DE102010031404A1

DE102010031404A1 - Verfahren zur schnellen Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben

Info

Publication number: DE102010031404A1
Application number: DE201010031404
Authority: DE
Inventors: Dr. Hillebrand Timo
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-01-19
Also published as: WO2012007582A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass flüssige biologische Proben mit magnetischen Partikeln versetzt und anschließend diese magnetischen Partikel mit daran adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe entfernt, gewaschen und anschließend lysiert werden und nach der Lyse die Inhaltsstoffe der Bakterien, Zellen oder Viren im Lysat vorliegen.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein universelles und stark vereinfachtes Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen wie Nukleinsäuren oder Proteinen aus biologischen Proben, insbesondere aus Viren, Bakterien oder biologischen Zellen.
Stand der Technik
Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning").
Diese ”klassischen Verfahren” zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.
Die klassische Methodik der Isolierung von Nukleinsäuren wurde in den zurückliegenden Jahren deutlich verbessert. Die „neuen” Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung einer zu isolierende DNA-Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst.
Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet (Marko, M. A., Chipperfield, R. und Birnboim, H. G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382–387).
Darüber hinaus existieren heute weltweit auch eine Vielzahl von Reagenziensystemen, vor allem zur Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen und für die Isolierung von Plasmid-DNA aus bakteriellen Lysaten, aber auch für die Isolierung von längerkettigen Nukleinsäuren (genomische DNA, zelluläre Gesamt-RNA) aus Blut, Geweben oder auch Zellkulturen etc.
Alle diese kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher Salze und alkoholische Komponenten und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z. B. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele (Diagen, DE 41 39 664 A1 ), Glasfasermaterialien in Filterkartuschen oder unterschiedlichste magnetische oder paramagnetische feste Materialien.
Auch hierbei laufen die Extraktionsprozesse prinzipiell nach folgendem Schema ab.

1. Lyse der Probe und Freisetzung der Nukleinsäuren
2. Optional Zugabe eines Bindungspuffers und Inkontaktbringen der lysierten Probe mit einer Nukleinsäure bindenden festen Phase
3. Waschen der an der festen Phase gebundenen Nukleinsäuren
4. Trocknung der festen Phase
5. Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren mit Wasser oder einem Niedrig salzpuffer

Diese Verfahrensabläufe sind gut optimiert und erlauben die Isolierung hochreiner DNA oder RNA aus beliebigen Nukleinsäuren enthaltenden Proben. Allerdings sind diese Verfahren ggf. doch recht zeitaufwendig und oftmals nicht preiswert.
Alternative Methoden zur klassischen Isolierung von Nukleinsäure sind sogenannten „quick-and-dirty”-Verfahren. Hierbei wird eine Nukleinsäure enthaltende biologische Probe mit einfachen Lysereagenzien aufgeschlossen und die freigesetzte Nukleinsäure direkt für downstream-Applikationen eingesetzt. In anderen Verfahren kombiniert man das Lysereagenz noch mit einem Neutralisierungspuffer, d. h. man lysiert die Probe und mischt das Lysat mit einem Neutralisierungsreagenz und nutzt dann ein sehr geringes Volumen für eine downstream-Anwendung (z. B. PCR). Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im internationalen Schrifttum auch häufig publiziert (Laboratory Animals (2004) 38, 413–417; Poultry Science (2007) 86, 102–106; Biochem. Genet. (2008) 46, 105–112; PNAS (2002) 99, 8, 5261–5266). Diese „Schnellverfahren” haben aber einen ganz gravierenden Nachteil. Es können nur geringe Mengen an Ausgangsprobe eingesetzt werden, da die inhibitorischen Effekte der Probenmatrizes sich negative auf downstream-Anwendungen auswirken (z. B. Bereitstellung von DNA aus einer Blutprobe). Dies wirkt sich insbesondere auf die Sensitivität der Nachweisreaktion aus. Darüber realisieren diese Verfahren auch nicht immer eine positive Anwendung. Wenn zu viele Inhibitoren in der Probe enthalten sind, dann kann z. B. eine PCR-Reaktion nicht durchgeführt werden.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung war es, die Nachteile der im Stand der Technik beschrieben Lösungen zu beseitigen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen wie Nukleinsäuren oder Proteinen aus biologischen Proben, insbesondere aus Zellen, Viren oder Bakterien, entwickelt, das sich wie die beschriebenen „Schnellverfahren” ganz einfach durchführen lässt, aber die bekannten Nachteile aufhebt, d. h. das die eingesetzte Menge an Probe deutlich erhöht werden kann und dass Inhibitoren nicht mehr in der Probe enthalten sind.
Die vorliegende Erfindung löst die Problemstellung dabei in einer überraschenden Weise. Zufällige experimentelle Beobachtungen zeigten überraschenderweise, dass die Verwendung von einfachen paramagnetischen oder magnetischen Partikeln (Beads, z. B. Beads aus Eisenoxyd mit OH-Funktionalisierung), die routinemäßig für die Isolierung von Nukleinsäuren nach den bekannten und ausführlich beschriebenen Verfahrensabläufen eingesetzt werden, noch andere Eigenschaften besitzen.
Obwohl diese Beads keine Antikörper auf der Oberfläche besitzen, binden sie überraschenderweise hocheffizient Biomoleküle (eukaryotische Zellen, Bakterien, Viren), aber keine freien Proteine. Es zeigt sich, dass die Inkubation einer diesbezüglichen Beads-Lösung mit einer Zellsuspension von NIH 3T3 Zellen dazu führt, dass alle Zellen der Suspension an die Beads adsorbierten. Dieses Phänomen lies sich auch bei der unspezifischen Adsorption von Bakterien oder Viren beobachten.
Entsprechend der Zielstellung der vorliegenden Erfindung konnte ein völlig neuartiges Verfahren entwickelt werden, welches es erlaubt, schnell und einfach und unter Umgehung der für die sog. „quick-and-dirty”-Verfahren bekannten Nachteile und Limitationen Nukleinsäuren aus unterschiedlichsten Proben bereitzustellen. Das Verfahren realisiert sich wie folgt:

1. Inkubation einer Probe mit magnetischen oder paramagnetischen Beads (z. B. OH-funktionalisiertes Eisenoxyd); dieser Schritt dient der Adsorption der Biomoleküle an die Beads
2. Entfernen der Probe und Waschen der Beads mit Wasser (bei diesem Schritt werden die inhibitorischen Komponenten der Probe effizient entfernt, wogegen die Biomoleküle an den Beads verbleiben)
3. Resuspendieren der Beads mit einem an sich bekannten Lysereagenz (z. B. 25 mM NaOH) und Inkubation bei 50°C–95°C.

In einer bevorzugten Variante liegt das Lysereagenz schon in einer lagerstabilen festen Form in einem Reaktionsgefäß vor. Die Bedas werden in diesem Falle mit einem definierten Volumen an Wasser resuspendiert und in das Reaktionsgefäß mit dem festen Lysereagenz überführt.

4. Nach Lyse werden die Beads mittels eines Magneten abgetrennt und der die freigesetzten Inhaltsstoffe enthaltende klare Überstand wird nachfolgend mit einer Neutralisierungslösung gemischt (z. B. 40 mM Tris HCl; pH 6).

In einer bevorzugten Variante liegt auch das Neutralisierungsreagenz schon in einer lagerstabilen festen Form in einem Reaktionsgefäß vor. Der klare Überstand von Schritt 3 wird dann auch in diesem Falle in das Reaktionsgefäß mit dem festen Neutralisierungsreagenz überführt.
Nach kurzer Inkubation (5 min) wird die Lösung direkt für z. B. eine PCR-Reaktion eingesetzt.
In einer noch einfacheren Ausführungsvariante erfolgt die Freisetzung der Inhaltsstoffe aus den an den Beads adsorbierten Biomolekülen einfach durch erhitzen (Kochlyse). Bei diesem Verfahren kann vollständig auf Lysereagenzien und ggf. Neutralisierungsreagenzien verzichtet werden.
Das noch einfachere Verfahren realisiert sich wie folgt:

1. Inkubation einer Probe mit magnetischen oder paramagnetischen Beads (z. B. OH-funktionalisiertes Eisenoxyd); dieser Schritt dient der Adsorption der Biomoleküle an die Beads
2. Entfernen der Probe und Waschen der Beads mit Wasser (bei diesem Schritt werden die inhibitorischen Komponenten der Probe effizient entfernt, wogegen die Biomoleküle an den Beads verbleiben)
3. Resuspendieren der Beads in Wasser und Freisetzung der Inhaltsstoffe durch nachfolgende Inkubation bei z. B. 95°C für 5 min
4. Nach Lyse werden die Beads mittels eines Magneten abgetrennt und der die freigesetzten Inhaltsstoffe enthaltende klare Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und kann jetzt direkt für downstream-Anwendungen eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren in seinen unterschiedlichen Ausführungsvarianten ist extrem schnell und einfach und umgeht die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik, da durch das Adsorbieren von Zellen, Bakterien oder Viren an die Beads in den nachfolgenden Waschschritten alle Inhibitoren (letztlich die gesamte Probenmatrix) effizient entfernt werden. Im Gegensatz zu den beschriebenen „quick-and-dirty”-Verfahren verschleppt man die Probe nicht bis zur geplanten downstream-Anwendung. Damit können dann auch sehr viel größere Probenmengen (z. B. 1 ml Vollblut, Urin etc.) eingesetzt werden, als dies bisher mit diesen Verfahren möglich war. Damit verbunden kann eine deutliche Sensitivitätserhöhung erreicht werden. Auch das Anwendungsspektrum in Bezug auf die zu untersuchende Probe ist quasi nicht limitiert. Ein weiterer Vorteil besteht auch darin, dass man für das Verfahren keinerlei Zentrifugationsschritte benötigt und die notwendigen Reagenzien völlig unproblematisch sind. Dies ermöglicht es, dass das Verfahren auch ideal für die Untersuchung von Proben unter Feldbedingungen eingesetzt werden kann.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1:
Bereitstellung amplifizierbarer bakterieller Nukleinsäure aus einer wässrigen Lösung
Jeweils ca. 500, 50 und 5 Salmonellen wurden in 1.0 ml Wasser gespiked. Die Bereitstellung der bakteriellen Nukleinsäure realisiert sich wie folgt.
Zur Probe erfolgte die Zugabe von 5 μl einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-Funktionalisierung; Menge ca. 1.5 mg). Die Probe wurde kurz gevortext und nachfolgend für 30 min auf einem Schüttler inkubiert. Nach Inkubation erfolgte eine Separation der Beads an die Wand des Reaktionsgefäßes mittels eines Magneten.
Der Überstand wurde verworfen und die Beads mit 800 μl Wasser gewaschen.
Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der Waschschritt wiederholt. Danach wurden die Beads in 80 μl Wasser resuspendiert und der gesamte Ansatz in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieses Reaktionsgefäß enthielt in eingetrockneter fester Form ein Lysereagenz (Herstellung des lagerstabilen Lysereagenzes durch Eintrocknen von 8 μl einer 250 mM NaOH-Lösung).
Nach Zugabe der Beads in das Reaktionsgefäß wurde der Ansatz für 15 min bei 70°C und nachfolgend bei 95°C für 5 min inkubiert. Dies führte zur Freisetzung der Nukleinsäuren aus den an den Beads adsorbierten Bakterien. Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der die Nukleinsäure enthaltende klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieses Reaktionsgefäß enthielt in eingetrockneter fester Form ein Neutralisierungsreagenz (Herstellung des lagerstabilen Neutralisierungsreagenzes durch Eintrocknen von 8 μl einer 400 mM Lösung aus Tris HCl; pH 6). Nach der Zugabe des klaren Überstandes in das Reaktionsgefäß wurde der Ansatz für ca. 5 min inkubiert. Dies führte zum Auflösen des festen Neutralisierungsreagenz und damit zur Neutralisierungsreaktion. Nachfolgend wurde die so bereitgestellte Nukleinsäure in einer Real Time-PCR auf ihre Amplifizierbarkeit zum Nachweis einer Salmonellen-spezifischen DNA getestet. Die gemessenen CT-Werte sind nachfolgend aufgeführt. Wie zu sehen ist, konnte mit dem Verfahren ein Salmonellennachweis aus der Probe durchgeführt werden. Dabei zeigt sich die enorme Sensitivität. Es war möglich, 50 Kopien in einer wässrigen Probe von 1 ml eindeutig nachzuweisen. Tabelle 1 zeigt die CT-Werte der durchgeführten Salmonellen-spezifischen RealTime-PCR Reaktion

Probe Anzahl Salmonellen CT-Wert

1 Ca. 500 30,2

2 Ca. 500 30,6

3 Ca. 50 33,3

4 Ca. 50 33,7

5 Ca. 5 39,6

6 Ca. 5 40,8
Ausführungsbeispiel 2:
Bereitstellung amplifizierbarer Nukleinsäure aus unterschiedlichen Volumen an Vollblutproben
Jeweils 10 μl, 50 μl, 200 μl sowie 500 μl Vollblut wurden in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt, mit 1 ml Wasser versetzt, kurz gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Nachfolgend wurden 5 μl einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-Funktionalisierung; Menge ca. 1.5 mg) zu den Proben gegeben und die Proben kurz gevortext und nachfolgend für 5 min inkubiert. Nach Inkubation erfolgte eine Separation der Beads an die Wand des Reaktionsgefäßes mittels eines Magneten.
Der Überstand wurde verworfen und die Beads mit 800 μl Wasser gewaschen.
Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der Waschschritt zweimal wiederholt. Danach wurden die Beads in 100 μl Wasser (bei den 10 μl und 50 μl Vollblutproben) bzw. 200 μl Wasser (bei den 10 μl und 50 μl Vollblutproben) resuspendiert und der gesamte Ansatz bei 95°C für 5 min und unter Schütteln inkubiert. Dies führte zur Freisetzung der Nukleinsäuren aus den an den Beads adsorbierten Zellen. Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der die Nukleinsäure enthaltende klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
Nachfolgend wurde die so bereitgestellte Nukleinsäure in einer PCR-Reaktion (1 μl) auf ihre Amplifizierbarkeit getestet. Amplifiziert wurde ein humanes Targetgen (GAPDH) unter Standard-PCR-Bedingungen. Die Amplifikate wurden nachfolgend auf einem Agarosegel analysiert. Wie zu sehen ist, konnte mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens schnell und absolut einfach amplifizierbare Nukleinsäure isoliert werden. Selbst aus Vollblutproben von 500 μl konnte mittels der erfindungsgemäßen Methode Nukleinsäure bereitgestellt werden, die absolut frei von Inhibitoren ist. Das gesamte Verfahren war in 15 min beendet, wobei die eigentliche „hands-on-time” noch viel kürzer war.
1 zeigt den Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure (GAPDH) auf einem Agarosegel
Die einzelnen Proben in 1 zeigen:
1 – DNA Leiter
2 + 3 – DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 10 μl Vollblut
4 + 5 – DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 50 μl Vollblut
6 + 7 – DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 200 μl Vollblut
8 + 9 – DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 500 μl Vollblut
10 – PCR Negativkontrolle
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 4139664 A1 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., 1989, CSH, ”Molecular Cloning” [0002]
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619 [0004]
Marko, M. A., Chipperfield, R. und Birnboim, H. G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382–387 [0005]
Laboratory Animals (2004) 38, 413–417 [0010]
Poultry Science (2007) 86, 102–106 [0010]
Biochem. Genet. (2008) 46, 105–112 [0010]
PNAS (2002) 99, 8, 5261–5266 [0010]

Claims

Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass flüssige biologische Proben mit magnetischen Partikeln versetzt und anschließend diese magnetischen Partikel mit daran adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe entfernt, gewaschen und anschließend lysiert werden und nach der Lyse die Inhaltsstoffe der Bakterien, Zellen oder Viren im Lysat vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse der adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren entweder mittels bekannter Lyse-Reagenzien oder durch Erhitzen (Kochlyse) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Lyse die magnetischen Partikel aus dem Lysat entfernt werden und das Lysat neutralisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Inhaltsstoffen der Bakterien, Zellen oder Viren um Nukleinsäuren oder Proteine handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den magnetischen Partikeln um a) silicatische Magnetpartikel oder b) Partikel aus Eisenoxid handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Eisenoxid-Partikeln um nichtfunktionalisierte oder funktionalisierte Eisenoxid-Partikel, vorzugsweise OH- oder COO-funktionalisierte, handelt
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Eisenoxid-Partikel eine Größe von 10 nm bis 5 μm, vorzugsweise von 50 nm bis 1 μm, besonders bevorzugt von 100 bis 300 nm, aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen eukaryotische oder prokaryotische Zellen sind.
Verfahren nach einem der, Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Inkubation einer Probe mit magnetischen oder paramagnetischen Partikeln zur Adsorption der Bakterien, Zellen oder Viren an die Partikel b) Entfernen der Probe und Waschen der Partikel mit Wasser zur Entfernung der inhibitorischen Komponenten, wogegen die Bakterien, Zellen oder Viren an den Partikeln verbleiben c) Resuspendieren der Partikel mit einem an sich bekannten Lysereagenz und Inkubation bei 50°C–95°C. d) Entfernen der Partikel mittels eines Magneten, wobei die freigesetzten Inhaltsstoffe im klaren Überstand enthalten sind wird Zusatz einer Neutralisierungslösung.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Resuspendieren der Partikel nicht mit einem Lysereagenz, sondern in Wasser erfolgt und Freisetzung der Inhaltsstoffe durch nachfolgende Inkubation bei z. B. für mindestens 3 min bei mindestens 90°C erfolgt
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Proben Blut, Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Wasser, Urin, Stuhlproben, Zellkultur-Supensionen, Kultivierungsmedien oder Kultivierungsmedien aus Stomacher-Beuteln der Lebensmitteldiagnostik darstellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse- und/oder und Neutralisierungsreagenzien als lagerstabile Komponenten in einer Reaktionskavität vorliegen und durch die Zugabe einer wässrigen Lösung aktiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsvolumen beliebig ist.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 als „One-Tube-Verfahren” oder „Walk-Away-Prozess”.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Vorbereitung von downstream-Anwendungen der bereitgestellten Inhaltsstoffe, insbesondere einer PCR oder RealTime-PCR.