DE69734263T2 - Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren. - Google Patents
Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren. Download PDFInfo
- Publication number
- DE69734263T2 DE69734263T2 DE69734263T DE69734263T DE69734263T2 DE 69734263 T2 DE69734263 T2 DE 69734263T2 DE 69734263 T DE69734263 T DE 69734263T DE 69734263 T DE69734263 T DE 69734263T DE 69734263 T2 DE69734263 T2 DE 69734263T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- ribonucleic acid
- carrier
- lithium
- isolating
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title claims description 177
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 75
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 39
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 25
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 24
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 23
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 22
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 17
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 16
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 claims description 15
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 claims description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 9
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 9
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 claims description 8
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 claims description 7
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 7
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L lithium carbonate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C([O-])=O XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910052808 lithium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229940071264 lithium citrate Drugs 0.000 claims description 7
- WJSIUCDMWSDDCE-UHFFFAOYSA-K lithium citrate (anhydrous) Chemical compound [Li+].[Li+].[Li+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O WJSIUCDMWSDDCE-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 7
- RIUWBIIVUYSTCN-UHFFFAOYSA-N trilithium borate Chemical compound [Li+].[Li+].[Li+].[O-]B([O-])[O-] RIUWBIIVUYSTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 150000002642 lithium compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 5
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 5
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 5
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 5
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 4
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- STIAPHVBRDNOAJ-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;carbonate Chemical compound NC(N)=N.NC(N)=N.OC(O)=O STIAPHVBRDNOAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 claims description 2
- DXTIKTAIYCJTII-UHFFFAOYSA-N guanidine acetate Chemical compound CC([O-])=O.NC([NH3+])=N DXTIKTAIYCJTII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- CEDDGDWODCGBFQ-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;hydron;phosphate Chemical compound NC(N)=N.OP(O)(O)=O CEDDGDWODCGBFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZZTURJAZCMUWEP-UHFFFAOYSA-N diaminomethylideneazanium;hydrogen sulfate Chemical compound NC(N)=N.OS(O)(=O)=O ZZTURJAZCMUWEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N Lithium ion Chemical compound [Li+] HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 229910001416 lithium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 3
- -1 Iodid Chemical compound 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 101100068489 Vicia faba AGPC gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- VRYGRLBNIVQXMY-UHFFFAOYSA-M sodium;acetic acid;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].CC(O)=O VRYGRLBNIVQXMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Chemical class 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 102000004441 bcr-abl Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010056708 bcr-abl Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- CJFCGSLFEZPBNJ-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;phosphate Chemical compound NC([NH3+])=N.NC([NH3+])=N.NC([NH3+])=N.[O-]P([O-])([O-])=O CJFCGSLFEZPBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 229910002026 crystalline silica Inorganic materials 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- UYAKTBUPMOOXNW-UHFFFAOYSA-N guanidine;sulfuric acid Chemical compound NC(N)=N.NC(N)=N.OS(O)(=O)=O UYAKTBUPMOOXNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M iodide Chemical compound [I-] XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940006461 iodide ion Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- LIVNPJMFVYWSIS-UHFFFAOYSA-N silicon monoxide Chemical class [Si-]#[O+] LIVNPJMFVYWSIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Fachgebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure und ein Reagens dafür. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure mit hoher Reinheit in einfacher und zweckmäßiger Weise aus einer Probe, die die Ribonucleinsäure enthält, durch Verwendung eines nucleinsäurebindenden Trägers und auf ein Reagens dafür. Die vorliegende Erfindung kann auch auf eine automatische Nucleinsäure-Extraktionsvorrichtung angewendet werden.
- Hintergrund der Erfindung
- Eine Desoxyribonucleinsäure (DNA) bildet das Genom, das die Information des Lebens trägt. Eine Ribonucleinsäure (RNA) ist ein wichtiges biologisches Polymer, das diese Information empfängt und an der Proteinbiosynthese und dergleichen im Körper beteiligt ist. Die Ribonucleinsäure wird grob in Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA) und ribosomale RNA (rRNA) unterteilt, die jeweils unterschiedliche Eigenschaften haben. Es gibt einige Viren, die eine Ribonucleinsäure als Genom verwenden, das die Information des Lebens trägt.
- Eine Analyse der Ribonucleinsäure ergibt äußerst wichtige Informationen für die Gebiete der Biochemie, Gentechnik, klinische Diagnose und dergleichen. Die Isolierung von Ribonucleinsäure aus einem biologischen Material ist ein wesentlicher Schritt für eine solche Analyse. Es ist notwendig, eine Ribonucleinsäure mit größtmöglicher Reinheit zu verwenden, um gute Ergebnisse in Analysen zu erreichen, wie bei der Northern-Blot-Analyse, Reverse-Transcription-Polymerase- Kettenreaktion (RT-PCR) und dergleichen, die auf diesen Gebieten routinemäßig verwendet werden.
- Im Allgemeinen kann eine Ribonucleinsäure nicht extrahiert werden, ohne Zellen aufzuschließen, und in diesem Stadium wird die Ribonucleinsäure in einem Gemisch mit Proteinen, Lipiden, Zuckern, Desoxyribonucleinsäure und dergleichen erhalten. Soweit eine Ribonucleinsäure durch Ribonuclease, die man universell in lebenden Organismen findet, leicht abgebaut wird, wird sie in Gegenwart eines Protein-Denaturierungsmittels oder in einem organischen Lösungsmittel isoliert, wodurch die Aktivität der Ribonuclease geschwächt wird. Das zu diesem Zweck am häufigsten verwendete Verfahren ist ein sogenanntes AGPC-Verfahren (Analytical Biochemistry, 162: 156–159 (1987)), das Folgendes umfasst: (1) Extrahieren eines biologischen Materials mit einer Guanidinthiocyanat-Lösung, danach Zugabe einer sauren Lösung, einer Phenollösung und einer Chloroformlösung, (2) Zentrifugieren des resultierenden Gemischs, um mit Phenol denaturierte Proteine und unlöslich gemachte Desoxyribonucleinsäuren in eine Zwischenschicht zwischen einer organischen Schicht und einer wässrigen Schicht abzutrennen, (3) Hinzufügen von Isopropanol zur wässrigen Schicht, um die Ribonucleinsäure darin unlöslich zu machen, und (4) selektives Ausfällen der Ribonucleinsäure durch Zentrifugation. Das AGPC-Verfahren ist insofern vorteilhaft, als man Ribonucleinsäure damit im Vergleich zu anderen Verfahren, die eine Ultrazentrifugation zum Isolieren von Ribonucleinsäure beinhalten, relativ leicht und effizient isolieren kann. Es erfordert jedoch eine giftige Substanz, wie Phenol und Chloroform, sowie einen ziemlich zeitaufwändigen Schritt, wie Isopropanolfällung, was wiederum dazu führt, dass ein unbedenklicheres und zeitsparenderes Verfahren notwendig ist, wenn mehrere Proben gleichzeitig in gemeinsamen Forschungsinstitutionen behandelt werden sollen.
- Inzwischen wurde von Boom et al. (J. Clin. Microbiol., 28 (3): 495–503 (1990)) ein anderes, einfaches und zweckmäßiges Verfahren für die Extraktion von Nucleinsäure vorgeschlagen, bei dem Siliciumoxidteilchen als nucleinsäurebindender Träger verwendet werden. Dieses Verfahren beinhaltet (1) das Mischen eines biologischen Materials, einer neutralen Lösung, die aus Guanidinthiocya nat, EDTA und Triton X-100 besteht, und einer nucleinsäurebindenden festen Phase (Siliciumoxid), so dass die Nucleinsäure an die feste Phase gebunden wird, (2) das Abtrennen der festen Phase mit der daran gebundenen Nucleinsäure von der flüssigen Phase, (3) das Waschen der festen Phase mit einer Waschlösung, die Guanidinthiocyanat enthält, (4) das Waschen der festen Phase mit 70% Ethanol, (5) das Waschen der festen Phase mit Aceton, anschließend Trocknen derselben und (6) Eluieren der Nucleinsäure mit einem Eluenten. Dieses Verfahren erlaubt charakteristischerweise die Isolierung der Nucleinsäure ohne Verwendung eines Gifts wie Phenol oder Konzentration mit Isopropanol. Die nach diesem Verfahren erhaltene Ribonucleinsäure enthält eine große Menge Desoxyribonucleinsäure, so dass dieses Verfahren für die Isolierung von Ribonucleinsäure in großer Reinheit ungeeignet ist.
- Als ein anderes Isolierungsverfahren für Nucleinsäure unter Verwendung eines Trägers, wie Siliciumoxidteilchen, ist ein Verfahren bekannt, das das Adsorbieren einer Nucleinsäure in einem Agarose-Gel auf die Oberfläche von Glasteilchen in einer NaI-Lösung und das Abtrennen der Nucleinsäure aus der flüssigen Phase umfasst (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 615 (1979)). Was diesen Verfahren gemeinsam ist, ist die Tatsache, dass Siliciumoxid und Nucleinsäure in einer neutralen Lösung, die ein chaotropes Ion (d.h. ein einwertiges Anion mit einem größeren Innenradius), wie ein Iodid-Ion und ein Thiocyanat-Ion, enthält, gebunden werden. Diese Verfahren zielen jedoch hauptsächlich auf die Isolierung von Desoxyribonucleinsäure, wobei Ribonucleinsäure bisher nur in geringen Ausbeuten isoliert werden kann, und die Isolierung von Ribonucleinsäure allein ist nicht erreichbar. Wiederum sind diese Verfahren für die Isolierung von Ribonucleinsäure ungeeignet.
- Ein weiteres Isolierungsverfahren (Lithiumfällungsverfahren) für Ribonucleinsäure wurde beschrieben, und es verwendet die chemische Eigenschaft, dass die Zugabe von Lithium-Ionen zu einer wässrigen Ribonucleinsäure-Lösung zur Insolubilisierung der Ribonucleinsäure führt (Molecular Cloning, 2. Aufl., 1.40 (1989)). Dieses Verfahren erfordert aber dennoch eine Zentrifugation mit hoher Drehzahl, um Ribonucleinsäure auszufällen. Die Entwicklung eines Isolierungs verfahrens für Ribonucleinsäure, das frei von solchen Schwierigkeiten ist, ist also wünschenswert.
- Kurzbeschreibung der Erfindung
- Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, um eine Ribonucleinsäure schnell und sicher mit hoher Reinheit in einfacher und zweckmäßiger Weise aus einer Probe wie Zellen, zu isolieren, sowie ein Reagens dafür bereitzustellen.
- Als Ergebnis verschiedener Untersuchungen wurde jetzt ein Verfahren bereitgestellt, das das Auflösen eines biologischen Materials, wie Zellen, in einer sauren Lösung, die ein Lithiumsalz und ein chaotropes Mittel enthält, und das In-Kontakt-Bringen derselben mit einem nucleinsäurebindenden Träger, wie Siliciumoxidteilchen, umfasst, wodurch die Ausbeute und die Reinheit der isolierten Ribonucleinsäure (d.h. die Selektivität) stark erhöht werden.
- WO-A-95/34569 offenbart ein RNA-Absorptionsverfahren. RNA wird aus ihren wässrigen Lösungen, die ein Tensid und ein Lithiumsalz enthalten, auf Siliciumoxid absorbiert. Der pH-Wert der Lösung wird nicht angegeben.
- US-A-5,155,015 beschreibt die selektive Isolierung von RNA durch Ansäuern der Lösung für die Absorption, die ein chaotropes Salz, wie Guanidin(iso)thiocyanat, enthält.
- Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure bereit, das die folgenden Schritte umfasst:
- (1) Mischen einer Probe, die die Ribonucleinsäure enthält, einer sauren Lösung, die ein Lithiumsalz und ein chaotropes Mittel enthält, und eines nucleinsäurebindenden Trägers, so dass die Ribonucleinsäure an den Träger adsorbiert wird, wobei es sich bei dem chaotropen Mittel um ein Guanidinsalz oder Harnstoff handelt, wobei die saure Lösung einen pH-Wert von nicht mehr als 6,0 hat;
- (2) Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers aus einer flüssigen Phase; und
- (3) Eluieren der Ribonucleinsäure von dem Träger.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Reagens zum Isolieren einer Ribonucleinsäure bereit, das Folgendes umfasst:
- (a) eine Lösung (pH nicht mehr als 6,0) für die Auflösung und Adsorption, die eine oder mehrere Lithiumverbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Lithiumchlorid, Lithiumacetat, Lithiumcitrat, Lithiumcarbonat, Lithiumhydroxid und Lithiumborat besteht, und ein chaotropes Mittel enthält, wobei es sich bei dem chaotropen Mittel um ein Guanidinsalz oder Harnstoff handelt;
- (b) einen nucleinsäurebindenden Träger, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kieselsäure, Cellulose, Nitrocellulose, Latex und Hydroxyapatit besteht;
- (c) eine Waschlösung, die ein chaotropes Mittel enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz, Harnstoff, Iodid, Perchlorat und (Iso)thiocyanat besteht;
- (d) eine Waschlösung, bei der es sich um einen Puffer mit einer geringen Salzkonzentration von nicht mehr als 100 mM handelt; und
- (e) eine Lösung zum Eluieren der Ribonucleinsäure von dem Träger.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer cDNA, das die folgenden Schritte umfasst:
- (1) das Umsetzen einer nach dem oben genannten Verfahren isolierten Ribonucleinsäure oder des in dem oben genannten Verfahren verwendeten ribonucleinsäuregebundenen Trägers mit einem Gemisch aus einer Rever sen Transcriptase, einem Ribonuclease-Inhibitor, dNTPs, einem Primer für die Reverse Transcription und einem Puffer für die Reverse Transcriptionsreaktion; und
- (2) das Synthetisieren einer cDNA aus der Ribonucleinsäure.
- Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Ribonucleinsäure schnell und sicher, leicht und in hohen Ausbeuten aus verschiedenen biologischen Materialien isoliert werden. Die nach diesem Verfahren erhaltene Ribonucleinsäure kann zweckmäßigerweise für verschiedene Analysen, wie Northern-Blot-Analyse, RT-PCR-Analyse und dergleichen, verwendet werden.
- Kurzbeschreibung der Zeichnungen
-
1 zeigt ein Agarose-Gel-Elektrophorese-Bild von Ribonucleinsäure, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bzw. nach dem Verfahren von Boom et al. aus K562-Zellen isoliert wurde. -
2 ist ein Agarose-Gel-Elektrophorese-Bild, das das Ergebnis einer RT-PCR von Ribonucleinsäuren, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung aus K562 und HL60 isoliert wurden, mit BCR-abl-Fusions-mRNA als Target zeigt. -
3 ist ein Elektrophoresebild, das das Ergebnis einer RT-PCR-Analyse von HCV-RNA zeigt, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung aus einem Serum isoliert wurde. - Ausführliche Beschreibung der Erfindung
- Die Probe, die in der vorliegenden Erfindung eine Ribonucleinsäure enthält, beinhaltet zum Beispiel Serum, Blut, Liquor, Gewebe, Urin, Stuhl, Speichel, Sperma, aus einem biologischen Material (z.B. Blut) isolierte Zellen, kultivierte Zellen und dergleichen. Die Ribonucleinsäure kann neben der endogenen Ribonucleinsäure, die aus diesen Proben stammt, auch exogene Ribonucleinsäure, die aus Viren, Bakterien oder Pilzen stammt, in vitro enzymatisch synthetisierte Ribonucleinsäure und andere beinhalten.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eine Probe, die eine Ribonucleinsäure enthält, eine saure Lösung, die ein Lithiumsalz und ein chaotropes Mittel enthält, und ein nucleinsäurebindender Träger miteinander gemischt, so dass die Ribonucleinsäure an den Träger gebunden wird.
- Die saure Lösung, die ein Lithiumsalz und ein chaotropes Mittel enthält, gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Lösung zum Auflösen und Adsorbieren einer Ribonucleinsäure. Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Lithiumsalz unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange es in einer wässrigen Lösung ein Lithiumion erzeugen kann. Beispiele dafür sind anorganische Lithiumsalze und organische Lithiumsalze, wie Lithiumchlorid, Lithiumacetat, Lithiumcitrat, Lithiumcarbonat, Lithiumhydroxid und Lithiumborat, wobei Lithiumchlorid besonders bevorzugt wird. Es wurde bestätigt, dass das Lithiumsalz im Vergleich zu einem Salz eines einwertigen Kations, das einen größeren Ionenradius besitzt, wie Natrium, leicht mit Ribonucleinsäure koordiniert.
- Ein Fällungsverfahren für eine hochmolekulare Ribonucleinsäure, bei dem ein Lithiumion verwendet wird, wird verbreitet verwendet (Molecular Cloning, 2. Aufl., 1.40 (1989)). Gemäß diesen Verfahren wird das Lithiumion verwendet, um Ribonucleinsäure in einer Lösung unlöslich zu machen, und die unlöslich gemachte Ribonucleinsäure wird dann durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen. Dagegen ist es in der vorliegenden Erfindung wichtig, eine Ribonucleinsäure auf einem nucleinsäurebindenden Träger, wie Siliciumoxid, unter solchen Bedingungen zu adsorbieren, dass die Ribonucleinsäure nicht unlöslich gemacht wird. Dabei ist die Gegenwart eines proteindenaturierenden (Protein unlöslich machenden) Mittels, wie Guanidinsalz und Harnstoff, in einem Reaktionsgemisch effektiv. Tatsächlich wird bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Probe nicht unlöslich gemacht, solange sie in einer geeigneten Menge vorliegt, während es zur Koagulation von unlöslich gemachten Komponenten kommen kann, wenn sie in einer extrem großen Menge verwendet wird. In der vorliegenden Erfindung sollten unlöslich gemachte Ribonucleinsäure oder andere unlöslich gemachte Komponenten daher entfernt werden, oder die Menge der Probe sollte reduziert werden.
- "Chaotropes Mittel" bedeutet eine Substanz, die eine Sekundär-, Tertiär- und/oder Quartärstruktur ändern kann, ohne einen Einfluss auf die Primärstruktur eines Proteins oder einer Nucleinsäure auszuüben. Beispiele für das chaotrope Mittel, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, umfassen eine Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz und Harnstoff besteht.
- Beispiele für das Guanidinsalz, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, sind ein anorganisches Guanidinsalz oder ein organisches Guanidinsalz, die im Allgemeinen für die Denaturierung eines Proteins verwendet werden, wie Guanidin-Hydrochlorid, Guanidiniumacetat, Guanidiniumphosphat, Guanidinium(iso)thiocyanat, Guanidiniumsulfat und Guanidiniumcarbonat. Es können auch zwei oder mehr der oben genannten Salze miteinander kombiniert werden, wobei das Guanidinsalz vorzugsweise eine hohe Konzentration von nicht weniger als 5 M aufweist.
- Die Lösung zum Auflösen und Adsorbieren kann ein Tensid enthalten, um die Plasmamembran aufzureißen und/oder intrazelluläre Proteine löslich zu machen. Das Tensid unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange es allgemein verwendet werden kann, um eine Nucleinsäure aus Zellen und dergleichen zu extrahieren. Spezielle Beispiele dafür sind ein nichtionisches Tensid, wie Triton-Tensid und Tween-Tensid, und ein anionisches Tensid, wie Natrium-N-lauroylsarcosinat. In der vorliegenden Erfindung liegt ein nichtionisches Tensid vorzugsweise in einem Anteil von 0,01–0,5% vor.
- Um die Ribonucleinsäure vor Ribonuclease zu schützen, kann ein Antioxidans, wie 2-Mercaptoethanol und Dithiothreit, zu der Lösung zum Auflösen und Adsorbieren gegeben werden.
- Eine bestimmte Art von Probe kann sich in der Lösung zum Auflösen und Adsorbieren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auflösen. Zum Beispiel haben Pflanzen, Hefe, Pilze und bestimmte Gram-positive Bakterien spezielle Zellwandstrukturen, die eine Isolierung von Ribonucleinsäure durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung verhindern. Wenn eine Ribonucleinsäure aus einer solchen Probe isoliert wird, wird jede Probe vorbehandelt (z.B. wird die Zellwand entfernt) und dann nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt.
- In der vorliegenden Erfindung wird eine Probe, die unter sauren Bedingungen von nicht mehr als pH 6,0 in der oben genannten Lösung zum Auflösen und Adsorbieren aufgelöst wurde, mit einem nucleinsäurebindenden Träger, wie Siliciumoxidteilchen, in Kontakt gebracht. Damit dies erreicht werden kann, sollte die Lösung zum Auflösen und Adsorbieren mit einem geeigneten Puffer gepuffert werden. Der hier verwendete Puffer unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er den pH-Wert der Lösung zum Auflösen und Adsorbieren auf nicht mehr als 6,0 einstellen kann. In der vorliegenden Erfindung wird am meisten bevorzugt ein Acetatpuffer oder Citratpuffer mit einem pH von 3–4 verwendet.
- Die vorliegende Erfindung ist auch durch die Verwendung eines nucleinsäurebindenden Trägers, wie Siliciumoxid, Cellulose, Nitrocellulose, Latex und Hydroxyapatit, der in der oben genannten Lösung zum Auflösen und Adsorbieren an eine Ribonucleinsäure binden kann, gekennzeichnet. Der Ausdruck "Siliciumoxid" umfasst in diesem Zusammenhang kristallines Siliciumdioxid und andere Siliciumoxide, Diatomeenerde, Glaspulver und chemisch modifizierte Kieselsäure. Der nucleinsäurebindende Träger kann zum Beispiel ein Komplex aus der oben genannten Substanz und einem supermagnetischen Metalloxid sein. Bevorzugt ist ein Siliciumoxidträger, der ein supermagnetisches Metalloxid, wie Trieisen tetroxid, enthält. Der nucleinsäurebindende Träger kann zum Beispiel in Form eines Teilchens, Filters, Reaktionsbehälters und dergleichen vorliegen, unterliegt jedoch keiner besonderen Einschränkung. Von diesen sind Teilchen im Hinblick auf die Effizienz der Adsorption und Elution bevorzugt, wobei die Teilchengröße je nach Verwendung in geeigneter Weise aus dem bevorzugten Bereich von 0,05–500 μm ausgewählt wird.
- Der durch den oben genannten Schritt erhaltene ribonucleinsäuregebundene Träger wird aus der flüssigen Phase isoliert, indem man zum Beispiel die flüssige Phase durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Alternativ dazu kann ein Magnetfeld verwendet werden, um den ribonucleinsäuregebundenen Träger aus der flüssigen Phase zu isolieren. Wenn der Träger ein Filter oder Reaktionsgefäß ist, braucht die Flüssigkeit nur ausgeleert oder entfernt zu werden.
- Der durch den oben genannten Schritt erhaltene ribonucleinsäuregebundene Träger wird zum Beispiel dadurch gewaschen, dass man den ribonucleinsäuregebundenen Träger zum Beispiel mit einem Vortexmischer in einer geeigneten Waschlösung suspendiert und den Träger aus der flüssigen Phase isoliert. Der ribonucleinsäuregebundene Träger wird vorzugsweise durch Zentrifugation, Filtration, Säulenmanipulation und dergleichen isoliert. Ein ribonucleinsäurebindender Träger, der ein supermagnetisches Metalloxid in den Teilchen enthält, kann leicht mit Hilfe eines Magneten isoliert werden, und dieser Modus- ist am meisten zu bevorzugen.
- Die Waschlösung der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise ein chaotropes Mittel, vorzugsweise ein Guanidinsalz. Die Konzentration des Guanidinsalzes in der Waschlösung ist vorzugsweise nicht kleiner als 6 M. Diese Lösung kann ein Tensid enthalten und unterliegt keinerlei besonderen Einschränkung bezüglich ihres pH-Werts.
- In der vorliegenden Erfindung wird der ribonucleinsäuregebundene Träger, der durch Waschen mit einer ein chaotropes Mittel enthaltenden Waschlösung erhalten wird, vorzugsweise weiterhin mit einem Puffer gewaschen, der eine geringe Salzkonzentration hat. "Geringe Salzkonzentration" bedeutet hier eine Salzkonzentration, bei der eine Reverse Transcription nicht wesentlich gehemmt wird, wenn dieser Puffer im endgültigen Eluat, das die Ribonucleinsäure enthält, vorhanden ist, und ein Beispiel dafür ist Wasser. In der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein Puffer mit einer Konzentration von nicht mehr als 100 mM verwendet, wobei Tris-Puffer besonders bevorzugt ist, obwohl es hier keinerlei Einschränkung gibt. Diese Lösung kann ein Tensid enthalten und unterliegt keiner besonderen Einschränkung bezüglich ihres pH-Werts.
- Bei dem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines Trägers zum Isolieren von Nucleinsäure wird in diesem Waschstadium ein organisches Lösungsmittel, wie Ethanol und Aceton, verwendet, so dass es notwendig ist, den Träger zu trocknen. Dagegen kann eine Ribonucleinsäure in der vorliegenden Erfindung ohne einen Trocknungsschritt eluiert werden. Dies ist äußerst vorteilhaft, um die für die Isolierung von Ribonucleinsäure notwendige Zeit zu verkürzen, sowie am meisten zu bevorzugen, um eine Kontamination, die dadurch verursacht wird, dass während des Trocknens ein offenes System vorliegt, zu verhindern. "Kontamination" bedeutet hier eine Kreuzkontamination zwischen Proben und die Gegenwart einer amplifizierten Nucleinsäure in PCR und dergleichen. Eine solche Kontamination gilt als Hauptursache für eine fehlerhafte Beurteilung bei der analytischen Diagnose von Infektionen durch RT-PCR.
- Im Elutionsschritt der Ribonucleinsäure in der vorliegenden Erfindung wird eine Ribonucleinsäure von einem nucleinsäuregebundenen Träger eluiert, an den die Ribonucleinsäure adsorbiert wurde. Der zu diesem Zweck zu verwendende Eluent unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er Ribonucleinsäure von dem Träger eluieren kann. Bevorzugt wird Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-Puffer, 1 mM EDTA, pH 8,0). Außerdem kann die Elution durch Erhitzen beschleunigt werden. Die Temperatur, auf die erhitzt wird, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange kein nachteiliger Einfluss auf die Ribonucleinsäure vorliegt. Eine bevorzugte Temperatur beträgt etwa 60°C. Die auf diese Weise eluierte Ribonucleinsäure kann ohne Entsalzung oder Konzentration, wie Dialyse und Ethanolfällung, direkt für die cDNA-Synthese unter Verwendung einer Reversen Transcriptase verwendet werden. Sie kann auch ohne Elution vom Träger für eine Reverse Transcriptionsreaktion auf dem ribonucleinsäuregebundenen Träger verwendet werden.
- Das Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine effiziente Isolierung von Ribonucleinsäure aus einer biologischen Komponente mit weniger Kontamination der Desoxyribonucleinsäure durch eine einfache Arbeitsweise ohne Verwendung eines schädlichen Lösungsmittels, so dass es zweifellos für einen Ribonucleinsäure-Reinigungskit und eine Nucleinsäure-Extraktionsvorrichtung, die automatisch die Herstellung der festen Phase und die Ausgabe eines Reagens durchführt, verwendet werden kann. Außerdem kann die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Ribonucleinsäure für die Northern-Blot-Analyse oder als Matrize für die Amplifikation bei der RT-PCR-Analyse, für das in
EP 0 329 822 offenbarte NASBA-Verfahren und dergleichen verwendet werden. - Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure, das die folgenden Schritte umfasst:
- (1) Mischen einer Probe, die die Ribonucleinsäure enthält, einer sauren Lösung (pH nicht mehr als 6,0), die eine oder mehrere Lithiumverbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Lithiumchlorid, Lithiumacetat, Lithiumcitrat, Lithiumcarbonat, Lithiumhydroxid und Lithiumborat besteht, und ein chaotropes Mittel enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz und Harnstoff besteht, so dass die Ribonucleinsäure an den Träger adsorbiert wird;
- (2) Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers aus einer flüssigen Phase unter Verwendung eines Magnetfelds;
- (3) Waschen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers mit einer Waschlösung, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz, Harnstoff, Iodid, Perchlorat und (Iso)thiocyanat be steht, und Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers unter Verwendung eines Magnetfelds;
- (4) Waschen des Trägers mit einem Puffer mit einer geringen Salzkonzentration von nicht mehr als 100 mM und Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers unter Verwendung eines Magnetfelds; und
- (5) Eluieren der Ribonucleinsäure mit einer Lösung, die die Ribonucleinsäure von dem Träger abtrennen kann.
- Das Reagens zum Isolieren von Ribonucleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst zum Beispiel (a) eine Lösung (pH nicht mehr als 6,0) zum Auflösen und Adsorbieren von Ribonucleinsäure, wobei die Lösung eine oder mehrere Verbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Lithiumchlorid, Lithiumacetat, Lithiumcitrat, Lithiumcarbonat, Lithiumhydroxid und Lithiumborat besteht, und eine Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz und Harnstoff besteht, enthält, (b) einen nucleinsäurebindenden Träger, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kieselsäure, Cellulose, Nitrocellulose, Latex und Hydroxyapatit besteht, und der vorzugsweise ein supermagnetisches Metalloxid enthält, (c) eine Waschlösung, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz, Harnstoff, Iodid, Perchlorat und (Iso)thiocyanat besteht, (d) eine Waschlösung, bei der es sich um einen Puffer mit einer geringen Salzkonzentration von nicht mehr als 100 mM handelt, und (e) einen Eluenten zum Eluieren der Ribonucleinsäure von dem Träger.
- Das Verfahren zur Herstellung von cDNA der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte (1) des Umsetzens der nach dem oben genannten Verfahren isolierten Ribonucleinsäure oder des in dem oben genannten Verfahren verwendeten ribonucleinsäuregebundenen Trägers mit einem Gemisch aus einer Reversen Transcriptase, einem Ribonuclease-Inhibitor, dNTPs, einem Primer für die Reverse Transcription und einem Puffer für die Reverse Transcriptionsreaktion und (2) des Synthetisierens einer cDNA aus der Ribonucleinsäure.
- Es können Reverse Transcriptase von AMV und Reverse Transcriptase von M-MLV als Reverse Transcriptase sowie Tth-DNA-Polymerase verwendet werden. Die dNTPs sind ein Gemisch von dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Der Primer für die Reverse Transcription kann zum Beispiel ein sequenzspezifischer Primer, ein Oligo-dT-Primer, ein statistischer Primer oder dergleichen sein. Der Puffer für die Reverse Transcriptionsreaktion enthält anorganische Salze, wie MgCl2, MnCl2 und KCl, und hat einen pH-Wert, der so eingestellt ist, dass man eine optimale Reverse Transcriptionsreaktion erhält.
- Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher anhand von Beispielen beschrieben, die nicht als Einschränkung der Erfindung angesehen werden sollten.
- Beispiel 1: Extraktion von Ribonucleinsäure aus kultivierten humanen Zellen
-
- (1) Herstellung von K562-Zellen
- Die Zellen der humanen Zelllinie K562 der chronischen mylogenen Leukämie (ATCC, CCL243) wurden 3 Tage lang bei 37°C in einem RPMI1640-Medium (Nissui Seiyaku), das 10% fetales Kälber-serum enthielt, kultiviert und dann zentrifugiert (1000 U/min, 5 min), um Überstand zu entfernen. Die Zellen wurden in PBS (–) (137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 4,3 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 1,4 mM Natriumdihydrogenphosphat, pH 7,4) suspendiert. Die Zellen wurden mit einem Hämatometer gezählt und in einer Menge von 1 × 106 Zellen in ein Mikroröhrchen gegeben. Der Überstand wurde durch Zentrifugation mit 1000 U/min während 5 min entfernt, was ein Zellsediment ergab, das als Probe verwendet werden sollte. Dieselbe Arbeitsweise bei der humanen Zelllinie HL60 der promylotischen Leukämie (ATCC, CCL240) ergab ein Zellsediment.
- (2) Extraktion von Ribonucleinsäure
-
- (a) Zu K562-Zell- und HL60-Zellsediment (1 × 106 Zellen), die oben in (1) hergestellt wurden, in Mikroröhrchen wurden jeweils 700 μl einer Lösung zum Auflösen und Adsorbieren (6 M Guanidin-Hydrochlorid, 1 M Lithiumchlorid, 0,2 M Natriumacetat-Hydrochlorid-Puffer (pH 3,0), 0,1% Triton X-100, 0,1 M 2-Mercaptoethanol) gegeben, und die Zellen wurden vollständig aufgelöst. Dazu wurde eine Suspension (20 μl) von magnetischen Siliciumoxidteilchen (0,5 g/ml, Teilchengröße 1–10 μl, enthält 30% Trieisentetraoxid-Teilchen, spezifische Oberfläche 280 cm2/g, Oberflächenporendurchmesser 2–6 nm, Porenvolumen 0,025 ml/g; hergestellt von Suzuki Yushi) in Wasser gegeben, und es wurde 2 min lang bei Raumtemperatur mit einem Vortexmischer gemischt. Dann wurden die Mikroröhrchen auf ein Magnetstativ (MCP-M; hergestellt von Dynal) gestellt, um magnetische Siliciumoxidteilchen zu sammeln. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. Die Mikroröhrchen wurden aus dem Magnetstativ entnommen, und 1 ml einer Waschlösung [6 M Guanidin-Hydrochlorid, 0,2 M Natriumacetat-Hydrochlorid-Puffer (pH 4,0)] wurde hinzugefügt. Unter Verwendung eines Vortexmischers wurde das Gemisch etwa 10 Sekunden lang gerührt, und die Mikroröhrchen wurden wieder auf das Magnetstativ gestellt, um magnetische Siliciumoxidteilchen zu sammeln, und dann wurde der Überstand entfernt. Dann wurden die Teilchen dreimal mit 10 mM Tris-Puffer (1 ml, pH 6,4) gewaschen, und der Puffer wurde vollständig entfernt. Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-Puffer, 1 mM EDTA, 50 μl, pH 8,0) wurde hinzugefügt, und die magnetischen Siliciumoxidteilchen wurden durch Pipettieren suspendiert. Dann wurde die Suspension eine Minute lang auf 60°C erhitzt. Die Mikroröhrchen wurden wieder auf ein Magnetstativ gestellt, um magnetische Siliciumoxidteilchen zu sammeln, und der Überstand wurde gewonnen.
- (b) Unter Verwendung dieser Probe und gemäß dem Verfahren von Boom et al. (J. Clin. Microbiol. 28 (3): 495–503 (1990)) wurde eine Ribonucleinsäure extrahiert. Eine Probe, L6-Puffer (900 μl, Guanidinthiocyanat 120 g, Tris-HCl-Puffer (pH 6,4) 100 ml, 0,2 M EDTA (pH 8,0) 22 ml, Triton X-100 2,6 g) und eine auf 1 g/ml eingestellte Suspension (40 μl) von Siliciumoxidteilchen (hergestellt von Sigma) wurden miteinander gemischt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zentrifugation bei 12 000 × g während 5 Minuten wurde der Überstand entfernt. Die Sedimente wurden in einem L2-Puffer (1 ml, Guanidiniumthiocyanat 120 g, 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,4) 100 ml) suspendiert und 5 Minuten lang mit 12 000 × g zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Dieser Waschschritt wurde nochmals wiederholt, und die Sedimente wurden zweimal in derselben Weise mit 70% Ethanol (1 ml) gewaschen. Nach dem Waschen mit Aceton (1 ml) wurden die Sedimente bei 56°C getrocknet. Die Nucleinsäure wurde mit einem Tris-EDTA-Puffer eluiert. Nach 10 Minuten Erhitzen auf 56°C wurden Siliciumoxidteilchen durch Zentrifugation ausgefällt, und der Überstand wurde gewonnen.
- (3) Analyse von Ribonucleinsäure durch Agarose-Gel-Elektrophorese
- Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung und nach Boom et al. wurden eine Ribonucleinsäurelösung (9 μl), die aus K562-Zellen erhalten wurde, und eine Farbstofflösung (1 μl, 50% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau) miteinander gemischt und in einen Schlitz in einem 1%igen Agarose-Gel gegeben. Unter Verwendung einer Mupid-Elektrophorese-Vorrichtung (hergestellt von Cosmo Bio) wurde das Gel 30 Minuten lang einer Elektrophorese in 1 × TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA·2Na) bei 100 V unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 30 Minuten lang in eine Ethidiumbromidlösung eingetaucht, leicht mit Leitungswasser abgespült, und das angefärbte Gel wurde unter UV-Bestrahlung mit Hilfe einer Polaroid-Kamera photographiert. Bei diesem Verfahren konnten die aus Zellen stammende Desoxyribonucleinsäure (genomische DNA) sowie zwei typische Ribonucleinsäuren (285-rRNA und 185-rRNA), die in vergleichsweise großen Mengen in Zellen vorhanden sind, nachgewiesen werden. Das Migrationsmuster ist in
1 gezeigt, wobei Spur 1 ein Molekulargewichtsmarker ist, bei dem es sich um ein HindIII-Abbauprodukt von λ-Phagen-DNA handelte, Spur 2 eine Ribonucleinsäure ist, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, und Spur 3 eine Ribonucleinsäure ist, die nach dem Verfahren von Boom et al. erhalten wurde. Wie aus1 hervorgeht, zeigte die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Ribonucleinsäure (rRNA) eine größere Ausbeute als die Ribonucleinsäure, die nach dem Verfahren von Boom et al. erhalten wurde, und weniger Kontamination mit Desoxyribonucleinsäure. - (4) Amplifikation von BCR/abl-Fusions-mRNA durch RT-PCR
- Unter Verwendung der Ribonucleinsäure, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, wurde BCR/abl-Fusions-mRNA, die spezifisch in K562-Zellen exprimiert wird, durch RT-PCR nachgewiesen. Zu Ribonucleinsäurelösungen (jeweils 5 ml), die von K562-Zellen und HL60-Zellen stammten und nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, wurden Reverse Transcriptase von M-MLV (hergestellt von Toyobo), Ribonuclease-Inhibitor (hergestellt von Toyobo), dNTPs, statistischer Primer und Reaktionspuffer gegeben, um eine optimale Konzentration zu erreichen. Davon wurden 20 μl 1 Stunde lang bei 37°C und 5 Minuten lang bei 95°C behandelt und dann auf Eis gekühlt. Zu einem Gemisch von Primern zur Amplifikation der BCR/abl-FusionsmRNA-Sequenz, dNTPs, Reaktionspuffer und Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Toyobo) wurden dann 5 μl der oben genannten cDNA-Lösung gegeben, die durch Reverse Transcriptionsreaktion erhalten wurde, so dass man eine Gesamtmenge von 50 μl erhielt, und ein Mineralöl (hergestellt von Sigma) wurde darüber geschichtet. Unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler (hergestellt von Perkin Elmer Cetus) wurde ein Cyclus von 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C 30mal wiederholt.
- (5) Nachweis von Amplifikationsprodukten durch Agarose-Gel-Elektrophorese
- Ein Amplifikationsprodukt (9 μl) und eine Farbstofflösung (1 μl, 50% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau) wurden miteinander gemischt und in einen Schlitz in einem 1,5%igen Agarose-Gel gegeben. Unter Verwendung einer Mupid-Elektrophorese-Vorrichtung (hergestellt von Cosmo Bio) wurde das Gel 30 Minuten lang einer Elektrophorese in 1 × TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA·2Na) bei 100 V unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 30 Minuten lang in eine Ethidiumbromidlösung eingetaucht, leicht mit Leitungswasser abgespült, und das angefärbte Gel wurde unter UV-Bestrahlung mit Hilfe einer Polaroid-Kamera photographiert. Als Ergebnis wurde eine Bande, die einem amplifizierten Fragment entsprach, das von der BCR/abl-Fusions-mRNA stammte, nur dann erkannt, wenn aus K562-Zellen extrahierte RNA als Matrize verwendet wurde, und eine solche Bande wurde im Falle von HL60-Zellen, die dieses Gen nicht exprimieren, nicht gefunden (
2 ). In dem in2 gezeigten Migrationsmuster ist Spur 1 ein Molekulargewichtsmarker, bei dem es sich um ein HincII-Abbauprodukt von ϕX174-Phagen-DNA handelte, Spur 2 ist ein RT-PCR-Amplifikationsprodukt von Ribonucleinsäure, die aus K562-Zellen stammt, und Spur 3 ist ein RT-PCR-Amplifikationsprodukt von Ribonucleinsäure, die aus HL60-Zellen stammt. Wie aus2 hervorgeht, ermöglichte das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Isolierung von mRNA aus Zellproben, und die erhaltene mRNA erlaubte in ausreichendem Maße eine Analyse durch RT-PCR. - Beispiel 2: Nachweis von Hepatitis-C-Virus-(HCV)-RNA durch RT-PCR
- (1) Extraktion von HCV-RNA aus einem Serum
- Serumproben von Patienten mit Hepatitis C, die 1 × 105 Kopien HCV/ml enthielten, wurden durch Verwendung eines normalen Serums in einer Verdünnungsreihe von 105, 104, 103 bzw. 102 Kopien/ml hergestellt. Jede Serumprobe (100 μl) wurde für die Extraktion von HCV-RNA nach dem Verfahren von Beispiel 1 (2) (a) verwendet.
- (2) Amplifikation von HCV-RNA durch RT-PCR
- Die HCV-RNA wurde nach dem Verfahren von Okamoto et al. (J. Exp. Med., 60: 215–222 (1990)) durch RT-PCR analysiert. Zu der in (1) erhaltenen Lösung (5 μl) wurden Reverse Transcriptase von M-MLV (hergestellt von Toyobo), Ribonuclease-Inhibitor (hergestellt von Toyobo), dNTPs, statistischer Primer und Reaktionspuffer gegeben, um eine optimale Konzentration zu erreichen. Davon wurden 10 μl 1 Stunde lang bei 42°C und 5 Minuten lang bei 95°C behandelt und dann auf Eis gekühlt. Zu einem Gemisch von Primern zur Amplifikation des nichtcodierenden Bereichs von HCV-RNA, dNTPs, Reaktionspuffer und Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Toyobo) wurden dann 2,5 μl der oben genannten cDNA-Lösung gegeben, die durch Reverse Transcriptionsreaktion erhalten wurde, so dass man eine Gesamtmenge der Flüssigkeit von 25 μl erhielt, und ein Mineralöl (hergestellt von Sigma) wurde darüber geschichtet. Unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler (hergestellt von Perkin Elmer Cetus) wurde ein Reaktionscyclus von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C 30mal wiederholt. Dann wurde das durch diese Reaktionen erhaltenen Amplifikationsprodukt (1 μl) erneut in 30 PCR-Cyclen unter Verwendung von inneren Primern amplifiziert; 2-Stufen-PCR.
- (3) Nachweis von amplifizierter DNA durch Agarose-Gel-Elektrophorese
- Ein Amplifikationsprodukt (9 μl) und eine Farbstofflösung (1 μl, 50% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau) wurden miteinander gemischt und in einen Schlitz in einem 1,5%igen Agarose-Gel gegeben. Unter Verwendung einer Mupid-Elektrophorese-Vorrichtung (hergestellt von Cosmo Bio) wurde das Gel 30 Minuten lang einer Elektrophorese in 1 × TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA·2Na) bei 100 V unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 30 Minuten lang in eine Ethidiumbromidlösung eingetaucht, leicht mit Leitungswasser abgespült, und das angefärbte Gel wurde unter UV-Bestrahlung mit Hilfe einer Polaroid-Kamera photographiert. Als Ergebnis wurde bis zu einem Serum von 103 Kopien/ml eine spezifische Amplifikationsbande nachgewiesen, und vom Virus stammende Ribonucleinsäure wurde effizient isoliert, was eine mögliche Analyse durch RT-PCR nahelegte (
3 ). In3 ist Spur 1 ein Molekulargewichtsmarker, bei dem es sich um ein HaeIII-Abbauprodukt von ϕX174-Phagen-DNA handelte, die Spuren 2–5 sind RT-PCR-Amplifikationsprodukte, wobei Ribonucleinsäuren, die aus Seren extrahiert wurden, welche 105, 104, 103 bzw. 102 Kopien HCV/ml enthielten, als Matrizen verwendet wurden, und Spur 6 ist ein RT-PCR-Amplifikationsprodukt, das unter Verwendung von Ribonucleinsäure, die aus normalem Serum extrahiert wurde, als Matrize erhalten wurde. - Beispiel 3: Extraktion von Ribonucleinsäure unter Verwendung von Lösungen zum Auflösen und Adsorbieren mit verschiedenen Zusammensetzungen
- Unter Verwendung von Lösungen zum Auflösen und Adsorbieren mit verschiedenen Zusammensetzungen, die unten in Tabelle 1 gezeigt sind, und in derselben Weise wie in Beispiel 1 (2) (a) wurde Nucleinsäure aus der K562-Zelllinie (2 × 106 Zellen) extrahiert. Jeder Extrakt wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen, und die Intensität der Bande wurde in drei Graden bewertet, wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 gezeigt sind. In Tabelle 1 zeigt die Zahl der "+"-Zeichen den Grad der Intensität der Bande an, wobei größere Zahlen von "+"-Zeichen intensivere Banden bedeuten, "–" eine nicht nachweisbare Bande bedeutet, GuHCl Guanidin-Hydrochlorid ist und GuSCN Guanidinthiocyanat ist. Tabelle 1
- * nicht gemäß der Erfindung
- Die Ergebnisse zeigen an, dass eine saure Lösung zum Auflösen und Adsorbieren, die ein Lithiumsalz und ein chaotropes Mittel enthielt, die Selektivität des nucleinsäurebindenden Trägers bezüglich der RNA-Adsorption merklich verbesserte, was zu höheren RNA-Ausbeuten führte.
Claims (20)
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure, das die folgenden Schritte umfasst: (1) Mischen einer Probe, die die Ribonucleinsäure enthält, einer sauren Lösung, die ein Lithiumsalz und ein chaotropes Mittel enthält, und eines nucleinsäurebindenden Trägers, so dass die Ribonucleinsäure an den Träger adsorbiert wird, wobei es sich bei dem chaotropen Mittel um ein Guanidinsalz oder Harnstoff handelt, wobei die saure Lösung einen pH-Wert von nicht mehr als 6,0 hat; (2) Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers aus einer flüssigen Phase; und (3) Eluieren der Ribonucleinsäure von dem Träger.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei das Guanidinsalz ein Vertreter ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Guanidin-Hydrochlorid, Guanidinacetat, Guanidinphosphat, Guanidin(iso)thiocyanat, Guanidinsulfat und Guanidincarbonat besteht.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Probe, die die Ribonucleinsäure enthält, ein Vertreter ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Serum, Blut, Gewebe, Urin, Stuhl, Speichel, aus biologischem Material isolierten Zellen und kultivierten Zellen besteht.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei das Lithiumsalz ein anorganisches Lithiumsalz oder ein organisches Lithiumsalz ist.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei das Lithiumsalz wenigstens ein Vertreter ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lithiumchlorid, Lithiumacetat, Lithiumcitrat, Lithiumcarbonat, Lithiumhydroxid und Lithiumborat besteht.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei der nucleinsäurebindende Träger Kieselsäure enthält.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei der nucleinsäurebindende Träger ein Teilchen ist.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei der nucleinsäurebindende Träger ein supermagnetisches Metalloxid enthält.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, das nach der Isolierung des ribonucleinsäuregebundenen Trägers aus der flüssigen Phase weiterhin einen Schritt des Waschens des ribonucleinsäuregebundenen Trägers mit einer Waschlösung umfasst.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, das nach der Isolierung des ribonucleinsäuregebundenen Trägers aus der flüssigen Phase weiterhin einen Schritt des Waschens des ribonucleinsäuregebundenen Trägers mit einer Waschlösung, die ein chaotropes Mittel enthält, umfasst.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 10, das nach dem Waschen des Trägers mit der Waschlösung, die das chaotrope Mittel enthält, weiterhin einen Schritt des Waschens des ribonucleinsäure gebundenen Trägers mit einem Puffer mit einer geringen Salzkonzentration umfasst.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 11, wobei der Puffer eine Salzkonzentration von nicht mehr als 100 mM hat.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 11, das nach dem Waschen des Trägers mit dem Puffer weiterhin einen Schritt des Eluierens der Ribonucleinsäure unter Verwendung einer Lösung, die die Ribonucleinsäure eluieren kann, von dem ribonucleinsäuregebundenen Träger umfasst.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Ribonucleinsäure von dem ribonucleinsäuregebundenen Träger eluiert wird, indem man den Träger erhitzt.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei der nucleinsäurebindende Träger ein supermagnetisches Metalloxid enthält und der Träger, der die Ribonucleinsäure trägt, unter Verwendung eines Isolationsmagnetfelds aus der flüssigen Phase isoliert wird.
- Verfahren zum Isolieren einer Ribonucleinsäure, das die folgenden Schritte umfasst: (1) Mischen einer Probe, die die Ribonucleinsäure enthält, einer sauren Lösung (pH nicht mehr als 6,0), die eine oder mehrere Lithiumverbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Lithiumchlorid, Lithiumacetat, Lithiumcitrat, Lithiumcarbonat, Lithiumhydroxid und Lithiumborat besteht, und ein chaotropes Mittel enthält, wobei es sich bei dem chaotropen Mittel um ein Guanidinsalz oder Harnstoff handelt, und eines nucleinsäurebindenden Trägers, der ein supermagnetisches Metalloxid enthält, so dass die Ribonucleinsäure an den Träger adsorbiert wird; (2) Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers aus einer flüssigen Phase unter Verwendung eines Magnetfelds; (3) Waschen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers mit einer Waschlösung, die ein chaotropes Mittel enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz, Harnstoff, Iodid, Perchlorat und (Iso)thiocyanat besteht, und Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers unter Verwendung eines Magnetfelds; (4) Waschens des Trägers mit einem Puffer mit einer geringen Salzkonzentration von nicht mehr als 100 mM und Abtrennen des ribonucleinsäuregebundenen Trägers unter Verwendung eines Magnetfelds; und (5) Eluieren der Ribonucleinsäure mit einer Lösung, die die Ribonucleinsäure abtrennen kann, von dem Träger.
- Reagens zum Isolieren einer Ribonucleinsäure, das Folgendes umfasst: (a) eine Lösung (pH nicht mehr als 6,0) für die Auflösung und Adsorption, die eine oder mehrere Lithiumverbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Lithiumchlorid, Lithiumacetat, Lithiumcitrat, Lithiumcarbonat, Lithiumhydroxid und Lithiumborat besteht, und ein chaotropes Mittel enthält, wobei es sich bei dem chaotropen Mittel um ein Guanidinsalz oder Harnstoff handelt; (b) einen nucleinsäurebindenden Träger, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kieselsäure, Cellulose, Nitrocellulose, Latex und Hydroxyapatit besteht; (c) eine Waschlösung, die ein chaotropes Mittel enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Guanidinsalz, Harnstoff, Iodid, Perchlorat und (Iso)thiocyanat besteht; (d) eine Waschlösung, bei der es sich um einen Puffer mit einer geringen Salzkonzentration von nicht mehr als 100 mM handelt; und (e) eine Lösung zum Eluieren der Ribonucleinsäure von dem Träger.
- Reagens zum Isolieren einer Ribonucleinsäure gemäß Anspruch 17, wobei der nucleinsäurebindende Träger ein supermagnetisches Metalloxid enthält.
- Verfahren zum Herstellen einer cDNA, umfassend das Umsetzen einer nach dem Verfahren von Anspruch 1 isolierten Ribonucleinsäure mit einem Gemisch aus einer Reversen Transcriptase, einem Ribonuclease-Inhibitor, dNTPs, einem Primer für die reverse Transcription und einem Puffer für die reverse Transcriptionsreaktion und Synthetisieren der cDNA aus der Ribonucleinsäure.
- Verfahren zum Herstellen einer cDNA, umfassend das Umsetzen eines nach dem Verfahren von Anspruch 1 erhaltenen ribonucleinsäuregebundenen Trägers mit einem Gemisch aus einer Reversen Transcriptase, einem Ribonuclease-Inhibitor, dNTPs, einem Primer für die reverse Transcription und einem Puffer für die reverse Transcriptionsreaktion und Synthetisieren der cDNA aus der Ribonucleinsäure.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18338196 | 1996-07-12 | ||
| JP18338196 | 1996-07-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69734263D1 DE69734263D1 (de) | 2006-02-09 |
| DE69734263T2 true DE69734263T2 (de) | 2006-07-13 |
Family
ID=16134781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69734263T Expired - Fee Related DE69734263T2 (de) | 1996-07-12 | 1997-07-11 | Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5990302A (de) |
| EP (1) | EP0818461B1 (de) |
| DE (1) | DE69734263T2 (de) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6365731B1 (en) * | 1997-08-06 | 2002-04-02 | Ambion, Inc. | Stripping nucleic acids with iodine and sodium thiosulfate |
| US7569342B2 (en) | 1997-12-10 | 2009-08-04 | Sierra Molecular Corp. | Removal of molecular assay interferences |
| DE59912604D1 (de) * | 1998-02-04 | 2005-11-03 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren |
| US6777210B1 (en) * | 1998-09-24 | 2004-08-17 | Ambion, Inc. | Method and reagents for inactivating ribonucleases RNase A, RNase I and RNase T1 |
| US5973138A (en) | 1998-10-30 | 1999-10-26 | Becton Dickinson And Company | Method for purification and manipulation of nucleic acids using paramagnetic particles |
| US6300069B1 (en) * | 1999-05-03 | 2001-10-09 | Qiagen Gmbh | Generation and amplification of nucleic acids from ribonucleic acids |
| AU781151B2 (en) * | 1999-10-26 | 2005-05-12 | Immusol Incorporated | Ribozyme therapy for the treatment of proliferative skin and eye diseases |
| US6936414B2 (en) | 1999-12-22 | 2005-08-30 | Abbott Laboratories | Nucleic acid isolation method and kit |
| US20030228600A1 (en) * | 2000-07-14 | 2003-12-11 | Eppendorf 5 Prime, Inc. | DNA isolation method and kit |
| US20040161789A1 (en) * | 2000-08-30 | 2004-08-19 | Tanner Cameron W. | Porous inorganic substrate for high-density arrays |
| WO2002055727A2 (en) * | 2001-01-09 | 2002-07-18 | Whitehead Biomedical Inst | Methods and reagents for the isolation of nucleic acids |
| JP2004523229A (ja) * | 2001-01-16 | 2004-08-05 | インヴィトロジェン コーポレーション | Ｒｎａ単離のための試薬 |
| US7893228B2 (en) | 2001-10-12 | 2011-02-22 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
| US7148343B2 (en) * | 2001-10-12 | 2006-12-12 | Gentra Systems, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
| US20050032105A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-02-10 | Bair Robert Jackson | Compositions and methods for using a solid support to purify DNA |
| AU2004233035B2 (en) * | 2001-10-12 | 2009-07-23 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
| DE10157624A1 (de) * | 2001-11-26 | 2003-06-05 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur Anreicherung und zum Nachweis von HIV |
| DE60234464D1 (de) | 2001-11-28 | 2009-12-31 | Applied Biosystems Llc | Zusammensetzungen und Verfahren zur selektiven Nukleinsäureisolierung |
| GB0207975D0 (en) * | 2002-04-05 | 2002-05-15 | Genovision As | Isolating nucleic acid |
| GB0215185D0 (en) | 2002-07-01 | 2002-08-07 | Genovision As | Binding a target substance |
| JP4025135B2 (ja) * | 2002-07-19 | 2007-12-19 | 富士フイルム株式会社 | 核酸の分離精製方法 |
| DE10258258A1 (de) * | 2002-12-13 | 2004-06-24 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren |
| US7601491B2 (en) * | 2003-02-06 | 2009-10-13 | Becton, Dickinson And Company | Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor |
| US20050059024A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for isolating small RNA molecules |
| EP2295569A1 (de) * | 2003-07-25 | 2011-03-16 | Ambion, Inc. | Verfahren und Zusammensetzungen zur Isolation von kleinen RNA-molekülen |
| EP1694692B1 (de) * | 2003-12-16 | 2010-04-28 | QIAGEN North American Holdings, Inc. | Formulierungen und verfahren zum denaturieren von proteinen |
| WO2005093065A1 (en) * | 2004-03-16 | 2005-10-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Improved method of isolating nucleic acids |
| US20050239091A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-10-27 | Collis Matthew P | Extraction of nucleic acids using small diameter magnetically-responsive particles |
| US20050277121A1 (en) * | 2004-06-11 | 2005-12-15 | Ambion, Inc. | Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection |
| JP2008510456A (ja) | 2004-07-30 | 2008-04-10 | アジェンコート バイオサイエンス コーポレーション | 多官能基コート化固相担体を用いる核酸の単離方法 |
| US20060024776A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Mcmillian Ray | Magnetic particle capture of whole intact organisms from clinical samples |
| KR20070097430A (ko) | 2004-11-05 | 2007-10-04 | 퀴아젠 노쓰 아메리칸 홀딩즈, 인크. | 안정화 시약으로부터 핵산을 정제하기 위한 조성물 및 방법 |
| US20060234251A1 (en) * | 2005-04-19 | 2006-10-19 | Lumigen, Inc. | Methods of enhancing isolation of RNA from biological samples |
| US20080277348A1 (en) * | 2005-06-07 | 2008-11-13 | Arkray, Inc. | Liquid Exchange Method, Ingredient Extraction Method Using the Same, Composite Container and Autoanalyzer |
| US20070015165A1 (en) * | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Sigma-Aldrich Co. | Method for the isolation of RNA from biological sources |
| US20070092403A1 (en) * | 2005-10-21 | 2007-04-26 | Alan Wirbisky | Compact apparatus, compositions and methods for purifying nucleic acids |
| DE102005057334A1 (de) * | 2005-11-28 | 2007-06-06 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus beliebigen Ausgangsmaterialien |
| US20070190526A1 (en) * | 2006-02-16 | 2007-08-16 | Nexgen Diagnostics Llc | Methods of extracting nucleic acids |
| US20070202511A1 (en) | 2006-02-28 | 2007-08-30 | Sigma-Aldrich Co. | Methods and compositions for the rapid isolation of small RNA molecules |
| EP1911844A1 (de) | 2006-10-10 | 2008-04-16 | Qiagen GmbH | Verfahren und Zusammenstellung zur Isolierung von Nukleinsäure |
| CA2629589C (en) | 2007-04-20 | 2016-03-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Isolation and purification of nucleic acid molecules with a solid phase |
| WO2009014766A2 (en) * | 2007-07-26 | 2009-01-29 | The University Of Utah Research Foundation | Non-invasive recovery of rna and analysis of gene expression in skin |
| WO2009099854A1 (en) * | 2008-02-01 | 2009-08-13 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Urine transport medium |
| ES2574129T3 (es) * | 2008-04-02 | 2016-06-15 | Rbc Bioscience Corp. | Reactivos, agentes caotrópicos, kits y métodos para aislar ácidos nucleicos basados en materiales de celulosa magnéticos |
| US20110046361A1 (en) * | 2008-04-30 | 2011-02-24 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids |
| GB0814570D0 (en) | 2008-08-08 | 2008-09-17 | Diagnostics For The Real World | Isolation of nucleic acid |
| JP2014176303A (ja) * | 2013-03-13 | 2014-09-25 | Seiko Epson Corp | ｃＤＮＡの合成方法 |
| JP2017539080A (ja) | 2014-10-23 | 2017-12-28 | コーニング インコーポレイテッド | 高分子被包磁性ナノ粒子 |
| TWI691595B (zh) * | 2015-09-02 | 2020-04-21 | 創想生物科技有限公司 | 選擇性分離核酸之方法及套組 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8900725A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| US5128247A (en) * | 1989-08-14 | 1992-07-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for isolation of nucleic acids from eukaryotic and prokaryotic sources |
| US5523231A (en) * | 1990-02-13 | 1996-06-04 | Amersham International Plc | Method to isolate macromolecules using magnetically attractable beads which do not specifically bind the macromolecules |
| US5620852A (en) * | 1990-11-14 | 1997-04-15 | Hri Research, Inc. | Nucleic acid preparation methods |
| WO1992018514A1 (en) * | 1991-04-12 | 1992-10-29 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Purification of nucleic acids using metal oxide supports |
| US5155018A (en) * | 1991-07-10 | 1992-10-13 | Hahnemann University | Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources |
| AU6230594A (en) * | 1993-02-01 | 1994-08-29 | University Of Iowa Research Foundation, The | Quartenary amine surfactants and methods of using same in isolation of rna |
| EP0765335B1 (de) * | 1994-06-14 | 1999-09-01 | Invitek GmbH | Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien |
| GB9425138D0 (en) * | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
-
1997
- 1997-07-11 US US08/893,561 patent/US5990302A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-11 EP EP97111798A patent/EP0818461B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 DE DE69734263T patent/DE69734263T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5990302A (en) | 1999-11-23 |
| DE69734263D1 (de) | 2006-02-09 |
| EP0818461A2 (de) | 1998-01-14 |
| EP0818461A3 (de) | 1999-02-10 |
| EP0818461B1 (de) | 2005-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69734263T2 (de) | Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren. | |
| DE69533317T2 (de) | Isolierung von nukleinsäuren | |
| DE69109275T2 (de) | Verfahren zur isolierung von makromolekülen mittels magnetisch anziehbarer kugeln, die die makromoleküle unspezifisch binden. | |
| DE69802191T3 (de) | Festphasen-Nukleinsäure-Isolierung | |
| DE69731939T2 (de) | Isolierung von einzelsträngigen nukleinsäuren | |
| EP1146049B1 (de) | Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen | |
| DE602004009022T2 (de) | Verfahren und Reagentien zur Extraktion von RNA und Verfahren zur Analyse von biologischem Material | |
| DE69432540T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäuren aus einer biologischen Probe bei niedrigem pH und unter Verwendung einer Säureprotease | |
| DE4321904B4 (de) | Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen | |
| EP1121460A1 (de) | Verfahren und mittel zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren an oberflächen | |
| DE3639949A1 (de) | Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren | |
| EP2283026B1 (de) | Verfahren zur anreicherung und isolierung von biomolekülen oder viren | |
| EP3168303A1 (de) | Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren, wobei die nukleinsäuren bei erhöhter temperatur an einer matrix immobilisiert werden | |
| DE4333805C2 (de) | Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und Verfahren zum Nachweis spezifizierter Nucleinsäuresequenzen | |
| DE69632904T2 (de) | Kopräzipitat und methode zur extraktion von nukleinsäuren | |
| JP3082908B2 (ja) | リボ核酸の単離方法 | |
| DE19912799B4 (de) | Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial und seine Verwendung | |
| EP2134840A1 (de) | Verfahren zur aufreinigung von biomolekülen | |
| EP2041281B1 (de) | Verfahren zur parallelen isolierung doppel- und einzelsträngiger nukleinsäuren sowie zur selektiven entfernung doppelsträngiger nukleinsäuren aus einem gemisch von doppel- und einzelsträngigen nukleinsäuren | |
| DE102006020872A1 (de) | Verfahren zur Nucleinsäureisolierung und Vorrichtung zur Nucleinsäureisolierung | |
| WO1998012351A1 (de) | Verfahren zur reinigung und gegebenenfalls analyse von nukleinsäuren aus biologischen proben | |
| EP1299531A2 (de) | Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren | |
| DE19731670C2 (de) | Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben | |
| EP1693453B1 (de) | Verfahren zur Isolierung und Trennung von einzel- und doppelsträngigen Nucleinsäuren sowie Trennsäule zur Durchführung des Verfahrens | |
| JPH11196869A (ja) | リボ核酸の単離方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |