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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren und/oder Fraktionen der Nukleinsäuren aus biologischen Prozessen und dafür geeignete Mittel.
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Unter Nukleinsäuren versteht man einen chemischen Überbegriff für Desoxyribonukleinsäure (DNS) und Ribonukleinsäure (RNS); Nukleinsäuren sind kettenförmige Moleküle, deren einzelne Bausteine die Nukleotide sind. Nukleinsäuren im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt genomische Nukleinsäuren.
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Nukleinsäuren erhält man bei verschiedenen biologischen Prozessen in der Regel zusammen mit anderen Inhaltsstoffen und/oder Reagenzien, die für nachfolgende Verfahren störend sind und entfernt werden müssen.
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So erhält man durch Aufbrechen biologischer Zellen (Lyse genannt) neben der Desoxyribonukleinsäure (DNS) andere Zellinhaltsstoffe, die beispielsweise biologische Prozesse wie die Polymerase Chain Reaction (PCR) hindern.
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Mit Hilfe der Polymerase Chain Reaction (PCR) lassen sich winzige Mengen an DNS in kürzester Zeit so stark vervielfältigen, dass sie ohne Probleme nachzuweisen, zu untersuchen und weiterzuverwenden sind. Dabei fallen auch wieder unterschiedliche Nebenprodukte und/oder Reagenzien, wie Primer, Primer Dimere, Protein Komplexe (DTNB), Enzyme, Aufarbeitungsreagenzien (dye terminator) Additive und/oder Salze an, die auch wieder vor weiteren Untersuchungen entfernt werden müssen.
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Es sind verschiedene Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren aus biologischen Prozessen bekannt (Mol. Gen. Genet. 229, 445 bis 452,
EP 0389063 B2 , J. Clin. Microbiol., 2003, 41(6) und 2440–3,
DE 100 33 991 A1 ,
AT 454471 E ,
EP 1278834 A1 ,
WO 2007 035750 A1 ,
US 2009 191566 A1 ,
EP 2363476 A1 ,
US 2012 059160 A1 ,
US 2009 306359 A1 ,
WO 2011 124705 A1 und
US 2007 087385 A1 ).
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Aus der
EP 1 608 752 B1 ist ein Verfahren zur Abtrennung von genomischen Nukleinsäuren aus biologischen Zellen bekannt. Die Zellen werden mit einem Reagenz behandelt, bei dem ein Bestandteil die Lyse der Zelle und ein zweiter Bestandteil das Ausfällen der Nukleinsäure auf einen Träger als feste Phase bewirkt. Die feste Phase kann einen magnetischen Kern enthalten.
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Danach wird der Träger mit der ausgefällten Nukleinsäure abgetrennt und die Nukleinsäure mit einem selektiven Eluierungsmittel isoliert.
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Nachteilig an dem aus der
EP 1 608 752 B1 bekannten Verfahren ist, dass die Fällung wenig selektiv ist und der Reinigungsprozess einen langen Zeitraum erfordert.
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Aus der
US 5,898,071 A ist ein Verfahren zur Reinigung genomischer DNA bekannt, wobei die Nukleinsäuren an magnetische Mikropartikel, bestehend aus einem magnetischen Metalloxidkern, der mit einer Carboxylgruppe oder einem Aminosilan ummantelt ist adsorbiert werden. Der magnetische Kern kann dabei als funktionelle Gruppe auch mit Streptavidin ummantelt sein.
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Aus ACS Nano (2011), 5(2), 1259–1266 ist bekannt, dass mesoporöse Kieselgelmaterialien große Oberflächen und Porengrößen aufweisen. Es werden als Beschichtung bzw. capping von Eisen(II)oxid-Partikeln Aminopropyltriethoxysilane verwendet.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Zurverfügungstellung eines schnellen und selektiven Reinigungsverfahrens für Nukleinsäuren.
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Es wurde ein Verfahren zur Reinigung von genomischen Nukleinsäuren oder Fraktionen von Nukleinsäuren aus biologischen Prozessen durch Adsorption an Kieselgel Partikel in Gegenwart von kosmotropen und chaotropen Salzen und nachfolgender Desorption gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nukleinsäuren aus biologischen Prozessen in einer Pufferlösung von kosmotropen und chaotropen Salzen und Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 und 5 kDa suspendiert werden, die Nukleinsäuren an säuregruppenfreie Kieselgel Partikel mit einem magnetischen Kern und mit einer Porengröße im Bereich von 5 bis 50 nm und einer inneren Oberfläche im Bereich von 0,1 bis 2000 m2/g adsorbiert werden, das Adsorbat abgetrennt und gegebenfalls gewaschen wird und die Nukleinsäuren oder die Fraktionen von Nukleinsäuren mit Wasser oder üblichen Zusätzen eluiert werden.
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Im Vergleich zu bekannten Reinigungsverfahren lässt sich die Reinigung sehr schnell durchführen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens lassen sich einzelne Fraktionen der Nukleinsäuren (Nucleotiden) stufenweise selektiv abtrennen.
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Im Vergleich zu dem Verfahren zur Abtrennung von Nukleinsäuren nach der
EP 1 608 752 B1 tritt keine Aggregation und Fällung der Nukleinsäuren ein, sondern die abgetrennten Nukleinsäuren werden an den säuregruppenfreie Kieselgel Partikel mit einem magnetischen Kern adsorbiert.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich Nukleinsäuren aus verschiedenen biologischen Prozessen reinigen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Reinigung der Nukleinsäuren aus dem durch Lyse von biologischen Zellen erhaltenen Zellinhaltsstoffe.
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Reinigung der Nukleinsäuren aus PCR Prozessen, beispielsweise durch Abtrennung von dNTPs, Primern, Enzymen, Farbstoff Terminatoren, Zusatzstoffen oder Salzen.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Reinigung der Nukleinsäuren zur Trennung von Fraktionen von Nukleinsäuren.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird an einem Adsorbens aus säuregruppenfreie Kieselgel Partikel mit einem magnetischen Kern und mit einer Porengröße im Bereich von 5 bis 50 nm, bevorzugt 5 bis 30 nm und einer inneren Oberfläche im Bereich von 0,1 bis 2000 m2/g, bevorzugt 10 bis 1000 m2/g, durchgeführt.
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Die Partikel haben im Allgemeinen einen Durchmesser im Bereich von 20 nm bis 500 μm, bevorzugt von 200 nm bis 10 μm, insbesondere bevorzugt von 500 nm bis 1,3 μm.
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Das Adsorbens aus säuregruppenfreie Kieselgel Partikel mit einem magnetischen Kern kann durch Beschichten von Eisenoxid enthaltende Partikel mit Kieselgel hergestellt.
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Die Beschichtung von Eisenoxid enthaltende Partikel mit Kieselgel ist an sich bekannt (J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62 bis 69; Langmuir 2005, 21, 10763 bis 10769; J. Colloid Interface Sci 2005, 283, 392 bis 396).
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Die Beschichtung von Eisenoxid enthaltende Partikel mit Kieselgel für das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Eine Suspension von Eisenoxid enthaltende Partikel in einem Alkohol (z. B. Isopropanol) wir unter starkem Rühren in Gegenwart von Ammoniak zur Beschichtung mit Tetraethylorthosilicat (TEOS) versetzt. Die Dicke der Beschichtung kann durch die Menge des zugegeben Tetraethylorthosilicat gesteuert werden.
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Die beschichteten Eisenoxid enthaltende Partikel werden mit einem Alkohol (z. B. Methanol) gewaschen und in Wasser gelagert.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren werden besonders säuregruppenfreien Kieselgel Partikel bevorzugt, die aus einer mesoporösen Schicht bestehen, die auf den magnetischen Kern aufgetragen ist und eine Schichtdicke im Bereich von 10 bis 100 nm aufweist.
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Magnetische Kerne für die erfindungsgenäßen säuregruppenfreien Kieselgel Partikel können an sich bekannte Partikel aus Eisenoxid (z. B. Fe2O3 und/oder Fe3O4) und Siliciumdioxid, Polystyrol und/oder Polyvinylalkohol sein.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren werden bevorzugt Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung eingesetzt, wie sie in Gegenwart von Polyethylenglykol als porogenes Mittel entsteht.
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Im Besonderen bevorzugt werden säuregruppenfreien Kieselgel Partikel, die aus einer mesoporösen Schicht bestehen, die auf den magnetischen Kern aufgetragen ist und eine Schichtdicke im Bereich von 10 bis 100 nm aufweist, wobei die magnetischen Kerne Maghemit und/oder Magnetit im Bereich von 30 bis 95 Gew.-% enthalten und einen mittleren Durchmesser im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen, wobei die Kieselgel Partikel einen mittleren Durchmesser im Bereich von 20 nm bis 500 μm, bevorzugt 200 nm bis 10 μm, im besonderen bevorzugt 300 nm bis 1,5 μm aufweisen.
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Pufferlösungen für das erfindungsgemäße Verfahren enthalten im Allgemeinen wässrige Lösungen von kosmotropen und chaotropen Salzen und Polyethylenglykol.
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Kosmotrope Ionen in wässrigen Lösungen von Salzen wirken als Fällungsmittel für Proteine und Nukleinsäuren. Sie verstärken hydrophobe Effekte und fördern dadurch und einen Aggregation und Fällung der Proteine und Nukleinsäuren über hydrophobe Wechselwirkungen.
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Chaotrope Ionen in wässrigen Lösungen von Salze vermindern hydrophobe Effekte und erhöhen dadurch die Löslichkeit von Proteinen und Nukleinsäuren in Wasser.
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Kosmotrope und chaotrope Ionen können in der sogenannten Hofmeister Reihe dargestellt werden.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung seien als kosmotrope Ionen beispielsweise Na+, Mg2+ und/oder SO4 2– und/oder Ca2+, Li+HPO4 2– genannt. Bevorzugte kosmotrope Ionen sind Na+, Mg2+ und SO4 2–.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung seien chaotrope Ionen wie beispielsweise K+, Cl– und NH4 +, Cs+ und NO3 – genannt. Bevorzugte chaotrope Ionen sind K+ und Cl–.
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Polyethylenglykol für das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 und 5 kDa, bevorzugt im Bereich von etwa 3 bis 5 kDa und besonders bevorzugt 4 bis 4,5 kDa haben.
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Wasser für das erfindungsgemäße Verfahren ist im Allgemeinen deionisiertes Wasser, das nicht das Enzym Desoxyribonuklease (DNase) enthält.
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Pufferlösung für das erfindungsgemäße Verfahren enthalten im Allgemeinen kosmotropen und chaotropen Salzen und Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 und 5 kDa in wässriger Lösung.
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Besonders bevorzugt ist ein mittleres Molekulargewicht des Polyethylenglykols im Bereich von 3 bis 5 kDa und in der Pufferlösung in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% vorliegt.
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In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Nukleinsäuren aus PCR Prozessen im Bereich von 80 bp und 30 kb gereinigt und aufgetrennt werden, wobei die Fraktionierung in Gegenwart einer wässrigen Zusatzpufferlösung erfolgt, die 0,1 bis 25 Gew.-% eines kosmotropen Salzes, 0,1 bis 20 Gew.-% % eines chaotropen Salzes, 10 bis 20 Gew.-% Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 und 5 kDa enthält, wobei die Summe der einzelnen Bestandteile 100% nicht übersteigt.
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Besonders bevorzugt ist hierbei, dass die Konzentration der kosmotropen und chaotropen Salze in der wässrigen Zusatzpufferlösung eine Konzentration von 2 M nicht übersteigt und die Fraktionierung durch einen Stufengradienten im Bereich von 0,1 bis 2 M erreicht wird.
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Nach der Adsorption der Nukleinsäuren wird im Allgemeinen das Adsorbat von genomischer Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Fraktionen von Desoxyribonukleinsäuren an säuregruppenfreie Kieselgel Partikel in an sich bekannter Weise, z. B: durch Filtration, aus der wässrigen Lösung abgetrennt.
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In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Adsorbat von genomischer Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Fraktionen von Desoxyribonukleinsäuren an säuregruppenfreie Kieselgel Partikel durch Anlegens ein magnetisches Feld aus der wässrigen Lösung abgetrennt werden.
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Hierfür werden die auf säuregruppenfreie Kieselgel Partikel mit einem magnetischen Kern adsorbierten Nukleinsäuren auf einem Magnetseparator abgetrennt und isoliert.
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Das isolierte Adsorbat kann gewaschen werden. Als Waschmedium nimmt man im Allgemeinen einen kurzkettigen aliphatischen Alkohol, wie Ethanol oder Isopropylalkohol.
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In dem folgenden Schritt werden die Nukleinsäuren von dem Adsorbat mit Hilfe eines Elutionspuffers abgetrennt.
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Elutionspuffer für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise wässrige Lösungen von (hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder DNase freies Wasser.
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In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die auf säuregruppenfreie Kieselgel Partikel mit einem magnetischen Kern adsorbierten Nukleinsäuren im Magnetfeld abgetrennt werden und gegebenfalls gewaschen werden und nachfolgend mit einem Elutionspuffer abgetrennt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Als Beispiel seien die folgenden bevorzugten Fälle genannt:
- • Reinigung der Nukleinsäuren aus dem durch Lyse von biologischen Zellen erhaltenen Zellinhaltsstoffe.
- • Reinigung der Nukleinsäuren aus PCR Prozessen, beispielsweise durch Abtrennung von dNTPs, Primern, Enzymen, Farbstoff Terminatoren, Zusatzstoffen oder Salzen.
- • Reinigung der Nukleinsäuren zur Trennung von Fraktionen von Nukleinsäuren.
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In der Regel werden durch das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren alle Nukleinsäuren aus den biologischen Prozessen abgetrennt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einzelne Fraktionen von Nukleinsäuren (Nukleotide) abzutrennen.
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Die Reinigung der Nukleinsäuren zur Trennung von Fraktionen von Nukleinsäuren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
An Hand eines Sequenzprotokolls erkennt man die Größenverteilung der einzelnen Nukleotide. Je nach Größe werden die Nukleotide in einzelne Fraktionen aufgeteilt.
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In einem ersten Schritt wird die Fraktion der größten Nukleotide abgetrennt. Hierzu wir das Gemisch der Nukleotide in dem Zusatzpuffer suspendiert und die betreffende Fraktion an den Kieselgel Partikel absorbiert. Die Abtrennung erfolgt mit Hilfe eines magnetischen Separators. Die Isolation der betreffenden Fraktion erfolgt durch Waschen der Partikel und Eluierung.
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Der Rückstand der Abtrennung im magnetischen Feld enthält Nukleotide, die kleiner sind als die größten Nukleotide. In gleicher Weise werden aus dem Rückstand Fraktionen kleinerer Nukleotide mit entsprechenden Zusatzpuffern abgetrennt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Mittel zur Reinigung von Nukleinsäuren und/oder Fraktionen der Nukleinsäuren aus biologischen Prozessen enthaltend
- • Pufferlösung von kosmotropen und chaotropen Salzen und Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 und 5 kDa
- • säuregruppenfreie Kieselgel Partikel mit einem magnetischen Kern und mit einer Porengröße im Bereich von 5 bis 50 nm und einer inneren Oberfläche im Bereich von 0,1 bis 2000 m2/g,
- • Zusatzpufferlösung,
die 0,1 bis 25 Gew.-% eines kosmotropen Salzes,
0,1 bis 20 Gew.-% eines chaotropen Salzes,
10 bis 20 Gew.-% Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von etwa 2 und 5 kDa enthält,
wobei die Summe der einzelnen Bestandteile 100% nicht übersteigt und
- • Elutionspuffer.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Nukleinsäuren haben eine Reinheit von größer als 90%, bevorzugt von größer als 95%, und besonders bevorzugt von größer als 99%.
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Beispiele:
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Beispiel 1
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Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung in Gegenwart von Polyethylenglykol
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10 ml Eisenoxidpartikel (e. g. MagSi-S beads von Firma MagnaMedics) mit einer Konzentration von 20 mg/ml werden in einem Magnetfeld abgetrennt und dann in 30 ml Polyethylenglykol (mittleres Molekulargewicht 400) 10 ml Isopropanol und 2 ml Wasser unter starkem Rühren dispergiert. Zu dieser Mischung gibt man 2 ml einer 25 Gew.-% Ammoniaklösung und 0,75 ml Tetra ethyl orthosilicat (TEOS). Die Beschichtung erfolgt innerhalb von 6 Stunden unter gleichmäßigem Rühren.
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Die beschichteten Eisenoxid enthaltende Partikel werden mit 40 ml Wasser gewaschen. Die Endkonzentration an säuregruppenfreie Kieselgel Partikel beträgt 20 mg/ml.
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Beispiel 2
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Reinigung eines PCR Produkts von Salzen, Enzymen, Nucleotiden und Primern
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10 μl Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung nach Beispiel 1 mit einer inneren Oberfläche von 20 m2/g werden zu 20 μl PCR Probe gegeben.
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Hierzu gibt man 30 μL einer Pufferlösung (20 Gew.-% PEG 4000 NaCl 0.5 M KCl 0.5 M MgCl2 0.1 M) unter Schütteln und lässt die Probe auf Raumtemperatur kommen.
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Die erhaltene Probe wird in einen magnetische Separator gegeben und die magnetischen Partikel entfernt, Der Überstand wird abgetrennt.
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Die magnetischen Partikel mit adsorbierter DNA werden mit 100 μL 70 v/v% Ethanol zweimal gewaschen.
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Die magnetischen Partikel werden aus der Waschlösung wieder mit dem magnetischen Separator entfernt und der Waschvorgang 4 bis 5 mal wiederholt.
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Die magnetischen Partikel mit der adsorbierten DNA werden an der Luft getrocknet.
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Die Isolierung der DNA Fragmente erfolgt mit einem Elutionspuffer, 40 μl (Dnase free water or DNase free 0,1 M Tris/HCl, pH 6,4) durch Schütteln der Probe.
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Die eluierten magnetischen Partikel werden wieder in einem magnetischen Separator abgetrennt. Die überstehende Lösung enthält die gereinigte DNA.
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Beispiel 3
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DNA Reinigung
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PCR wird nach Beispiel 2 gereinigt.
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Ein nach DNA Base readout erstelltes Sequenzprotokoll zeigt eine Reinheit der DNA von 95%.
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Beispiel 4
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An Hand eines Sequenzprotokolls erkennt man die Größenverteilung der einzelnen Nukleotide. Je nach Größe werden die Nukleotide in einzelne Fraktionen aufgeteilt. Gemäß dem vorliegenden Beispiel erhält man die folgenden 3 Fraktionen:
300 bis 800 bp
300 bis 500 bp und
150 bis 300 bp
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Außer der Isolierung der einzelnen Fraktionen der Nukleotide werden auch Nebenprodukte des Herstellungsprozesses (z. B. Enzyme, Salze und Pufferlösungen) abgetrennt.
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Beispiel 5
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Isolierung Nukleotid Fraktionen im Bereich von 150 bis 300 bp
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In einem ersten Schritt wird die Fraktion der größten Nukleotide (größer als 300 bp) abgetrennt.
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In einem Probenrohr werden 100 μl DNA Fragmente, 20 μl Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung nach Beispiel 1 mit einer inneren Oberfläche von 20 m2/g und 72 μl eines Zusatzpuffers (20% PEG 4000 NaCl 0.1 M KCl 0.1 M MgCl2 0.1 M) unter Schütteln gegeben und lässt die Probe auf Raumtemperatur kommen.
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Alle DNA Fragmente, die größer als 300 bp sind werden auf den Partikeln absorbiert. Der Rest der Fragmente (kleiner als 300 bp) bleiben in Lösung.
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Die erhaltene Probe wird in einen magnetische Separator gegeben und die magnetischen Partikel entfernt. Der Überstand wird abgetrennt.
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Um eine größere Reinigung zu erhalten, wird der erste Schritt wiederholt.
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In dem nächsten Schritt werden 150 μl des Überstands mit 82,8 μl des Zusatzpuffers (20% PEG 4000 NaCl 0.1 M KCl 0.1 M MgCl2 0.1 M) und 20 μl der magnetischen Partikel unter Schütteln gemischt; dann lässt die Probe auf Raumtemperatur kommen.
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Alle DNA Fragmente die größer als 150 bp sind, werden auf dan magnetischen Partikeln adsorbiert. Der Rest der Fragmente (kleiner als 150 bp) bleiben in Lösung und wird verworfen.
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Die erhaltene Proben aus beiden Abtrennungschritten (einschließlich der Wiederholung) werden in einen magnetische Separator gegeben und die magnetischen Partikel entfernt. Der Überstand wird abgetrennt.
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Die magnetischen Partikel mit adsorbierter DNA werden mit 100 μL 70 v/v% Ethanol zweimal gewaschen.
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Die magnetischen Partikel werden aus der Waschlösung wieder mit dem magnetischen Separator entfernt und der Waschvorgang 4 bis 5 mal wiederholt.
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Die magnetischen Partikel mit der adsorbierten DNA werden an der Luft getrocknet.
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Die Isolierung der DNA Fragmente erfolgt mit einem Elutionspuffer, 40 μl (Dnase free water or DNase free 0,1 M Tris/HCl, pH 6,4) durch Schütteln der Probe.
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Die eluierten magnetischen Partikel aus den Reinigungsschritten werden jeweils wieder in einem magnetischen Separator abgetrennt. Die überstehende Lösung enthält die gereinigte DNA aufgetrennt nach den einzelnen Fraktionen.
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Beispiel 6
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Isolierung Nukleotid Fraktionen im Bereich von 300 bis 500 bp
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In einem ersten Schritt wird die Fraktion der größten Nukleotide (größer als 500 bp) abgetrennt.
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In einem Probenrohr werden 100 μl DNA Fragmente, 20 μl Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung nach Beispiel 1 mit einer inneren Oberfläche von 20 m2/g und 72 μl eines Zusatzpuffers (20% PEG 4000 NaCl 0.1 M KCl 0.1 M MgCl2 0.1 M) unter Schütteln gegeben und lässt die Probe auf Raumtemperatur kommen.
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Alle DNA Fragmente, die größer als 500 bp sind werden auf den Partikeln absorbiert. Der Rest der Fragmente (kleiner als 500 bp) bleiben in Lösung.
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Die erhaltene Probe wird in einen magnetischen Separator gegeben und die magnetischen Partikel entfernt. Der Überstand wird abgetrennt.
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Um eine größere Reinigung zu erhalten, wird der erste Schritt wiederholt.
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In dem nächsten Schritt werden 150 μl des Überstands mit 82,8 μl des Zusatzpuffers (20% PEG 4000 NaCl 0.1 M KCl 0.1 M MgCl2 0.1 M) und 20 μl der magnetischen Partikel unter Schütteln gemischt; dann lässt die Probe auf Raumtemperatur kommen.
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Alle DNA Fragmente die größer als 300 bp sind, werden auf dan magnetischen Partikeln adsorbiert. Der Rest der Fragmente (kleiner als 300 bp) bleiben in Lösung und wird verworfen.
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Die erhaltene Proben aus beiden Abtrennungschritten (einschließlich der Wiederholung) werden in einen magnetische Separator gegeben und die magnetischen Partikel entfernt. Der Überstand wird abgetrennt.
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Die magnetischen Partikel mit adsorbierter DNA werden mit 100 μL 70 v/v% Ethanol zweimal gewaschen.
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Die magnetischen Partikel werden aus der Waschlösung wieder mit dem magnetischen Separator entfernt und der Waschvorgang 4 bis 5 mal wiederholt.
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Die magnetischen Partikel mit der adsorbierten DNA werden an der Luft getrocknet.
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Die Isolierung der DNA Fragmente erfolgt mit einem Elutionspuffer, 40 μl (Dnase free water or DNase free 0,1 M Tris/HCl, pH 6,4) durch Schütteln der Probe.
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Die eluierten magnetischen Partikel aus den Reinigungsschritten werden jeweils wieder in einem magnetischen Separator abgetrennt. Die überstehende Lösung enthält die gereinigte DNA aufgetrennt nach den einzelnen Fraktionen.
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Beispiel 7
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Isolierung Nukleotid Fraktionen im Bereich von 300 bis 800 bp
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In einem ersten Schritt wird die Fraktion der größten Nukleotide (größer als 800 bp) abgetrennt.
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In einem Probenrohr werden 100 μl DNA Fragmente, 20 μl Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung nach Beispiel 1 mit einer inneren Oberfläche von 20 m2/g und 72 μl eines Zusatzpuffers (20% PEG 4000 NaCl 0.1 M KCl 0.1 M MgCl2 0.1 M) unter Schütteln gegeben und lässt die Probe auf Raumtemperatur kommen.
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Alle DNA Fragmente, die größer als 800 bp sind werden auf den Partikeln absorbiert. Der Rest der Fragmente (kleiner als 800 bp) bleiben in Lösung.
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Die erhaltene Probe wird in einen magnetischen Separator gegeben und die magnetischen Partikel entfernt. Der Überstand wird abgetrennt.
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Um eine größere Reinigung zu erhalten, wird der erste Schritt wiederholt.
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In dem nächsten Schritt werden 150 μl des Überstands mit 82,8 μl des Zusatzpuffers (20% PEG 4000 NaCl 0.1 M KCl 0.1 M MgCl2 0.1 M) und 20 μl der magnetischen Partikel unter Schütteln gemischt; dann lässt die Probe auf Raumtemperatur kommen.
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Alle DNA Fragmente die größer als 800 bp sind, werden auf dan magnetischen Partikeln adsorbiert. Der Rest der Fragmente (kleiner als 800 bp) bleiben in Lösung und wird verworfen.
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Die erhaltenen Proben aus beiden Abtrennungschritten (einschließlich der Wiederholung) werden in einen magnetischen Separator gegeben und die magnetischen Partikel entfernt. Der Überstand wird abgetrennt.
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Die magnetischen Partikel mit adsorbierter DNA werden mit 100 μL 70 v/v% Ethanol zweimal gewaschen.
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Die magnetischen Partikel werden aus der Waschlösung wieder mit dem magnetischen Separator entfernt und der Waschvorgang 4 bis 5 mal wiederholt.
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Die magnetischen Partikel mit der adsorbierten DNA werden an der Luft getrocknet.
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Die Isolierung der DNA Fragmente erfolgt mit einem Elutionspuffer, 40 μl (Dnase free water or DNase free 0,1 M Tris/HCl, pH 6,4) durch Schütteln der Probe.
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Die eluierten magnetischen Partikel aus den Reinigungsschritten werden jeweils wieder in einem magnetischen Separator abgetrennt. Die überstehende Lösung enthält die gereinigte DNA aufgetrennt nach den einzelnen Fraktionen.