DE69130394T2

DE69130394T2 - Nicht-ätzende zusammensetzung und verfahren zur gewinnung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69130394T2
Application number: DE69130394T
Authority: DE
Inventors: B. Melina Portland Or 97229 Cimler; Rich B. Jr. Woodinville Wa 98072 Meyer; Jeffrey Bothell Wa 98011 Van Ness; Nicholaas Marthinus Johannes Woodinville Wa 98072 Vermeulen
Original assignee: MicroProbe Corp
Current assignee: Nanogen Inc
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2011-07-13
Also published as: JP3102569B2; WO1992000983A1; EP0539515B1; ATE172466T1; ES2125869T3; JPH05508658A; EP0539515A4; CA2087105C; EP0539515A1; CA2087105A1; DE69130394D1

Description

Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Untersuchungsmethoden zur Extraktion und Hybridisierung von Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft diese Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Zellen in komplexen biologischen Proben oder Mustern ohne Verwendung giftiger Verbindungen, wie Phenol und/oder Chloroform, vor allen Dingen durch die Anwendung von Benzylalkohol oder Derivaten von Benzylalkohol. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren sind zur Gewinnung und Reinigung von Nukleinsäuren sehr wirksam.
Organische Lösungsmittel, wie Phenol und Chloroform, werden üblicherweise in Techniken zur Isolierung von Nukleinsäuren von Prokaryonten und Eukaryonten oder von komplexen biologischen Proben eingesetzt. Nukleinsäuren werden typischerweise durch enzymatische Behandlung mit Proteasen, danach Zell-Lysis mit ionischen Detergentien und anschließende Extraktion mit Phenol oder einer Phenol/Chloroform-Mischung isoliert. Die organische und die wäßrige Phase werden getrennt, und Nukleinsäure, die sich in der wäßrigen Phase angereichert hat, wird durch Ausfällung mit Alkohol gewonnen. Allerdings wirken Phenol oder eine PhenoI/Chloroform- Mischung ätzend auf menschliche Haut und werden als gefährliche Abfallstoffe angesehen, die vorsichtig gehandhabt und ordnungsgemäß entsorgt werden müssen. Weiterhin ist die Extraktionsmethode zeitaufwendig und mühsam. Marmur, J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961), beschreibt die Stan dardherstellmethode zur Extraktion und Reinigung von intakter hochmolekularer DNA aus prokaryonten Organismen mittels enzymatischer Behandlung, Zugabe eines Detergens und Anwendung eines organischen Lösungsmittels, wie Phenol oder Phenol/Chloroform. Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979), beschreiben die Isolierung von intakter RNA aus an Ribonuklease angereichertem Gewebe durch Homogenisierung in Guanidiniumthiocyanat und 2-Mercaptoethanol mit nachfolgender Ausfällung mit Ethanol oder durch Sedimentation durch Cäsiumchlorid.
Weiterhin ist die Verwendung chaotroper Agentien, wie Guanidiniumthiocyanat (GuSCN), zur Lysis und Freisetzung von Nukleinsäuren von Zellen in Lösung weit verbreitet, zum großen Teil weil chaotrope Salze Nukleasen und Proteasen inhibieren. Bei einer solchen vorgegebenen hohen molaren Salzkonzentration hat es sich wegen der Inkompatibilität der Chaotrope mit ionischen Detergentien und wegen der Schwierigkeit, die Nukleinsäuren in eine wäßrige Phase zu überführen, jedoch als schwierig herausgestellt, die Nukleinsäuren aus diesen chaotropen Salzlösungen zu isolieren.
Es ist wichtig, Nukleasen während der Isolierungsverfahren der Nukleinsäuren wirksam zu inhibieren, insbesondere wenn das Startmaterial, beispielsweise Kot oder Blut, komplex ist. 1959 haben Brownhill et al. berichtet, daß Bentonit als Inhibitor von Nukleasen wirkt (Brownhill et al., Biochem. J., 73, 434 (1959)). Fraenkel-Conrat et al. haben später eine Methode zur Verwendung von Bentonit zur Inhibierung von Ribonuklease bei einem Verfahren zur Reinigung von Tabakmosaik-Virus entwickelt (Fraenkel- Conrat et al., Virology, 14, 54-58 (1961)). Nachfolgende Forscher berichteten über die Verwendung von Bentonit in Kombination mit Phenol und Chloroform bei der Verringerung der Ribonuklease-Aktivität bei der Isolierung von RNA (Jacoli et al., Can. J. Biochem., 51, 1558-1565 (1973); Griffin et al., Anal. Biochem., 87, 506-520 (1978); Grady et al., Anal. Biochem., 101, 118-122 (1980)1. Es ist auch berichtet worden, daß DNase 1 und a-Amylase durch Behandlung mit Bentonit frei von RNAse gebildet werden können (Garrett et al., Anal. Biochem., 52, 342-348 (1973)).
Die gesamten vorstehend erwähnten herkömmlichen Gewinnungsverfahren für Nukleinsäure erfordern daher die Verwendung von giftigen Verbindungen, wie von Phenol und/oder Chloroform. Forscher haben lange nach sichereren wirksamen Gewinnungsmethoden gesucht.
Diese Erfindung betrifft sichere und wirksame Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren. Insbesondere werden Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus einer Probe beschrieben, die eine Mischung von Nukleinsäuren und anderen biologischen Verbindungen enthält, wobei die Probe mit einer Extraktionslösung in Kontakt gebracht wird, die mindestens eine organische Verbindung enthält, wie Benzylalkohol oder ein Derivat von Benzylalkohol, so daß sich eine wäßrige und eine nicht-wäßrige Phase ausbilden. Die Nukleinsäure wird aus der wäßrigen Phase isoliert. Vorzugsweise enthält die erhaltene kombinierte Lösung auch Bentonit oder Macaloid®, wie nachfolgend definiert wird. Typischerweise wird die Probe vor der Extraktion zuerst mit einem Lysiermittel versetzt. Die bevorzugten Lysiermittel sind chaotrope Salze, wie Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl) und Guanidiniumisothiocyanat (GuSCN).
Vorteilhafterweise kann die oben beschriebene Extraktionslösung auch zusammen mit einem Lactam, wie Cyclohexylpyrrolidon, Dodecylpyrrolidon, Hydroxyethylpyrrolidon, Octylpyrrolidon, 1-Phenyl-2-pyrrolidon und 1,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(H)-pyrrolidon, eingesetzt werden.
Sobald die Nukleinsäure in die wäßrige Phase abgetrennt ist, kann sie mit einem Alkohol, vorzugsweise Ethanol oder iso-Propanol, ausgefällt oder mit Butanol aufkonzentriert werden. Die wäßrige Phase kann auch direkt in Hybridisierungsassays angewendet oder auf festen Trägern für nachfolgen de Untersuchungen immobilisiert werden.
Die für die vorliegende Erfindung verwendeten organischen Verbindungen weisen eine sehr geringe Giftigkeit auf und wirken gegenüber menschlichem Gewebe nicht ätzend. Sie weisen die meisten der Lösungsmitteleigenschaften von Phenol oder Phenol/Chloroform auf und sind hervorragend zur Anwendung bei der Isolierung von Nukleinsäuren und/oder Fraktionierung von biologischen makromolekularen Komplexen geeignet. Außerdem sind sie wesentlich weniger teuer als die üblicherweise verwendeten organischen Lösungsmittel. Auch die Extraktion mit Cäsiumchlorid, Zentrifugierung und die Ausfällung mit Alkohol kann durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren vermieden werden, so daß eine Exposition gegenüber giftigem Cäsiumchlorid umgangen wird. Die erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren sind schneller, einfacher, sicherer und empfindlicher als die bisher bei der Extraktion von Nukleinsäure benutzten Methoden. Daher stellen sie einen bedeutsamen Fortschritt auf diesem Gebiet dar, so daß eine sicherere Übertragung des Verfahrens zur Extraktion von gewünschten Nukleinsäuren auf einen größeren Maßstab möglich ist.
Chaotrope Agentien werden gewöhnlich als Lysiermittel im Extraktionsverfahren eingesetzt. Wegen der Inkompatibilität der chaotropen Agentien mit ionischen Detergentien hat es sich als schwierig herausgestellt, Nukleinsäuren von chaotropen Salzlösungen zu isolieren. Ferner ist es bei vorgegebener hoher molarer Salzkonzentration schwierig, Nukleinsäure in eine wäßrige Phase zu überführen. Die Verwendung von Bentonit in Kombination mit den erfindungsgemäßen Extraktionslösungen zum Einsatz in Extraktionstechniken mit chaotropen Salzen erlaubt die schnelle und einfache Gewinnung intakter RNA, DNA oder der insgesamt enthaltenen Nukleinsäuren insbesondere aus besonders komplexen biologischen Proben.
In Fig. 1 ist das elektrophoretische Profil der gesamten extrahierten Nukleinsäuren (chromosomale DNA und RNA) wiedergegeben, bei denen als organische Phase
2-Methylbenzylalkohol in Spur 1,
4-Methoxybenzylalkohol in Spur 2,
3-Ethoxybenzylalkohol in Spur 3,
4-Phenoxybenzylalkohol in Spur 4,
Benzylalkohol in Spur 5 und
Phenol in Spur 6
verwendet wird.
In Fig. 2 ist das elektrophoretische Profil der insgesamt enthaltenen Nukleinsäuren aus extrahierten Kotproben dargestellt, wobei Benzylalkohol und Bentonit verwendet wurden. In Spur 1 ist das elektrophoretische Profil der insgesamt enthaltenen, aus Kotproben isolierten Nukleinsäuren einschließlich einer Markierung mit Bakterien (Bacteriodes gingivalis) gezeigt, wobei die Extraktionslösung aus Benzylalkohol und 1 Gew.-% Bentonit zusammengesetzt ist. Im Vergleich hierzu ist in Spur 2 das Profil für den Fall gezeigt, daß die Extraktionslösung aus Phenol besteht. In beiden Extraktionsfällen ist die Gewinnung der insgesamt enthaltenen Nukleinsäuren vergleichbar; 16S- und 23S-RNAs werden in intakter Farm isoliert.
Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus einer eine biologische Mischung von Nukleinsäuren und andere biologische Verbindungen enthaltenden Probe. Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die einfache Verarbeitung einer biologischen, Nukleinsäuren enthaltenden Probe durch Extraktion von Nukleinsäuren ohne Verwendung von giftigen oder ätzenden Chemikalien. Die erfindungsgemäßen Methoden ermöglichen ferner die Herstellung einer Nukleinsäureprobe für Hybridisierungsassays.
Die Gewinnungsverfahren schließen folgende Verfahrensschritte ein:
In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer mindestens eine organische Verbindung enthaltenden Extraktionslösung, wie weiter unten ausgeführt, wobei eine wäßrige und eine nicht-wäßrige Phase gebildet wird und Trennen der wäßrigen Phase von der nichtwäßrigen Phase. Die Extraktionslösung ermöglicht die Bildung von zwei Phasen aus der Probe. Die Nukleinsäure wird dann in der wäßrigen Phase isoliert.
Die erfindungsgemäßen Gewinnungsmethoden können auf eine Probe angewendet werden, die eine biologische Mischung von Nukleinsäuren (Ribonukleinsäure (RNA) und/oder Desoxyribonukleinsäure (DNA)) und andere biologische Verbindungen enthalten, die nicht Nukleinsäuren darstellen. Eine derartige Probe kann jede wäßrige Mischung biologischen Materials enthalten, die Nukleinsäuren enthält, einschließlich komplexer biologischer Mischungen irgendwelcher Eukaryonten und/oder Prokaryonten, einschließlich Protoplasten oder anderen biologischen Materials, das Nukleinsäuren beherbergen kann. Die Methoden sind daher auf Gewebekulturen tierischer Zellen, Tierzellen (z. B. Herz, Leber oder Gehirn, homogenisiert in Lysierpuffer), Kot, Blutzellen, Reticulozyten, Lymphozyten, Pflanzenzellen oder andere gegen einen osmotischen Schock empfindliche Zellen sowie Bakterien-, Hefe-, Virus-, Mycoplasma-, Protozoen-, Rickettsia-, Pilz- und andere kleine Mikrobenzellen und ähnliche anwendbar.
Die zu untersuchende oder als Quelle für die Gewinnung von Nukleinsäuren dienende Nukleinsäureprobe wird mit einer Extraktionslösung in Kontakt gebracht, die die Trennung der Nukleinsäuren in der Probe von den anderen in der Probe vorhandenen biologischen Bestandteilen ermöglicht. Die Extraktionslösungen schließen Benzylalkohol, Derivate von Benzylalkohol oder andere Lösungsmittel mit ähnlichen Eigenschaften ein. Das Lösungsmittel muß die Isolierung der Nukleinsäuren von anderen biologischen Komponenten wirksam ermöglichen, indem die Nukleinsäuren durch Ver mischen der Extraktionslösung mit einer wäßrigen Probe in eine wäßrige Phase abgetrennt werden. Die Extraktionslösung soll typischerweise eine organische Zusammensetzung mit einer organischen Verbindung einschließen, die als Eigenschaften
(a) eine Dielektrizitätskonstante von etwa 9,0 bis etwa 15,5,
(b) ein Dipolmoment von etwa 1,35 bis etwa 1,70 Coulomb-Meter und
(c) einen Verteilungskoeffizienten von etwa 0,001 bis etwa 0,3 Teile Wasser zu 1 Teil der organischen Verbindung
aufweist. Vorzugsweise hat eine derartige organische Verbindung auch eine Dichte von etwa 0,7 bis etwa 1,9 g/ml, vorzugsweise von etwa 1,01 bis 1,9 und besonders bevorzugt von etwa 1,09 bis etwa 1,9, und ist nichtätzend gegenüber menschlicher Haut. Beispiele organischer Verbindungen, die für die Extraktionslösung geeignet sind, sind 4-Hexylresorcin und Resorcin sowie die weiteren, unten angeführten Verbindungen.
Die Größe "Dielektrizitätskonstante" (D) ist eine dimensionslose Zahl im Zusammenhang mit dem Coulombschen Gesetz:
wobei F die Anziehungs- oder Abstoßungskraft und q&sub1; und q&sub2; die Größe zweier elektrischer Ladungen sind, die durch einen Abstand d voneinander entfernt sind. Im Vakuum hat D einen Wert von 1,0. Beispiele anderer Werte für D sind 1,00059 für Luft bei 1 atm und bei 0ºC, 24,3 für Alkohol bei 25ºC und 80,37 für Wasser bei 20ºC.
Der Begriff "Dipolmoment" bezieht sich auf eine Molekularkonstante (ρ oder u) und gibt die Verteilung der elektrischen Ladungen in einem neu tralen Molekül an oder die Größe der positiven (+) oder negativen (-) Ladungen, multipliziert mit dem Abstand zwischen den Ladungszentren.
1 Coulomb·Meter = 2,99793 · 10²&sup9; Debye. Wenn das Dipolmoment beispielsweise Null ist, sind die Ladungen symmetrisch verteilt.
Der Begriff "Verteilungskoeffizient" gibt die Konzentration von Wasser in der organischen Phase nach der Phasentrennung an, wenn gleiche Volumina von organischem Lösungsmittel und Wasser vorliegen.
Vorzugsweise enthält die Extraktionslösung wahlweise mindestens eine organische Verbindung der Formel I, wobei Formel I ausgewählt ist aus der Gruppe von Verbindungen mit der chemischen Summenformel C&sub6;H&sub5;CH&sub2;OH oder von:
wobei R¹ ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)nOH, mit n = 1 bis 6, -CH(OH)CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;OH und -CH(OH)COOR&sup5;, wobei
R&sup5; = -(CH&sub2;)pCH&sub3; mit p = 0 bis 3;
R² ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -S(CH&sub2;)rCH&sub3;, mit r = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)qCH&sub3;, mit q = 0 bis 6, -COOR&sup6;, wobei R&sup6; = -(CH&sub2;)SCH&sub3;, mit s = 0 bis 3, -C&sub6;H&sub5;, -CH&sub2;C&sub6;H&sub5;, -OC&sub6;H&sub5;, -OCH&sub2;C&sub6;H&sub5;, -CH&sub2;OH, -CF&sub3; und -(CH&sub2;)tCH&sub3;, mit t = 0 bis 6;
R³ ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -CH&sub3;, -(CH&sub2;)xCH&sub3;, mit x = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)vCH&sub3;, mit v = 0 bis 3; und
R&sup4; ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -(CH&sub2;)yCH&sub3;, mit y = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)wCH&sub3;, mit w = 0 bis 3,
und wobei R², R³ und R&sup4; weiterhin in irgendeiner Stellung in Bezug zur Stellung von R¹ vorkommen können; mit der Maßgabe, daß:
(a) wenn R¹ = -CH(OH)CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;OH oder -CH(OH)COOR&sup5;, dann müssen R², R³ und R&sup4; = -H sein,
(b) wenn R¹ = -CH&sub2;OH und R² = -C&sub6;H&sub5;, -OCH&sub2;C&sub6;H&sub5; oder -CH&sub2;C&sub6;H&sub5;, dann müssen R³ = -CH&sub3;, -OH, -CI, -Br, -F, -I, -H, -OCH&sub3; oder -OCH&sub2;CH&sub3; und R&sup4; = -H sein, und
(c) wenn R¹ = -(CH&sub2;)nOH mit n = 2 bis 6, dann müssen R³ und R&sup4; beide = -H sein.
Formel I soll alle isomeren Formen von Alkylgruppen einschließen und zwar sowohl verzweigte als auch unverzweigte Formen. Soweit nicht anderweitig angegeben, schließen alle Zahlenbereiche die angegebenen Bereichsgrenzen ein, wobei im Falle von Null das Element nicht enthalten ist. Beispielsweise bezieht sich -(CH&sub2;)nCH&sub3; mit n = 0 bis 2 auf die drei Komponenten: -CH&sub3;, -CH&sub2;CH&sub3; und -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub3;. HC&sub6;H&sub5; ist ein Benzolring.
Die folgenden Verbindungen mit der Formel I sind besonders bevorzugt:
diejenigen, bei denen: R¹ = -(CH&sub2;)nOH mit n = 1 bis 4 und R², R³ und R&sup4; = -H
bei denen: R¹ = -(CH&sub2;)nOH mit n = 1 bis 4, R² = -(CH&sub2;)tCH&sub3; mit t = 0 bis 4 und R³ und R&sup4; = -H oder
bei denen: R¹ = -(CH&sub2;)nOH mit n = 1 bis 4,
R² = -O(CH&sub2;)qCH&sub3; mit q = 0 bis 4 und R³ und R&sup4; = -H.
Die vorgenannten Komponenten sind alle handelsüblich. Typische Verbindungen können von Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wiskonsin oder von Fluka Chemical Company, New York, New York bezogen werden.
Die zuvor bezeichneten organischen Verbindungen oder deren Mischungen weisen eine Dichte von etwa 0,7-1,9 g/ml, vorzugsweise von mehr als etwa 1,01 und besonders bevorzugt von mehr als etwa 1,09, auf. Sie haben auch einen Schmelzpunkt von 37ºC oder weniger.
Die am meisten bevorzugten organischen Verbindungen der Extraktionslösung sind Benzylalkohol, 2-Methylbenzylalkohol, 4-Methoxybenzylalkohol, 3-Ethoxybenzylalkohol und 4-Phenoxybenzylalkohol.
Einige der zuvor angegebenen organischen Verbindungen liegen nicht in flüssiger Form vor und können zur Anwendung in der Extraktionslösung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Benzylalkohol, aufgelöst werden.
Üblicherweise werden organische Lösungsmittel, wie Phenol oder eine Phenol/Chloroform-Mischung verwendet, um Nukleinsäure durch Phasentrennung zu extrahieren. Diese Methoden können mit den erfindungsgemäßen Extraktionslösungen wirksam angewendet werden; jedoch besteht ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß solche giftigen Verbindungen und langwierigen Extraktionsmethoden nicht erforderlich sind.
Die Extraktionslösung wird der Probe, die eine biologische Mischung enthält, in Kontakt gebracht, so daß die kombinierte Lösung zweiphasig wird, wobei sich das nicht die Nukleinsäure enthaltende Material in der or ganischen Phase und die Nukleinsäure in der wäßrigen Phase anreichern. Es ist hilfreich, die organische Phase mit einem geeigneten Puffer zu sättigen, typischerweise mit dem Puffer, der zum Verdünnen oder Suspendieren der Probe verwendet wird. Die kombinierte Lösung wird typischerweise vermischt und einmal oder mehrmals mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert. Das Zentrifugieren ist für die Phasentrennung nicht erforderlich, es beschleunigt jedoch die Trennung.
Die Nukleinsäure in der wäßrigen Phase wird mit bekannten Methoden mit einem Alkohol, wie Ethanol oder iso-Propanol, ausgefällt. Sie kann auch in der wäßrigen Phase belassen werden, beispielsweise zur Anwendung bei Hybridisierungsmethoden. Die wäßrige Phase kann auch mittels frisch zugegebener Extraktionslösung wieder re-extrahiert werden.
Die Extraktionslösung soll mit der Probe in Kontakt gebracht werden, so daß die kombinierte Lösung typischerweise etwa 10 bis etwa 80 Vol.-%, vorzugsweise etwa 40 bis etwa 60 Vol.-% und besonders bevorzugt etwa 50 Vol.-%, der zuvor beschriebenen organischen Zusammensetzung enthält. Vorzugsweise soll die Extraktionslösung auch Standardpuffer und Detergentien enthalten, um die Lysis der Zellen zu fördern. Es kann ein Puffer, wie Natriumcitrat, Tris-HCl, PIPES oder HEPES, vorzugsweise Tris-HCl, in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 0,1 M, eingesetzt werden. Typischerweise soll der Puffer auch etwa 0,05 bis 5% eines ionischen oder nichtionischen Detergens, beispielsweise Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Sarkosyl (Handelsname von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), zwischen 1 bis 20 mM EDTA und zwischen etwa 0-250 mM eines Salzes, wie NaCl, enthalten.
Vorzugsweise ist in der Extraktionslösung ferner ein Nuklease-Inhibitor enthalten, insbesondere ein Organo-Tonmineral oder ähnliches, und besonders bevorzugt Bentonit, Macaloid®, Bentone® (Plättchen eines Bentonit- oder Hektorit-Organo-Tonminerals mit einem langen organischen Rest, jeweils auf den beiden Oberflächen gebunden) oder ähnliches, sowie deren Mischungen, Derivate oder Analoge, in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 5 Gew.-%. Bentonit soll hier jedes Tonmineral oder Silikat einschließen, wie Diatomeenerde oder irgendeine Substanz, die im wesentlichen aus Montmorillonit (Al&sub2;O&sub3;·4SiO&sub2;·H&sub2;O) besteht, und typischerweise Aluminiumsilikat oder ähnliche Substanzen. Für den Gebrauch wird Bentonit zunächst mit Wasser gesättigt und dann zur Extraktionslösung zugegeben. Macaloid® (ein Tonmineral) und Bentone® sind bei N. L. Chemicals, Hightstown, N. J. erhältlich. Bentone® ist für den erfindungsgemäßen Gebrauch besonders geeignet, da das teilchenförmige Material, verglichen mit Bentonit und Macaloid®, längere Zeit relativ homogen suspendiert bleibt. Es kann erforderlich sein, zuerst den Nuklease-Inhibitor, beispielsweise Bentonit oder Macaloid®, gemäß der in Sambrook et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" ("Molekular- Cloning - Ein Laborbuch"), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), angegebenen Methode, auf die hiermit Bezug genommen wird, zu reinigen. Zur wirksamen Extraktion werden vorzugsweise kleine gleichförmige Teilchen verwendet. Derartige Nuklease-Inhibitoren sind besonders geeignet, wenn RNA extrahiert werden soll. In Proben, in denen Ribonuklease die Extraktion nicht wesentlich behindert, oder wenn nur DNA extrahiert werden soll, kann Nukleinsäure ohne Verwendung derartiger Nuklease-Inhibitoren extrahiert werden.
Die Extraktionslösung enthält gegebenenfalls einen Aminotriarylmethan-Farbstoff, wie die in R. D. Lillie, H. J. Conn's Biological Stains, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1977) beschriebenen. Als Eigenschaften von geeigneten Farbstoffen sind die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, minimale oder keine Anreicherung in Wasser und minimale oder keine Bindung an Nukleinsäuren zu nennen. Ein bevorzugter Farbstoff ist Methylviolett, wobei Methylviolett 6B (Handelsname) besonders bevorzugt ist. Die Verwendung von Farbstoff in der Extraktionslösung führt zu einer gefärbten organischen Phase und einer farblosen wäßrigen Phase, so daß eine verbesserte Abgrenzung der zwei Phasen beim Extraktionsprozeß erhältlich ist. Die Farbstoffkonzentration ist ausreichend, um einen sichtbaren Kontrast zwischen der wäßrigen und der organischen Phase zu ermöglichen. Die Konzentration wird typischerweise im Bereich von etwa 0,0005-0,01 Gew.-% eingestellt. Da sich der Farbstoff in der organischen Phase anreichert, kann die bevorzugte organische Verbindung mit der Wahl des Farbstoffes variieren.
Die biologischen Proben werden üblicherweise unter Anwendung von Lysiermitteln vor oder während der Extraktion lysiert, um die Proteinstruktur zu stören und um die Nukleinsäure freizusetzen. Vorzugsweise wird die Probe vor der Zugabe der Extraktionslösung lysiert. Alle üblicherweise bei der Extraktion von Nukleinsäure verwendeten Lysiermittel sind geeignet, wie SDS, Lysozym, Proteinase K in verschiedenen Mischungen mit chaotropen Agentien oder alle anderen Stoffe, die die Zellmembran schwächen oder zerstören.
Chaotrope Agentien, die die Sekundär- und Tertiärstruktur von Proteinen stören (z. B. Guanidiniumsalze, wie Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl), Guanidiniumisothiocyanat (GuSCN), Harnstoff oder andere Isothiocyanate) können in Verbindung mit der Extraktionslösung oder vor deren Anwendung als Lysiermittel eingesetzt werden, um Nukleinsäuren zu trennen und um Nukleasen zu inhibieren. Die Verwendung von chaotropen Agentien bei der Extraktion und Hybridisierung von Nukleinsäuren ist in der EP-Druckschrift 0 127 327 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Das chaotrope Agens ist in einer Konzentration enthalten, die ausreicht, um Nukleinsäure aus den Trägerzellen freizusetzen und um die freigesetzte Nukleinsäure gegen Nuklease zu schützen. Typischerweise ist das Chaotrop in einer Konzentration von etwa 1 M bis etwa 5 M und besonders bevorzugt von etwa 2 M bis etwa 3 M enthalten. Lactame können ebenfalls in Kombination mit der Extraktionslösung verwendet werden, um die Lysis und Extraktion zu erleichtern. Beispiele von Lactamen und deren Verwendung in Extraktionsverfahren sind in US-Patent 5,106,730 (Ser. No. 07/384,235, eingereicht am 24.07.1989) ausführlich beschrieben, auf das hiermit Bezug genommen wird. Bevorzugte Lactame sind Cyclohexylpyrrolidon, 1-Phenyl-2-pyrrolidon und 1,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(H)-pyrrolidon.
Zur Extraktion der insgesamt enthaltenen Nukleinsäure (DNA und RNA) wird die Extraktion typischerweise etwa 1 bis 10 Minuten lang bei etwa 37ºC bis etwa 65ºC durchgeführt. Das Extraktionsverfahren ergibt dabei bevorzugt eine wäßrige Probe, die Nukleinsäure in einer Konzentration enthält, so daß deren Menge in der wäßrigen Phase nach dem Mischen der Probe mit der Extraktionslösung 1 mg/ml nicht übersteigt. Als nützliche Daumenregel wird angegeben, daß die Menge des insgesamt enthaltenen biologischen Materials in einer vorgegebenen Probe 50 mg/ml nicht übersteigen darf. Das Verhältnis des Probenvolumens zum Volumen der Extraktionslösung beträgt typischerweise 0,5 : 1 bis 3 : 1, bevorzugt 0,75 : 1 bis 2 : 1 und besonders bevorzugt etwa 1 : 1.

Extraktion von ribosomaler RNA

Die erfindungsgemäßen Extraktionslösungen erlauben auch die selektive Extraktion von ribosomaler RNA (rRNA). Nachdem die die Nukleinsäuren enthaltende Probe lysiert worden ist, wird die Probe vor oder nach dem Mischen mit der Extraktionslösung erwärmt. Die Ausbeute an rRNA wird durch ein etwa 10 Minuten langes Erwärmen der Probe auf 65ºC vor oder nach der Zugabe der Extraktionslösung 5- bis 50-fach erhöht. Wenn die Probe nicht erwärmt wird, wird in erster Linie DNA extrahiert.
Daher ist durch eine zunächst durchgeführte Lysis der Probe eine sequentielle Extraktion von rRNA und DNA möglich. Danach wird die Extraktion bei Raumtemperatur durchgeführt, indem die hier beschriebenen Extraktionslösungen verwendet werden. DNA wird aus der ersten wäßrigen Phase isoliert, wobei rRNA in der ersten organischen Phase zurückbleibt. RNA wird dann aus der ersten organischen Phase nach Zugabe einer Standard-Pufferlösung (beispielsweise 1% SDS, 50 mM Tris, 25 mM EDTA und 0,05 mM NaCl) extrahiert. Diese Lösung wird erwärmt, typischerweise auf etwa 65ºC, um eine zweite organische Phase und eine zweite wäßrige Phase zu bilden.
Besonders bevorzugte Extraktionslösungen, die wahlweise auch als Untersuchungskit angeboten werden können, enthalten Bentonit oder Bentone®, ein Lysiermittel und eine aus den zuvor beschriebenen organischen Verbindungen ausgewählte Verbindung zusammen mit der Extraktionslösung. Die neuen Extraktionsmischungen können jeden der zuvor beschriebenen Bestandteile in Kombination enthalten, der in den verschiedenen beschriebenen Extraktionslösungen enthalten sein kann.

Extraktion zur Verbesserung der Hybridisierung

Es ist ferner vorteilhaft, die erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren und -zusammensetzungen vor der Durchführung eines Hybridisierungsassay an einer komplexen biologischen Probe, beispielsweise Kot oder Blut, durchzuführen. Das Extraktionsverfahren kann in einigen Fällen notwendig sein, um Verunreinigungen, die zu Untergrundstörungen beitragen können, zu entfernen. Eine Extraktion, gefolgt von Methoden zur Aufkonzentrierung der Nukleinsäure, kann die Empfindlichkeit und das Signal/Rausch-Verhältnis bei Hybridisierungsassays verbessern.
Ein erfindungsgemäßes Hybridisierungsassay kann mit jeder bekannten Methode oder mit Methoden, die zu Immunoassayverfahren analog sind, gemäß den hier angegebenen Anleitungen durchgeführt werden. Bevorzugte Assays sind die Sandwich-Assays und deren Abwandlungen sowie der Competition- oder Displacement-Assay. Hybridisierungstechniken sind allgemein beschrieben in: "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach" ("Hybridisierung von Nukleinsäuren - Eine praktische Methode"), Hrsg. Hames, B. D. und Higgins, S. J., IRL Press, 1985; Gall und Pardue (1969), Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 63, 378-383; John, Burnsteil und Jones (1969), Nature, 223, 582-587. Sobald Verbesserungen bei den Hybridisierungstechniken erreicht sind, können diese leicht umgesetzt werden.
Sandwich-Assays sind handelsüblich gebräuchliche Hybridisierungsassays zur Bestimmung oder Isolierung von Nukleinsäuresequenzen. Bei solchen Assays werden eine "Capture"-Nukleinsäure, die auf einem festen Träger kovalent immobilisiert ist, und eine markierte "Signal"-Nukleinsäure in Lösung verwendet. Die klinische Probe soll die Träger-Nukleinsäure liefern. Die "Capture"-Nukleinsäure und die "Signal"-Nukleinsäure-Sonde hybridisieren mit der Träger-Nukleinsäure, wobei ein "Sandwich"-Hybridisierungskomplex gebildet wird. Um wirksam zu sein, kann die Signal-Nukleinsäure mit der Capture-Nukleinsäure nicht hybridisieren.
Beim Hybridisierungsassay stellt die Träger-Nukleinsäure die Nukleotidsequenz von Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA) oder ribosomaler Ribonukleinsäure (rRNA) dar, deren Gegenwart oder Abwesenheit festgestellt werden soll. Die Träger-Nukleinsäure kann in einer komplexen biologischen Mischung von Nukleinsäure (RNA, DNA und/oder rRNA) und Nicht-Nukleinsäure bereitgestellt werden.
Die Hybridisierungsmedien können vorbereitet werden, entweder kommerziell oder im Laboratorium, indem sie alle notwendigen Bestandteile zur Hybridisierung enthalten. Beispielsweise könnten die Medien für ein Sandwich-Assay ein Lactam, gewünschte Puffer und Detergentien, eine an einen festen Träger, wie ein Mikroteilchen, gebundene Capture-Nukleinsäure, und eine Signal-Nukleinsäure, enthalten. Dieses Medium braucht dann lediglich mit der die Träger-Nukleinsäure enthaltenden Lösung zu dem Zeitpunkt vermischt werden, zu dem das Assay durchgeführt werden soll. Sobald die Hybridisierung stattfindet, kann der an den festen Träger gebundene Hybridisierungskomplex gewaschen und das Ausmaß der Hybridisierung bestimmt werden.
Sobald die passenden Sequenzen bestimmt sind, werden DNA-Sonden vorzugsweise chemisch synthetisiert, indem im Handel erhältliche Verfahren und Mittel eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Phosphoramidit-Methode auf fester Phase angewendet werden, um kurze Sonden mit zwischen 15 und 50 Basen herzustellen, die ein Molekulargewicht von weniger als 16.000 Daltons aufweisen (Caruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 411-418 (1982) und Adams et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 661 (1983)). Wenn eine Sonde für einen spezifischen Träger synthetisiert wird, wird die Wahl der Nukleotidsequenz die Spezifität des Tests bestimmen. Indem beispielsweise DNA-Sequenzen verschiedener isolierter Viren verglichen werden, kann eine Sequenz für die Virusbestimmung ausgewählt werden, die entweder typen- oder artenspezifisch ist. DNA-Regionen und -sequenzen können mit handelsüblichen Rechnerprogrammen verglichen werden.
Das Maß der Hybridisierung kann mit jeder bekannten Methode bestimmt werden. Für den Fall, daß eine Hybridisierung nicht feststellbar ist, ist der entsprechende Wert daher 0. Typischerweise werden markierte Signal-Nukleinsäuren verwendet, um die Hybridisierung zu festzustellen. Komplementäre Nukleinsäuren oder Signal-Nukleinsäuren können mit einer der verschiedenen Methoden, die typischerweise eingesetzt werden, um die Gegenwart von hybridisierten Polynukleotiden zu ermitteln, markiert werden. Die am meisten angewendete Bestimmungsmethode ist die Autoradio graphie mit ³H-, ¹²&sup5;I-, ³&sup5;S-, ¹&sup4;C- oder ³²P- markierten Sonden oder ähnliche Verfahren. Die Auswahl radioaktiver Isotope hängt von der Leichtigkeit des jeweiligen Syntheseweges, der unterschiedlichen Stabilität und den Halbwertszeiten der ausgewählten Isotope ab. Andere Marker schließen Liganden ein, die an markierte Antikörper, Fluorophore, chemilumineszierende Agentien, Enzyme und Antikörper, die als spezifische Bindungspaarglieder für einen markierten Liganden dienen, binden. Die Auswahl des Markers hängt von der erforderlichen Empfindlichkeit, der Leichtigkeit der Verbindung mit der Sonde, von Stabilitätserfordernissen und dem verfügbaren Instrumentarium ab.
Extraktions- und Hybridisierungskits für Nukleinsäuren, die die vorgenannten Lösungen und Zusammensetzungen in den verschiedenen gewünschten Mischungen enthalten, können ebenfalls eingesetzt werden.
Typischerweise üben in biologischen Proben enthaltene Verbindungen eine inhibierende Wirkung auf die Trägerverstärkungsmethoden, wie PCR und LCR, aus. Diese beobachtete Inhibierung ist besonders bei der Verstärkung von aus Blutproben extrahierter Nukleinsäure problematisch. Mit den erfindungsgemäßen Methoden werden die meisten, wenn nicht alle Inhibitoren der Trägerverstärkung aus biologischen Proben im allgemeinen und insbesondere aus Blut entfernt. Daher können die beanspruchten Verfahren vorteilhaft in Kombination mit Trägerverstärkungsverfahren eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung ist besonders für die Trägerverstärkung von Nukleinsäure, die aus biologischen Proben erhalten wurde, geeignet und die Träger-Nukleinsäure mit geringer Kopieanzahl enthalten.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und sind nicht in irgendeiner Weise als die beanspruchte Erfindung beschränkend auszulegen.

Beispiel 1

Extraktion der insgesamt enthaltenen Nukleinsäuren mit Benzylalkohol und Derivaten von Benzylalkohol
Dieses Extraktionsprotokoll erlaubt die Isolierung von Nukleinsäuren aus mit Guanidiniumisothiocyanat lysierten Proben ohne Verwendung von Phenol oder Phenol/Chloroform. Die organische Phase ist aus Benzylalkohol oder einem Derivat von Benzylakohol gebildet.
Ungefähr 5 · 10&sup9; Bacteroides gingivalis-Zellen wurden in 750 ul einer 3 M GuSCN (Kodak, Rochester, New York) und 2% Sarkosyl (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), 50 mM Tris (pH 7,6) und 25 mM EDTA enthaltenden Lysierlösung lysiert. Dann wurden aliquote Portionen von 100 ul des Lysats in sechs 1,5 ml große Mikrozentrifugierröhrchen gegeben. Zu jedem Röhrchen wurden jeweils hinzugegeben: 500 ul der mit 0,05 M Tris-HCl und 5 mM EDTA (pH 7,2) gesättigten organischen Phase, wobei die organische Phase
in Röhrchen 1 : 2-Methylbenzylalkohol (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin),
in Röhrchen 2 : 4-Methoxybenzylalkohol (Aldrich),
in Röhrchen 3 : 3-Ethoxybenzylalkohol (Aldrich),
in Röhrchen 4 : 4-Phenoxybenzylalkohol (Aldrich),
in Röhrchen 5: Benzylalkohol (Aldrich) und
in Röhrchen 6: Phenol (Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, Maryland)
war, sowie 250 ul eines Extraktionspuffers (0,05 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA und 0,5% Natriumdodecylsulfat (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri (SDS))). Die Lösungen wurden 15 Sekunden lang heftig gemischt und 10 Minuten lang auf 65ºC erwärmt. Die Röhrchen wurden dann wieder 15 Sekunden lang heftig geschüttelt. Anschließend wurden die Phasen durch Zentrifugieren bei 10.000 UpM in einer Mikrozentrifuge getrennt. Die obere wäßrige Phase wurde entfernt (üblicherweise ein Volumen von 400 pl), und danach wurde zweimal das Volumen von 100%igem Ethanol zur wäßrigen Phase zugegeben. Innerhalb von 5 Minuten fiel die Nukleinsäure bei 19ºC aus. Die Nukleinsäuren wurden anschließend durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 10.000 UpM als Feststoff abgetrennt. Die flüssige Phase wurde dann dekantiert und verworfen. Die feste Nukleinsäure wurde in 100 ul destilliertem Wasser aufgelöst und dann mit Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 wiedergegeben und zeigen an, daß Ausbeute und Reinheit aus den Extraktionen mit denen bei Verwendung von Phenol vergleichbar waren.

Beispiel 2:

Extraktion der insgesamt enthaltenen Nukleinsäuren aus Kotproben bei Verwendung von Benzylalkohol und Bentonit
Dieses Extraktionsprotokoll erlaubt die Isolierung von Nukleinsäuren aus besonders komplexen, mit Guanidiniumisothiocyanat lysierten Proben ohne Verwendung von Phenol oder Phenol/Chloroform. Die organische Phase ist aus Benzylalkohol und Bentonit gebildet.
Kotproben in einem Transportmedium (Trend Fekal Enteric Plus Transport System, Trend Scientific Inc., St. Paul, Minnesota) wurden jeweils in aliquote 100 pl große Portionen aufgeteilt. Jedes Aliquot wurde wie in Beispiel 1 mit 300 ul einer GuSCH-Lysierlösung lysiert und mit 5 · 10&sup8; Bacteroides gingivalis-Zellen markiert. Nach dem Markieren wurden die Proben in zwei gleiche Sätze geteilt. Ein Satz wurde mit Phenol extrahiert, und der andere Satz wurde unter Zugabe von 500 ul einer Benzylalkohol/Bentonit-Lösung extrahiert, die Benzylalkohol, 1 Gew.-% H&sub2;O-gesättigtes Bentonit (Sigma) und 250 ul eines Extraktionspuffers (0,05 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA und 0,5% Natriumdodecylsulfat) enthielt. Die Lösungen wurden 15 Sekunden lang heftig gemischt und 10 Minuten lang auf 65ºC erwärmt. Die Röhrchen wurden dann wieder 15 Sekunden lang heftig geschüttelt. Die Phasen wurden danach durch 2 Minuten langes Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 UpM getrennt. Die obere wäßrige Phase wurde entfernt (im allgemeinen ein Volumen von 400 ul), und anschließend wurde zweimal ein Volumen von 100%igem Ethanol zur wäßrigen Phase zugegeben. Innerhalb von 5 Minuten fiel die Nukleinsäure bei 19ºC aus. Die Nukleinsäuren wurden anschließend durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 10.000 UpM als Feststoff abgetrennt. Die flüssige Phase wurde dann dekantiert und verworfen. Die feste Nukleinsäure wurde in 100 ul destilliertem Wasser aufgelöst und dann mit Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt.
Für die Phenolextraktion wurden Proben, wie oben angegeben, lysiert und, genau wie für das Extraktionsverfahren mit Benzylalkohol beschrieben, extrahiert. Die Phasen wurden, wie zuvor angegeben, durch Zentrifugieren getrennt, und die wäßrige Phase wurde mit einem zusätzlich zugegebenen Volumen von Phenol re-extrahiert. Die isolierten Nukleinsäuren wurden dann, wie angegeben, mit 70%igem Ethanol ausgefällt. Die flüssige Phase wurde abdekantiert und verworfen. Die feste Nukleinsäure wurde in 100 ul destilliertem Wasser aufgelöst und dann mit Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, in der gezeigt ist, daß die insgesamt enthaltenen Nukleinsäuren aus Quellen mit einem hohen Nuklease-Level mittels Extraktion mit Benzylalkohol isoliert werden können.

Beispiel 3:

Verbesserte Hybridisierungsverfahren durch Vorextraktion einer komplexen biologischen Probe
Für den Assay werden feste Nylonträger in einem Sandwich-Assay- Format verwendet, bei der eine Träger-Nukleinsäure-Sequenz abgeschieden und dann mittels eines auf Fluoreszenz basierenden Assay-Format detektiert wird.
Kotproben in einem Transportmedium (Trend Fekal Enteric Plus Transport System, Trend Scientific Inc.) wurden jeweils in aliquote, 100 ul große Portionen aufgeteilt. Jedes Aliquot wurde wie in Beispiel 1 mit 300 pl einer GuSCN-Lysierlösung lysiert und mit 5 · 10&sup8; Bacteroides gingivalis markiert. Nach dem Markieren wurden die Proben in zwei gleiche aliquote Mengen geteilt. Ein Aliquot wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Benzylalkohol/Bentonit-Methode extrahiert. Das andere Aliquot wurde nicht extrahiert. Die feste Nukleinsäure aus der extrahierten Probe wurde in 100 ul einer 3 M GuSCN-Lysierlösung (in 2% Sarkosyl, 50 mM Tris (pH 7,6) und 25 mM EDTA) aufgelöst. Sowohl das nicht extrahierte Lysat als auch die isolierte Nukleinsäure in 3 M GuSCN wurden 5 Minuten lang auf 65ºC erwärmt. Eine biotinylierte 24-mer Oligonukleotid-Sonde, die zu erhaltenen Regionen von bakterieller 16S rRNA (Signalsonde) komplementär war, wurde zu einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro ml zum Lysat und zu der isolierten Nukleinsäure zugegeben.
Fünf aufeinanderfolgende Verdünnungen der Lysate wurden unter Verwendung von Verdünnungsmitteln in der 3 M GuSCN-Lysierlösung hergestellt, die die biotinylierten Signal-Oligonukleotide:
Oligonukleotid-Sequenzen:
Bg 1 : 5'-XCAATACTCGTATCGCCCGTTATTC-3'
UP9A: 5'-XCTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'
sowie 1 · 10&sup8; der gesamten Zellen von Actinobacillus actinomycetecomitans, Bacteroides intermedius, Eikenella corrodens, Wolinella recta und Fusobacterium nucleatum im Falle der extrahierten Probe und das Kotlysat im Falle der nicht extrahierten Probe enthielten.
Die Verdünnungsmittel enthielten, wie oben beschrieben, 100 mg/ml biotinylierte Signal-Oligonukleotide. Die Lösungen wurden dann 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur mit zwei von der The Hoover Group (Sault St. Marie, MI) hergestellten Nylon-Perlen, die 0,1 um von Bg 1-spezifischer Oligonukleotid-Sonde (Capture-Sonde) kovalent immobilisiert enthielten, entwickelt. Die festen Träger wurden mit SDS/FW (0,09 M NaCl, 50 mM Tris pH 7,6, 25 mM EDTA und 0,1% SDS) bei Umgebungstemperatur gewaschen, anschließend mit 0,5% Tween 20® (Pierce, Rockford, Illinois), 1 mM MgCl&sub2;, 0,01 M Tris-HCl pH 8,0 (APB) gewaschen und dann 5 Minuten lang mit 0,4 ug/ml eines Streptavidin/alkalische Phosphatase- (SA/AP)-Konjugats in APB bei Umgebungstemperatur entwickelt. Die festen Träger wurden dann fünfmal mit APB, TMNZ (0,05 M Tris (pH 9,5), 1 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM ZnCl&sub2;) gewaschen und danach das Vorhandensein alkalischer Phosphatase bestimmt, indem die Nylonperlen mit 150 ul von 0,5 mM 4-Methylumbelliferylphosphat (4-Hydroxymethylcoumann) in schwarzen Mikrotiter-Quell-Streifen (black microtiter well strips, Dynatek Laboratories, Chantilly, VA) entwickelt wurden. Die Entwicklung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC durchgeführt. Die Lösung wurde dann abdekantiert und in eine 96-Quell-Mikrotiter-Platte (96 well microtiter plate) eingesetzt. Die Platten wurden dann mit einem Fluoroskan II Fluorometer (Flow Laboratories, McLean, VA) direkt ausgelesen, indem eine Anregungswellenlänge von 360 nm und eine Emissionswellenlänge von 456 nm verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung der extrahierten Probe bei einer 30 Minuten langen Hybridisierung eine Menge von 6 · 10³ Zellen ermittelt wurde, während bei der nicht extrahierten Probe nur eine Menge von 4 · 10&sup6; Zellen festgestellt wurde.

Beispiel 4:

Extraktion von DNA aus biologischen Proben mit Benzylalkohol und Bentone®

Eine Suspension von E. coli wurde durch Zentrifugieren erhalten und der erhaltene Feststoff wieder re-suspendiert, so daß zwischen 10&sup8; und 10¹&sup0; Zellen/ml in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,6), enthaltend 10 mM EDTA und 10 Gew.-% Sucrose, vorlagen. Die Suspension wurde dann 5-15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur entwickelt. In einem anderen Versuch wurde eine Blutprobe in ein Natrium-EDTA enthaltendes Sammelröhrchen aufgenommen.
Die biologische Probe (entweder die bakterielle Suspension oder die Blutprobe) wurden mit einem gleich großen Volumen eines Lysierpuffers (5 M GuSCN, 83 mM Tris-HCl, pH 7,6, 17 mM EDTA und 3,3 Gew.-% Sarkosyl) lysiert.
Das Lysat (200 ul) wurde in ein 2 ml-Zentrifugierröhrchen überführt. Nach heftigem Schütteln wurden 700 ul einer Extraktionslösung (1,1 Gew.-% Bentone® in 99%igem reinem Benzylalkohol) zum Lysat gegeben. Zu dieser Mischung wurden 400 ul Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,5 Gew.-% SDS) zugegeben. Die Mischung wurde 10 Sekunden lang aufgewirbelt und dann 5 Minuten lang bei 12.000 · g zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde in ein neues 2 ml- Mikrozentrifugierröhrchen überführt, und 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat wurden zugegeben. Ein gleich großes Volumen von iso-Propanol wurde hinzugefügt und die Lösung sanft vermischt, um DNA auszufällen. Nach 10 Minuten langem Zentrifugieren bei 12.000 · g wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen und 1 ml von 70%igem Ethanol wurde zur festen DNA hinzugegeben. Nach sanftem Vermischen wurde das Präparat 5 Minuten lang bei 12.000 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, der Feststoff wurde an Luft getrocknet, und die feste DNA wurde dann in RNase-freiem Wasser oder einem geeigneten Puffer bis zum Erreichen der gewünschten Konzentration re-suspendiert.
Die extrahierte DNA entsprechend dem in diesem Beispiel wiedergegebenen Protokoll ist für eine Anwendung bei Trägerverstärkungsverfahren geeignet, wie dem PCR-Verfahren (Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)). Verschiedene Trägerverstärkungsverfahren sind bekannt. In Tabelle 2 ist gezeigt, daß das DNA-Extraktionsverfahren nach diesem Beispiel die Verstärkung und Bestimmung von Träger-Nukleinsäure mit geringer Kopieanzahl erlaubt. Hierzu wurden bekannte Konzentrationen eines HIV-1 Plasmids zu menschlichem Gesamtblut zugegeben, wobei 0-250 pHIV-1- Kopien pro PCR Reaktion erhalten wurden. Duplikate von 100 ul-Blutproben wurden extrahiert, die extrahierte Nukleinsäure wurde in 100 ul Wasser resuspendiert, und 50 ul dieser Nukleinsäure-Suspension wurde pro Verstärkungsreaktion verwendet. Der verstärkte Träger wurde durch Hybridisierung einer komplementären, mit ³²P markierten Oligonukleotid-Sonde detektiert.
In Tabelle 3 ist die Extraktion von DNA mit Gesamtblut unter Verwendung einer Proteinase K/Phenol-Extraktionsmethode mit der Extraktionsmethode dieses Beispiels verglichen. Hierzu wurden drei PCR-positive HTLV-I-Blutproben und fünf Kontroll-Blutproben (HTLV-I negativ auf PCR) in Natrium-EDTA enthaltenden Röhrchen gesammelt. Jede der positiven Pro ben wurden nacheinander in Fünffach-Schritten mit Kontrollblut verdünnt. Duplikate von 100 ul-Blutproben wurden mit einem Proteinase K/Phenol- Verfahren (siehe beispielsweise Sambrook et al. in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" ("Molekular-Cloning - Ein Laborbuch"), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; R. Higuchi in "Amplifications - A Forum for PCR Users" ("Verstärkungen - ein Forum für PCR-Benutzer"), Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, 1989) oder mit der Methode nach diesem Beispiel extrahiert. Die extrahierte Nukleinsäure wurde in 100 ul Wasser resuspendiert, und 50 ul dieser Nukleinsäure-Suspension wurde pro PCR-Reaktion eingesetzt. Der verstärkte Träger wurde durch Hybridisierung einer komplementären, mit ³²P markierten Oligonukleotid-Sonde detektiert. In Tabelle 3 ist anschaulich dargestellt, daß Proteinase K/Phenol und das beschriebene Verfahren vergleichbare Extraktions- und Erfassungsgrenzen liefern.

Beispiel 5:

Extraktion der insgesamt enthaltenen Nukleinsäure aus biologischen Proben mit Benzylalkohol und Bentone®

Eine Suspension von E. coli wurde durch Zentrifugieren erhalten. Der erhaltene Feststoff wurde so re-suspendiert, daß sich zwischen 10&sup8; und 10¹&sup0; Zellen/ml in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,6), enthaltend 10 mM EDTA und 10 Gew.-% Sucrose, einstellten. Die Suspension wurde dann 5-15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur entwickelt. In einem anderen Versuch wurde eine Blutprobe in einem Natrium-EDTA enthaltenden Sammelröhrchen aufgenommen.
Die biologische Probe (entweder die bakterielle Suspension oder die Blutprobe) wurde mit einem gleich großen Volumen eines Lysierpuffers (5 M GuSCN, 83 mM Tris-HCl, pH 7,6, 17 mM EDTA und 3,3 Gew.-% Sarkosyl) lysiert.
Das Lysat (200 ul) wurde in ein 2 ml-Mikrozentrifugierröhrchen überführt. Nach heftigem Schütteln wurden 700 ul einer Extraktionslösung (1,1 Gew.-% Bentone® in 99%igem reinem Benzylalkohol) zu dem Lysat zugegeben. Zu dieser Mischung wurden 400 ul Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,5 Gew.-% SDS) hinzugefügt. Die Mischung wurde 10 Sekunden lang aufgewirbelt, 10 Minuten lang bei gelegentlichem Mischen auf 65ºC erwärmt und dann 5 Minuten lang bei 12.000 · g zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde in ein neues 2 ml- Mikrozentrifugierröhrchen überführt. 500 ul Extraktionslösung (Benzylakohol und Bentone®, wie vorstehend beschrieben) wurden hinzugegeben. Die Mischung wurde 10 Sekunden lang aufgewirbelt und 5 Minuten lang bei 12.000 · g zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde erneut in ein neues 2 ml-Mikrozentrifugierröhrchen überführt, und 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat wurden hinzugefügt. Ein gleich großes Volumen von isoPropanol wurde zugegeben, und die Lösung wurde sanft gemischt, um die insgesamt enthaltene Nukleinsäure auszufällen. Nach 10 Minuten langem Zentrifugieren bei 12.000 · g wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen, und 1 ml von 70%igem Ethanol wurde zu der festen Nukleinsäure zugegeben. Nach sanftem Mischen wurde das Präparat 5 Minuten lang bei 12.000 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, der Feststoff wurde an Luft getrocknet, und die feste Nukleinsäure wurde dann in RNase-freiem Wasser oder einem geeigneten Puffer bis zum Erreichen einer gewünschten Konzentration re-suspendiert. Tabelle 1: Fluoreszenzsignal:
**) niedrigster Erfassungswert

Tabelle 2: Verstärkung und Detektion einer Träger-DNA mit geringer Kopieanzahl:

pHIV-1-Kopien pro PCR-Reaktion ermitteltes Signal
250 +
100 +
50 +
20 +
10 +
5 +
2 -
0 -
Negative PCR-Kontrolle - Tabelle 3: Vergleich von Proteinase K/Phenol mit der Extraktionsmethode nach Beispiel 4 - PCR-Verstärkung und Detektion von Nukleinsäure aus Gesamtblut:

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus einer Probe, enthaltend eine Mischung von Nukleinsäuren und anderen biologischen Verbindungen, wobei das Verfahren folgende Verfahrensschritte umfaßt:

- In-Kontakt-bringen der Probe mit einer Extraktionslösung, enthaltend mindestens eine organische Verbindung mit der chemischen Formel I;

- Bilden einer wäßrigen und einer nichtwäßrigen Phase; und

- Abtrennen der wäßrigen Phase von der nichtwäßrigen Phase, wobei die Verbindung mit der chemischen Formel I ausgewählt wird aus der Gruppe der Verbindungen, die die chemische Summenformel C&sub6;H&sub5;CH&sub2;OH oder die Strukturformel

aufweisen,

wobei R¹ ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH&sub2;)nOH, mit n = 1 bis 6, -CH(OH)CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;OH und -CH(OH)COOR&sup5;, wobei R&sup5; = -(CH&sub2;)pCH&sub3; mit p = 0 bis 3;

wobei R² ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -S(CH&sub2;)rCH&sub3;, mit r = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)qCH&sub3;, mit q = 0 bis 6, -COOR&sup6;, wobei R&sup6; = -(CH&sub2;)sCH&sub3;, mit s = 0 bis 3, -C&sub6;H&sub5;, -CH&sub2;C&sub6;H&sub5;, -OC&sub6;H&sub5;, -OCH&sub2;C&sub6;H&sub5;, -CH&sub2;OH,

-CF&sub3; und -(CH&sub2;)tCH&sub3;, mit t = 0 bis 6;

wobei R³ ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -CH&sub3;, -(CH&sub2;)xCH&sub3;, mit x = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)vCH&sub3;, mit v = 0 bis 3;

und wobei R&sup4; ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -(CH&sub2;)yCH&sub3;, mit y = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)wCH&sub3;, mit w = 0 bis 3,

und wobei R², R³ und R&sup4; weiterhin in irgendeiner Stellung in Bezug zur Stellung von R¹ vorkommen können; mit der Maßgabe, daß:

(a) wenn R¹ = -CH(OH)CH&sub2;OH, -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;OH oder -CH(OH)COOR&sup5;, dann müssen R², R³ und R&sup4; = -H sein;

(b) wenn R¹ = -CH&sub2;OH und R² -C&sub6;H&sub5;, -OCH&sub2;C&sub6;H&sub5; oder -CH&sub2;C&sub6;H&sub5;, dann müssen R³ = -CH&sub3;, -OH, -Cl, -Br, -F, -I, -H, -OCH&sub3; oder -OCH&sub2;CH&sub3; und R&sup4; = -H sein; und

(c) wenn R¹ = -(CH&sub2;)nOH und n = 2 bis 6, dann müssen R³ und R&sup4; beide = -H sein.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Extraktionslösung außerdem ein Organo-Tonmineral enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Organo-Tonmineral Bentonit, Macaloid®, Benton® oder eine Mischung, Derivat oder ein Analoges dieser Stoffe ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Organo-Tonmineral in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 10% enthalten ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe vor der Extraktion mit einem Lysiermittel versetzt wird.

6. Extraktionszusammensetzung zur Gewinnung freigesetzter Nukleinsäuren, enthaltend 0,1 bis 10 Gewichts-% eines Organo-Tonminerals, einen Puffer, ein Detergens und mindestens eine organische Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe der Verbindungen, die die chemische Summenformel C&sub6;H&sub5;CH&sub2;OH oder die Strukturformel

aufweisen,

wobei R² ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -S(CH&sub2;)rCH&sub3;, mit r = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)qCH&sub3;, mit q = 0 bis 6, -COOR&sup6;, wobei R&sup6; = -(CH&sub2;)sCH&sub3;, mit s = 0 bis 3, -C&sub6;H&sub5;, -CH&sub2;C&sub6;H&sub5;, -OC&sub6;H&sub5;, -OCH&sub2;C&sub6;H&sub5;, -CH&sub2;OH, -CF&sub3; und -(CH&sub2;)tCH&sub3;, mit t = 0 bis 6;

wobei R³ ein Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -H, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -CH&sub3;, -(CH&sub2;)xCH&sub3;, mit x = 0 bis 3, -O(CH&sub2;)vCH&sub3;, mit v = 0 bis 3; und

und wobei R², R³ und R&sup4; weiterhin in irgendeiner Stellung in Bezug zur Stellung von R¹ vorkommen können; mit der Maßgabe daß:

(b) wenn = -CH&sub2;OH und R² = -C&sub6;H&sub5;, -OCH&sub2;C&sub6;H&sub5; oder -CH&sub2;C&sub6;H&sub5;, dann müssen R³ = -CH&sub3;, -OH, -Cl, -Br, -F, -I, -H, -OCH&sub3; oder -OCH&sub2;CH&sub3; und R&sup4; = -H sein; und

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Organo-Tonmineral Bentonit, Macaloid®, Benton® oder eine Mischung, ein Derivat oder Analoges dieser Stoffe ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Organo-Tonmineral in einer Konzentration von 1 bis 5% enthalten ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei die organische Verbindung der Formel I ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Benzylalkohol, 4-Methoxybenzylalkohol, 3-Ethoxybenzyialkohol und 4-Phenoxybenzyialkohof.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei der Puffer ausgewählt ist aus Natriumcitrat, Tris-HCl, PIPES oder HEPES.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei der Puffer Tris-HCl mit einer Konzentration von etwa 0,01 bis 0,1 M ist.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei der Puffer außerdem etwa 0,05 bis 5% eines ionischen oder nichtionischen Detergens, wie Natriumdodecylsulfat, von 1 bis 20 mM EDTA und bis zu 250 mM eines Salzes, wie NaCl, enthält.

13. Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus einer Probe, enthaltend eine komplexe Mischung von Nukleinsäuren und Nicht-Nuklein säuren, wobei das Verfahren folgende Verfahrensschritte umfaßt:

- In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Extraktionslösung, enthaltend eine organische Verbindung mit den folgenden Eigenschaften:

(a) eine Dielektrizitätskonstante von etwa 0,9 bis etwa 15,5;

(b) ein Dipolmoment von etwa 1, 35 bis etwa 1,70 Coulomb·Meter; und

(c) ein Verteilungskoeffizient von etwa 0,001 bis etwa 0,3 Teile Wasser zu einem Teil der organischen Verbindung;

- Bilden einer wäßrigen und einer nichtwäßrigen Phase; und

- Abtrennen der wäßrigen Phase von der nichtwäßrigen Phase.