6 % Polyacrylamid/l X TBE Laufpuffer (Maniatis et al. Cold Spring Harbor), in Anwesenheit von Standardgrößen, bis die Übertragung der Fragmente auf die Nitrozellulose entsprechend der mit dem Vacugene Vacuum Blotting System (Pharmacia LKB) bereitgestellten Anweisungen erreicht war. Die Membran wurde bei 80º C unter Vakuum über 1,5 Stunden ausgeheizt. Die Übertragung der polyacrylamidgelseparierten DNA-Fragmente auf Nylon wurde entsprechend den Anweisungen durchgeführt, welche mit dem "Semi- Dry-Electroblotter" (JKA-Biotech, Denmark) bereitgestellt wurden. Bei der Nylonmembran war ein Ausheizen nicht erforderlich.
Beide Filtermembranen wurden in einer Hybridisierungslösung vorhybridisiert, mit 1,5X SSPE (0,27M NaCl, 15 mM Natriumphosphat (pH 7,7), 1,5 mM EDTA), 0,5% (w/v) BLOTTO (Carnation fettfreies Milchpulver) und 1% (w/v) SDS. Die Vorhybridisierung erfolgte bei 68 über 24 Stunden (Nitrozellulosefilter) oder über 72 Stunden (Nylonfilter) unter kontinuierlicher Bewegung. Biotinylierte amplifizierte Alpha-Satellit-DNA-Sonden, welche unter Verwendung von Hind III-Restriktions-pBS-Chromosom-8-DNA als Matrize und den degenerierten Primern (U. Weier, LLNL) hergestellt wurde, wurde zum Testen jedes Blot verwendet. Die biotinylierten Proben (40 ul einer 100 ul PCR-Reaktion) wurden für fünf Minuten bei 70º C in Anwesenheit von 50% Formamid/- 0,3M NaCl/30mM Natriumcitrat/10% Dextransulfat, pH 7,0 und 5 ug einer Träger-DNA (mit Schall behandelte Lachs-Sperma-DNA) denaturiert. Die denaturierten Sonden wurden schnell auf Eis abgekühlt und 20 ml einer frisch präparierten Hybridisierungslösung (oben beschrieben) zugefügt. Die Hybridisierung wurde bei 68 C über drei Stunden fortgeführt. Ungebundene Sonden wurden durch das Auswaschen der Filtermembran (viermal, jeweils für fünf Minuten bei Raumtemperatur unter starker Bewegung) in einer Lösung geringer Stringenz mit 2 · SSC (0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) entfernt. Die Stärke wurde durch das Waschen der Filter (zweimal, jeweils für zehn Minuten bei 55-60º C unter starker Bewegung) in einer Lösung mit 1 · SSC (pH 7,0) und 0,1% SDS erhöht.
Der Nachweis der hybridisierten, biotinylierten Alpha-Satellit-Sequenzen als homologe, auf jedem Filter vorliegende Ziel-Sequenzen folgte. Dieser Prozeß zum Nachweis eines Signals basiert auf der starken Bindung von Streptavidin an Hiotin und wurde ausgeführt, wie oben in diesem Beispiel beschrieben.
Eine Southern-Analyse der Nitrozellulosemembran zeigte 16 Klone, in welchen ein einziges Nicht-Vektor-Fragment ein starkes Hybridisierungssignal erzeugte. Die verbleibenden Klone wiesen jeweils zwei Hybridisierungssignale auf, welche die Anwesenheit von Alphoid-Sequenzen in beiden Hind III-Fragmenten anzeigten. Die Fragmente, bei denen erkannt wurde, daß sie Alphoid-Sequenzen enthalten, können durch ihre Größe klassifiziert werden:
1. 2 Kbp, 1.5 Kbp
1. 9 Kbp
2. 3 Kbp, 2,5 Kbp
3 Kbp
3. 5-3,8 Kbp
5. 5-5 Kbp
9 Kbp
Eine Southern-Analyse der Nylonmembran erzeugte ebenfalls starke Hybridisierungssignale, von denen keines mit einem DNA-Fragment assoziiert war, welches eine geringere Länge als 1200 Basenpaare aufwies.

Beispiel 13. Labeln jeder Vektor-DNA, welche eine Sondenklasse bildet

Die gesamte fermentierte und extrahierte Vektor-DNA-Material. welches, wie in Beispiel 12 beschrieben, hergestellt wurde, wurde durch das Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Verfahren gemäß Beispiel 7 gelabelt, so daß 21 Sonden-Kompositionen hergestellt wurden.

Beispiel 14. Hybridisieren jeder Sonde mit einer Probe des Genoms als Ziel

Jede der Sonden-Kompositionen nach Beispiel 12 wurde in eine Ziel-Probe des Humangenoms hybridisiert.
Die Ziel-Probe un das Hybridisierungsverfahren wurden in Beispiel 8 beschrieben.

Beispiel 15. Identifizieren repetitiver DNA-Sequenzen, Züchten und Extrahieren

Die hybridisierten Produktproben des Beispiels 13 wurden überprüft, und eine einzelne DNA-Sequenz mit repetitiven Sequenzen, die für Chromosom 8 charakteristisch sind, wurde durch das Verfahren nach Beispiel 9 separiert. Wie in Beispiel 9 wurden keine DNA-Sequenzen separiert. Aufzeichnungen wurden verwendet, um zu bestimmen, welche der Sonden aus den spezifischen Kolonien abgeleitet war. Nach der Identifizierung der für weitere Verwendung zu züchtenden Kolonie, wird von der ursprünglichen Kolonie eine Probe genommen, und sie wird gezüchtet.
Es gibt nur einen geringen Unterschied bezüglich des Wachstums der Bakterien mit Plasmid und den phageinfizierten Bakterien, wie den Fachleuten verständlich sein wird. Sobald eine Kultur identifiziert ist, wird die DNA-Extraktion, wie im obigen Beispiel 11 beschrieben, ausgeführt.
E. coli-Kulturen mit den angemessenen Plasmiden wurden wie folgt präpariert:
Bakterien mit dem geeigneten Plasmid wurden auf die Oberfläche einer YT-Agarplatte mit 200 ug/ml Ampicillin ausgestrichen, und sie konnten über Nacht bei 30ºC zu wachsen. Eine einzelne Kolonie dieser Platte wurde in 500 ml eines 2YT-Nährmediums in einem 2,4 l Fernbach-Kolben überführt, und sie konnte über Nacht bei 30 C mit einer konstanten Bewegungsrate von 200 Zyklen wachsen. Wie im Beispiel 11 wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet und die Plasmid-DNA wurde extrahiert.
Die derzeit bevorzugte Plasmid-Sonde für die Centromere des Chromosom 8 hat einen Vektor von etwa 2800 Basenpaaren und eine Insertion von etwa 9000 Basenpaaren.

Beispiel 16. Transaminierung mit Chaotropen

Es wurde festgestellt, daß das Ausmaß der hydrogensulfitkatalysierten Transaminierung, welche unter Einbeziehung einer einstrangigen DNA erreicht werden kann, die zur Ausbildung doppelstrangiger komplementärer DNA hybridisieren kann, durch die Bildung der doppelstrangigen Form des DNA- Substrates limitiert ist. Diese Desoxycytidin-Reste, welche an den Paarungswechselwirkungen der Hasen teilnehmen, werden nicht transaminiert. Es wurde beobachtet, daß diese Begrenzung in den Fällen extremer war, in denen die zu transaminierende DNA-Sequenz zum Großteil aus relativ kleinen Wiederholungen zusammengesetzt war, im Vergleich zu Fällen klonierter Alphoid-DNA. Wenn jedoch die Konzentration komplementärer Stränge zunimmt, wächst auch die Rate ihrer Hybridisierung. Die Hinzunahme von Chaotropen in die Transaminierungs-Reaktion wurde als Verfahren erkannt, um die Rate, mit welcher DNA bei dieser Reaktion renaturiert, abzusenken. Die Effizienz des Verfahrens wurde mit Lachs- Sperma-DNA getestet.
Lachs-Sperma-DNA (Sigma Cat. #D-1626) wurde in Wasser in einer Konzentration von 8 mg/ml aufgelöst. Die DNA wurde mit Wasser auf eine Konzentration von 2 mg/ml verdünnt, und ein 2 ml Aliquot wurde mit Schall behandelt. Die Lösung wurde in eine Polypropylenröhre gegeben, die in ein Trockeneis/Ethanol-Bad eingeführt wurde, um das Sieden während der Schallbehandlung zu verhindern. Die Mikrospitze der Schallbehandlungsvorrichtung wurde in die Lösung eingeführt, bis die Spitze 2-5 mm von der Unterseite der Röhre entfernt war. Die Schallbehandlung wurde bei einer Ausgangsleistung von 25-30 Watt diskontinuierlich ausgeführt, mit einem 80% Arbeitszyklus (80% der Zeit eingeschaltet, 20% der Zeit ausgeschaltet), über einen Zeitraum von fünf Minuten. Nach der Schallbehandlung wurde die DNA durch Zufügen von 0,2 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 4 ml Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren für fünf Minuten bei 8000 · g rückgewonnen und vakuumgetrocknet.
Um einen Hydrogensulfit-Puffer ohne Chaotrope zu präparieren, wurde 1,7 ml konzentrierte HCl langsam 2 ml entionisiertem Wasser auf Eis zugefügt. 1 ml frisches Ethylendiamin (Sigma Cat. #E-4379) wurde dann auf Eis langsam zugeführt. Nach dem Auflösen des Ethylendiamin wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 0,475 g Natriummetahydrogensulfit (Aldrich Cat. #25,55-6) wurde zugegeben. Konzentrierte HCl wurde dann der Hydrogensulfit-Mischung langsam zugegeben, bis der pH-Wert 7,0 erreicht war, und das Volumen der Lösung wurde auf 5,0 ml eingestellt.
Zum Herstellen eines Hydrogensulfit-Puffers mit den Chaotropen, wurden 1,53 ml Trifluoressigsäure 2,5 ml entionisiertem H&sub2;O auf Eis zugegeben, und der Mischung wurde gestattet, für zehn Minuten abzukühlen. 0,87 ml Ethylen diamin (Sigma Cat. #E-4379) wurden dann langsam auf Eis zugegeben. Nach der Auflösung des Ethylendiamin wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt, und 0,475 g Natriummetahydrogensulfit (Aldrich Cat. #25,555-6) wurden zugegeben. Die Lösung wurde auf 45 C erwärmt, um das Natriummetahydrogensulfit aufzulösen. Der pH wurde auf 7,0 durch das Zufügen von Trifluoressigsäure eingestellt, und das Volumen der Lösung wurde auf 5,0 ml eingestellt. Eine 100 mg/ml- Lösung Hydroquinol in reinem Ethanol wurde präpariert und dem Hydrogensulfit-Puffer mit einer Rate von 50 ul Hydroquinol-Lösung pro 5 ml Hydrogensulfit-Lösung zugegeben.
Um DNA zu transaminieren, wurden 1 mg schallbehandelte DNA-Segmente in 300 ul Wasser resuspendiert. Die DNA- Segmente wurden durch Kochen bei 100 C für fünf Minuten und nachfolgendes rasches Abkühlen in einem Eiswasserbad denaturiert. Die Transaminierungs-Reaktion wurde durch das Zugeben von 2,7 ml Hydrogensulfit-Puffer oder Hydrogensulfit-Puffer mit Chaotropen gestartet. Die Reaktion in dem wässrigen Hydrogensulfit-Puffer ohne Chaotrope durfte zwei Tage bei 37º C erfolgen. Die Reaktion im Hydrogensulfit-Puffer mit Chaotropen durfte achtzehn Stunden bei 35º C dauern. Die DNA-Lösung wurde in jedem Fall durch eine Routine-Dialyse gegen 20 mM Natriumacetat (pH 7) entsalzt. Nach der Dialyse wurden 0,1 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,5) zugegeben. Jedes aminierte DNA-Produkt wurde mit 2,5 ml Ethanol ausgefällt und nach dem Zentrifugieren mit 8000 x g für zehn Minuten rückgewonnen. Die Pellets wurden vakuumgetrocknet und mit einer Konzentration von 3 mg/ml in Wasser rehydriert.
Das Ausmaß der Transaminierung jedes aminierten DNA-Produktes (dC) wurde durch enzymatische Verdauung des dC bestimmt, gefolgt von einer Separation der resultierenden Nukleoside mit einem FPLC-Chromatographie-System (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). 5-10 ug aminierte DNA wurde mit Wasser auf 50 ul verdünnt, und die DNA wurde auf einer Drehsäule ("Spin column") mit Sephadex G-50 (3 Prime > 5 Prime catalog # 5301-755608, West Chester Pennsylvania) gereinigt. Die DNA wurde dann getrocknet und 12,5 ul eines 2X DNase-I-Puffers (20 mM Tris, 10 mM MgCl&sub2;, pH 7,5) und 0,5 ul Desoxyribonuclease I (DNase I) (BRL, 2 mg/474 ul, > 10000 u/mg) wurden zu der DNA zugegeben und die Lösung wurde in einem Wasserbad mit 37 C für eine Stunde inkubiert. 50 ul 2X PDI/Alk. Phos.-Puffer (100 mM Tris, 200 mM NaCl, 28 mM MgCl&sub2;, 2 mM ZnCl&sub2;, pH 9,0), 19 ul Wasser, 5,0 ul Phosphordiesterase I (PDI) (PHarmacia LKB, 1000 u/ml gelöst in 1 X PDI/Alk. Phos.-Puffer) und 1,0 ul Kälberdarm-Alkalinphosphatase (Promega, 10000 u/ml) wurden daraufhin zugegeben, und die Lösung wurde über weitere zwei Stunden bei 37º C inkubiert. Die verdaute Probe wurde dann einer MinoRPC-Säule (Pharmacia, LKB) zugeführt, und ein linearer Gradient zwischen Puffer A (97,5 : 1 Ionenpaarpuffer: Methanol, Ionenpaarpuffer = 50 mM KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% Hexansulfonsäure, pH 7,0) und Puffer B (50 : 50 Ionenpaarpuffer : Methanol) wurde verwendet, um die Probe zu eluieren (ein 0,8%iges Ansteigen des Puffer B/min mit einer Fließrate von 0,37 ml/min bis 40% Puffer B wurde erreicht, gefolgt von einem 3%igen Ansteigen von Puffer B/min auf 100% Puffer B mit einer Fließrate von 0,3 ml/min), während das DNA-Eluierungsprofil durch Absorption aufgezeichnet wurde. Jedes der vier natürlichen Desoxynukleoside und das Transaminierungs-Produkt von Desoxycytidin eluierten getrennt, und die Menge an transaminiertem Desoxycytidin wurde aus den relativen Flächen unter Desoxycytidin- und transaminierten Desoxycytidin-Peaks in dem Eluierungsprofil bestimmt.
Die Desoxycytidin-Rückstände in der Lachs-Sperma-DNA, die in Abwesenheit von Chaotropen aminiert wurde, wurden mit einer Rate von 15,2% derivatisiert. Die Desoxycytidin- Rückstände in der Lachs-Sperma-DNA, die in Anwesenheit von Chaotropen aminiert wurde, wurden mit einer Rate von 67% derivatisiert.
Dieses Ergebnis zeigt deutlich, daß die Verwendung von Chaotropen das Ausmaß der Aminierung, welches über die Transaminierungs-Reaktion zu erreichen ist, signifikant steigern kann.

Beispiel 17. Transaminierung von Sequenzen, die komplementär zum Centromer von Chromosom #8 sind

Um die Funktionsfähigkeit unterschiedlicher Alphoid-DNA mit Plasmiden zu untersuchen, welche aus der pHS8-Bibliothek rückgewonnen wurde, die im Beispiel 12 hergestellt wurde, sowie von M13-Klonen, die im Beispiel 5 durch in situ- Hybridisierungen unter Verwendung des Biotin-Streptavidin- Formats hergestellt wurden, war es erforderlich, diese DNA mit Biotin zu modifizieren. Dies wurde mit dem zweischrittigen Verfahren erreicht, wobei zunächst Desoxycytidin- Rückstände in der Plasmid-DNA mit Ethylendiamin über die oben beschriebene Hydrogensulfit-katalysierte Transaminierungsreaktion derivatisiert (transaminiert) wurden und zweitens, indem Biotin an die neu eingeführten, aktiven Amine über die Reaktion mit dem Succinimidylester des Biotins angefügt wurde.
Um zu bestimmen, ob ein höherer Grad an Biotinsubstitution die Funktionsfähigkeit der Sonde in der Probe verbessern würde, wurden einige der DNAs sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit der chaotropen Trifluoressigsäure transaminiert.
Die Kulturen der Plasmide 1-1, 2-2 und 10&supmin;&sup4; verhielten sich wie folgt. Bakterien mit dem richtigen Plasmid wurden auf die Oberfläche einer YT-Agarplatte mit 200 ug/ml Ampicillin ausgestrichen, und sie durften über Nacht bei 30º C wachsen. Eine einzelne Kolonie von dieser Platte wurde in ein 500 ml 2 YT-Nährinedium in einem 2,4 l Fernbach- Kolben übertragen, und sie durfte über Nacht bei 30º C mit einer konstanten Bewegungsrate von 200 Zyklen/Minute wachsen.
Kulturen der M13-Klone 1-1 und 2-2 wurden wie folgt präpariert. E. coli JM101 wurde über Nacht bei 37 C in YT-Nährmedium kultiviert. Die JM101-Kultur wurde 1/10 in 3 ml YT-Nährmedium verdünnt und durfte für drei Stunden wachsen. 10 Phagen wurden zu 0,5 ml dieser Kultur zugefügt, und sie durften über drei Stunden wachsen, woraufhin sie auf 500 ml YT-Nährmedium in einem 2,4 l Fernbach-Kolben übertragen wurden. Dieser Kultur wurde gestattet, über Nacht bei 37 C mit konstanter Bewegung zu wachsen. An diesem Punkt enthalten die Zellen signifikante Mengen der zirkulären doppelstrangigen (replikativen Form) des Hakteriophage-DNA. Diese Form der DNA kann durch dasselbe Verfahren rückgewonnen werden, wie es zur Rückgewinnung der Plasmid-DNA verwendet wird.
DNA wurde aus allen kultivierten Zellmengen extrahiert, wie im obigen Beispiel 10 beschrieben. Die gereinigte DNA wurde in kleine Fragmente von etwa 300 Basenpaaren zerrissen, indem eine Schallbehandlung unter Verwendung eines Branson Sonifier 450 (Danbury, Connecticut) erfolgte. DNA von den Plasmid-Präparaten wurde in 2 ml Wasser bei Konzentrationen zwischen 100 bis 350 u/ml mit Schall behandelt. Die Spitze der Schallbehandlungsvorrichtung wurde in diese Lö sung eingeführt, bis die Spitze etwa 2-5 mm von der Unterseite der Röhre entfernt war. Die Schallbehandlung wurde mit einer Ausgangsleistung von 25-30 Watt diskontinuierlich ausgeführt, mit einem 80% Arbeitszyklus (80% der Zeit eingeschaltet, 20 · der Zeit ausgeschaltet), über einen Zeitraum von fünf Minuten. Nach der Schallbehandlung wurde die DNA durch Zufügen von 0,2 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 4 ml Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren für fünf Minuten bei 8000 · g rückgewonnen und vakuumgetrocknet.
Zu der chaotrop transaminierten Sonden-DNA wurden 200-500 ug schallbehandelte DNA in 100 ul Wasser resuspendiert. Die DNA wurde durch Kochen bei 100 C für fünf Minuten und dann rasches Kühlen in einem Eiswasserbad denaturiert. Die Transaminierungs-Reaktion wurde durch das Zufügen von 900 ul Hydrogensulfit-Puffer oder Hydrogensulfit-Puffer mit Chaotropen, wie oben im Beispiel 15 beschrieben, in Gang gesetzt. Die Reaktion im Hydrogensulfit-Puffer durfte zwei Tage bei 37 C erfolgen. Die Reaktion im Hydrogensulfit-Puffer mit Chaotropen durfte zehn Stunden bei 45 C erfolgen. Die DNA-Lösung wurde durch Routine-Dialyse gegen 20 mm Natriumacetat (pH 7) entsalzt. Nach der Dialyse wurden 0,1 ml 3 M Natriumacetat (pH 5, 5) zugefügt. Die aminierte DNA wurde mit 2,5 ml Ethanol ausgefällt und nach Zentrifugieren bei 8000 · g für zehn Minuten rückgewonnen. Die Pellets wurden vakuumgetrocknet und mit einer Konzentration von 700-1400 ug/ml in 0,2 M3-(N-morpholino)-Propansulfonsäure (MOPS) -Puffer, pH 7,4 rehydriert.
Biotin wurde der aminierten DNA durch Reaktion der DNA mit dem Succinimidylester von Biotin zugefügt. Die aminierte DNA-Lösung wurde durch Kochen für fünf Minuten und nachfolgendes rasches Abkühlen in einem Eiswasserbad denaturiert. Ein geschätzter hundertfacher molarer Übeschuß Sulfosuccinimidyl-6-(Biotinamido)-Hexanoat (Pierce catalog # 21335 C, Rockford, IL) als 0,2 M-Lösung in Dimethylsulfoxid wurde dann der aminierten DNA zugefügt. Die Menge aminierter Nukleotide wurde in allen Fällen auf 5% der gesamten Mole der in der Probe anwesenden Nukleotide geschätzt. Diese Reaktion durfte über Nacht bei Raumtemperatur bei konstanter Bewegung erfolgen. Die DNA wurde aus der Reaktion durch das Zufügen von 0,1 Volumeneinheiten Natriumacetat (pH 5,5) und drei Volumeneinheiten Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren rückgewonnen. Die Ausfällung wurde in zehn ul Wasser rehydriert und daraufhin in einer BioRad S30-Säule (Rockville Centre, NY) entsalzt. DNA aus dem Eluierungsmittel wurde durch das Zufügen von 0,1 Volumeneinheiten Natriumacetat (pH 5,5) und drei Volumeneinheiten Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gesammelt und vakuumgetrocknet. Die DNA wurde in etwa 1 mg/ml resuspendiert. Ein 5 ul Anteil der Sonden-Lösung wurde in 600 ul 50 mM NaOH verdünnt. Die Absorption dieser Lösung bei 260 Nanometern wurde bestimmt, um eine genaue Sonden-Konzentration zur Verfügung zu stellen.
Die Funktionsfähigkeit dieser Sonden wurde in der in situ-Hybridisierungsprobe ausgewertet, die im obigen Beispiel 4 beschrieben wurde. Aus einem Vergleich der Signalintensitäten, die durch Sonden erzeugt wurden, welche ohne Chaotrope transaminiert wurden, zu den Signalintensitäten, welche durch Sonden erzeugt wurden, die mit Chaotropen transaminiert wurden, schließen wir, das biotinylierte Sonden, die durch Transaminierung hergestellt werden, in An wesenheit der chaotropen Trifluoressigsäure intensivere Signale bei geringerer DNA-Konzentration erzeugen, als Sonden, die durch Transaminierung in Abwesenheit der Chaotrope erzeugt werden.

Beispiel 18. Direktes und indirektes Labeln transaminierter Sequenzen mit Fluorophorgruppen und Verwendung bei der in situ-Hybridisierung

Die Fähigkeit einer DNA-Sequenz, welche wie oben beschrieben hergestellt wurde, bei in situ-Hybridisierungsproben zu funktionieren, welche Biotin-Avidin-Wechselwirkungen verwenden, sowie ein fluoreszierender Endpunkt sind nützliche Eigenschaften. Jedoch gibt es eine große Vielzahl von Verfahren, um Sonden sichtbar zu machen. Um die allgemeine Nützlichkeit von Sonden zu demonstrieren, welche aus DNA-Sequenzen hergestellt werden, welche durch die Ausführung der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, werden die folgenden Beispiele angegeben, welche anschaulich zeigen, daß eine jener Sequenzen, welche oben im Beispiel 12 als 10&supmin;&sup4; identifiziert wurde, ohne weiteres geeignet ist, in fluoreszierenden Proben verwendet zu werden, bei welchen die Sonde direkt mit Fluorophoren gelabelt wird.

(A) Direktes und indirektes Labeln der DNA-Sequenz 10-4 zum Centromer des Chromosoms #8

Die DNA-Sequenz des Plasmids 10-4 wurde durch Fermentierung präpariert (amplifiziert). Bakterien, welche das Plasmid 10-4 enthalten, wurden auf eine YT-Agarplatte mit 200 ug/ml Ampicillin ausgestrichen. Eine einzelne Kolonie von dieser Platte wurde in 2 ml eines 2 YT-Nährmediums übertragen und durfte über Nacht bei 30º C unter Bewegung wachsen. Diese bakterielle Suspension diente als Samenstamm für den vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Fermentierungsprozeß. Die Ernte der fermentierten Kultur und die Extrahierung der DNA-Sequenz wurden vorstehend in diesem Beispiel beschrieben. Die Fermentierung hatte eine Ausbeute an Zellmasse von 204 g. Die Extraktion von 122 g dieses Pellet ergab 60 mg Plasmid-DNA. Ein mg der resultierenden Plasmid10-4-DNA-Sequenz wurde schallbehandelt, wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben. 1 mg der schallbehandelten DNA wurde in 1 ml destilliertes Wasser resuspendiert. Die DNA wurde durch Kochen für fünf Minuten und rasches Abkühlen auf Eis denaturiert.
9 ml Hydrgogensulfit-Puffer mit Chaotropen (vorstehend in Beispiel 15 beschrieben) wurde zugegeben, und eine Transaminierungsreaktion mit Chaotropen, wie in Beispiel 15 beschrieben, durfte für zwei Tage bei 37 C stattfinden. Das DNA-Produkt, welches resultierte, wurde durch eine Routine-Dialyse gegen 10 mM Natriumborat (pH 8,0) entsalzt. Diese resultierende DNA wurde durch die Zufügung von 1,0 Volumeneinheiten 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 2,5 Volumeneinheiten Ethanol ausgefällt, und die ausgefällte DNA wurde in Wasser mit einer Konzentration von 1 mg/ml resuspendiert.
Vierzig Mikrogramm der resultierenden zu dem Centromer des Chromosom #8 aminierten DNA-Sequenz 10-4 wurde in einer 2 ml-Röhre getrocknet und dann in 362 ul 0,20 M MOPS (3-(N-Morpholino)Propansulfonsäure), pH 7,4, resuspendiert. Die fluoreszierende Verbindung 5-(und -6) Carboxytetramethylrhodamin (CTMR) Succinimidylester wurde in Dimethylformamid zu 30 mM aufgelöst. Ein 150-facher molarer Über schuß dieses Fluorophor wurde der aminierten DNA zugegeben, in diesem Fall 37,9 ul der 30 mM CTMR. Diese Label- Reaktion fand bei Dunkelheit bei Raumtemperatur mit rotierender Röhre über Nacht statt.
Die Reinigung der gelabelten Sonde durch Entfernung von dem überschüssigen Fluorophor war ein nachfolgendes dreischrittiges Verfahren. Der erste Schritt war eine Ethanolausfällung. Das gesamte verbleibende Ethanol wurde aus dem ausgefällten Pellet evaporiert, woraufhin die Probe in 300 ul Wasser resuspendiert wurde. Diese Lösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule mit 28 cm Höhe und 1 cm im Durchmesser gegeben. Der erwünschte Anteil (das Säulen-Hohlraumvolumen) wurde mit Wasser eluiert und getrocknet, um das Gesamtvolumen zu vermindern. Eine zweite Ethanolausfällung vollendete die Reinigung und das trockene Pellet wurde in 300 ul Wasser resuspendiert. Ein Absorptionsspektrum der resultierenden Direkt-Label-Sonden-Komposition zeigte, daß 3,1 % der Gesamtzahl der Nukleotide gelabelt war.
Biotin wurde der aminierten DNA durch Reaktion der DNA mit dem Sucinimidylester des Biotin zugefügt. Ein 200 ug Aliquot transaminierter 10-4-DNA-Lösung wurde in 485 ul 0,2 M MOPS-Puffer, pH 7,4 hergestellt und durch Kochen für fünf Minuten und nachfolgendes rasches Abkühlen in einem Eiswasserbad denaturiert. Sulfosuccinimidyl-6-(Hiotinamido) Hexanoat (Pierce catalog #21335 C, Rockford, IL) wurde als eine 0,2 M-Lösung in Dimethylsulfoxid hergestellt. Ein 15,2 ul Aliquot der Biotin-Lösung wurde der DNA-Lösung zugefügt, und der Reaktion wurde gestattet, über Nacht bei Raumtemperatur unter konstanter Bewegung fortzuschreiten. Die DNA wurde aus der Reaktion durch Zufügung von 0,1 Volumeneinheiten Natriumacetat (pH 5,5) und 3 Volumen einheiten Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren rückgewonnen. Die Ausfällung wurde in 100 ul Wasser rehydriert und daraufhin auf einer BioRad S30-Säule (Rockville Centre, NY) entsalzt. DNA aus dem Eluierungsmittel wurde durch Zufügen von 0,1 Volumeneinheiten Natriumacetat (pH 5, 5) und 3 Volumeneinheiten Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gesammelt und vakuumgetrocknet. Die DNA wurde zu etwa 1 mg/ml resuspendiert. Ein 5 ul-Anteil der Sonden- Lösung wurde in 600 ul 50 mM NaOH verdünnt. Die Absorption dieser Lösung bei 260 Nanometern wurde bestimmt, um eine genaue Sonden-Konzentration zu liefern.

(B) In Situ-Hybridisierung unter Verwendung einer 10-4- CTMR Sondenkomposition

16 ng der oben genannten direkten Label-Sonden-Komposition wurde in einer 0,5 ml-Röhre mit einer dichten Verschlußkappe getrocknet. Die Sonde wurde in 10 ul 55% Formamid/10% Dextransulfat/0,15 M NaCl/15mM Natriumcitrat, pH 7,0 resuspendiert, wobei 4,5 u schallbehandelte menschliche Placenta-DNA als Blocker zugefügt wurde. Diese Hybridisierungsmischung wurde denaturiert, indem die Röhre für fünf Minuten in ein Wasserbad mit 70ºC gegeben wurde.
Ein Zielträger, der, wie im obigen Beispiel 4 beschrieben, präpariert wurde, wurde für drei Minuten in einer Lösung von 70% Formamid/2XSSC mit 70º C denaturiert und daraufhin durch aufeinanderfolgendes Durchlaufen von Ethanolbädern mit 70%, 85% und 100% dehydriert (je zwei Minuten). Ein Tropfen der Hybridisierungsmischung wurde auf den Träger pipettiert, und der Tropfen wurde durch ein Deckglas abgedeckt. Das Deckglas wurde an dem Träger mit Gummilösung versiegelt. Die Hybridisierung durfte über Nacht in einer dunklen, feuchten Kammer bei 37º C erfolgen.
Am nächsten Tag wurde die rückständige, ungebundene Sonde durch Waschen des Trägers (dreimal, jeweils für fünfzehn Minuten bei 45º C) in 50 · Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat, pH 7,0 entfernt. Eine einzelne Waschung (fünfzehn Minuten bei 45º C) in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (2XSSC, pH 7,0) folgte. Der Träger wurde dann in 0,1 M Natriumphosphat/0,1% NP40-Detergentium (PN-Puffer) (fünfzehn Minuten bei 45º C) gewaschen. Schließlich wurde der Träger zweimal in PN-Puffer (zwei Minuten bei Raumtemperatur) gewaschen und luftgetrocknet. 7,5 ul 1 ug/ml DAPI in einer Antiausbleichslösung wurden über die Zielzellen gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI dargestellt: TABELLE VI Ergebnisse der in situ-Hybridisierung mit direkter Fluorophor-Label-Sonde

Tabellenfußnoten:

(1) Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) gerade sichtbar, (++) gut sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell, (NE) nicht auswertbar.
(2) Spezifität: (-) keine erkennbar, (+) geringe Spezifität, (++) annehmbare Spezifität, (++++) gute Spezifität, (NE) nicht auswertbar.
(3) *vorliegende Träger DNA (4,5 ug menschliche Placenta- DNA/10ul)
Basierend auf den Ergebnissen in Tabelle VI, wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß die derart hergestellte direkte Label-Sonden-Komposition gut für die Verwendung für Numerierungen spezifischer Chromosom-Centromere bei der in situ-Hybridisierung geeignet ist, wobei eine fluoroskopische Analyse verwendet wird.

Beispiel 19. Eine Centromer-12-spezifische DNA-Sonde

(A) Rückgewinnung von Centromer-12-spezifischen DNA- Klonen aus der PBS 12-Bibliothek

Die Herstellung ausgedehnter Samenstämme und die Herstellung großer Mengen DNA durch Fermentieren und Extrahieren aus der Original-Bibliothek für das Chromosom 12, welche vom LLNL zur Verfügung gestellt wurde, wurde bewerkstelligt, wie im Beispiel 1 gemäß dem Patent USSN 585,876 von Bittner et al. und im Beispiel 1 des oben zitierten USSN 07/762,912 von Bittner et al. beschrieben wurde, welches parallel hinterlegt wurde.
Das Screening der Bibliothek-DNA mit fließsortierter Hind III-Restriktions-Chromosom-12-DNA, welche in den "Bluescribe" (pBS) Plasmid-Vektor (Stratagene) kloniert wurde, begann mit dem Präparieren einiger Nitrozellulose-Filter membranen, welche Bakterienkolonien mit der Bibliothek-DNA trugen. Elf Kolonie-Lifts, etwa 1000 Bakterienkolonien pro Filter, wurden präpariert, wie im obigen Beispiel 12 beschrieben, und sondiert, wie im obigen Beispiel 12 beschrieben. Die verwendete radioaktive Sonde wurde präpariert, indem 0,75 u Hind III verdaute Chromosom-12-Bibliothek-DNA einer PCRReaktion mit ³²PdCTP zugeführt wurde, wie im obigen Beispiel 11 beschrieben.
Jedes der elf Filter erzeugte einige diskrete, intensive Hybridisierungssignale. Nach dem Anpassen der Orientierungen der Filter an ihren jeweiligen Original-Nähr-Agarplatten, wurden 60 Bakterienkolonien, welche starke Hybridisierungssignale auf dem Film erzeugt hatten, zur weiteren Analyse ausgewählt. Das Herstellen der klonierten DNA aus jeder dieser Kolonien und das Bestimmen der Größe der Hind III- Insertionen in jeder dieser Kolonien wurde bewerkstelligt, wie im Beispiel 12 beschrieben. Die Hind III-Verdauung dieser Plasmide identifizierte die Anwesenheit eines oder mehrerer Chromosom-12-DNA-Fragmente pro Klon, welche in der Größenregion von etwa 200 Basenpaaren bis zu 6000 Basenpaaren lagen.
Eine Dot-Blot-Analyse dieser Klone zur Bestimmung, welche derselben DNA enthielten, die komplementär zu Chromosom- 12-Alphoid-Sequenzen war, wurde durch das in Beispiel 12 beschriebene Verfahren erreicht. Die verwendete biotinylierte Sonden-DNA wurde hergestellt, indem 0,75 ug Hind III-digerierte Chromosom-12-Bibliothek-DNA dem PCR-Verfahren zugeführt wurde, welches im Beispiel 3 beschrieben ist.
Alle mit diesem Verfahren untersuchten Klone erzeugten Signale; Keines zeigte sich stärker als eines der anderen. Dreizehn Klone wurden zur weiteren Analyse ausgewählt, wobei jedes Chromosom zwölf Fragmente enthielt, die in einem Größenbereich von 1,3 Kbp bis 6 Kbp lagen.
Zwei der dreizehn Klone enthielten mehr als eine einzelne Hind III-Insertion, wodurch es erforderlich wurde, zu identifizieren, welches dieser klonierten Fragmente für die Hybridisierung zu den gelabelten, amplifizierten Alpha-Satellit-DNA-Sonden verantwortlich war. Eine Southern-Analyse, wie im Beispiel 12 beschrieben, machte es unter Verwendung einer Biotinylierung möglich, den Alphoid-Inhalt in jedem Klon zu bestimmen.
Eine Southern-Analyse der Klone zeigte ein einzelnes Nicht- Vektor-Fragment in jedem der dreizehn Klone, welches für die Erzeugung eines starken Hybridisierungssignals verantwortlich war. Die Fragmente, bei welchen festgestellt wurde, daß sie Alphoid-Sequenzen enthielten, können durch ihre Größe klassifiziert werden:
1,3 - 1,4 Kbp
1,8 Kbp
2,3 - 2,5 Kbp
3 Kbp
3,5 - 3,8 Kbp
4,3 - 4, 5 Kbp
5,5 - 6 Kbp

(B) Funktion klonierter Centromer-12-spezifischer DNAs, welche enzymatisch mit Biotin derivatisiert wurden

Um die Funktion der verschiedenen Plasmide mit Alphoid-DNA zu untersuchen, welche aus der pBS8-Bibliothek durch in situ-Hybridisierungen unter Verwendung des Biotin-Streptavidin-Formates rückgewonnen wurden, war es erforderlich, diese DNAs mit Biotin zu modifizieren. PCR wurde verwendet, um die verwendeten biotingelabelten Proben herzustellen und ein Klon oder Klone zu identifizieren, welche zur Verwendung als Chromosom-12-centromerspezifische Sonde geeignet sind. Ein 0,75 ug Aliquot einer Hind III-digerierten DNA-Matrize aus jedem Klon wurde dem in Beispiel 3 beschriebenen PCR-Protokoll unterworfen. Die PCR-Produkte wurden mit Phenol-Chlorophorm extrahiert und dann auf einer Bio-Spin-30-Säule (BioRad, Richmond, CA) gefiltert, wobei den Herstelleranweisungen gefolgt wurde, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen.
Drei ul Aliquots einer 1 : 50-Verdünnung von jedem gereinigten, biotinylierten Klon wurde in einer in situ-Hybridisierungsprobe ausgewertet.
Als Hybridisierungsmischung, welche auf jeden Glasträger gegeben wurde, wurde stets 55% Formamid/10% Dextransulfat/- 0,15 M NaCl/15 mM-Natriumcitrat, pH 7,0 verwendet. Die Mischung enthielt 3 ul der verdünnten PCR-Reaktionsmischung und 0,5 ug schallbehandelte Lachs-Sperma-DNA, welcher als Träger zugefügt wurde. Zehn Mikroliter der vollständigen Hybridisierungsmischung wurde durch Erhitzen auf 70º C für fünf Minuten und nachfolgendes schnelles Abkühlen auf Eis denaturiert. Die Mischung wurde direkt auf den Glasträger gegeben, mit einem Deckglas abgedeckt, dessen Kanten mit Gummilösung abgedichtet wurden, und sie durfte über Nacht bei 42 C in einer befeuchteten Kammer hybridisieren.
Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VII dargestellt: TABELLE VII Qualitative Ergebnisse

Fußnoten zu Tabelle VII:

(1) Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) gerade sichtbar, (++) gut sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell, (NE) nicht auswertbar.
(2) Spezifität: (-) keine erkennbar, (+) geringe Spezifität, (++) annehmbare Spezifität, (++++) gute Spezifität, (NE) nicht auswertbar.
Basierend auf diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß sowohl eine gute Intensität als auch eine gute Spezifität mit einer Sonde erhalten werden kann, welche von einem einzelnen Plasmid abgeleitet ist.
Basierend auf den Ergebnissen der Auswertung der biotinylierten Klone in der in situ-Hybridisierungsprobe, wurde Klon 1-1 für das direkte Fluor-labeln ausgewählt. Eine Kultur Plasmid 1-1 wurde wie folgt präpariert. Bakterien, welche das Plasmid enthielten, wurden auf der Oberfläche einer YT-Agarplatte mit 200 ug/ml Ampicillin ausgestrichen, und sie durften über Nacht bei 30º C wachsen. Eine einzelne Kolonie von dieser Platte wurde in 500 ml eines 2 YT-Nährmediums in einen 2,4 Liter Fernbach-Kolben übertragen, und sie durfte über Nacht bei 30º C bei konstanter Bewegungsrate mit 200 Zyklen/Minute wachsen.
Die DNA wurde aus den kultivierten Zellmassen extrahiert, indem das in Beispiel 10 beschriebene Protokoll verwendet wurde.

(C) Verfahren zum direkten Labeln der Sonde 1-1 zum Centromer 12

Gereinigte Plasmid-DNA 1-1 wurde in kleine Fragmente von etwa 300 Basenpaaren durch Schallbehandlung, wie oben beschrieben, zerteilt, und die Fragmente der DNA wurden transaminiert und kovalent an die fluoreszierende Verbindung CTMR gebunden, um eine Sonden-Komposition zu erzeugen, wie im obigen Beispiel 18 gelehrt. Die Sonden- Komposition war für die in situ-Hybridisierung nützlich.

Claims

1. Verfahren zum Transaminieren eines Polynucleotids, welches wenigstens ein Desoxycytidin-Nucleotid pro Molekül enthält, unter Bedingungen einer wässrigen flüssigen Phase in Gegenwart eines Hydrogensulfit-Katalysators und ezner reaktiven Verbindung, welche eine Aminogrupoe enthält,

dadurch gekennzeichnet,

daß die Transaminierung in Gegenwart eines gelösten chaotropen Trihalogenacetat-Anions durchgeführt wird, während eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 6CºC und ein pH im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,5 eingehalten werden.

2. Ver fahren gemäß Anspruch 1, worin das chaotrope Trihalogenacetat-Anion ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Trifluoracetat und Trichloracetat besteht.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin

das chaotrope Trihalogenacetat-Anion Trifluoracetat ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches nach den Schritten ausgeführt wird:

(a) Inkontaktbringen der Polynucleotidsequenz in einer wässrigen Lösung, welche als gelöste Stoffe enthält (1) Alkalimetall-Hydrogensulfit und (2) wenigstens ein wasserlösliches Trihalogenacetat-Salz, worin das Trihalogenacetat-Anion ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Trifluoracetat, Trichloracetat und deren Mischungen besteht, mit einer wasserlöslichen difunktionellen Kupplungsverbindung als die reaktive Verbindung, wobei die Kupplungsverbindung pro Molekül zwei funktionelle Substituenreste enthält, von denen einer ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus primären und sekundären Aminoresten besteht, und der andere ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus primären Aminoresten, sekundären Aminorester, Carbonsäureresten und Carboxylatresten besteht, wobei die funktionellen Reste jeweils an einen organischen Rest gebunden sind, der wenigstens zwei und nicht mehr als etwa 20 Kohlenstoffatome enthält;

(b) Halten der Lösung bei einem pH im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,5 und einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 60 ºC, bis die Transminierung des Desoxycytidin-Nukleotids oder der Desoxycytidin- Nukleotide durch die Aminogruppe der Kuppllungsverbindung in vorherbestimmtem Ausmaß stattgefunden hat;

c) Dialyse der resultierenden transaminierten Lösung gegen ein Alkalimetall-Niederalkanoat (mit weniger als sechs Kohlenstoffatomen), um im wesentlichen alle Nicht-Alkaneatsalz-Anionen von, dieser abzutrennen;

(d) Ausfällen des resultierenden transaminierten Nucleotid-Sequenzprodukts aus der so dialysierten Lösung; und

(e) Abtrennen des so ausgefällten Produkts.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin

die difunktionelle Kupplungsverbindung durch die folgende Formel wiedergegeben wird:

worin:

X ein divalenter Rest ist, ausgewählt aus der Klasse, die besteht aus

und

R ein Alkylenrest mit zwei bis einschließlich zwölf Kohlenstoffatomen ist, und

R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Klasse, die besteht aus Wasserstoff und einer Alkylgruppe, welche weniger als sechs Kohlenstoffatome enthält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin

die difunktionelle Kupplungsverbindung Ethylendiamin ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin

das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe die besteht aus (a) wenigstens einer DNA-Sequenz, die nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt wurde, und (b) einer Mischung von fragmentierten Segmenten, die von dieser abgeleitet sind.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin

(a) das Polynucleotid die Mischung der fragmentierten Segmente umfaßt und die Mischung zu einem Ausmaß transaminiert ist, daß etwa 12 bis etwa 70 Mol-Prozent aller darin vorhandenen Desoxycytidin- Nucleotide so durch die Kupplungsverbindung transaminiert sind,

(b) die Segmente eine Durchschnittsgröße im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 Basenpaaren aufweisen,

(c) die Konzentration der Segmente in der Lösung wenigstens etwa 20 Microgramm pro Milliliter ist, und

(d) die Segmente nicht weniger als etwa 1 · 10¹&sup0; komplementäre sequentielle Kopien pro Microgramm des Segments enthalten.

9. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das resultierende, so transaminierte Nukleotidsequenz- Produkt mit einer eine Label-Gruppe enthaltender. Verbindung umgesetzt wird, welche einen reaktiven Rest enthält, der reaktiv ist gegenüber einem funktionellen Rest in dem resultierenden, so transaminierten Nukleotidsequenz-Produkt, der aus der Kupplungsverbindung stammt.