EP1299531A2 - Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren

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Publication number
EP1299531A2
EP1299531A2 EP01971766A EP01971766A EP1299531A2 EP 1299531 A2 EP1299531 A2 EP 1299531A2 EP 01971766 A EP01971766 A EP 01971766A EP 01971766 A EP01971766 A EP 01971766A EP 1299531 A2 EP1299531 A2 EP 1299531A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acids
solution
nacl
isopropanol
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP01971766A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Weber
Thorsten Singer
Sarah Cosaert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP1299531A2 publication Critical patent/EP1299531A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating nucleic acids from a solution, the nucleic acids being adsorbed on a Si0 2 -containing surface.
  • the present invention relates to the use of a buffer solution for isolating nucleic acids on a support containing SiO 2 and to a kit for carrying out a method for isolating nucleic acids from a solution.
  • EP 0389063 B1 relates to a method for isolating nucleic acids from a biological source.
  • the biological sources containing nucleic acids such as blood, cells, plasma, etc.
  • the nucleic acids are then attached bound a silica surface. These are then washed and eluted.
  • the biological sample is acidified and treated with a chaotropic agent, e.g. mixed with a guanidinium salt.
  • a chaotropic agent e.g. mixed with a guanidinium salt.
  • Silicate particles are added to the sample and, under the given conditions, RNA binds to the silicate particles. Subsequently, the RNA is also separated from the particles here.
  • Colpan et al. in WO 95/01359 disclose a process for the purification and separation of nucleic acid mixtures by adsorption of the nucleic acid from an alcohol-containing solution with a high ionic strength.
  • the adsorption solution contains salts in a concentration of 1 to 10 M, the chaotropic salts, e.g. Guanidinium thiocyanate, sodium perchlorate, or guanidinium hydrochloride are preferred.
  • WO 95/21849 relates to a method for separating double-stranded and / or single-stranded nucleic acids from sources which contain these nucleic acids.
  • the nucleic acids are adsorbed on mineral carriers under conditions which allow binding of the desired nucleic acid species, while the undesired nucleic acid species does not bind on this mineral carrier.
  • the non-adsorbed double-stranded nucleic acid can then be further purified or isolated using known methods.
  • nucleic acids that are used for molecular biological applications are subject to very high requirements in terms of purity and integrity.
  • the use of nucleic acids in molecular diagnostics or molecular medicine presupposes that they must be free of toxic substances, which can lead, for example, to pathogenic effects in the organisms to be treated.
  • chaotropic salts are used in high concentrations for the isolation of nucleic acids on silica surfaces.
  • Chaotropic substances such as guanidinium hydrochloride, guanidinium thiocyanate or sodium perchlorate are highly toxic substances. It cannot be ruled out that the nucleic acids isolated in the presence of these substances will be contaminated with them and thus cannot be used or can only be used to a limited extent for use in molecular biological applications.
  • chaotropic substances also represents a high health risk for the user, so that the handling of these substances must be carried out under certain protective measures.
  • the technical problem on which the present invention is based is to provide an improved method which uses known disadvantages overcome.
  • the substances used in this method for binding the nucleic acid should not be toxic.
  • the method should be as inexpensive as possible, for example by using inexpensive chemicals, and the isolated nucleic acids should be isolated quantitatively and qualitatively purely.
  • the present invention provides a method for isolating nucleic acids from a solution which achieves this object.
  • the invention consists in the fact that in a first step the binding of nucleic acids to Si0 2 -containing surfaces in the presence of alkali halides in a concentration of 0.1-3M, preferably 0.25-1.5M, and alcohol in a concentration from 37 to 70 vol.% is carried out.
  • the nucleic acids adsorbed on the Si0 2 -containing surface are then optionally washed with an alcohol-containing washing buffer and the nucleic acid is eluted with an aqueous salt solution or with water.
  • Aqueous adsorption solutions are used to bind the nucleic acids to the Si0 2 -containing surface, the alkali halides such as NaCl, KCl and LiCl in a concentration of 0.1-3M, preferably 0.25-1.5M, particularly preferably 0.5 - 1, 25 M and in particular 0.5 - 1, 0 M included.
  • Alkali halides are non-toxic substances and handling the salt solutions in the concentration used is harmless to health.
  • the aqueous adsorption solutions contain lower aliphatic, branched or unbranched alcohols with a chain length of 1 to 5 carbon atoms.
  • the aliphatic alcohols present in the solution are preferably methanol, ethanol, propanol, isopropanol and butanol in a concentration of 37-70% by volume, preferably 37-50% by volume.
  • ethanol and / or isopropanol in a concentration of 37-70% by volume are particularly preferred.
  • Si0 2 -containing surfaces can, for example, be porous or non-porous silicon oxides or metal-silicon mixed oxides, silica gels, materials
  • Base of glasses e.g. modified or unmodified glass particles or glass powder, quartz, zeolites or mixtures of one or more of the substances mentioned above.
  • a surface is understood to mean any microporous separating layer.
  • the Si0 2 -containing surface is a porous membrane or a process
  • Filters made of silica gel, glass or quartz fibers made of silica gel, glass or quartz fibers.
  • the term surface in the broader sense also includes a layer of particles or also a granulate and also fibers, such as, for. B. silica gel nonwovens.
  • water or aqueous salt solutions are suitable as eluents for eluting the bound nucleic acid.
  • Buffer solutions known from the prior art are used as salt solutions, such as, for example, morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazino] ethanesulfonic acid (HEPES) in a concentration of 0.001 to 0.5 mol / liter, preferably 0.01 to 0.2 mol / liter, particularly preferably 0.01 to 0.05 molar solutions.
  • MOPS morpholinopropanesulfonic acid
  • TMS tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • HEPES 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazino] ethanesulfonic acid
  • the nucleic acids in the eluate can preferably be isolated by alcoholic precipitation.
  • the nucleic acids isolated with this method are free of toxic substances and are therefore suitable for use in molecular biology.
  • the term "nucleic acid” is to be understood in its broadest sense, that is to say ribonucleic acids (RNA) as well as deoxyribonucleic acids (DNA) in all lengths and configurations, such as double-stranded, single-stranded, circular and linear, branched, etc.
  • nucleic acids such as monomeric nucleotides, oligomers, plasmids, cosmids, viral and bacterial DNA and RNA, as well as genomic and non-genomic DNA and RNA from animal and plant cells or other eukaryotes, mRNA in processed and unprocessed form, tRNA, hn-RNA, rRNA, cDNA and include all other conceivable nucleic acids.
  • the method according to the invention allows nucleic acids of any origin to be isolated from solutions.
  • the sample containing nucleic acids comes, for example, from animal or vegetable tissues, tissue or cell cultures, bone marrow, human and animal body fluids such as blood, serum, plasma, urine, sperm, cerebrospinal fluid, sputum and smears, plants, plant parts and extracts, for example Juices, mushrooms, prokaryotic or eukaryotic microorganisms such as bacteria or yeast, fossil or mummified samples, soil samples, sewage sludge, waste water and food (especially processed, ie technically processed food).
  • Nucleic acids which have arisen from chemical reactions such as, for example, those which have been obtained by polymerase chain reaction (PCR) or plasmid DNA, genomic DNA and RNA and / or nucleic acids which come from microorganisms, can also be isolated according to the invention.
  • the method according to the invention is particularly suitable for isolating plasmid DNA from bacteria, such as, for example, E. coli, for subsequent cloning, transfection or sequencing.
  • the bacteria are lysed using known lysis methods, such as alkaline lysis according to Bimboim and Doly (1979) or lysis by heating according to Holmes and Quigley.
  • the cell debris as well as the precipitated proteins and the genomic DNA are removed from the viscous lysate by centrifugation or filtration, and a clarified lysate is obtained which contains the plasmid DNA.
  • the plasmid DNA can be purified, for example, by means of ion exchange chromatography, and the plasmid DNA pre-purified in this way can then be isolated using the method according to the invention.
  • Another object of the present invention is a kit for isolating nucleic acids from a solution, comprising a) an adsorption solution containing 0.25-1.5 M NaCl, KCI or a mixture thereof and ethanol or isopropanol in one
  • the Si0 2 -containing surface can be a porous membrane or a filter made of silica gel, glass or quartz fibers and arranged in a suitable device.
  • the kit preferably also contains solutions suitable for lysis and, as described above, washing and elution buffers.
  • nucleic acids isolated according to the invention are free from ; nucleic acid degrading enzymes and have such a high purity, that they can be processed and processed immediately in a variety of ways.
  • the nucleic acids produced according to the invention can be used for cloning and serve as substrates for a wide variety of enzymes, such as, for example, DNA polymerases, DNA restriction enzymes, DNA ligase and reverse transcriptase.
  • enzymes such as, for example, DNA polymerases, DNA restriction enzymes, DNA ligase and reverse transcriptase.
  • the nucleic acids provided by the method according to the invention are particularly well suited for amplification, in particular for PCR, strand displacement amplification, rolling circle methods, ligase chain reaction (LCR) and similar methods.
  • the method according to the invention is furthermore particularly suitable for providing nucleic acids for use in diagnostics, in particular for a diagnostic method, which is characterized in that the nucleic acid purified by the method according to the invention is amplified in a subsequent step and subsequently and / or simultaneously the nucleic acid amplified in this way is detected (e.g. Holland, PM et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7276-7280. Livak, KJ et al., 1995. PCR Methods Applic. 4, 357 - 362; Kievits, T. et al., 1991. J. Virol. Meth. 35, 273-286; Uyttendaele, M. et al., 1994. J. Appl. Bacteriol. 77, 694-701).
  • each of the individual buffers (0.25-1.5 M NaCl; 50 mM Tris, pH 8.5; 15% (w / v) isopropanol) were mixed with 10 ⁇ g plasmid DNA (pCMVß; Fa.
  • the batches were transferred to a column containing a silica membrane (QIAquick, QIAGEN GmbH, # 28104) and under vacuum (approx. 600 mbar; use of the QIAvac 6S from QIAGEN GmbH) through the silica membrane.
  • the mixture was then washed with 750 ⁇ l of buffer PE (10 mM Tris, pH 7.5; 80% ethanol) and drawn through the membrane until the air was dry. Elution was carried out by adding 100 ⁇ l of buffer EB (10 mM Tris, pH 8.5) and the yield was determined photometrically at 260 nm.
  • the batches were transferred to a column containing a silica membrane and passed through the silica membrane under vacuum (approx. 600 mbar; use of the QIAvac 6S from QIAGEN GmbH).
  • the mixture was then washed with 750 ⁇ l of buffer PE (10 mM Tris, pH 7.5; 80% ethanol) and drawn through the membrane until the air was dry.
  • Elution was carried out by adding 100 ⁇ l of buffer EB (10 mM Tris, pH 8.5) and the yield was determined photometrically at 260 nm.
  • 15 ml buffer Q1 1, 25 M NaCl; 50 mM Tris, pH 8.5; 15 vol% Isopropanol
  • isopropanol was added to a final concentration of 49.8% by volume, mixed thoroughly and incubated for 5 minutes on the laboratory bench.
  • the DNA / Q1 / isopropanol mixture was transferred to a 20 ml syringe, which was equipped with a syringe filter containing a silica membrane (from Sartorius, Minisart series).
  • the recovery rate of the DNA is between 80 and 90% even with higher amounts of plasmid DNA.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Lösung, wobei die Nukleinsäuren an einer SiO2-haltigen Oberfläche in Gegenwart von Alkalihalogeniden und Alkohol absorbiert werden. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung einer Pufferlösung enthaltend Alkalihalogenide zur Isolierung von Nukleinsäuren an einem SiO2-haltigen Träger sowie ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Lösung.

Description

Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Lösung, wobei die Nukleinsäuren an einer Si02- haltigen Oberfläche adsorbiert werden.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Pufferlösung zur Isolierung von Nukleinsäuren an einem SiO2-haltigen Träger sowie ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Lösung.
Die Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren an mineralischen Trägern in Gegenwart von chaotropen Salzen ist in der Literatur wohlbekannt.
Marko et al. [Analyt. Biochem. 121 (1982) 382] sowie Vogelstein et al. [Proc. Nat. Acad. Sei. 76 (1979) 615] erkannten, dass, falls die DNA aus Nukleinsäure-enthaltenden Extrakten hohen Konzentrationen von Natriumjodid oder Natriumperchlorat ausgesetzt wird, nur die DNA an mechanisch fein zerkleinerten Glass-Scintillationsröhrchen sowie zerkleinerten Glasfasermembranen bzw. Glasfiberplatten bindet, während RNA und Proteine nicht binden. Die so gebundene DNA kann ggf. mit Wasser eluiert werden.
Die EP 0389063 B1 betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Quelle. Gemäß dieser Methode werden die Nukleinsäuren enthaltenden biologischen Quellen, wie Blut, Zellen, Plasma etc. in Gegenwart von chaotropen Salzen in hohen Konzentrationen aufgeschlossen und anschließend die Nukleinsäuren an eine Silikaoberfläche gebunden. Diese werden dann gewaschen und eluiert.
Das im US Patent 5,155,018 beschriebene Verfahren beschreibt die Isolierung von RNA aus biologischen Quellen, die neben RNA auch DNA und andere Inhaltsstoffe enthalten.
Die biologische Probe wird angesäuert und mit einem chaotropen Agens, wie z.B. einem Guanidiniumsalz vermischt. Der Probe werden Silikatpartikel zugegeben und unter den gegebenen Bedingungen bindet RNA an die Silikatpartikel. Anschließend wird auch hier die RNA von den Partikeln abgetrennt.
Colpan et al. offenbaren in der WO 95/01359 ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Nukleinsäuregemischen durch Adsorption der Nukleinsäure aus einer alkoholhaltigen Lösung mit hoher lonenstarke. Die Adsorptionslösung enthält neben Alkohol in einer Konzentration von 1 bis 50 Vol.% Salze in einer Konzentration von 1 bis 10 M, wobei die chaotropen Salze, wie z.B. Guanidiniumthiocyanat, Natriumperchlorat, oder Guanidiniumhydrochlorid bevorzugt werden.
Gegenstand der WO 95/21849 ist ein Verfahren zur Trennung von doppel- und/oder einzelsträngigen Nukleinsäuren aus Quellen, die diese Nukleinsäuren enthalten. Auch bei diesem Verfahren werden die Nukleinsäuren an mineralischen Trägern adsorbiert unter Bedingungen, die eine Bindung der gewünschten Nukleinsäurespezies erlauben, während die unerwünschte Nukleinsäurespezies nicht an diesen mineralischen Träger bindet.
Um überwiegend einzelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger zu binden und somit von doppelsträngiger Nukleinsäure zu trennen, werden die Behandlungsbedingungen für die beide Nukleinsäurespezies enthaltenden Proben mit einem wässrigen Gemisch von Salzen, insbesondere chaotropen Salzen, und Alkohol entsprechend eingestellt. Die nicht adsorbierte doppelsträngige Nukleinsäure kann daraufhin mit bekannten Verfahren weiter aufgereinigt oder isoliert werden.
Nukleinsäuren, die für molekularbiologische Anwendungen, wie z.B. für die PCR, die Sequenzierung, und den Gentransfer, insbesondere die Transfektion oder Vakzinierung, verwendet werden, unterliegen sehr hohen Anforderungen an Reinheit und Integrität. Die Verwendung von Nukleinsäuren in der Molekularen Diagnostik oder Molekularen Medizin setzt voraus, dass diese frei sein müssen von toxischen Substanzen, die beispielsweise zu pathogenen Effekten in den zu behandelnden Organismen führen können.
Den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist gemein, dass für die Isolierung von Nukleinsäuren an Silikaoberflächen chaotrope Salze in hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Chaotrope Substanzen, wie Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumthiocyanat oder Natriumperchlorat sind hoch toxische Substanzen. Es ist nicht auszuschließen, dass die in Gegenwart dieser Substanzen isolierten Nukleinsäuren damit kontaminiert werden und somit für den Gebrauch bei molekularbiologischen Anwendungen nicht oder nur bedingt verwendbar sind.
Der Umgang mit chaotropen Substanzen stellt außerdem für den Anwender ein hohes gesundheitliches Risiko dar, so dass die Handhabung dieser Substanzen unter gewissen Schutzmassnahmen erfolgen muss.
Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht darin, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, das die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile überwindet. Die in diesem Verfahren zur Bindung der Nukleinsäure verwendeten Substanzen sollten nicht toxisch sein. Das Verfahren soll dabei möglichst kostengünstig sein, indem beispielsweise preisgünstige Chemikalien verwendet werden, und die isolierten Nukleinsäuren sollten quantitativ und qualitativ rein isoliert werden.
Überraschenderweise wird mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Lösung zur Verfügung gestellt, das diese Aufgabe löst. Die Erfindung besteht darin, dass in einem ersten Schritt die Bindung von Nukleinsäuren an Si02-haltigen Oberflächen in Gegenwart von Alkalihalogeniden in einer Konzentration von 0,1 - 3 M, vorzugsweise 0,25 - 1 ,5 M, und Alkohol in einer Konzentration von 37 - 70 Vol.% durchgeführt wird. Die an der Si02-haltigen Oberfläche adsorbierten Nukleinsäuren werden dann ggf. mit einem alkoholhaltigen Waschpuffer gewaschen und die Nukleinsäure mit einer wässrigen Salzlösung oder mit Wasser eluiert.
Zur Bindung der Nukleinsäuren an die Si02-haltige Oberfläche werden wässrige Adsorptionslösungen eingesetzt, die Alkalihalogenide wie NaCI, KCI und LiCI in einer Konzentration von 0,1 - 3 M, vorzugsweise 0,25 - 1 ,5 M, besonders bevorzugt 0,5 - 1 ,25 M und insbesondere 0,5 - 1 ,0 M enthalten. Alkalihalogenide sind nicht-toxische Substanzen und die Handhabung der Salzlösungen in der eingesetzten Konzentration ist gesundheitlich unbedenklich.
Die wässrigen Adsorptionslösungen enthalten neben den erwähnten Salzen niedere aliphatische, verzweigte oder unverzweigte Alkohole mit einer Kettenlänge von 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. Die in der Lösung vorhandenen aliphatischen Alkohole sind bevorzugt Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol und Butanol in einer Konzentration von 37 - 70 Vol%, bevorzugt 37 - 50 Vol.%. Unter den vorgenannten Alkoholen werden Ethanol und/oder Isopropanol in einer Konzentration von 37 - 70 Vol.% besonders bevorzugt.
Si02-haltige Oberflächen können beispielsweise poröse oder nicht-poröse Siliziumoxide oder Metall-Siliziummischoxide, Silikagele, Materialien auf
Basis von Gläsern, z.B. modifizierte oder nicht-modifizierte Glaspartikel oder Glasmehl, Quarz, Zeolithe oder Mischungen von einer oder mehreren der oben genannten Substanzen sein.
Unter einer Oberfläche wird im Sinne der vorliegenden Erfindung jede mikroporöse Trennschicht verstanden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist die Si02-haltige Oberfläche eine poröse Membran oder ein
Filter aus Silikagel, Glas - oder Quarzfasern.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst der Begriff Oberfläche im weiteren Sinne auch eine Schicht von Partikeln bzw. auch ein Granulat sowie auch Fasern, wie z. B. Silikagelvliese.
Zur Elution der gebundenen Nukleinsäure eignen sich erfindungsgemäß Wasser oder wässrige Salzlösungen als Elutionsmittel. Als Salzlösungen werden Pufferlösungen eingesetzt, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie beispielsweise Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazino]ethansulfonsäure (HEPES) in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Mol/Liter, bevorzugt 0,01 bis 0,2 Mol/Liter, besonders bevorzugt 0,01 bis 0,05 molare Lösungen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die im Eluat befindlichen Nukleinsäuren vorzugsweise auf dem Wege der alkoholischen Fällung isoliert werden. Die mit diesem Verfahren isolierten Nukleinsäuren sind frei von toxischen Substanzen und somit geeignet für die Verwendung in der Molekularbiologie. Im folgenden soll die Bezeichnung "Nukleinsäure" in ihrem breitesten Sinn verstanden werden, also Ribonukleinsäuren (RNA) wie auch Desoxyribonukleinsäuren (DNA) in allen Längen und Konfigurationen, wie Doppelstrang, Einzelstrang, zirkulär und linear, verzweigt usw. umfassen und alle möglichen Unterarten, wie z.B. monomere Nukleotide, Oligomere, Plasmide, Cosmide, virale und bakterielle DNA und RNA, sowie genomische und nichtgenomische DNA und RNA aus Tier- und Pflanzenzellen oder anderen Eukaryonten, mRNA in prozessierter und unprozessierter Form, tRNA, hn-RNA, rRNA, cDNA sowie alle anderen denkbaren Nukleinsäuren einschließen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Nukleinsäuren jeglicher Herkunft aus Lösungen zu isolieren. Die Nukleinsäuren enthaltende Probe stammt beispielsweise aus tierischen oder pflanzlichen Geweben, Gewebe- oder Zellkulturen, Knochenmark, humanen und tierischen Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Sperma, Zere- brospinalflüssigkeit, Sputum und Abstrichen, Pflanzen, Pflanzenteilen und -extrakten, z.B. Säften, Pilzen, prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefen, fossilen oder mumifizierten Proben, Bodenproben, Klärschlamm, Abwässern und Lebensmitteln (insbesondere prozessierten, d.h. technisch aufbereiteten Lebensmitteln). Auch Nukleinsäuren, die durch chemische Reaktionen entstanden sind, wie z.B. solche, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten wurden oder Plasmid-DNA, genomische DNA und RNA und/oder Nukleinsäuren, die aus Mikroorganismen stammen, lassen sich erfindungsgemäß isolieren. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren, um Plasmid- DNA aus Bakterien, wie z.B. E.coli für die anschließende Klonierung, Transfektion oder Sequenzierung zu isolieren.
Die Lyse der Bakterien erfolgt dabei nach bekannten Lyseverfahren, wie z.B. der alkalischen Lyse nach Bimboim und Doly (1979) oder der Lyse durch Erhitzen nach Holmes und Quigley.
Die Zelldebris sowie die ausgefallenen Proteine und die genomische DNA werden aus dem viskosen Lysat mittels Zentrifugation oder Filtration entfernt und man erhält ein geklärtes Lysat, das die Plasmid-DNA enthält. Die Aufreinigung der Plasmid-DNA kann beispielsweise mittels lonenaustauscherchromatographie erfolgen und die so vorgereinigte Plasmid-DNA anschließend mit dem erfindungsmäßigen Verfahren isoliert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Lösung, umfassend a) eine Adsorptionslösung enthaltend 0,25 - 1,5 M NaCI, KCI oder eine Mischung davon und Ethanol oder Isopropanol in einer
Konzentration von 37 - 70 Vol %; und b) eine Si02-haltige Oberfläche.
Die Si02-haltige Oberfläche kann eine poröse Membran oder ein Filter aus Silikagel, Glas - oder Quarzfasern und in einer geeigneten Vorrichtung angeordnet sein. Vorzugsweise enthält der Kit zusätzlich Lösungen geeignet für die Lyse sowie, wie zuvor beschrieben, Wasch- und Elutionspuffer.
Die erfindungsgemäß isolierten Nukleinsäuren sind frei von ; nukleinsäureabbauenden Enzymen und haben eine derartig hohe Reinheit, daß sie unmittelbar in verschiedensten Weisen weiterbehandelt und bearbeitet werden können.
Die erfindungsgemäß hergestellten Nukleinsäuren können für Klonierungen verwendet werden und als Substrate für verschiedenste Enzyme dienen, wie beispielsweise DNA-Polymerasen, DNA-Restriktionsenzyme, DNA-Ligase und reverse Transkriptase.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellten Nukleinsäuren eignen sich in besonders guter Weise zur Amplifikation, insbesondere für die PCR, Strand Displacement Amplifikation, Rolling Circle Verfahren, Ligase Chain Reaction (LCR) und ähnlicher Verfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich weiterhin in besonders guter Weise zur Bereitstellung von Nukleinsäuren für die Verwendung in der Diagnostik, insbesondere für ein Diagnoseverfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigte Nukleinsäure in einem Folgeschritt amplifiziert wird und anschließend und/oder gleichzeitig die so amplifizierte Nukleinsäure detektiert wird (z. B. Holland, P.M. et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 7276 - 7280. Livak, K.J. et al., 1995. PCR Methods Applic. 4, 357 - 362; Kievits, T. et al., 1991. J. Virol. Meth. 35, 273 - 286; Uyttendaele, M. et al., 1994. J. Appl. Bacteriol. 77, 694 - 701 ).
Beispiel 1 :
Isolierung von Plasmid-DNA in Gegenwart von NaCl und Alkohol in verschiedenen Konzentrationen.
Es wurden je 390 μl der einzelnen Puffer (0,25 - 1 ,5 M NaCl; 50 mM Tris, pH 8,5; 15 % (w/v) Isopropanol) mit 10 μg Plasmid-DNA (pCMVß; Fa.
Clontech # 6177-1 ) (c = 1 μg/μf) gemischt und mit verschiedenen Mengen an Isopropanol versetzt, die einem Gesamtanteil von 28,9 - 49,8 Vol% Isopropanol in den jeweiligen Bindepuffern entspricht. Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur (20-25°C) wurden die Ansätze in eine eine Silikamembran enthaltende Säule überführt und unter Vakuum (ca. 600 mbar; Verwendung der QIAvac 6S der Fa. QIAGEN GmbH) durch die Silicamembran geführt. Anschließend wurde mit 750 μl Puffer PE (10 mM Tris, pH 7,5; 80 % Ethanol) gewaschen und bis zur Trockene Luft durch die Membran gezogen. Eluiert wurde durch Zugabe von 100 μl Puffer EB (10 mM Tris, pH 8,5) und die Ausbeute photometrisch bei 260 nm bestimmt. Das Ergebnis ist aus Tabelle 1 ersichtlich.
Tabelle 1 :
Verdünnungsfaktor 20; Gesamtvolumen 50 μl; Ausbeute DNA 10 μg = 100% Beispiel 2:
Isolierung von Plasmid-DNA bei verschiedenen Alkoholkonzentrationen Es wurden 500 μg (c = 1 μg/μl) Plasmid-DNA (pCMVß; Fa. Clontech # 6177-1 ) in 5 ml Puffer Q1 (1 ,25 M NaCl; 50 mM Tris, pH 8,5; 15 Vol % Isopropanol) gelöst. Dann wurde Isopropanol zugegeben, in einer Menge, die einem Gesamtanteil von 22,7 - 43,3 Vol% Isopropanol im Bindepuffer entspricht, sorgfältig gemischt und 5 min bei Zimmertemperatur (20-25°C) inkubiert. Das DNA/Q1/lsopropanol-Gemisch wurde in ein Glasfaserfilter gedrückt (Fa. Sartorius, Minisart-Serie) und die Membranen bis zur Trockne ausgeblasen. Die Elution erfolgte mit 1 ml TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5; 1 mM EDTA). Die Ausbeute wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Verdünnungsfaktor: 20; Gesamtvolumen: 1 ml Beispiel 3:
Isolierung von Plasmid-DNA in Gegenwart von KCI und Alkohol in verschiedenen Konzentrationen Es wurden je 390 μl der einzelnen Puffer (0,25 - 1 ,0 M KCI; 50 mM Tris, pH 8,5; 15 % (w/v) Isopropanol) mit 10 μg Plasmid-DNA (pCMVß; Fa. Clontech # 6177-1 ) (c = 1 μg/μl) gemischt und mit verschiedenen Mengen an Isopropanol versetzt, die einem Anteil von bis zu 57,3 Vol% Isopropanol (siehe Tabelle 3) bzw. bis zu 71 ,4 Vol.-% Isopronal nebst Ethanol in den jeweiligen Bindepuffern entsprachen. Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur (20 -25°C) wurden die Ansätze in eine eine Silikamembran enthaltende Säule (QIAquick, Fa. QIAGEN GmbH, #28104) überführt und unter Vakuum (ca. 600 mbar; Verwendung der QIAvac 6S der Fa. QIAGEN GmbH) durch die Silicamembran geführt. Anschließend wurde mit 750 μl Puffer PE (10 mM Tris, pH 7,5; 80 % Ethanol) gewaschen und bis zur Trockene Luft durch die Membran gezogen. Eluiert wurde durch Zugabe von 100 μl Puffer EB (10 mM Tris, pH 8,5) und die Ausbeute photometrisch bei 260 nm bestimmt.
Verdünnungsfaktor 20; Gesamtvolumen 80 μl. Beispiel 4:
Isolierung von Plasmid-DNA in Gegenwart von LiCI; NaCl oder KCI und Alkohol in verschiedenen Konzentrationen Es wurden je 390 μl der einzelnen Puffer (0,25 - 1 ,0 M Salz; 50 mM Tris, pH 8,5; 15 % (w/v) Isopropanol) mit 10 μl (4 10 μg) Plasmid-DNA (pCMVß; Fa. Clontech # 6177-1) (c = 1 μg/μl) gemischt und mit verschiedenen Mengen an Ethanol versetzt, die einem Anteil von bis zu 71 ,4 Vol% Ethanol (siehe Tabelle 4 unten) in den jeweiligen Bindepuffern entsprachen. Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Ansätze in eine eine Silikamembran enthaltende Säule überführt und unter Vakuum (ca. 600 mbar; Verwendung der QIAvac 6S der Fa. QIAGEN GmbH) durch die Silikamembran geführt. Anschließend wurde mit 750 μl Puffer PE (10 mM Tris, pH 7,5; 80 % Ethanol) gewaschen und bis zur Trockene Luft durch die Membran gezogen. Eluiert wurde durch Zugabe von 100 μl Puffer EB (10 mM Tris, pH 8,5) und die Ausbeute photometrisch bei 260 nm bestimmt.
Tabelle 4:
Verdünnungsfaktor 20; Gesamtvolumen 100 μl Beispiel 5.
Isolierung von größeren Mengen DNA
Es wurden ansteigende Mengen an Plasmid-DNA (c = 1 μg/μl; pCMVb; Fa. Clontech # 6177-1 ) in 15 ml Puffer Q1 (1 ,25 M NaCl; 50 mM Tris, pH 8,5; 15 Vol % Isopropanol) gelöst. Dann wurde Isopropanol bis zu einer Endkonzentration von 49,8 Vol % zugegeben, sorgfältig gemischt und 5 min auf der Laborbank inkubiert. Das DNA/Q1/lsopropanol-Gemisch wurde in eine 20 ml Spritze überführt, die mit einem eine Silikamembran enthaltenden Spritzenvorsatzfilter (Fa. Sartorius, Minisart-Serie) bestückt war. Das Gemisch wurde unter gleichmäßigem Druck durch den Filter gedrückt, dieser abgenommen, und mit der Spritze noch mehrmals Luft durch die Membran geblasen, um die Alkoholreste zu entfernen. Zur Elution wurden anschließend 5 ml TE- Puffer (10 mM Tris, pH 7,5; 1 mM EDTA) mittels einer frischen 5 ml Spritze durch den Spritzenvorsatzfilter gedrückt. Die Ausbeute wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 zusammengefaßt.
Tabelle 5:
Verdünnungsfaktor: 20; Gesamtvolumen: 5 ml
Ergebnis:
Die Wiederfindungsrate der DNA liegt auch bei höheren Mengen an Plasmid-DNA zwischen 80 und 90 %. Beispiel 6
Isolierung von Plasmid-DNA in Gegenwart verschiedener NaCI- Konzentrationen und Alkohol
Es wurden je 340 μl einer NaCI-Lösung (0 M; 0,1 M; 0,25 M; 0,5 M; 1 M; 2,5 M; 5 M; gesättigte Lösung; 50 mM Tris; ph 8,5) mit 10μl einer 1 μg/μl enthaltenden Plasmid-DNA-Lösung (pCMVß; Fa. Clontech # 6177-1 ) gemischt. Zu jeder Probe wurden 350 μl Isopropanol gegeben, wodurch sich eine Konzentration von 50 Vol-% für jeden Ansatz ergab. Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur (20 - 25° C) in eine Säule (QIAvac 6S; QIAGEN GmbH) überführt, in welcher eine Glasfaser/Silika- Membran (QIAprep 8-welI strips; QIAGEN GmbH) angeordnet war. Die DNA-haltigen Lösungen wurden unter Vacuum (ca. 600 mbar) durch die Membran geführt und anschließend mit 200 μl EB-Puffer (10 mM Tris; pH 8,5) eluiert. Die jeweiligen Ausbeuten an DNA (in Prozent der eingesetzten Menge) bei den für jede Salzkonzentration vorgenommenen vierfachen Bestimmungen sowie der jeweilige Durchschnittswert sind in der nachfolgenden Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6
STABW: Standardabweichung, ausgehend von einer Stichprobe Das Ergebnis dieses Versuchs deutet darauf hin, daß die Ausbeute bei der DNA-Gewinnung bei sehr hohen Salzkonzentrationen (5 M, gesättigt) abnimmt im Vergleich zu geringeren Salzkonzentrationen zwischen 0,1 und 2,5 M.
Beispiel 7
Isolierung von Plasmid-DNA in Gegenwart verschiedender Salze bzw. verschiedener Alkoholkonzentrationen
Es wurden je 500 μg Plasmid-DNA in 5 ml TE-Puffer (10mM Tris-Cl; ph 8,0; 1 mM EDTA; QIAGEN GmbH) gelöst und Isopropanol zugegeben, bis die Endkonzentrationen an Alkohol in den einzelnen Ansätzen bei 41 ,2, 50, 66,7 und 75 Vol-% lag. Alle Bestimmungen für die DNA-Isolierung wurden mit einem QIAprecipitator Maxi (QIAGEN GmbH) in einer QIAvec 6S-Säule (QIAGEN GmbH) durchgeführt. In Tabelle 7 sind die Ergebnisse der Versuche zusammengefaßt, bei denen die Salzkonzentration in den jeweiligen Ansätzen 1 ,25 M NaCl betrug. Die Untersuchungen wurden jeweils mehrfach durchgeführt, wobei in Tabelle 7 die Ergebnisse für die einzelnen Proben und der daraus errechnete Mittelwert mit Standardabweichung angegeben sind.
Tabelle 7
Ausbeuten [%]
Anschließend wurden die vorstehend beschriebenen Versuche dahingehend abgeändert, daß die Art der verwendeten Salzlösung geändert wurde, und zwar wurde die 1 ,25 M NaCI-Lösung durch eine 1 ,25 M KCI-Lösung ersetzt. Die Ergebnisse der Versuche mit KCI-Lösung sind in Tabelle 8 wiedergegeben.
Tabelle 8
Ausbeuten [%]
Schließlich wurde auch noch der Einfluß des verwendeten Puffers auf die Ausbeute bei der Plasmid-DNA untersucht. Dazu wurde wie vorstehend beschrieben vorgegangen, und in dem Ansatz mit einer 1 ,25 M NaCI- Lösung der TE-Puffer durch eine QF-Puffer (50 mM MOPS; pH 7,0; 15 % Isopropanol) ersetzt. Die Ergebnisse der Mehrfachbestimmungen nebst Mittelwert und Standardabweichung sind in Tabelle 9 zusammengefaßt. Die gegenüber den Tabellen 7 und 8 abweichenden Alkoholkonzentrationen in den einzelnen Ansätzen gehen auf den 15%-igen Isopropanolgehalt des QF-Puffers zurück.
Tabelle 9
Ausbeuten [%]
Die Ergebnisse zeigen, daß die Art des verwendeten Salzes (NaCl / KCI) nur einen geringen Einfluß auf die Ausbeute bei der DNA-Isolierung zeigt. Auch der Austausch des Puffers hat praktisch keinen Einfluß auf die DNA- Ausbeute (77,4 % bei 1,25 M NaCl und TE-Puffer und 75,0 % bei 1 ,25 M NaCl und QF-Puffer).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Lösung, mit den folgenden Schritten:
a) Adsorbieren der in der Lösung enthaltenen Nukleinsäuren in Gegenwart von Alkali- und/oder Erdalkalisalzen an einer Si02-haltigen Oberfläche,
b) gegebenenfalls Waschen der an der Si02-haltigen Oberfläche adsorbierten Nukleinsäuren mit einem alkoholhaltigen Waschpuffer, und
c) Eluieren der Nukleinsäuren mit einer wäßrigen Lösung und gegebenenfalls Isolieren der Nukleinsäuren,
dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) die Adsorption der Nukleinsäuren an die Si0 -haltige Oberfläche in Gegenwart von 0,1 bis 3 M Alkali- und/oder Erdalkalisalzen und 37 bis 70 Vol-% eines aliphatischen Alkohols erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Plasmid-DNA ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Si02-haltige Oberfläche aus Silikagel, Glasfasern oder Quarzfasern besteht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die SιO2-haltige Oberfläche eine Membran oder ein Filter ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Lösung enthaltenen Alkalisalze Halogenide, vorzugsweise NaCl und/oder KCI sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) NaCl in einer Konzentration von 0,25 bis 1 ,5 M, bevorzugt von 0,5 bis 1 ,25 M und besonders bevorzugt von 0,5 bis 1 ,0 M in der Lösung vorliegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Lösung enthaltenen Alkohole niederaliphatische, verzweigte oder unverzweigte Alkohole mit einer Kettenlänge von 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der in der Lösung enthaltene Alkohol Ethanol oder/und Isopropanol ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt c) verwendeten Elutionslösungen Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), Tris(hydroxymethyl)amino- methan (TRIS) oder 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]ethansulfon- säure (HEPES) in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Mol/Liter, bevorzugt 0,001 bis 0,2 Mol/Liter, besonders bevorzugt 0,01 bis 0,05 Mol/Liter enthalten.
10. Verwendung einer Lösung enthaltend 0,25 - 1 ,5 M NaCl, KCI oder eine Mischung davon und Ethanol oder Isopropanol in einer Konzentration von 37 - 70 Vol.-% zur Adsorbtion von Nukleinsäure an eine Si02-haltige Oberfläche.
11. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, enthaltend a) eine Lösung nach Anspruch 10 und b) eine Si02-haltige Oberfläche.
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