WO2012007582A1 - Verfahren zur schnellen bereitstellung von inhaltsstoffen aus biologischen proben - Google Patents

Verfahren zur schnellen bereitstellung von inhaltsstoffen aus biologischen proben Download PDF

Info

Publication number
WO2012007582A1
WO2012007582A1 PCT/EP2011/062162 EP2011062162W WO2012007582A1 WO 2012007582 A1 WO2012007582 A1 WO 2012007582A1 EP 2011062162 W EP2011062162 W EP 2011062162W WO 2012007582 A1 WO2012007582 A1 WO 2012007582A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
particles
cells
lysis
viruses
bacteria
Prior art date
Application number
PCT/EP2011/062162
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Original Assignee
Aj Innuscreen Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aj Innuscreen Gmbh filed Critical Aj Innuscreen Gmbh
Publication of WO2012007582A1 publication Critical patent/WO2012007582A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the invention relates to a universal and highly simplified method for providing ingredients such as nucleic acids or proteins from biological samples, in particular from viruses, bacteria or biological cells.
  • nucleic acid-containing starting materials under strongly denaturing and reducing conditions, partially digested using protein-degrading enzymes, the exiting nucleic acid fractions purified by phenol / chloroform extraction steps and the nucleic acids are obtained from the aqueous phase by dialysis or ethanol precipitation (Sambrook, J., Fritsch, EF and Manitis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning").
  • kits are based on the well-known principle of binding of nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different salts and alcoholic components and use as support materials suspensions of finely ground glass powder (eg Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), Diatomaceous earth (Fa. Sigma) or silica gel (Diagen, DE 41 39 664 AI), glass fiber materials in filter cartridges or a variety of magnetic or paramagnetic solid materials.
  • finely ground glass powder eg Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA
  • Diatomaceous earth Fe. Sigma
  • silica gel Diagen, DE 41 39 664 AI
  • the object of the invention was to eliminate the disadvantages of the solutions described in the prior art.
  • a method for providing ingredients such as nucleic acids or proteins from biological samples, in particular from cells, viruses or bacteria has been developed, which can easily be carried out as described "rapid method", but eliminates the known disadvantages, ie the amount of sample used can be increased significantly and that inhibitors are no longer contained in the sample.
  • the present invention solves the problem in a surprising manner. Random experimental observations have surprisingly revealed that the use of simple paramagnetic or magnetic particles (beads, e.g., OH-functionalized beads of iron oxide) routinely employed for the isolation of nucleic acids according to the known and well-described procedures have still other properties.
  • simple paramagnetic or magnetic particles beads, e.g., OH-functionalized beads of iron oxide
  • these beads do not have any antibodies on the surface, they surprisingly bind biomolecules (eukaryotic cells, bacteria, viruses) in a highly efficient manner, but they do not bind ne free proteins. It turns out that the incubation of a corresponding bead solution with a cell suspension of NIH 3T3 cells results in all cells of the suspension adsorbing to the beads. This phenomenon has also been observed in the nonspecific adsorption of bacteria or viruses.
  • the lysis reagent is already present in a storage-stable solid form in a reaction vessel.
  • the Bedas are resuspended in this case with a defined volume of water and transferred to the reaction vessel with the solid lysis reagent.
  • the beads are separated by means of a magnet and the clear supernatant containing the released ingredients is subsequently mixed with a neutralization solution (e.g., 40 mM Tris HCl, pH 6).
  • a neutralization solution e.g., 40 mM Tris HCl, pH 6
  • the neutralization reagent is also already present in a storage-stable solid form in a reaction vessel.
  • the clear supernatant from step 3 is then transferred in this case in the reaction vessel with the solid neutralizing reagent.
  • the solution is directly for example, a PCR reaction used.
  • the release of the ingredients from the biomolecules adsorbed on the beads is carried out simply by heating (boiling lysis).
  • This method can be completely dispensed with lysing reagents and neutralizing reagents if necessary.
  • the beads are separated by means of a magnet and the clear supernatant containing the liberated ingredients is transferred to a new reaction vessel and can now be used directly for downstream applications.
  • the inventive method in its different embodiments is extremely fast and easy and circumvents the disadvantages of the prior art described, since by adsorbing cells, bacteria or viruses to the beads in the subsequent washing steps all inhibitors (ultimately the entire sample matrix) be removed efficiently.
  • the sample is not carried off until the planned downstream application, which means that much larger sample volumes (eg 1 ml whole blood, urine, etc.) can be used than before.
  • sample volumes eg 1 ml whole blood, urine, etc.
  • the range of applications with regard to the sample to be investigated is virtually unlimited, and another advantage is that no centrifugation steps are required for the process and the necessary reagents are completely eliminated unproblematic are table. This allows the process to also be used ideally for the investigation of samples under field conditions.
  • Embodiments Embodiment 1 Embodiments Embodiment 1
  • the provision of the bacterial nucleic acid is realized as follows.
  • a bead suspension iron oxide particles with OH-functionalization, amount about 1.5 mg.
  • the sample was vortexed briefly and then incubated for 30 min on a shaker. After incubation, the beads were separated on the wall of the reaction vessel by means of a magnet.
  • the supernatant was discarded and the beads washed with 800 ⁇ water.
  • the beads were again separated by means of a magnet and the washing step repeated. Thereafter, the beads were resuspended in 80 ⁇ water and the entire batch transferred to a new reaction vessel.
  • This reaction vessel contained in a dried solid form a lysis reagent (preparation of the storage-stable lysis reagent by drying 8 ⁇ of a 250 mM NaOH solution).
  • the mixture was incubated for 15 min at 70 ° C and then at 95 ° C for 5 min. This resulted in the release of the nucleic acids from the bacteria adsorbed on the beads.
  • the beads were again separated by means of a magnet and the nucleic acid-containing clear supernatant was transferred to a new reaction vessel.
  • This reaction vessel contained a neutralization reagent in dried solid form (preparation of the storage-stable neutralization reagent by drying 8 ⁇ M of a 400 mM solution of Tris HCl, pH 6). After the addition of the clear supernatant into the reaction vessel, the mixture was incubated for about 5 minutes.
  • the nucleic acid thus prepared was tested in a real-time PCR for its amphifiability for the detection of Salmonella-specific DNA.
  • the measured CT values are below listed.
  • the method was used to detect salmonella from the sample. This shows the enormous sensitivity. It was possible to clearly detect 50 copies in an aqueous sample of 1 ml.
  • Table 1 shows the CT values of the performed Salmonella-specific RealTime PCR reaction
  • Embodiment 2 is a diagrammatic representation of Embodiment 1:
  • the supernatant was discarded and the beads washed with 800 ⁇ water.
  • the beads were again separated by means of a magnet and the washing step repeated twice. Thereafter, the beads were resuspended in 100 ⁇ water (for the 10 ⁇ and 50 ⁇ whole blood samples) or 200 ⁇ water (for the 10 ⁇ and 50 ⁇ whole blood samples) and the entire batch was incubated at 95 ° C for 5 min and with shaking. This resulted in the release of the nucleic acids from the cells adsorbed on the beads.
  • the beads were again separated by means of a magnet and the nucleic acid-containing clear supernatant was transferred to a new reaction vessel. Subsequently, the thus prepared nucleic acid in a PCR reaction (1 ⁇ ) was tested for their amplifiability.
  • a human target gene (GAPDH) was amplified under standard PCR conditions. The amplicons were subsequently analyzed on an agarose gel. As can be seen, it was possible to isolate rapidly and absolutely easily amplifiable nucleic acid by means of the method according to the invention. Even from whole blood samples of 500 ⁇ could be provided by the method according to the invention nucleic acid, which is absolutely free of inhibitors. The entire process was completed in 15 minutes, whereby the actual "hands-on-time" was much shorter.
  • FIG. 1 shows the detection of the amplified nucleic acid (GAPDH) on an agarose gel

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass flüssige biologische Proben mit magnetischen Partikeln versetzt und anschließend diese magnetischen Partikel mit daran adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe entfernt, gewaschen und anschließend lysiert werden und nach der Lyse die Inhaltsstoffe der Bakterien, Zellen oder Viren im Lysat vorliegen.

Description

VERFAHREN ZUR SCHNELLEN BEREITSTELLUNG VON INHALTSSTOFFEN AUS BIOLOGISCHEN PROBEN
Beschreibung
[0001] Gegenstand der Erfindung ist ein universelles und stark vereinfachtes Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen wie Nukleinsäuren oder Proteinen aus biologischen Proben, insbesondere aus Viren, Bakterien oder biologischen Zellen.
Stand der Technik
[0002] Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/ Chloroform- Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolprä- zipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Mania- tis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ).
[0003] Diese "klassischen Verfahren" zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.
[0004] Die klassische Methodik der Isolierung von Nukleinsäuren wurde in den zurückliegenden Jahren deutlich verbessert. Die„neuen" Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1979, 76, 615-619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung einer zu isolierende DNA- Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst.
[0005] Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegen- wältigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet (Marko, M.A., Chipperfield, R. und Birnboim, H.G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387).
[0006] Darüber hinaus existieren heute weltweit auch eine Vielzahl von Reagenziensystemen, vor allem zur Reinigung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen und für die Isolierung von Plasmid- DNA aus bakteriellen Lysaten, aber auch für die Isolierung von längerkettigen Nukleinsäuren (genomische DNA, zelluläre Gesamt- RNA) aus Blut, Geweben oder auch Zellkulturen etc.
[0007] Alle diese kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher Salze und alkoholische Komponenten und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z.B. Glasmilk , BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele (Diagen, DE 41 39 664 AI), Glasfasermaterialien in Filterkartuschen oder unterschiedlichste magnetische oder paramagnetische feste Materialien.
[0008] Auch hierbei laufen die Extraktionsprozesse prinzipiell nach folgendem Schema ab.
1. Lyse der Probe und Freisetzung der Nukleinsäuren
2. Optional Zugabe eines Bindungspuffers und Inkontaktbringen der lysierten Probe mit einer Nukleinsäure bindenden festen Phase
3. Waschen der an der festen Phase gebundenen Nukleinsäuren
4. Trocknung der festen Phase
5. Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren mit Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer
[0009] Diese Verfahrensabläufe sind gut optimiert und erlauben die Isolierung hochreiner DNA oder RNA aus beliebigen Nukleinsäuren enthaltenden Proben. Allerdings sind diese Verfahren ggf. doch recht zeitaufwendig und oftmals nicht preiswert.
[0010] Alternative Methoden zur klassischen Isolierung von Nukleinsäure sind sogenannten „quick-and-dirty"-Verfahren. Hierbei wird eine Nukleinsäure enthaltende biologische Probe mit einfachen Lysereagenzien aufgeschlossen und die freigesetzte Nukleinsäure direkt für downstream- Applikationen eingesetzt. In anderen Verfahren kombiniert man das Lysereagenz noch mit einem Neutrali sierungspuff er, d.h. man lysiert die Probe und mischt das Lysat mit einem Neutralisierungsreagenz und nutzt dann ein sehr geringes Volumen für eine downstream-Anwendung (z.B. PCR). Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im internationalen Schrifttum auch häufig publiziert (Laboratory Animals (2004) 38, 413-417; Poultry Science (2007) 86, 102-106; Biochem. Genet. (2008) 46, 105-112; PNAS (2002) 99, 8, 5261-5266). Diese„Schnellverfahren" haben aber einen ganz gravierenden Nachteil. Es können nur geringe Mengen an Ausgangsprobe eingesetzt werden, da die inhibitorischen Effekte der Probenmatrizes sich negative auf downstream- Anwendungen auswirken (z.B. Bereitstellung von DNA aus einer Blutprobe). Dies wirkt sich insbesondere auf die Sensitivität der Nachweisreaktion aus. Darüber realisieren diese Verfahren auch nicht immer eine positive Anwendung. Wenn zu viele Inhibitoren in der Probe enthalten sind, dann kann z.B. eine PCR- Reaktion nicht durchgeführt werden.
Aufgabe der Erfindung
[0011] Die Aufgabe der Erfindung war es, die Nachteile der im Stand der Technik beschrieben Lösungen zu beseitigen.
Lösung der Aufgabe
[0012] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
[0013] Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen wie Nukleinsäuren oder Proteinen aus biologischen Proben, insbesondere aus Zellen, Viren oder Bakterien, entwickelt, das sich wie die beschriebenen„Schnellverfahren" ganz einfach durchführen lässt, aber die bekannten Nachteile aufhebt, d.h. das die eingesetzte Menge an Probe deutlich erhöht werden kann und dass Inhibitoren nicht mehr in der Probe enthalten sind.
[0014] Die vorliegende Erfindung löst die Problemstellung dabei in einer überraschenden Weise. Zufällige experimentelle Beobachtungen zeigten überraschenderweise, dass die Verwendung von einfachen paramagnetischen oder magnetischen Partikeln (Beads, z.B. Beads aus Eisenoxyd mit OH- Funktionalisierung), die routinemäßig für die Isolierung von Nukleinsäuren nach den bekannten und ausführlich beschriebenen Verfahrensabläufen eingesetzt werden, noch andere Eigenschaften besitzen.
[0015] Obwohl diese Beads keine Antikörper auf der Oberfläche besitzen, binden sie überraschenderweise hocheffizient Biomoleküle (eukaryotische Zellen, Bakterien, Viren), aber kei- ne freien Proteine. Es zeigt sich, dass die Inkubation einer diesbezüglichen Beads-Lösung mit einer Zellsuspension von NIH 3T3 Zellen dazu führt, dass alle Zellen der Suspension an die Beads adsorbierten. Dieses Phänomen lies sich auch bei der unspezifischen Adsorption von Bakterien oder Viren beobachten.
[0016] Entsprechend der Zielstellung der vorliegenden Erfindung konnte ein völlig neuartiges Verfahren entwickelt werden, welches es erlaubt, schnell und einfach und unter Umgehung der für die sog.„quick-and-dirty"- Verfahren bekannten Nachteile und Limitationen Nukleinsäuren aus unterschiedlichsten Proben bereitzustellen. Das Verfahren realisiert sich wie folgt:
1. Inkubation einer Probe mit magnetischen oder paramagnetischen Beads (z.B. OH- funk- tionalisiertes Eisenoxyd); dieser Schritt dient der Adsorption der Biomoleküle an die Beads
2. Entfernen der Probe und Waschen der Beads mit Wasser (bei diesem Schritt werden die inhibitorischen Komponenten der Probe effizient entfernt, wogegen die Biomoleküle an den Beads verbleiben)
3. Resuspendieren der Beads mit einem an sich bekannten Lysereagenz (z.B. 25 mM Na- OH) und Inkubation bei 50°C - 95°C.
[0017] In einer bevorzugten Variante liegt das Lysereagenz schon in einer lagerstabilen festen Form in einem Reaktionsgefäß vor. Die Bedas werden in diesem Falle mit einem definierten Volumen an Wasser resuspendiert und in das Reaktionsgefäß mit dem festen Lysereagenz überführt.
4. Nach Lyse werden die Beads mittels eines Magneten abgetrennt und der die freigesetzten Inhaltsstoffe enthaltende klare Überstand wird nachfolgend mit einer Neutrali sierungslö- sung gemischt (z.B. 40 mM Tris HCl; pH 6).
[0018] In einer bevorzugten Variante liegt auch das Neutralisierungsreagenz schon in einer lagerstabilen festen Form in einem Reaktionsgefäß vor. Der klare Überstand von Schritt 3 wird dann auch in diesem Falle in das Reaktionsgefäß mit dem festen Neutralisierungsreagenz überführt.
[0019] Nach kurzer Inkubation (5 min) wird die Lösung direkt für z.B. eine PCR- Reaktion eingesetzt.
[0020] In einer noch einfacheren Ausführungsvariante erfolgt die Freisetzung der Inhaltsstoffe aus den an den Beads adsorbierten Biomolekülen einfach durch erhitzen (Kochlyse). Bei diesem Verfahren kann vollständig auf Lysereagenzien und ggf. Neutralisierungsreagenzien verzichtet werden.
[0021] Das noch einfachere Verfahren realisiert sich wie folgt:
1. Inkubation einer Probe mit magnetischen oder paramagnetischen Beads (z.B. OH- funk- tionalisiertes Eisenoxyd); dieser Schritt dient der Adsorption der Biomoleküle an die Beads
2. Entfernen der Probe und Waschen der Beads mit Wasser (bei diesem Schritt werden die inhibitorischen Komponenten der Probe effizient entfernt, wogegen die Biomoleküle an den Beads verbleiben)
3. Resuspendieren der Beads in Wasser und Freisetzung der Inhaltsstoffe durch nachfolgende Inkubation bei z.B. 95°C für 5 min
4. Nach Lyse werden die Beads mittels eines Magneten abgetrennt und der die freigesetzten Inhaltsstoffe enthaltende klare Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und kann jetzt direkt für downstream- Anwendungen eingesetzt werden.
[0022] Das erfindungsgemäße Verfahren in seinen unterschiedlichen Ausführungsvarianten ist extrem schnell und einfach und umgeht die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik, da durch das Adsorbieren von Zellen, Bakterien oder Viren an die Beads in den nachfolgenden Waschschritten alle Inhibitoren (letztlich die gesamte Probenmatrix) effizient entfernt werden. Im Gegensatz zu den beschriebenen„quick-and-dirty"-Verfahren verschleppt man die Probe nicht bis zur geplanten downstream- Anwendung. Damit können dann auch sehr viel größere Probenmengen (z.B. 1 ml Vollblut, Urin etc.) eingesetzt werden, als dies bisher mit diesen Verfahren möglich war. Damit verbunden kann eine deutliche Sensitivitätserhöhung erreicht werden. Auch das Anwendungsspektrum in Bezug auf die zu untersuchende Probe ist quasi nicht limitiert. Ein weiterer Vorteil besteht auch darin, dass man für das Verfahren keinerlei Zentrifugationsschritte benötigt und die notwendigen Reagenzien völlig unproblema- tisch sind. Dies ermöglicht es, dass das Verfahren auch ideal für die Untersuchung von Proben unter Feldbedingungen eingesetzt werden kann.
[0023] Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.
Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1:
Bereitstellung amplifizierbarer bakterieller Nukleinsäure aus einer wässrigen Lösung
[0024] Jeweils ca. 500, 50 und 5 Salmonellen wurden in 1.0 ml Wasser gespiked. Die Bereitstellung der bakteriellen Nukleinsäure realisiert sich wie folgt.
[0025] Zur Probe erfolgte die Zugabe von 5 μΐ einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH- Funktionalisierung; Menge ca. 1.5 mg). Die Probe wurde kurz gevortext und nachfolgend für 30 min auf einem Schüttler inkubiert. Nach Inkubation erfolgte eine Separation der Beads an die Wand des Reaktionsgefäßes mittels eines Magneten.
[0026] Der Überstand wurde verworfen und die Beads mit 800 μΐ Wasser gewaschen.
[0027] Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der Waschschritt wiederholt. Danach wurden die Beads in 80 μΐ Wasser resuspendiert und der gesamte Ansatz in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieses Reaktionsgefäß enthielt in eingetrockneter fester Form ein Lysereagenz (Herstellung des lagerstabilen Lysereagenzes durch Eintrocknen von 8 μΐ einer 250 mM NaOH-Lösung).
[0028] Nach Zugabe der Beads in das Reaktionsgefäß wurde der Ansatz für 15 min bei 70°C und nachfolgend bei 95°C für 5 min inkubiert. Dies führte zur Freisetzung der Nukleinsäuren aus den an den Beads adsorbierten Bakterien. Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der die Nukleinsäure enthaltende klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieses Reaktionsgefäß enthielt in eingetrockneter fester Form ein Neutralisie- rungsreagenz (Herstellung des lagerstabilen Neutrali sierungsreagenzes durch Eintrocknen von 8 μΐ einer 400 mM Lösung aus Tris HCl; pH 6). Nach der Zugabe des klaren Überstandes in das Reaktionsgefäß wurde der Ansatz für ca. 5 min inkubiert. Dies führte zum Auflösen des festen Neutrali sierungsreagenz und damit zur Neutralisierungsreaktion. Nachfolgend wurde die so bereitgestellte Nukleinsäure in einer Real Time- PCR auf ihre Amphfizierbarkeit zum Nachweis einer Salmonellen -spezifischen DNA getestet. Die gemessenen CT- Werte sind nachfolgend aufgeführt. Wie zu sehen ist, konnte mit dem Verfahren ein Salmonellennachweis aus der Probe durchgeführt werden. Dabei zeigt sich die enorme Sensitivität. Es war möglich, 50 Kopien in einer wässrigen Probe von 1 ml eindeutig nachzuweisen.
[0029] Tabelle 1 zeigt die CT- Werte der durchgeführten Salmonellen- spezifischen RealTime- PCR Reaktion
Figure imgf000008_0001
Ausführungsbeispiel 2:
Bereitstellung amplifizierbarer Nukleinsäure aus unterschiedlichen Volumen an Vollblutproben
[0030] Jeweils 10 μΐ, 50 μΐ, 200 μΐ sowie 500 μΐ Vollblut wurden in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt, mit 1 ml Wasser versetzt, kurz gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
[0031] Nachfolgend wurden 5 μΐ einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH- Funktionalisierung; Menge ca. 1.5 mg) zu den Proben gegeben und die Proben kurz gevortext und nachfolgend für 5 min inkubiert. Nach Inkubation erfolgte eine Separation der Beads an die Wand des Reaktionsgefäßes mittels eines Magneten.
[0032] Der Überstand wurde verworfen und die Beads mit 800 μΐ Wasser gewaschen.
[0033] Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der Waschschritt zweimal wiederholt. Danach wurden die Beads in 100 μΐ Wasser (bei den 10 μΐ und 50 μΐ Vollblutproben) bzw. 200 μΐ Wasser (bei den 10 μΐ und 50 μΐ Vollblutproben) resuspendiert und der gesamte Ansatz bei 95°C für 5 min und unter Schütteln inkubiert. Dies führte zur Freisetzung der Nukleinsäuren aus den an den Beads adsorbierten Zellen. Die Beads wurden wiederum mittels eines Magneten separiert und der die Nukleinsäure enthaltende klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. [0034] Nachfolgend wurde die so bereitgestellte Nukleinsäure in einer PCR- Reaktion (1 μΐ) auf ihre Amplifizierbarkeit getestet. Amplifiziert wurde ein humanes Targetgen (GAPDH) unter Standard- PCR- Bedingungen. Die Amplifikate wurden nachfolgend auf einem Agarosegel analysiert. Wie zu sehen ist, konnte mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens schnell und absolut einfach amplifizierbare Nukleinsäure isoliert werden. Selbst aus Vollblutproben von 500 μΐ konnte mittels der erfindungsgemäßen Methode Nukleinsäure bereitgestellt werden, die absolut frei von Inhibitoren ist. Das gesamte Verfahren war in 15 min beendet, wobei die eigentliche „hands-on-time" noch viel kürzer war.
[0035] Figur 1 zeigt den Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure (GAPDH) auf einem Agarosegel
[0036] Die einzelnen Proben in Figur 1 zeigen:
1 - DNA Leiter
2 + 3 - DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 10 μΐ Vollblut
4 + 5 - DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 50 μΐ Vollblut
6 + 7 - DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 200 μΐ Vollblut
8 + 9 - DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen aus 500 μΐ Vollblut
10 - PCR Negativkontrolle

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass flüssige biologische Proben mit magnetischen Partikeln versetzt und anschließend diese magnetischen Partikel mit daran adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe entfernt, gewaschen und anschließend lysiert werden und nach der Lyse die Inhaltsstoffe der Bakterien, Zellen oder Viren im Lysat vorliegen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse der adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren entweder mittels bekannter Lyse-Reagenzien oder durch Erhitzen (Kochlyse) erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Lyse die magnetischen Partikel aus dem Lysat entfernt werden und das Lysat neutralisiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Inhaltsstoffen der Bakterien, Zellen oder Viren um Nukleinsäuren oder Proteine handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den magnetischen Partikeln um
a) silicatische Magnetpartikel oder
b) Partikel aus Eisenoxid
handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Eisenoxid- Partikeln um mchtfunktionalisierte oder funktionalisierte Eisenoxid-Partikel, vorzugsweise OH- oder COO-funktionalisierte, handelt
7. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Eisenoxid-Partikel eine Größe von 10 nm bis 5 μιτι, vorzugsweise von 50 nm bis 1 μιτι, besonders bevorzugt von 100 bis 300 nm, aufweisen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen euka- ryotische oder prokaryotische Zellen sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Inkubation einer Probe mit magnetischen oder paramagnetischen Partikeln zur Adsorption der Bakterien, Zellen oder Viren an die Partikel
b) Entfernen der Probe und Waschen der Partikel mit Wasser zur Entfernung der inhibitorischen Komponenten, wogegen die Bakterien, Zellen oder Viren an den Partikeln verbleiben
c) Resuspendieren der Partikel mit einem an sich bekannten Lysereagenz und Inkubation bei 50°C - 95°C.
d) Entfernen der Partikel mittels eines Magneten, wobei die freigesetzten Inhaltsstoffe im klaren Überstand enthalten sind wird Zusatz einer Neutralisierungslösung.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Resuspendieren der Partikel nicht mit einem Lysereagenz, sondern in Wasser erfolgt und Freisetzung der Inhaltsstoffe durch nachfolgende Inkubation bei z.B. für mindestens 3 min bei mindestens 90°C erfolgt
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Proben Blut, Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Wasser, Urin, Stuhlproben, Zellkultur-Supensionen, Kultivierungsmedien oder Kultivierungsmedien aus Stomacher-Beuteln der Lebensmitteldiagnostik darstellen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse- und / oder und Neutrali sierungsreagenzien als lagerstabile Komponenten in einer Reaktions- kavität vorliegen und durch die Zugabe einer wässrigen Lösung aktiviert werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsvolumen beliebig ist.
14. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 als „One-Tube- Verfahren" oder„Walk-Away-Prozess".
15. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Vorbereitung von downstream-Anwendungen der bereitgestellten Inhaltsstoffe, insbesondere einer PCR oder RealTime-PCR.
PCT/EP2011/062162 2010-07-15 2011-07-15 Verfahren zur schnellen bereitstellung von inhaltsstoffen aus biologischen proben WO2012007582A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE201010031404 DE102010031404A1 (de) 2010-07-15 2010-07-15 Verfahren zur schnellen Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben
DE102010031404.8 2010-07-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012007582A1 true WO2012007582A1 (de) 2012-01-19

Family

ID=44651656

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2011/062162 WO2012007582A1 (de) 2010-07-15 2011-07-15 Verfahren zur schnellen bereitstellung von inhaltsstoffen aus biologischen proben

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102010031404A1 (de)
WO (1) WO2012007582A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586197A (zh) * 2012-03-08 2012-07-18 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒
JP2021519591A (ja) * 2018-04-03 2021-08-12 モメンタム・バイオサイエンス・リミテッドＭｏｍｅｎｔｕｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 微生物の分離及び検出

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4139664A1 (de) 1991-12-02 1993-06-03 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren
EP1655366A2 (de) * 2004-11-03 2006-05-10 Samsung Electronics Co., Ltd. Apparat und Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren durch Phasentrennung durch die Verwendung von Laser und Kügelchen
EP1944368A1 (de) * 2007-01-15 2008-07-16 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure durch Erhitzung auf einem magnetischen Träger
WO2008101192A1 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Applied Biosystems, Llc Method for recovering nucleic acid from a mixed cell suspension, without centrifugation

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1230531C (zh) * 2002-12-09 2005-12-07 清华大学 从样品中分离细胞粒子的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4139664A1 (de) 1991-12-02 1993-06-03 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren
EP1655366A2 (de) * 2004-11-03 2006-05-10 Samsung Electronics Co., Ltd. Apparat und Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren durch Phasentrennung durch die Verwendung von Laser und Kügelchen
EP1944368A1 (de) * 2007-01-15 2008-07-16 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure durch Erhitzung auf einem magnetischen Träger
WO2008101192A1 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Applied Biosystems, Llc Method for recovering nucleic acid from a mixed cell suspension, without centrifugation

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM. GENET., vol. 46, 2008, pages 105 - 112
LABORATORY ANIMALS, vol. 38, 2004, pages 413 - 417
MARKO, M.A., CHIPPERFIELD, R., BIRNBOIM, H.G., ANAL. BIOCHEM., vol. 121, 1982, pages 382 - 387
PNAS, vol. 99, no. 8, 2002, pages 5261 - 5266
POULTRY SCIENCE, vol. 86, 2007, pages 102 - 106
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 76, 1979, pages 615 - 619
RUDI K ET AL: "RAPID, UNIVERSAL METHOD TO ISOLATE PCR-READY DNA USING MAGNETIC BEADS", BIOTECHNIQUES, INFORMA HEALTHCARE, US, vol. 22, no. 3, 1 March 1997 (1997-03-01), pages 506 - 511, XP008054779, ISSN: 0736-6205 *
SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T.: "Molecular Cloning", 1989, CSH

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586197A (zh) * 2012-03-08 2012-07-18 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒
JP2021519591A (ja) * 2018-04-03 2021-08-12 モメンタム・バイオサイエンス・リミテッドＭｏｍｅｎｔｕｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 微生物の分離及び検出
JP7476466B2 (ja) 2018-04-03 2024-05-01 モメンタム・バイオサイエンス・リミテッド 微生物の分離及び検出

Also Published As

Publication number Publication date
DE102010031404A1 (de) 2012-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2163622B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von kurzer RNA sowie Kit hierfür
DE69817484T2 (de) Verfahren zur isolierung bestimmter biologischer stoffe mittels magnetischer silika-partikel
EP3286325B1 (de) Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
DE60015148T2 (de) Simultane isolierung und quantifizierung von dna
DE102017204267B4 (de) Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen
DE112010001766B4 (de) Verfahren zur isolierung hochreiner rna mittels paramagnetischen mikro- und nanopartikeln
WO2011061274A1 (de) Verfahren zur selektiven anreicherung und isolierung mikrobieller und optional zusätzlich viraler nukleinsäuren
EP2256195A1 (de) Nukleinsäureaufreinigungsverfahren
EP1771242B1 (de) Verfahren zur effizienten isolierung von nukleinsäuren
EP1560926B1 (de) Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
WO2012007581A1 (de) Verfahren zur anreicherung von bakterien, viren sowie zellen und zur nachfolgenden nukleinsäureisolierung
EP2010672B1 (de) Formulierungen und verfahren zur isolierung von nukleinsäuren aus beliebigen komplexen ausgangsmaterialien und nachfolgende komplexe genanalytik
EP3228710B1 (de) Aufreinigung von nukleinsäure aus einer nukleinsäure und endotoxin enthaltenden probe
DE60123828T2 (de) Lysat-klärung und nukleinsäureisolierung mit silanisierten silicamatrizes
EP2041281B1 (de) Verfahren zur parallelen isolierung doppel- und einzelsträngiger nukleinsäuren sowie zur selektiven entfernung doppelsträngiger nukleinsäuren aus einem gemisch von doppel- und einzelsträngigen nukleinsäuren
DE10253351B4 (de) Neuartige Pufferfomulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren
WO2012007582A1 (de) Verfahren zur schnellen bereitstellung von inhaltsstoffen aus biologischen proben
DE10033991A1 (de) Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
DE102015216558A1 (de) Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
DE102004045332B3 (de) Verfahren zur Isolierung und Trennung von einzel- und doppelsträngigen Nucleinsäuren aus einer diese Nucleinsäuren enthaltenden Probe sowie Trennsäule zur Durchführung dieses Verfahrens
WO2011128086A1 (de) Dnase-beschichtete magnetische partikel
DE102007006008B4 (de) Verfahren und Kit zur Isolierung von Plasmid DNA
DE102008044721A1 (de) Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Proben sowie ein dazu geeignetes Testkit

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11752129

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11752129

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1