WO2011128086A1 - Dnase-beschichtete magnetische partikel - Google Patents

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WO2011128086A1
WO2011128086A1 PCT/EP2011/001857 EP2011001857W WO2011128086A1 WO 2011128086 A1 WO2011128086 A1 WO 2011128086A1 EP 2011001857 W EP2011001857 W EP 2011001857W WO 2011128086 A1 WO2011128086 A1 WO 2011128086A1
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WO
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dna
dnase
particles
eukaryotic
coated magnetic
Prior art date
Application number
PCT/EP2011/001857
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English (en)
French (fr)
Inventor
Johan De Bondt
Gerbert Schaap
Paul Borm
Viorel Rusu
Original Assignee
Magnamedics Gmbh
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Definitions

  • the invention relates to a method for isolating non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA from a sample using DNase-coated magnetic particles, in particular using DNase-coated magnetic particles (beads) having a particle size of> 10 nm to ⁇ 800 ⁇ which can be used, for example, to digest in a controlled manner non-bacterial DNA from a sample containing both bacterial and eukaryotic cells.
  • DNase-coated magnetic particles in particular using DNase-coated magnetic particles (beads) having a particle size of> 10 nm to ⁇ 800 ⁇ which can be used, for example, to digest in a controlled manner non-bacterial DNA from a sample containing both bacterial and eukaryotic cells.
  • Presence of eukaryotic DNA (deoxyribonucleic acid) next to prokaryotic DNA may be, e.g. in PCR and RT-PCR applications that interfere with results in the detection of prokaryotic (preferably bacterial) DNA. Therefore, the removal of eukaryotic DNA from a sample with eukaryotic and prokaryotic DNA is necessary.
  • Magnetic particles are used as chromatographic media especially for the purification of nucleic acids, for the immobilization of nucleic acids and enzymes in purification steps, as storage media, for use in immunoassay and for gel permeation chromatography.
  • Other magnetic particles containing a core magnetic material coated with an inorganic oxide are disclosed in EP 0343 934.
  • Polymer particles coated with another polymeric material-containing polymer layer bearing a third polymer coating capable of interacting with biomolecules are described in PCT Application FR 97/00912.
  • Magnetic hybrid particles consisting of a polymer core first coated with a ferrofluid and subsequently coated with a functional polyacrylate are the subject of U.S. Patent 5,648,124.
  • WO 98/58257 discloses 0.1 to 500 pm magnetic particles for separating biological mixtures comprising pearlescent pigments having magnetic properties and a biological polymer coating.
  • the polymer coating can be a protein, but these are proteins for binding components in immunoassays. None of these documents disclose or imply the coating of magnetic particles with DNase for purifying specific DNA in a sample containing DNA from various sources.
  • Deoxyribonuclease is an enzyme that catalyzes the hydrolytic cleavage of phosphodiester bonds in DNA. There are two main types of deoxyribonuclease: DNase I and DNase II. However, it is mostly used in the
  • Deoxyribonuclease is used in many molecular biology techniques such as isolation of RNA from a DNA / RNA mixture following cell lysis, PCR and RT-PCR applications, DNA-free water for molecular biology or isolation of bacterial DNA from human, clinical samples
  • isolation kits for genomic DNA from bacteria, fungi and yeasts are for example: Masterpure DNA Purification Kit (Epicenter Technologies, Madison, Wisconsin), DNA pure yeast Genomic Kit (CPG Inc., Lincoln Park, NJ), Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), High Pure PCR Template Creation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), and Magna Pure LC DNA Isolation Kit III (Bacteria, fungi).
  • DNA is separated by precipitation with isopropanol after lysis of the cells and precipitation of proteins, dried and resuspended the DNA pellets.
  • the Qiamp and High Pure Kits the first two kits are separated by precipitation with isopropanol after lysis of the cells and precipitation of proteins, dried and resuspended the DNA pellets.
  • the detection of the bacterial content of a particular sample irrelevant from which source is not that easy.
  • source e.g., clinical, food or environmental samples
  • the gold standard for the detection and identification of pathogens in patients suspected of systemic infections is the blood culture.
  • a microbiological examination of the blood an attempt is made to culture the pathogens (usually bacteria) that are in the blood, culturally. This technique is also the basis of ISO standards.
  • Amplification-based methods such as PCR results allow a faster way. However, their sensitivity to date is not better and sometimes worse than culture-based methods.
  • DNase has to be removed time-consuming before e.g. bacterial DNA is amplified and / or analyzed or otherwise used in further steps.
  • the DNase-coated magnetic particles allow for simplified and rapid purification of, e.g. bacterial DNA from a sample with
  • the method of the invention for isolating non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA from a sample comprises the following steps a) digesting the eukaryotic DNA in the sample by means of DNase-coated magnetic particles; and
  • step b) removing the DNase-coated magnetic particles from the reaction mixture obtained in step a).
  • step a) lysis of eukaryotic cells can be carried out.
  • step b) lysis of non-eukaryotic cells can be performed.
  • the method additionally comprises the following step
  • step b) Reaction mixture.
  • the sample from which non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA is isolated further comprises eukaryotic DNA. It is preferably a biological sample.
  • the non-eukaryotic DNA or RNA is at least one DNA and / or RNA selected from the group consisting of viral DNA, viral RNA, prokaryotic DNA, fungal DNA, and bacterial DNA.
  • the non-eukaryotic DNA is DNA
  • Prokaryotes more preferably from gram-positive or gram-negative bacteria.
  • the non-eukaryotic DNA is DNA from fungi, more preferably from yeast.
  • DNase-coated magnetic particles having a particle size of> 10 nm to ⁇ 800 pm, preferably with a particle size of> 100 nm to ⁇ 20 pm, particularly preferably with a particle size of > 0.5 to ⁇ 2 pm, and very particularly preferably from> 900 nm to ⁇ 1.3 pm.
  • the particles according to the invention have a particle size of> 500 nm to 2 pm and the average diameter of particles according to the invention (d 0.9) is between> 900 nm and ⁇ 1, 3 pm. It is to be understood that the particle sizes and mean diameters of the particles of the invention may take any value between the indicated sizes.
  • in the average diameter of particles according to the invention may take any value between the indicated sizes.
  • the magnetic particle has a particle size of> 10 nm to ⁇ 800 ⁇ , particularly preferably a particle size of> 100 nm to ⁇ 20 pm, most preferably a particle size of> 900 nm to ⁇ 1, 3 pm.
  • the DNase-coated magnetic particles may have a particle size between> 500 nm and ⁇ 2 ⁇ .
  • the particles Preferably, the particles have a particle size between> 500 nm and ⁇ 2 pm and the d 0.9 of the particles is between 900 nm and 1.3 pm.
  • the cores are the same
  • eukaryotic or bacterial DNA as the corresponding wild-type (s) or has a higher specificity against eukaryotic or bacterial DNA than the corresponding wild-type (have).
  • Turbo TM DNase which has greatly enhanced activity, is such a preferred DNase form.
  • one or more DNase (s) has a higher activity against eukaryotic DNA than the corresponding wild-type and / or higher specificity
  • DNase is immobilized on the cores of the particles according to the invention via a spacer, preferably gelatin, BSA, PEG or tosyl.
  • a spacer preferably gelatin, BSA, PEG or tosyl.
  • Another aspect of the present invention is a suspension of DNase-coated magnetic particles.
  • Methods may be added to the DNase-coated magnetic particles before or during step a), preferably before step a) as a suspension to the sample.
  • Suspension in the range of about 0.1 and about 100 mg / ml, preferably in the range of about 0.1 and about 50 mg / ml, and most preferably in
  • Range from about 1 to about 20 mg / ml.
  • the DNase concentration by the particles according to the invention in the suspension in the range of about 100 and about 20,000 U / ml, preferably in the range of about 100 and about 10,000 U / ml, more preferably in the range of about 300 and about 2000 U / ml, and most preferably in the range of about 300 and about 600 U / ml.
  • the pH range of the suspension is in the range of about pH 4 and about pH 8, preferably in the range of about 4.5 and about 8.5.
  • the suspension additionally comprises divalent cations, preferably Mg 2+ and / or Mn 2+ .
  • the sample additionally has divalent cations in step a), preferably Mg 2+ and / or Mn 2+ .
  • a third aspect of the present invention is the use of the DNase-coated magnetic particles or suspension containing them to degrade DNA in a (preferably biological) sample or matrix.
  • DNase-coated magnetic particles or a suspension containing these particles are used to degrade DNA in a (preferably biological) sample or matrix.
  • kits comprising at least one DNase-coated magnetic particle or at least one of these particles contained suspension or all components for the preparation of such a suspension as DNase-coated magnetic particles and, for example, buffer substances.
  • the kit comprises at least one DNase-coated magnetic particle for carrying out the method according to the invention.
  • the method of the invention for removing DNA from biological samples comprises the steps of: a) digesting genomic DNA in a sample using the DNase-coated magnetic particles or a suspension containing these particles, b) removing the DNase-coated magnetic particles the
  • the sample comprises eukaryotic DNA and viral DNA and / or viral RNA and / or prokaryotic DNA and / or DNA from fungi (such as yeast) and / or bacterial DNA and / or RNA and the DNA to be digested eukaryotic DNA, preferably human DNA, and the DNA to be isolated / purified is prokaryotic, most preferably bacterial, DNA or bacterial RNA.
  • the DNA to be isolated / purified by the process is DNA from prokaryotes, preferably from gram-positive or gram-negative bacteria; or DNA from fungi, preferably yeast.
  • RNA RNA from prokaryotes, preferably from gram-positive or gram-negative bacteria, or viruses.
  • the digestion of the process of the invention preferably takes place in the range of about 5 and about 40 ° C, more preferably in the range of about 20 and about 37 ° C instead.
  • the present invention allows for an increase in sensitivity 5 in bacterial DNA isolation (or RNA isolation) and identification from a variety of samples.
  • the particles, suspensions and methods according to the invention enable a faster and simplified
  • the aspects of the present invention allow removal of specific DNA from biological samples containing both interfering and, for example, DNA of interest without further contamination with DNase. DNA is removed by digestion with DNase
  • the particles, suspensions and methods of isolation of prokaryotic DNA allow the combination of efficient lysis of the cells of a sample with a specific lysis buffer for extraction of genomic DNA from eukaryotic cells with the total digestion of eukaryotic DNA 30 using the DNase-coated magnetic Particle.
  • the magnetic particles of the present invention can be easily removed magnetically, so that the reaction mixture after the digestion step by the DNase-coated magnetic particles now results in the bacterial DNA of interest and, next, cell debris and DNA fragments from the previous lysis and the DNA digestion step.
  • the DNase-coated magnetic particles consist of a core coated with DNase.
  • DNase can be immobilized directly on the core or, preferably, be connected by spacers to the core of the particles.
  • the core of the DNase-coated magnetic particles of the present invention is known per se.
  • such magnetic particles may be made of, for example, silica and / or a variety of different polymers such as polystyrene, cross-linked polystyrene, polyacrylic, polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactide-co-glycolides),
  • Polyanhydrides poly (methyl methacrylate), poly (ethylene-co-vinyl acetate), polysiloxanes, polymeric silicic acid, latex, dextran polymers and
  • Epoxy resins with silica being preferred, and a magnetic filler.
  • Said magnetic fillers are, without limitation, for example, iron, iron silicones, nickel, cobalt or alloys of any of these metals with molybdenum, chromium, copper, vanadium, manganese, aluminum or titanium, iron oxides ( Fe 3 O or gamma Fe 2 O 3 ) in pure form or in combination or admixture with other oxides such as oxides of cobalt, manganese, zinc, barium or rare earth, or chromium dioxide.
  • the magnetic fillers are usually in the form of particles that are sufficiently fine that they can be incorporated into the polymer particles of the core. In general, the magnetic fillers are 0.005 to 10 pm in size.
  • the magnetic particles are usually prepared by mixing the magnetic filler with the polymer and / or silica by conventional methods of bulk, solution, emulsion or
  • Suspension polymerization prepared, but can also be prepared in any other way known in the art, such as
  • DNase includes all nucleolytic enzymes (i.e., nucleases, EC class 3.1) that mince DNA, and typical restriction enzymes are known to those skilled in the art.
  • DNases are preferably deoxyribonucleases which catalyze the hydrolytic cleavage of phosphodiester bonds in the DNA backbone.
  • Deoxyribonucleases digest single and double stranded DNA into a mixture of mono- and oligonucleotides, each containing a 5'-phosphate and a 3'-OH terminus.
  • the present invention encompasses both the use of Dnase wild types and the use of for
  • Variants for example, have an increased catalytic performance relative to the have respective wild type and / or a higher selectivity for DNA from different sources such as bacterial DNA, fungal DNA or DNA from mammals (eg human DNA).
  • sources such as bacterial DNA, fungal DNA or DNA from mammals (eg human DNA).
  • mammals eg human DNA.
  • DNase I Deoxyribonucleases known as DNase I and DNase II.
  • Presence / absence of divalent ions For example, in the presence of Mg 2+ , DNase I hydrolyzes randomly and independently one strand of double-stranded DNA. In the presence of Mn 2+ both strands are split.
  • oligonucleotides DNA
  • a specific source for example, non-bacterial DNA
  • Nucleotide units (mono or smaller oligonucleotides) understood by DNase of DNase-coated magnetic particles of the present invention, wherein the resulting nucleotide units are not recognized by a DNA polymerase in a subsequent PCR step (PCR - Polymerase Chain Reaction), or not be duplicated.
  • PCR - Polymerase Chain Reaction PCR - Polymerase Chain Reaction
  • the skilled worker knows which polymerases can be used in a PCR step.
  • methods for measuring DNA degradation (digestion), for example by means of agarose gels are known to the person skilled in the art.
  • the specific activity of DNase is the ability of the enzyme to cleave 1 pmol of double-stranded DNA (dsDNA) per minute under standard conditions.
  • DNase activity can be determined, for example, as follows: Incubation of a sample with 100,000 cpm 32p-DNA plus 80 ⁇ g / ml nonradioactive salmon sperm DNA in DNase buffer (10 mM Tris-HCl pH 7, 4 mM MgCl 2 , 4 mM CaCl 2 ) for 45 min at 37 ° C. The reaction is stopped by adding half a volume of non-radioactive DNA (2 mg / ml) and a volume of ice-cold 20% trichloroacetic acid. After 10 min at 4 ° C, the reaction mixture is centrifuged for 10 min at 12,000 g, an aliquot of Supernatant is measured. The measured rashes of the acid-soluble DNA fragments in the supernatant reflect the DNase activity.
  • the cores of the DNase-coated magnetic particles can be coated with a DNase or with different DNases in different or equal activity levels.
  • a preferred DNase or with different DNases in different or equal activity levels can be coated with a DNase or with different DNases in different or equal activity levels.
  • the cores of the particles are coated with one or more Type I DNases.
  • the cores of the particles are coated with one or more Type II DNases.
  • the cores of the particles are coated with one or more type I DNases and one or more type II DNases.
  • the various DNases can come from the same life form or different life forms. For example, a DNase of human origin or a variant of a
  • human DNase and another DNase may be from another mammal, plant or fungus, or a variant of such DNase.
  • the coating of the cores of the DNase-coated magnetic particles with DNase is carried out by immobilization of DNase at the
  • the immobilization of the DNase can be achieved either directly or via a linkage by means of a spacer, wherein a coating by immobilization of DNase via a spacer is a preferred embodiment.
  • Immobilization encompasses both the covalent binding of DNase to the core surface or to a spacer and the binding of the DNase to the core surface or a spacer by, for example, hydrophobic interactions.
  • DNase is preferably covalently attached to the
  • Immobilization in this context means that during a digestion step and under the conditions of a
  • DNase is linked by a spacer to the core of the DNase-coated magnetic particles.
  • the spacers affect the biological activity of the bound DNase, as this results in a very good availability of the active sites of the enzyme.
  • the length of the spacers seems to play a role here. It is also assumed that by the use of spacers the non-specific binding of DNA and cell residues from bacteria, yeast, fungi or eukaryotes to the
  • Core surface of the DNase-coated magnetic particles can be reduced.
  • the bond to the core surface of the DNase-coated magnetic particles is preferably prevented by spacers of more than 80%, 90%, 95%, particularly preferably more than 99%, and very particularly preferably 100%.
  • DNase is immobilized on the core surface via block spacers such as large proteins (for example BSA).
  • spacers are, for example, compounds with one or more bifunctional reaction groups, for example: (1) diamines of the formula NH 2 -RI-NH 2, where R 1 can be a C 2 -C 20 -alkyl group, ( 2) amino acids having the general formula NH 2 -R 2 -CO 2 H, where R 2 can be a C 1 -C 20 -alkyl group and (3) dialdehydes having the formula OHC-R 3 -CHO, where R 3 can be a C 1 -C 20 -alkyl group , Two or more linking groups can be coupled to increase the spacer length.
  • diamines of the formula NH 2 -RI-NH 2 where R 1 can be a C 2 -C 20 -alkyl group
  • R 2 can be a C 1 -C 20 -alkyl group
  • dialdehydes having the formula OHC-R 3 -CHO, where R 3 can be a C 1 -C 20 -alkyl group
  • Two or more linking groups can
  • spacers examples include 6-aminocaproic acid, 1, 6-diaminohexane, 1, 12-diaminododecane, glutaraldehyde, and mixtures thereof. Further preferred spacers are gelatin, tosyl
  • spacers have at least 10, 20, 50 or 100 carbon atoms in length or spacers are proteins, these proteins preferably having a size of more than 5 kDa, more than 10 kDa, more than 20 kDa, more than 30 kDa , particularly preferably above 50 kDa, or spacers are polymers, the polymers preferably having a size greater than 1; 2.5; 5; 10; 15; 20 or 30 kDa.
  • the core comprises a functionalized surface having a plurality of reactive, functional
  • the DNase is thus directly covalently bound to a functional group on the surface, or a spacer of the appropriate length, which is covalently bound to one or more of this functional group.
  • Known and accepted methods of immobilization include, for example: (1) the use of water-soluble carbodiimides in the reaction of a carboxyl group on the functionalized core surface and a freely accessible amino group on the DNase to likely form a stable amide bond; (2) the use of bifunctional aldehydes
  • glutaraldehyde which connect as spacer a amino group on the core surface and a freely accessible amino group on the DNase
  • cyanogen bromide in the reaction of a hydroxyl group on the core surface with an amino group on a spacer or a DNase or a hydroxyl group on a spacer and an amino group on one DNase
  • EDS / NHS EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimides / N-hydroxysuccinimides
  • the DNase-coated magnetic particles of the present invention have a particle size of> 10 nm to ⁇ 800 pm, preferably a particle size of> 100 nm to ⁇ 20 ⁇ , particularly preferably a particle size of> 500 nm to ⁇ 2 ⁇ and most preferably a particle size of> 900 nm to 1, 3 pm.
  • a particle size of> 10 nm to ⁇ 800 pm preferably a particle size of> 100 nm to ⁇ 20 ⁇ , particularly preferably a particle size of> 500 nm to ⁇ 2 ⁇ and most preferably a particle size of> 900 nm to 1, 3 pm.
  • the DNase-coated magnetic particles have a particle size of> 500 nm to ⁇ 2 pm and the average diameter of 90% of the DNase-coated magnetic particles (d 0.9) is between> 900 nm and ⁇ 1, 3 pm.
  • the size of the particles can be manipulated using conventional techniques and, for example, by laser
  • the particles Preferably, the particles have spherical shape.
  • suspensions of the DNase-coated magnetic particles can be added to the sample.
  • the pH of these suspensions is both before and after addition of the suspension to a sample or sample to a suspension in the range of about pH 2 and about pH 10, more preferably in the range of about pH 4.5 and about pH 8.5 and more preferably in the range of about pH 6 and about pH 8.
  • the pH of the suspensions is at the optimum pH of at least one of the immobilized DNases.
  • the pH of a suspension is adjusted by a buffer.
  • a buffer With regard to the absolute concentration of a buffer substance in a suspension for the successful performance of, for example, digestion of eukaryotic DNA, the
  • the concentration of at least one buffer substance in a suspension prior to addition of a sample in preferred embodiments is in the range of about 1 mM and about 1 M, about 10 mM, and about 1 M, about 10 mM and about 500 mM, about 10 mM and about 250 mM, preferably in the range of about 100 mM and about 250 mM.
  • the buffer concentration does not reach a minimum concentration
  • the concentration of at least one buffer substance after mixing a sample and a suspension is in the range of about 1 mM and about 1 M, about 10 mM and about 1 M, about 10 mM and about 500 mM, about 10 mM and about 250 mM, respectively in the range of about 100 mM and about 250 mM.
  • buffers for suspensions are acetate, TRIS (a volatile buffer substance), PBS and bicarbonate.
  • Further preferred buffers are, for example, formic acid, acetic acid, picolinic acid, diacetyl acetone, o-, m- and p-cresols, o-, m-, p-CI-phenols, hydroxy-pyridine, isonicotinamide, various pyridines, carbinols, diethanolamine, Benzylamine, pyridine-ethanol and dimethylaminopropionitrile.
  • the list of preferred buffers contains volatile buffer substances, for example, by vacuum centrifugation after
  • suspensions may also comprise other substances, such as essential ions.
  • Such ions can be cationic or be anionic and serve, for example, to stabilize or increase the activity of DNase or other compounds. Preference is given to divalent cations such as Ca 2+ , Fe + , Cu 2 + 1 Mn 2+ and / or Mg 2+ , very particular preference being given to Mn 2+ and / or Mg 2+ .
  • a suspension may simultaneously act as a lysis solution. In this case, the suspension additionally contains all necessary components to carry out a lysis of cells.
  • kits for performing a DNA digestion comprises at least one DNase-coated magnetic particle or at least one suspension containing such particles or all components for producing such a suspension.
  • all components for producing a suspension are in individual, sealed containers.
  • the DNase-coated magnetic particles are already present in the form of a suspension in a sealed container in the kit, wherein the suspension is ready for use (ready to use) or in the form of a concentrate, which in the following order For example, a factor of 1, 2, 4, 8, 16, 20, 50, 100, 250, 500 or 1000 must be diluted.
  • the kit may also contain added additives in sealed containers which may be added to a suspension comprising the DNase-coated magnetic particles. Alternatively, such additives may already be in the suspension in a sealed container.
  • kits additionally contains components for lysing cells and / or a magnet or a device for generating a magnetic field for removing the DNase-coated magnetic particles from the reaction solution.
  • a kit optionally additionally contains instructions for the use of the DNase-coated magnetic
  • Particle / suspension for the digestion of DNA preferably eukaryotic DNA, and / or instructions for separating the DNase-coated magnetic particles.
  • DNA may be prokaryotic (bacteria and archaea) or
  • DNA in the sense of the present invention is a polynucleotide chain which can be recognized and amplified by a DNA polymerase in a PCR step.
  • DNA refers to genomic DNA.
  • DNases By choosing the appropriate DNases to serve as a coating for the DNase-coated magnetic particles, it is thus generally possible to specifically detect bacterial, and / or yeast, and / or fungal DNA from other DNA, such as human DNA isolate or isolate bacterial and / or viral RNA from DNA.
  • isolated or purifying specific DNA refers to removing DNA from a reaction mixture other than the specific DNA of interest. The removal is done by digesting the other DNA.
  • the DNase-coated magnetic particles most preferably serve for the controlled digestion of non-prokaryotic (preferably non-bacterial) DNA in a sample comprising prokaryotic DNA and
  • non-bacterial DNA eukaryotic DNA and. This means; non-bacterial DNA (preferred
  • eukaryotic DNA in a mixed DNA sample is digested by the DNase-coated magnetic particles.
  • the particles according to the invention can be removed from the reaction mixture by a magnet or an object which generates a magnetic field.
  • fungal DNA preferably yeast DNA
  • yeast DNA may be isolated from other DNA such as bacterial DNA or mammalian DNA, more preferably human DNA.
  • the DNase-coated magnetic particles can also be used for the isolation / purification of RNA such as viral and / or bacterial RNA by DNA, preferably animal
  • the DNase-coated magnetic particles can be used to produce DNA free of water. It is not difficult for a person skilled in the art to choose a DNase combination for coating which produces the desired effect.
  • Magnetic particles DNA digested can be biological samples such as environmental samples, food samples or clinical samples.
  • the clinical samples are whole blood, blood serum,
  • Lymphatic fluid or urine A sample may have been treated with other methods such as a lysis method prior to the addition of the DNase-coated magnetic particles / suspensions, or
  • Example without further procedures with a suspension containing DNase-coated magnetic particles are mixed. In the last embodiment, lysis occurs through the suspension.
  • another aspect of the present invention is a method for removing DNA from a sample, preferably from a biological sample, comprising the steps of: a) digesting genomic DNA in a sample
  • the digestion of DNA is preferably in the range of about 5 and about 40 ° C, more preferably in the range of about 20 and about 37 ° C,
  • a sample prior to step a) is subjected to lysis to destroy cells.
  • the lysis of cells occurs in the presence of
  • step a) each in the
  • Sample digested DNA available. This is desirable, for example, if the sample is water that is to be converted to DNA-free water.
  • DNA from certain sources e.g., human DNA
  • DNA from other sources such as bacteria, viruses, or fungi (e.g., yeast)
  • bacteria, viruses, or fungi e.g., yeast
  • the term "essentially undigested” means that after the digestion step with the particles according to the invention more than 50%, more than 70%, more than 80%, preferably more than 90%, more preferably more than 95%, more preferably more than 99%, most preferably 100% of the non-removable DNA (ie the DNA to be isolated / purified) in the
  • Reaction mixture is present based on the amount to be isolated /
  • DNA to be purified in the sample before addition of the DNase-coated magnetic particles can be determined, for example, by comparisons of DNA bands in agarose gels.
  • the genomic DNA to be digested by the DNase-coated magnetic particles is, in the case of isolatable / bacterial or viral DNA to be purified preferably out of DNA
  • a preferred embodiment of the above method is a method of removing eukaryotic DNA (preferably mammalian DNA, more preferably human DNA) from a biological sample, the eukaryotic DNA and viral DNA and / or viral RNA and / or
  • prokaryotic DNA and / or prokaryotic RNA and / or DNA from fungi (such as yeast) and / or bacterial DNA contains from a biological sample comprising the steps: a ') digestion of eukaryotic DNA, preferably of DNA
  • Mammals more preferably of human DNA, in a sample containing eukaryotic DNA and at least one of the following DNA or RNA selected from a group of viral DNA, viral RNA, prokaryotic DNA, prokaryotic RNA, fungal DNA, yeast DNA, bacterial DNA, gram positive bacterial DNA, gram negative bacterial DNA using the DNase-coated magnetic particles or a suspension containing these particles; and b) magnetically removing the DNase-coated magnetic particles from the reaction mixture.
  • DNA or RNA selected from a group of viral DNA, viral RNA, prokaryotic DNA, prokaryotic RNA, fungal DNA, yeast DNA, bacterial DNA, gram positive bacterial DNA, gram negative bacterial DNA using the DNase-coated magnetic particles or a suspension containing these particles.
  • Embodiments other than eukaryotic DNA should preferably be removed from a sample by one or more DNA from others Isolate / clean up sources.
  • a sample prior to performing step a), a sample may be lysed. Further lysis can be carried out after step b). Preference is given to the Second lysis any contamination by DNase removed by addition of proteinase. Also optionally, the methods of the present invention may directly after step b) (or after step b) and further steps such as purification steps, concentration steps or Umpuff ceremoniess Colouren) as step c) contain a PCR or RT-PCR application.
  • the non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA to be isolated is removed from the sample.
  • the non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA to be isolated is bound by means of magnetic particles capable of binding DNA and / or RNA.
  • the supernatant solution is separated from the magnetic particles. It may follow further purification steps.
  • the non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA to be isolated is detached from the magnetic particles capable of binding DNA and / or RNA.
  • the supernatant solution containing the non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA to be isolated may be separated from the magnetic particles.
  • the DNase-coated magnetic particles can be removed quantitatively after digestion of the DNA, that is, at least 99%, preferably at least 99.9% and particularly preferably at least 99.99% or 100% of all particles are prepared by using a magnet or a magnetic field generating apparatus removed from the reaction mixture.
  • the magnetic particles capable of binding DNA and / or RNA may be quantitatively removed after the purification or concentration step, that is, at least 99% preferably at least 99.9%, and most preferably at least 99.99% and 100% of all particles, respectively are removed from the reaction mixture by use of a magnet or a magnetic field generating apparatus.
  • the skilled person is aware of how magnetic particles from a reaction mixture using Magnetism can be removed.
  • magnetic separators can be readily obtained from Bioclone Inc.
  • Reaction mixture (more precisely: from the liquid supernatant) are more
  • Another aspect of the present invention is based on a
  • a sample comprising eukaryotic DNA and non-eukaryotic DNA
  • 200 ⁇ of a lysis buffer is added.
  • the sample is shaken for 15 minutes at 60 ° C in a thermomixer. 50 ⁇ one
  • Suspension containing DNase-coated magnetic particles is added to the sample.
  • the sample is shaken for 15 minutes at 37 ° C in a thermomixer. A sufficiently strong magnetic field is applied. After 5 minutes, the supernatant solution is removed. To the removed supernatant solution is added 20 ⁇ proteinase solution. The solution is shaken for 10 minutes at 56 ° C in a thermomixer. In order to carry out a second lysis, a buffer is added to the solution for 10 min at 95 ° C in a
  • thermomixer Shaking the thermomixer. Subsequently, magnetic particles capable of binding DNA and / or RNA and a buffer solution are added to the thermomixer.
  • the supernatant washing solution is removed in each case with applied magnetic field.
  • a buffer solution is added to the magnetic particles that have bound DNA and / or RNA.
  • the DNA and / or RNA is removed from the magnetic particles.
  • the supernatant solution containing the non-eukaryotic DNA or non-eukaryotic RNA to be isolated is removed from the magnetic particles capable of binding DNA and / or RNA.
  • a PCR or RT-PCR is performed with the DNA and / or RNA in the supernatant solution.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von nicht-eukaryotischer DNS oder nicht-eukaryotischer RNS aus einer Probe unter Verwendung DNase-beschichteter magnetischer Partikel.

Description

DNase-beschichtete magnetische Partikel
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von nicht-eukaryotischer DNS oder nicht-eukaryotischer RNS aus einer Probe unter Verwendung DNase- beschichteter magnetischer Partikel, insbesondere unter Verwendung DNase- beschichteter magnetischer Partikel (Beads) mit einer Teilchengröße von > 10 nm bis < 800 μιη, die zum Beispiel verwendet werden können, um in einer kontrollierten Art und Weise nicht-bakterielle DNS aus einer Probe, die sowohl bakterielle als auch eukaryotische Zellen enthält, zu verdauen. Die
Anwesenheit von eukaryotischer DNS (Desoxyribonukleinsäure) neben prokaryotischer DNS kann, z.B. bei PCR und RT-PCR-Anwendungen, die Ergebnisse in der Detektion von prokaryotischer (bevorzugt bakterieller) DNS stören. Darum ist die Entfernung von eukaryotischer DNS aus einer Probe mit eukaryotischer und prokaryotischer DNS nötig.
[001] DE 10035953 A1 gibt eine Zusammenfassung von Anwendungen bekannter magnetischer Partikel wie Silica-Partikel mit zum Teil einstellbaren Poren- und Teilchengrößen sowie adaptierbarem Magnetgehalt. Magnetische Partikel werden als chromatographische Medien speziell für die Nukleinsäure- Aufreinigung, für die Immobilisierung von Nukleinsäuren und Enzymen in Reinigungsschritten, als Speichermedien, für den Einsatz im Immunoassay und für die Gelpermeationschromatographie eingesetzt. Weitere Magnetpartikel, die ein magnetisches Kernmaterial enthalten und mit einem anorganischen Oxid beschichtet sind, werden in EP 0343 934 offenbart. Polymerpartikel, die mit einer weiteren ein magnetisches Material enthaltenden Polymerschicht beschichtet sind, auf der ein dritter zur Interaktion mit Biomolekülen befähigter Polymerüberzug aufgetragen ist, sind in der PCT Anmeldung FR 97/00912 beschrieben.
BESTÄTIGUNGSKOPIE [002] Magnetische Hybridpartikel, die aus einem Polymerkern bestehen, welcher zunächst mit einem Ferrofluid beschichtet und anschließend mit einem funktionellen Polyacrylat beschichtet wurde, sind Gegenstand der US- Patentschrift 5,648,124. [003] WO 98/58257 offenbart 0.1 bis 500 pm große magnetische Partikel zum Trennen von biologischen Gemischen, die Perlglanzfarbpigmente mit magnetischen Eigenschaften und einen biologischen Polymerüberzug aufweisen. Der Polymerüberzug kann ein Protein sein, jedoch handelt es sich dabei um Proteine zum Binden von Komponenten in Immuno-Assays. [004] Keines dieser Dokumente offenbart oder impliziert die Beschichtung von magnetischen Partikeln mit DNase zum Reinigen von spezifischer DNS in einer Probe, die DNS aus verschiedenen Quellen enthält.
[005] Deoxyribonuklease ist ein Enzym, dass die hydrolytische Spaltung von Phosphodiester-Bindungen in DNS katalysiert. Es gibt zwei Haupttypen von Deoxyribonuklease: DNase I und DNase II. Allerdings wird meist in der
Molekularbiologie DNase I verwendet. Mit Protein-Engineering-Ansätzen zum Austausch von einzelnen Aminosäuren im aktiven Zentrum von DNAse konnte in den letzten Jahren Varianten von Deoxyribonuklease-Wildtypen hergestellt werden, deren katalytische Leistung um mehr als das Zehnfache gegenüber dem Wildtyp DNase verbessert ist. Deoxyribonuklease kann von vielen
Anbieter wie Sigma Aldrich (p/n-D5319 500UG) oder BioLabs (p/n M0303S) käuflich erworben werden.
[006] Deoxyribonuklease wird in vielen molekularbiologischen Techniken wie Isolierung von RNS aus einer DNS / RNS-Gemisch nach Zell-Lyse, PCR und RT-PCR-Anwendungen, DNS-freies Wasser für die Molekularbiologie oder Isolierung von bakterieller DNS aus menschlichen, klinischen Proben
eingesetzt.
[007] Einige kommerziell erwerbbare Isolationskits für genomische DNS aus Bakterien, Pilzen und Hefen sind zum Beispiel: Masterpure DNA-Aufreinigung Kit (Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin), DNA-reine Hefe Genomic Kit (CPG Inc., Lincoln Park, NJ ), Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland), High Pure PCR Template-Erstellung Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), und Magna Pure LC DNA Isolation Kit III (Bakterien, Pilze). [008] In den ersten beiden Kits wird nach Lyse der Zellen und Fällung von Proteinen DNS durch Fällung mit Isopropanol abgetrennt, getrocknet und die DNS-Pellets resuspendiert. In den Qiamp und High Pure Kits wird die
freigesetzte DNS an eine Kieselgel-Membran und folgend an einen Glasfaser- Filter gebunden und jeweils vor der Elusion gewaschen. In der Magna Pure Anwendung wird die DNS, die durch den Einsatz von Lysepuffer freigesetzt wird, an glasüberzogene, magnetische Kügelchen gebunden, die das
Instrument durch mehrere Waschschritte führt. Schließlich wird die DNS eluiert und die Perlen werden verworfen. Weitere Kits von MolYsis, Molzym GmbH & Co. KG, Bremen, Deutschland, Pureprove, SIRS-Lab GmbH, Jena,
Deutschland und Looxter / VYOO von Damen und Herren Lab werden zur selektive Isolierung von bakterieller DNA aus menschlichen klinischen Proben genutzt, wobei menschliche DNS weitgehend beseitigt werden kann, während nachweisbaren Konzentrationen der bakteriellen DNS aus den Proben erhalten wurden. In keiner dieser Ansätze / Kits werden DNase beschichteten
magnetischen Partikel verwendet sondern freie DNase.
[009] Der Nachweis des bakteriellen Inhalts einer bestimmten Probe, irrelevant aus welcher Quelle (z. B. klinische, Lebensmittel- oder Umweltproben), ist nicht so einfach. So ist zum Beispiel in klinischen mikrobiologischen Laboratorien der Goldstandard zum Nachweis und zur Identifizierung von Erregern bei Patienten, bei denen systemischen Infektionen vermutet werden, die Blutkultur. Bei einer Blutkultur, einer mikrobiologischen Untersuchung des Blutes, wird versucht die Krankheitserreger (meist Bakterien), die sich im Blut befinden, kulturell anzuzüchten. Diese Technik ist auch die Grundlage der ISO-Normen.
Allerdings ist diese Technik dafür bekannt, viele Nachteile zu haben,
insbesondere im Hinblick auf nicht-kultivierbare Organismen, geringe Abundanz (längere Lag-Phase) der möglichen Erreger und Antibiotika-Behandlungen von Patienten. Außerdem dauert es in der Regel 3 bis 5 Tage, um ein Ergebnis aus Blutkulturen zu erhalten, die oft zu spät ist, um die richtige Antibiotika-Therapie einzuleiten.
[0010] Amplification-basierte Methoden wie PCR-Ergebnisse erlauben eine schnellere Art und Weise. Allerdings sind ihre Empfindlichkeit bis dato nicht besser und manchmal schlechter, als Kultur-basierten Methoden.
[0011] Somit gibt es in all diesen oben aufgezählten Methoden Limitierungen und Nachteile. Typischerweise muss bei diesen Methoden frei eingesetzte DNase nach dem Verdau von störender DNS durch zeitaufwendige
Zentrifugationssch ritte vor nachgelagerten Anwendungen entfernt werden. Weiterhin sind Protokolle für die Verdauung von störender DNS unter
Verwendung freier DNase schwer zu automatisieren.
[0012] Zusammenfassend kann gesagt werden, dass im Stand der Technik DNase erst zeitaufwendig entfernt werden muss, bevor z.B. bakterielle DNS in weiteren Schritten vervielfältigt und/oder analysiert oder anderweitig verwendet wird.
[0013] Es besteht demnach eine klare Nachfrage in der
Gesundheitsversorgung für die schnelle Isolierung von PCR-fertige DNS aus pathogenen grampositiven oder gramnegativen Bakterien in verschiedenen biologischen Proben.
[0014] Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst. Die DNase-beschichteten magnetischen Partikel ermöglichen eine vereinfachte und schnelle Aufreinigung von, z.B. bakterieller DNS aus einer Probe mit
eukaryotischer DNS durch eine einfache, magnetische Abtrennung der an die Partikel gebundenen DNase nach der Verdauung der störenden eukaryotischen DNS.
[0015] Das erfindungsgemäße Verfahren zum Isolieren von nicht- eukaryotischer DNS oder nicht-eukaryotischer RNS aus einer Probe umfasst die folgenden Schritte a) Verdauen der eukaryotischen DNS in der Probe mit Hilfe von DNase- beschichteten magnetischen Partikel; und
b) Entfernen der DNase-beschichteten magnetischen Partikel aus dem in Schritt a) erhaltenen Reaktionsgemisch. [0016] Vor Schritt a) kann eine Lyse von eukaryotischen Zellen durchgeführt werden. Nach Schritt b) kann eine Lyse von nicht-eukaryotischen Zellen durchgeführt werden.
[0017] In einer besonderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich den folgenden Schritt
c) PCR oder RT-PCR-Anwendung mit dem in Schritt b) erhaltenen
Reaktionsgemisch. Zwischen dem Schritt b) und dem Schritt c) können
Aufreinigungsschritte und/oder Konzentrierungsschritte und/oder
Umpufferungsschritte durchgeführt werden.
[0018] Die Probe, aus der nicht-eukaryotische DNS oder nicht-eukaryotische RNS isoliert wird, umfasst weiterhin eukaryotische DNS. Bevorzugt handelt es sich um eine biologische Probe.
[0019] In einer Ausführungsform ist die nicht-eukaryotische DNS oder RNS wenigstens eine DNS und/oder RNS ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus viraler DNS, viraler RNS, prokaryotischer DNS, DNS aus Pilzen und bakterieller DNS. Bevorzugt ist die nicht-eukaryotische DNS DNS aus
Prokaryoten, besonders bevorzugt aus gram-positiven oder gram-negativen Bakterien. Ebenfalls bevorzugt ist die nicht-eukaryotische DNS DNS aus Pilzen, besonders bevorzugt aus Hefe.
[0020] Entsprechend besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung in DNase- beschichteten magnetischen Partikeln (Beads) mit einer Teilchengröße von > 10 nm bis < 800 pm, bevorzugt mit einer Teilchengröße von > 100 nm bis < 20 pm, besonders bevorzugt mit einer Teilchengröße von > 0.5 bis < 2 pm und ganz besonders bevorzugt von > 900 nm bis < 1 ,3 pm. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Partikel eine Teilchengröße von > 500 nm bis £ 2 pm und der mittlere Durchmesser der erfindungsgemäßen Partikel (d 0,9) beträgt zwischen > 900 nm und < 1 ,3 pm. Es ist zu verstehen, dass die Teilchengrößen und mittleren Durchmesser der erfindungsgemäßen Partikel jeden Wert zwischen den angegebenen Größen annehmen können. [0021] In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die im
erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten DNase-beschichteten
magnetischen Partikel eine Teilchengröße von > 10 nm bis < 800 μιτι, besonders bevorzugt eine Teilchengröße von > 100 nm bis < 20 pm, am meisten bevorzugt eine Teilchengröße von > 900 nm bis < 1 ,3 pm auf. Die DNase-beschichteten magnetischen Partikel können eine Teilchengröße zwischen > 500 nm und < 2 μητι besitzen. Bevorzugt besitzen die Partikel eine Teilchengröße zwischen > 500 nm und < 2 pm und der d 0,9 der Partikel liegt zwischen 900 nm und 1 ,3 pm.
[0022] In bevorzugten Ausführungsformen sind die Kerne der
erfindungsgemäßen Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I beschichtet, oder mit einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet, oder mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I und einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet, bevorzugt, wobei eine oder mehrere DNase(n) stabiler als der entsprechende Wildtyp ist (sind), eine höhere Aktivität gegen
eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist (aufweisen) oder eine höhere Spezifität gegen eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist (aufweisen). Zum Beispiel ist Turbo™ DNase, die eine stark erhöhte Aktivität aufweist eine derartige bevorzugte DNase-Form. In einer bevorzugten Ausführungsform weist eine oder weisen mehrere DNase(n) eine höhere Aktivität gegen eukaryotische DNS als der entsprechende Wildtyp und/oder eine höhere Spezifität gegen
eukaryotische DNS als der entsprechende Wildtyp auf.
[0023] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist DNase auf die Kerne der erfindungsgemäßen Partikel über einen Abstandshalter (Spacer), bevorzugt Gelatine, BSA, PEG oder Tosyl, immobilisiert. [0024] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Suspension aus DNase-beschichteten magnetischen Partikeln. Im erfindungsgemäßen
Verfahren können die DNase-beschichteten magnetischen Partikel vor oder während Schritt a), bevorzugt vor Schritt a) als Suspension zu der Probe dazugeben werden.
[0025] In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Konzentration der DNase-beschichteten magnetischen Partikel in der erfindungsgemäßen
Suspension im Bereich von etwa 0,1 und etwa 100 mg / ml, bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 und etwa 50 mg / ml, und besonders bevorzugt im
Bereich von etwa 1 und etwa 20 mg / ml.
[0026] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die DNase- Konzentration durch die erfindungsgemäßen Partikel in der Suspension im Bereich von etwa 100 und etwa 20.000 U / ml, bevorzugt im Bereich von etwa 100 und etwa 10.000 U / ml, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 2000 U / ml, und ganz besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 600 U / ml liegt.
[0027] In ebenfalls einer bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Bereich der Suspension im Bereich von etwa pH 4 und etwa pH 8, bevorzugt im Bereich von etwa 4,5 und etwa 8,5. [0028] In noch einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Suspension zusätzlich divalente Kationen, vorzugsweise Mg2+ und/oder Mn2+. In einer weiteren Ausführungsform weist die Probe im Schritt a) zusätzlich divalente Kationen auf, vorzugsweise Mg2+ und/oder Mn2+.
[0029] Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder der diese Partikel enthaltene Suspension zum Abbau von DNS in einer (vorzugsweise biologischen) Probe oder Matrix. [0030] In einer bevorzugten Ausführungsform sind DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder eine diese Partikel enthaltene Suspension
Bestandteil eines bakteriellen DNS Isolation Kits.
[0031] Entsprechend handelt ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung von einem Kit umfassend mindestens ein DNase-beschichtetes magnetisches Partikel oder mindestens eine diese Partikel enthaltene Suspension oder alle Komponenten zur Herstellung einer solchen Suspension wie DNase- beschichtete magnetische Partikel und zum Beispiel Puffersubstanzen.
Erfindungsgemäß umfasst das Kit mindestens ein DNase-beschichtetes magnetisches Partikel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
[0032] Das erfindungsgemäßeVerfahren zum Entfernen von DNS aus biologischen Proben umfasst die folgenden Schritte: a) Verdauen von genomischer DNS in einer Probe unter Verwendung der DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder einer diese Partikel enthaltenen Suspension, b) Entfernen der DNase-beschichteten magnetischenPartikel aus dem
Reaktionsgemisch.
[0033] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probe eukaryotische DNS und virale DNS und/oder virale RNA und/oder prokaryotische DNS und/oder DNS aus Pilzen (wie Hefe) und/oder bakterielle DNS und/oder RNS und die zu verdauende DNS ist eukaryotische DNS, bevorzugt menschliche DNS, und die zu isolierende /aufzureinigende DNS ist prokaryotische, besonders bevorzugt bakterielle, DNS oder bakterielle RNS.
[0034] In einer weitere bevorzugten Ausführungsform ist die durch das Verfahren zu isolierende / aufzureinigende DNS DNS aus Prokaryoten, bevorzugt aus gram positiven oder gram negativen Bakterien; oder DNS aus Pilzen, bevorzugt Hefe.
[0035] In einer weitere bevorzugten Ausführungsform ist die durch das
Verfahren zu isolierende / aufzureinigende RNS RNS aus Prokaryoten, bevorzugt aus gram positiven oder gram negativen Bakterien, oder Viren. [0036] Der Verdau des erfindungsgemäßen Verfahrens findet bevorzugt im Bereich von etwa 5 und etwa 40 °C, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 20 und etwa 37 °C statt.
[0037] Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Erhöhung der Empfindlichkeit 5 in der bakteriellen DNS-Isolation (oder RNS-Isolation) und Identifikation aus verschiedensten Proben. Gleichzeitig ermöglichen die erfindungsgemäßen Partikel, Suspensionen und Methoden eine schnellere und vereinfachte
Abtrennung von DNase nach dem Verdau potentiell störender DNS aus einer Probe, d. h. die Aspekte der vorliegenden Erfindung ermöglichen ein Entfernen i o von spezifischen DNS aus biologischen Proben, die sowohl störende als auch zum Beispiel DNS von Interesse enthalten, ohne weitere Kontamination mit DNase. Das Entfernen von DNS erfolgt durch Verdau mit DNase der
erfindungsgemäßen Partikel.
[0038] Mit Hilfe der DNase-beschichteten magnetischen Partikel kann die
15 Isolierung von PCR-bereiter prokaryotische DNS vereinfacht werden, und in einer kürzeren Zeit erreicht werden als mit Methoden des Standes der Technik, bei denen zunächst Bakterien aus einer Probe isoliert werden müssen. Zudem ermöglicht die Verwendung von den DNase-beschichteten magnetischen Partikeln einfachere, automatisierte und sichere Protokolle welche ein völlig 20 automatisiertes Entfernen von DNase nach erfolgter Verdauung von
unerwünschter DNS aus einer Probe ermöglichen ohne auf
Zentrifugationssch ritte oder Adsorptionsschritte wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, zurückgreifen zu müssen.
[0039] Diese Protokolle sind speziell ein Vorteil in klinische Anwendungen für 25 die Nachweis von pathogenen DNS in menschlichen Proben (z.B. Vollblut).
[0040] Die Partikel, Suspensionen und Verfahren der Isolation prokaryotischer DNS erlauben die Kombination von effizienter Lyse der Zellen einer Probe mit einem bestimmten Lysepuffer zur Extraktion von genomischer DNS aus eukaryotischen Zellen mit der gesamten Verdauung von eukaryotischer DNS 30 mit Hilfe der DNase-beschichteten magnetische Partikel. [0041] Nach abgeschlossener Verdauung der eukaryotischen DNS können die magnetischen Partikel der vorliegenden Erfindung einfach magnetisch entfernt werden, so dass das Reaktionsgemisch nach dem Verdauungsschritt durch die DNase-beschichteten magnetischen Partikel nun die Bakterien-DNS von Interesse und daneben Zelltrümmer und DNS-Fragmente resultierend aus der früheren Lyse und dem DNS-Verdauungsschritt enthält.
[0042] Der Fachmann wird verstehen, dass die Ausdrücke„ein" und„eine", wenn sie in der vorliegenden Anmeldung gebraucht werden, je nach
Sachverhalt„ein (1)",„mindestens ein (1)" oder„ein (1) oder mehr" bedeuten kann.
[0043] Die DNase-beschichteten magnetischen Partikel bestehen aus einem Kern, der mit DNase beschichtet ist. Dabei kann DNase direkt auf dem Kern immobilisiert sein oder, bevorzugt, durch Platzhalter (Spacer) mit dem Kern der Partikel verbunden sein.
[0044] Der Kern der DNase-beschichteten, magnetischen Partikel der vorliegenden Erfindung ist an sich bekannt. Ohne limitierend zu sein können solche magnetischen Partikel zum Beispiel aus Silika und/oder einer Vielzahl unterschiedlicher Polymere, wie zum Beispiel Polystyrol, vernetztes Polystyrol, Polyacryl, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Poly (Lactidcoglycolide),
Polyanhydride, Poly(Methylmethacrylat), Poly(Ethylen-Co-Vinyl-Acetat), Polysiloxane, polymere Kieselsäure, Latex, Dextran-Polymere und
Epoxidharze, wobei Silika bevorzugt ist, und einem magnetischen Füllstoff hergestellt werden.
[0045] Bei besagten magnetische Füllstoffe handelt es sich, ohne limitierend zu sein, zum Beispiel um Eisen, Eisensilikone, Nickel, Kobalt oder Legierungen jedes dieser Metalle mit Molybdän, Chrom, Kupfer, Vanadium, Mangan, Aluminium oder Titan, Eisen-Oxide (Fe3O oder gamma Fe2Ü3) in reiner Form oder in Verbindung oder Vermischung mit andere Oxiden wie Oxiden von Kobalt, Mangan, Zink, Barium oder seltenen Erden, oder Chromdioxid. [0046] Zum Beispiel liegen die magnetischen Füllstoff üblicherweise in Form von Partikeln vor, die hinreichend fein sind, dass sie in die Polymer-Partikel des Kerns aufgenommen werden können. In der Regel sind die magnetischen Füllstoffe 0,005 bis 10 pm groß. Die magnetischen Partikel werden in der Regel durch Mischen der magnetischen Füllstoff mit dem Polymer und/oder Silika durch konventionelle Methoden der Masse-, Lösungs-, Emulsions- oder
Suspensionspolymerisation hergestellt, können aber auch auf jedem anderen dem Fachmann bekannten Weg hergestellt werden, wie zum Beispiel
Beschichten eines Silikakerns mit einem magnetischen Material, dass dann, optional, wiederum mit einer weiteren Schicht wie zum Beispiel einem Polymer, beschichtet wird.
[0047] Dem Fachmann ist geläufig, wie verschiedene magnetische Kerne in Abhängigkeit von den zu verwendenden Materialen hergestellt werden können. Kerne zur Herstellung der DNase-beschichteten magnetischen Partikel sind nicht auf die hier beschriebenen Möglichkeiten beschränkt, vielmehr sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik weitere, mögliche magnetische Kerne bekannt, die ebenfalls geeignet sind DNase-beschichtete magnetische Partikel herzustellen. Viele magnetische Kerne im Sinne der vorliegenden Erfindung sind zum Beispiel in DE 10035953 A1 beschrieben. Diese Kerne sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
[0048] Bei dem Begriff„DNase" wie in der vorliegenden Anmeldung gebraucht fallen alle nukleolytischen Enzyme (d. h. Nukleasen, EC-Klasse 3.1), die DNS zerkleinern. Typische Restriktions-Enzyme sind dem Fachmann bekannt.
Bevorzugt handelt es sich bei DNasen jedoch um Deoxyribonukleasen, die die hydrolytische Spaltung von Phosphodiester-Bindungen im DNS-Rückrat katalysiert. Deoxyribonukleasen verdauen Einzel-und Doppelstrang-DNS zu einer Mischung aus Mono-und Oligonukleotiden, die jeweils einen 5'-Phosphat und einen 3'-OH Terminus aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst sowohl den Einsatz von Dnase-Wildtypen als auch den Einsatz von zum
Beispiel rekombinanter DNase oder durch„enzyme engineering" hergestellte
Varianten, die zum Beispiel eine erhöhte katalytische Leistung bezogen auf den jeweiligen Wildtyp aufweisen und/oder eine höhere Selektivität bezüglich DNS aus verschiedenen Quellen wie bakterielle DNS, Pilz-DNS oder DNS aus Säugetieren (z. B. menschliche DNS). Es gibt zwei Haupttypen von
Deoxyribonukleasen, die als DNase I und DNase II bekannt sind. Die
katalytische Aktivität der DNase I ist abhängig von der
Anwesenheit/Abwesenheit zweiwertigen Ionen. Zum Beispiel hydrolysiert DNase I in Anwesenheit von Mg2+ zufällig und unabhängig einen Strang einer doppelsträngigen DNS. In Gegenwart von Mn2+ werden beide Stränge gespalten.
[0049] Unter dem Begriff„Verdauung" bzw.„Verdau" im Sinn der vorliegenden Anmeldung wird die enzymatische Fragmentierung von Oligonukleotiden (DNS) aus einer spezifischen Quelle (zum Beispiel nicht-bakterielle DNS) in
Nukleotideinheiten (Mono bzw. kleinere Oligonukleotide) mittels DNase von DNase-beschichteter magnetischer Partikelen der vorliegenden Erfindung verstanden, wobei die entstehenden Nukleotideinheiten nicht von einer DNS- Polymerase in einem nachfolgenden PCR-Schritt (PCR - Polymerase Chain Reaction) erkannt werden, bzw. nicht vervielfältigt werden. Dem Fachmann ist bekannt, welche Polymerasen in einer PCR-Schritt eingesetzt werden können. Dem Fachmann sind zudem Verfahren zum Messen von DNS-Degradierung (Verdau), zum Beispiel mittels Agarosegelen, bekannt.
[0050] Unter der spezifischen Aktivität von DNase wird die Fähigkeit des Enzyms verstanden 1 pmol doppelsträngige DNS (dsDNS) pro Minute unter Standardbedingungen zu spalten.
[0051] DNase Aktivität kann zum Beispiel wie im Folgenden bestimmt werden: Inkubation einer Probe mit 100,000 cpm 32p-DNS plus 80 lg/ml nichtradioaktiver Lachssperma DNS in DNase Puffer (10 mM Tris-HCI pH 7, 4 mM MgCI2, 4 mM CaCI2) für 45 min bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe eines halben Volumens der nicht-radioaktiven DNS (2 mg/ml) und einem Volumen eiskalter 20% Trichloressigsäure abgebrochen. Nach 10 min auf 4 °C wird das Reaktionsgemisch 10 min bei 12.000 g zentrifugiert, ein Aliquot des Überstandes wird gemessen. Die gemessenen Ausschläge der säurelöslichen DNS Fragmente im Überstand reflektieren die DNase-Aktivität.
[0052] Die Kerne der DNase-beschichteten magnetischen Partikel können mit einer DNase oder mit verschiedenen DNasen in unterschiedlichen oder gleichen Aktivitätsanteilen beschichtet werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform sind die Kerne der Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I beschichtet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Kerne der Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet. In einer dritten bevorzugten Ausführungsform sind die Kerne der Partikel mit einer oder mehreren DNasen vom Typ I und einer oder mehreren DNasen vom Typ II beschichtet sind. Dabei können die verschiedenen DNasen aus derselben Lebensform oder unterschiedlichen Lebensformen stammen. Zum Beispiel kann eine DNase menschlichen Ursprungs oder eine Variante einer
menschlichen DNase sein und eine weitere DNase kann aus einem anderen Säugetier, einer Pflanze oder einem Pilz stammen oder eine Variante einer derartigen DNase sein.
[0053] Die Beschichtung der Kerne der DNase-beschichteten magnetischen Partikel mit DNase erfolgt durch Immobilisierung von DNase an der
Kernoberfläche. Die Immobilisierung der DNase kann entweder direkt oder über eine Verlinkung mittels eines Abstandshalters (Spacers) erreicht werden, wobei eine Beschichtung mittels Immobilisierung von DNase über einen Spacer eine bevorzugte Ausführungsform ist.
[0054] Die Immobilisierung umfasst dabei sowohl die kovalent Bindung von DNase an die Kernoberfläche bzw. an einen Spacer als auch die Bindung der DNase an die Kernoberfläche oder einen Spacer durch, z.B., hydrophobe Wechselwirkungen. Bevorzugt wird DNase jedoch kovalent an die
Kernoberfläche oder den Spacer gebunden.
[0055] Immobilisierung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass während eines Verdauungsschrittes und unter den Bedingungen eines
Verdauungsschrittes von DNS durch die immobilisierte DNase und dem anschließenden Entfernen der DNase-beschichteten magnetischen Partikel mehr als 95%, 98%, 99%, 99.5% bevorzugt mehr als 99,9% und besonders bevorzugt 99,99% ganz besonders bevorzugt 100% der DNase an den
Kernen/Spacern der DNase-beschichteten magnetischen Partikel gebunden bleibt.
[0056] In einer bevorzugten Ausführungsform ist DNase durch einen Spacer mit dem Kern der DNase-beschichteten magnetischen Partikel verbunden. Ohne daran gebunden zu sein wird davon ausgegangen, dass die Spacer die biologische Aktivität der gebundenen DNase beeinflussen, da so eine sehr gute Verfügbarkeit der aktiven Zentren des Enzyms erreicht wird. Dabei scheint die Länge der Spacer eine Rolle zu spielen. Auch wird davon ausgegangen, dass durch den Einsatz von Spacern die unspezifische Bindung von DNS und Zellrückständen aus Bakterien, Hefe, Pilzen oder Eukaryonten an die
Kernoberfläche der DNase-beschichteten magnetischen Partikel vermindert werden kann. Bevorzugt wird die Bindung an die Kernoberfläche der DNase- beschichteten magnetischen Partikel durch Spacer zu über 80%, 90%, 95%, besonders bevorzugt zu über 99%, und ganz besonders bevorzugt zu 100% verhindert. Besonders bevorzugt wird DNase auf die Kernoberfläche über Block-Spacer wie große Proteine (zum Beispiel BSA) immobilisiert. [0057] Als Spacer im Sinne der vorliegenden Erfindung gelten zum Beispiel Verbindungen mit einer oder mehreren bifunktionellen Reaktionsgruppen zu verstehen, wie beispielsweise : (1) Diamine der Formel NH2-RI-NH2, wobei R1 eine C2-C2o-Alkylgruppe sein kann, (2) Aminosäuren, mit der allgemeinen Formel NH2-R2 -CO2H, wobei R2 eine Ci-C2o-Alkylgruppe sein kann und (3) Dialdehyde, mit der Formel OHC-R3-CH0, wobei R3 eine Ci-C2o-Alkylgruppe sein kann. Zwei oder mehr Verbindungsgruppen können gekoppelt werden, um die Spacer-Länge zu erhöhen. Beispiele für geeignete Spacer umfassen 6- Aminocapronsäure, 1 ,6-Diaminohexan, 1 ,12-Diaminododecan, Glutaraldehyd, und Mixturen daraus. Weitere bevorzugte Spacer sind Gelatine, tosyl
(CH3C6H4SO2), PEG (Polyethylenglycol), PEO (Polyethylenoxid), POE (Polyoxiethylen) und große Proteine mit einer Größe größer 30 kDa, bevorzugt größer 45 kDa besonders bevorzugt größer 60 kDa wie zum Beispiel BSA.
[0058] In einer bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besitzen Spacer mindestens eine Länge von 10, 20, 50 oder 100 Kohlenstoffatome oder Spacer sind Proteine, wobei diese Proteine bevorzugt eine Größe von über 5 kDa, über 10 kDa, über 20 kDa, über 30 kDa, besonders bevorzugt über 50 kDa aufweisen, oder Spacer sind Polymere, wobei die Polymere bevorzugt eine Größe von über 1 ; 2,5; 5; 10; 15; 20 oder 30 kDa aufweisen.
[0059] In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Kern eine funktionalisierte Oberfläche mit einer Vielzahl von reaktiven, funktionellen
Gruppen. Die DNase ist somit direkt kovalent an eine funktionelle Gruppe an der Oberfläche, oder einem Spacer der entsprechenden Länge, der kovalent an eine oder mehrere dieser funktionellen Gruppe gebunden ist, gebunden. Nach ausgiebigem Waschen des Trägers mit einer funktionalisierten Oberfläche, wird die biologisch aktive Einheit (DNase) oder ein Spacer, an den später die biologisch aktive Einheit (DNase) gebunden wird (vorzugsweise kovalent), an eine funktionelle Gruppe der Kernoberfläche (vorzugsweise kovalent) gebunden.
[0060] Dem Fachmann bereitet es keine Schwierigkeiten entsprechende Kupplungsreaktionen für die Immobilisierung von DNase durchzuführen.
Bekannte und akzeptierte Verfahren zur Immobilisierung sind zum Beispiel: (1) die Verwendung von wasserlöslichen Carbodiimiden bei der Reaktion von einer Carboxylgruppe auf der funktionalisierten Kernoberfläche und einem frei zugänglichen Amino-Gruppe auf der DNase, um wahrscheinlich eine stabile Amidbindung zu formen; (2) die Verwendung von bifunktionellen Aldehyden
(z. B. Glutaraldehyd) die als Spacer eine Amino-Gruppe auf der Kernoberfläche und eine frei zugänglichen Amino-Gruppe auf der DNase verbinden; (3) die Verwendung von Bromcyan in der Reaktion einer Hydroxylgruppe auf der Kernoberfläche mit einer Aminogruppe auf einem Spacer oder einer DNase bzw. einer Hydroxylgruppe auf einem Spacer und einer Aminogruppe auf einer DNase; (4) der Einsatz von EDS/N HS EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide) oder (5) der Einsatz von Tosyl-Gruppen.
[0061] Vorzugsweise haben die DNase-beschichteten magnetischen Partikel der vorliegenden Erfindung eine Teilchengröße von > 10 nm bis < 800 pm, bevorzugt eine Teilchengröße von > 100 nm bis < 20 μιτι, besonders bevorzugt eine Teilchengröße von > 500 nm bis < 2 μιη und ganz besonders bevorzugt eine Teilchengröße von > 900 nm bis £ 1 ,3 pm. In einer bevorzugten
Ausführungsform besitzen die DNase-beschichteten magnetischen Partikel eine Teilchengröße von > 500 nm bis < 2 pm und der mittlere Durchmesser von 90% der DNase-beschichteten magnetischen Partikel (d 0,9) liegt zwischen > 900 nm und < 1 ,3 pm. Die Größe der Partikel kann unter Verwendung der üblichen Techniken manipuliert werden und zum Beispiel mittels Laser
Diffraktometrie bestimmt werden. Vorzugsweise haben die Partikel Kugelform.
[0062] Im oder vor Schritt a) können Suspensionen aus den DNase- beschichteten magnetischen Partikeln zur Probe gegeben werden.
[0063] Vorzugsweise, liegt der pH-Wert dieser Suspensionen sowohl vor als auch nach Zugabe der Suspension zu einer Probe oder der Probe zu einer Suspension im Bereich von etwa pH 2 und etwa pH 10, mehr bevorzugt im Bereich von etwa pH 4,5 und etwa pH 8,5 und besonders bevorzugt im Bereich von etwa pH 6 und etwa pH 8. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen liegt der pH Wert der Suspensionen am pH Optimum zumindest einer der immobilisierten DNasen.
[0064] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert einer Suspension durch einen Puffer eingestellt. Im Hinblick auf die absolute Konzentration einer Puffersubstanz in einer Suspension für die erfolgreiche Durchführung von zum Beispiel Verdau eukaryotischer DNS wird der
Fachmann erkennen, dass es keine strenge Regel geben kann, obwohl es in der Regel zu verstehen ist, dass die Konzentration einer Puffersubstanz hoch genug sein sollte, um eine ausreichende Pufferung des pH-Wertes der
Suspension bei Zugabe einer Probe zu der Suspension oder bei der Zugabe der Suspension zu einer Probe zu erreichen, aber gleichzeitig so niedrig wie möglich sein sollte um spätere Ansätze der zum Beispiel von eukaryotischer DNS befreiten Reaktionsgemisch (bestehend aus einer Probe und einer erfindungsgemäßen Suspension) so wenig wie möglich zu beeinflussen. [0065] Mit den oben genannten Grundsätzen im Auge, liegt die Konzentration von mindestens einer Puffersubstanz in einer Suspension vor Zugabe einer Probe in bevorzugten Ausführungsformen im Bereich von etwa 1 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 500 mM, etwa 10 mM und etwa 250 mM, bevorzugt im Bereich von etwa 100 mM und etwa 250 mM. Der Fachmann wird verstehen, dass nach Vermischen einer Probe und einer Suspension die Pufferkonzentration eine Mindestkonzentration nicht
unterschreiten sollte um eine ausreichende Pufferkapazität und einen stabilen pH-Wert des Reaktionsgemisches noch zu gewährleisten. Entsprechend liegt die Konzentration mindestens einer Puffersubstanz nach Vermischen einer Probe und einer Suspension im Bereich von etwa 1 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 1 M, etwa 10 mM und etwa 500 mM, etwa 10 mM und etwa 250 mM, bevorzugt im Bereich von etwa 100 mM und etwa 250 mM.
[0066] Besonders bevorzugte Puffer für Suspensionen sind Acetat, TRIS (eine flüchtige Puffersubstanz), PBS und Bicarbonat. Weitere bevorzugte Puffer sind zum Beispiel Ameisensäure, Essigsäure, Pikolinsäure, Diacetyl Aceton, o-, m- und p-Kresolen, o-, m-, p-CI-Phenole, Hydroxy-Pyridin, Isonikotinsäureamid, verschiedene Pyridine, Carbinolen, Diethanolamin, Benzylamin, Pyridin-Ethanol und Dimethylaminopropionitril. Die Liste bevorzugter Puffer enthält flüchtige Puffersubstanzen, die zum Beispiel durch Vakuumzentrifugation nach
beendeter Verdauung leicht aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden können. Es versteht sich, dass die vorstehende Liste nicht erschöpfend sein soll oder in irgendeiner Weise limitierend sein soll, der Fachmann ist in der Lage zahlreichen andere möglichen Buffersubstanzen zu finden, die zum Beispiel nicht leicht flüchtig sind. [0067] Zusätzlich zu Puffersubstanzen können Suspensionen auch weitere Stoffe umfassen wie essentielle Ionen. Solche Ionen können kationisch oder anionisch sein und zum Beispiel der Stabilisierung oder Aktivitätserhöhung von DNase oder anderen Verbindungen dienen. Bevorzugt sind divalente Kationen wie Ca2+, Fe +, Cu2+1 Mn2+ und/oder Mg2+, ganz besonders bevorzugt sind Mn2+ und/oder Mg2+. [0068] Zusätzlich kann eine Suspension in einer Ausführungsform gleichzeitig als Lyse-Lösung fungieren. In diesem Fall enthält die Suspension zusätzlich alle nötigen Komponenten um eine Lyse von Zellen durchzuführen. Dem
Fachmann ist in diesem Fall bekannt, welche Zusätze nötig sind.
[0069] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Durchführung eines DNS-Verdaues. Dieses Kit umfasst mindestens ein DNase- beschichtetes magnetisches Partikel oder mindestens eine solche Partikel enthaltene Suspension oder alle Komponenten zur Herstellung einer solchen Suspension.
[0070] In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich alle Komponenten zur Herstellung einer Suspension in einzelnen, abgeschlossenen Behältnissen.
[0071] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die DNase- beschichteten magnetischen Partikel bereits in Form einer Suspension in einem abgeschlossenen Behältnis im Kit vor, wobei die Suspension entweder benutzungsfertig (ready to use) ist oder in Form eines Konzentrates vorliegt, das im folgenden um zum Beispiel einen Faktor 1 , 2, 4, 8, 16, 20, 50, 100, 250, 500 oder 1000 verdünnt werden muss. Dem Kit können auch weitere Additive in abgeschlossenen Behältnissen zugefügt sein, die einer Suspension umfassend die DNase-beschichteten magnetischen Partikel zugesetzt werden können. Alternativ können sich derartige Additive bereits in der Suspension in einem abgeschlossenen Behältnis befinden.
[0072] Wahlweise enthält ein Kit zusätzlich Komponenten zur Lyse von Zellen und/oder einen Magneten bzw. ein Gerät zur Erzeugung eines magnetischen Feldes zur Entfernung der DNase-beschichteten magnetischen Partikel aus der Reaktionslösung. [0073] In einer weiteren Ausführungsform enthält ein Kit wahlweise zusätzlich Anweisungen für die Nutzung der DNase-beschichteten magnetischen
Partikel/Suspension für den Verdau von DNS, bevorzugt von eukaryotischer DNS, und/oder Anweisungen zum Abtrennen der DNase-beschichteten magnetischen Partikel.
[0074] DNS kann prokaryotischen (Bakterien und Archaeen) oder
eukaryotischen (von Pflanzen, Tieren und Pilzen) Ursprungs sein. DNS im Sinn der vorliegenden Erfindung ist eine Polynukleotidkette, die von einer DNS- Polymerase in einem PCR-Schritt erkannt und vervielfältigt werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird unter DNS genomische DNS verstanden.
[0075] Durch Wahl der entsprechenden DNasen, die als Beschichtung der DNase-beschichteten magnetischen Partikel dienen, ist es so im allgemeinen möglich spezifisch Bakterien-, und/oder Hefe-, und/oder Pilz-DNS von anderer DNS wie zum Beispiel menschlicher DNS zu isolieren oder bakterielle und/oder virale RNS von DNS zu isolieren.
[0076] Die Ausdrücke„Isolieren" bzw.„Aufreinigen" von spezifischer DNS wie in der vorliegenden Anmeldung benutzt, beziehen sich auf das Entfernen von anderer DNS aus einem Reaktionsgemisch als der spezifischen DNS von Interesse. Die Entfernung erfolgt durch Verdau der anderen DNS.
[0077] Die DNase-beschichteten magnetischen Partikel dienen besonders bevorzugt dem kontrollierten Verdau von nicht-prokaryotischer (bevorzugt nichtbakterieller) DNS in einer Probe umfassend prokaryotische DNS und
eukaryotische DNS und. Das heißt; nicht-bakterielle DNS (bevorzugt
eukaryotische DNS, besonders bevorzugt menschliche DNS) in einer Probe mit gemischter DNS wird durch die DNase-beschichteten magnetischen Partikel verdaut. In einem optional folgenden Schritt können die erfindungsgemäßen Partikel durch einen Magneten oder ein Gegenstand, der ein magnetisches Feld erzeugt, aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. [0078] In weiteren Ausführungsformen können Pilz-DNS, bevorzugt Hefe-DNS von anderer DNS wie bakterieller DNS oder Säugetier-DNS, besonders bevorzugt menschlicher DNS, isoliert werden.
[0079] Die DNase-beschichteten magnetischen Partikel können jedoch auch zur Isolierung/Aufreinigung von RNS wie zum Beispiel viraler und/oder bakterieller RNS eingesetzt werden indem DNS, vorzugsweise tierische
(besonders bevorzugt menschliche DNS) durch die DNase-beschichteten magnetischen Partikel verdaut wird.
[0080] In einer weiteren Ausführungsform können die DNase-beschichteten magnetischen Partikel zur Herstellung von DNS-freiem Wasser genutzt werden. Es bereitet dem Fachmann dabei keine Schwierigkeiten eine DNase- Kombination zum Beschichten zu wählen, die den gewünschten Effekt hervorbringt.
[0081] Bei den Proben, aus denen mit den DNase-beschichteten
magnetischen Partikeln DNS verdaut wird, kann es sich um biologische Proben wie Umweltproben, Nahrungsproben oder klinische Proben handeln. Bevorzugt handelt es sich bei den klinischen Proben um Vollblut, Blutserum,
Lymphflüssigkeit oder Urin. Eine Probe kann vor der Zugabe der DNase- beschichteten magnetischen Partikeln/Suspensionen mit anderen Verfahren wie zum Beispiel einem Lyseverfahren behandelt worden sein oder zum
Beispiel ohne weitere Verfahren mit einer Suspension, die DNase-beschichtete magnetische Partikel enthält, vermischt werden. In der letzten Ausführungsform erfolgt die Lyse durch die Suspension.
[0082] Entsprechend handelt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung von einem Verfahren zum Entfernen von DNA aus einer Probe, bevorzugt aus einer biologischen Probe, umfassend die Schritte: a) Verdauen von genomischer DNS in einer Probe unter
Verwendung der erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder einer erfindungsgemäßen
Suspension; und b) Magnetisches Entfernen der erfindungsgemäßen Partikel aus dem Reaktionsgemisch.
[0083] Der Verdau von DNS wird bevorzugt im Bereich von etwa 5 und etwa 40°C, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 20 und etwa 37 °C,
durchgeführt.
[0084] In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Probe vor Schritt a) einer Lyse zur Zerstörung von Zellen unterzogen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Lyse von Zellen in Gegenwart der
erfindungsgemäßen DNase-beschichteten magnetischen Partikel. [0085] In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) jede in der
Probe vorhandene DNS verdaut. Dies ist zum Beispiel erwünscht, wenn es sich bei der Probe um Wasser handelt, dass in DNS-freies Wasser umgewandelt werden soll.
[0086] In anderen bevorzugten Ausführungsformen soll vorzugsweise nur DNS aus bestimmten Quellen (zum Beispiel menschliche DNS) verdaut werden, während DNS aus anderen Quellen wie zum Beispiel Bakterien, Viren oder Pilze (zum Beispiel Hefe) essentiell unverdaut bleiben.
[0087] Unter dem Begriff„essentiell unverdaut" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird verstanden, dass nach dem Verdauungsschritt mit den erfindungsgemäßen Partikeln mehr als 50%, mehr als 70%, mehr als 80%, bevorzugt mehr als 90%, mehr bevorzugt mehr als 95%, besonders bevorzugt mehr als 99%, ganz besonders bevorzugt 100% der nicht zu entfernenden DNS (das heißt der zu isolierenden / aufzureinigenden DNS) in dem
Reaktionsgemisch vorliegt bezogen auf die Menge zu isolierender /
aufzureinigender DNS in der Probe vor Zusatz der DNase-beschichteten magnetischen Partikel. Dies kann zum Beispiel durch Vergleiche von DNS- Banden in Agarosegelen festgestellt werden.
[0088] Bei der durch die DNase-beschichteten magnetischen Partikel zu verdauenden genomischen DNS handelt es sich im Falle von zu isolierender / aufzureinigender bakterieller oder viraler DNS bevorzugt um DNS aus
Säugetieren (besonders bevorzugt um menschlicher DNS). Entsprechend ist eine bevorzugte Ausführungsform des obigen Verfahrens ein Verfahren zum Entfernen von eukaryotischer DNS (bevorzugt von DNS aus Säugetieren, besonders bevorzugt von menschlicher DNS) aus einer biologischen Probe, die eukaryotische DNS und virale DNS und/oder virale RNS und/oder
prokaryotische DNS und/oder prokaryotische RNS und/oder DNS aus Pilzen (wie Hefe) und/oder bakterielle DNS enthält aus einer biologischen Probe, umfassend die Schritte: a') Verdauen von eukaryotischer DNS, bevorzugt von DNS aus
Säugetieren, besonders bevorzugt von menschlicher DNS, in einer Probe enthaltend eukaryotische DNS und mindestens eine der folgenden DNS oder RNS ausgewählt aus einer Gruppe aus viraler DNS, viraler RNS, prokaryotischer DNS, prokaryotischer RNS, DNS aus Pilzen, DNS aus Hefe, bakterielle DNS, gram positive bakterielle DNS, gram negative bakterielle DNS unter Verwendung der DNase-beschichteten magnetischen Partikel oder einer diese Partikel enthaltenen Suspension; und b) Magnetisches entfernen der DNase-beschichteten magnetischen Partikel aus dem Reaktionsgemisch.
[0089] Der Fachmann wird verstehen, dass in anderen bevorzugten
Ausführungsformen eine andere als eukaryotische DNS (zum Beispiel viraler DNS, prokaryotische DNS, DNS aus Pilzen, DNS aus Hefe, bakterielle DNS, gram positive bakterielle DNS oder gram negative bakterielle DNS) aus einer Probe bevorzugt entfernt werden soll um eine oder mehrere DNS aus anderen Quellen zu isolieren / aufzureinigen.
[0090] Optional können bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung vor Durchführung von Schritt a) eine Probe einer Lyse unterzogen werden. Eine weitere Lyse kann nach Schritt b) durchgeführt werden. Bevorzugt wird vor der zweiten Lyse eine eventuelle Verunreinigung durch DNase durch Zugabe von Proteinase entfernt. Ebenfalls optional können die Verfahren der vorliegenden Erfindung direkt nach Schritt b) (oder nach Schritt b) und weiteren Schritten wie Aufreinigungsschritten, Konzentrierungsschritten oder Umpufferungsschritten) als Schritt c) eine PCR oder RT-PCR-Anwendung enthalten.
[0091] In einer besonderen Ausführungsform wird die zu isolierende nicht- eukaryotische DNS oder nicht-eukaryotische RNS aus der Probe entfernt. In diesem Aufreinigungs- oder Konzentrierungsschritt wird in einer weiteren Ausführungsform die zu isolierende nicht-eukaryotische DNS oder nicht- eukaryotische RNS mit Hilfe von magnetischen Partikel, die DNS und/oder RNS binden können, gebunden. In einem weiteren Schritt wird nach Anlegen eines Magnetfeldes die überstehende Lösung von den magnetischen Partikel getrennt. Es können weitere Reinigungsschritte folgen. Bevorzugt wird die zu isolierende nicht-eukaryotische DNS oder nicht-eukaryotische RNS von den magnetischen Partikel, die DNS und/oder RNS binden können, abgelöst. Nach Anlegen eines Magnetfeldes kann die überstehende Lösung, die die zu isolierende nicht-eukaryotische DNS oder nicht-eukaryotische RNS enthält, von den magnetischen Partikel getrennt werden.
[0092] Die DNase-beschichteten magnetischen Partikel können nach dem Verdau der DNS quantitativ entfernt werden, das heißt, mindestens 99% bevorzugt mindestens 99,9% und besonders bevorzugt mindestens 99,99% bzw. 100% aller Partikel werden durch Einsatz eines Magneten oder ein ein magnetisches Feld erzeugenden Apparat aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Die magnetischen Partikel, die DNS und/oder RNS binden können, können nach dem Aufreinigungs- oder Konzentrierungsschritt quantitativ entfernt werden, das heißt, mindestens 99% bevorzugt mindestens 99,9% und besonders bevorzugt mindestens 99,99% bzw. 100% aller Partikel werden durch Einsatz eines Magneten oder ein ein magnetisches Feld erzeugenden Apparat aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Dem Fachmann ist bekannt, wie magnetische Partikel aus einem Reaktionsgemisch unter Einsatz von Magnetismus entfernt werden können. Zum Beispiel können magnetische Separatoren ohne weiteres von Bioclone Inc. bezogen werden.
[0093] Durch das quantitative Entfernen der Partikel aus dem
Reaktionsgemisch (präziser: aus dem flüssigen Überstand) sind weitere
Anwendungen wie zum Beispiel PCR oder RT- PCR, die sensitiv gegenüber DNS-Degradation sind, vollständig gegen DNase Aktivität geschützt.
[0094] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht auf einem
Verfahren zum Verdau von DNS aus einer Probe bzw. Matrix durch die DNase- beschichteten magnetischen Partikel oder diese Partikel enthaltenen
Suspensionen. Bei diesem Verfahren wird entweder nur ein Teil der
vorhandenen DNS, bevorzugt mehr als 5%, mehr als 10%, mehr als 20%, mehr als 30%, mehr als 40%, mehr als 50%, mehr als 75%, mehr als 90%, mehr als 95%, mehr als 99%, oder die gesamte in der Probe/Matrix vorliegende DNS verdaut (100%). [0095] Beispiel
[0096] Zu 200 μΙ einer Probe, die eukaryotische DNS und nicht-eukaryotische DNS umfasst, werden 200 μΙ eines Lysepuffers gegeben. Die Probe wird 15 min lang bei 60°C in einem Thermomixer geschüttelt. 50 μΙ einer
Suspension, die DNase-beschichtete magnetische Partikel enthält, werden zur Probe gegeben. Die Probe wird 15 min lang bei 37°C in einem Thermomixer geschüttelt. Ein ausreichend starkes Magnetfeld wird angelegt. Nach 5 min wird die überstehende Lösung entfernt. Zu der entfernten überstehenden Lösung werden 20 μΙ Proteinase-Lösung gegeben. Die Lösung wird 10 min lang bei 56°C in einem Thermomixer geschüttelt. Zur Durchführung einer zweiten Lyse wird ein Puffer zu der Lösung gegeben, die 10 min lang bei 95°C in einem
Thermomixer geschüttelt wird. Anschließend werden magnetische Partikel, die DNS und/oder RNS binden können, und eine Pufferlösung zu dem
Reaktionsgemisch gegeben. Nach fünf Minuten wird ein ausreichend starkes Magnetfeld angelegt. Die überstehende Lösung wird verworfen. Die
magnetische Partikel, die DNS und/oder RNS gebunden haben, werden mehrfach mit einer Pufferlösung gewaschen, wobei die überstehende Waschlösung jeweils bei angelegtem Magnetfeld entfernt wird. Zu den magnetischen Partikel, die DNS und/oder RNS gebunden haben, wird eine Pufferlösung gegeben. Bei 65°C wird die DNS und/oder RNS von den magnetischen Partikel entfernt. Bei angelegtem Magnetfeld wird die überstehende Lösung, die die zu isolierende nicht-eukaryotische DNS oder nicht-eukaryotische RNS enthält, von den magnetischen Partikel, die DNS und/oder RNS binden können, entfernt. Mit der DNS und/oder RNS in der überstehenden Lösung wird eine PCR bzw. RT-PCR durchgeführt.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Isolieren von nicht-eukaryotischer DNS oder nicht- eukaryotischer RNS aus einer Probe, bevorzugt einer biologischen Probe, wobei die Probe weiterhin eukaryotische DNS umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst a) Verdauen der eukaryotischen DNS in der Probe mit Hilfe von
DNase-beschichteter magnetischer Partikel; b) Entfernen der DNase-beschichteten magnetischen Partikel aus dem in Schritt a) erhaltenen Reaktionsgemisch.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei die nicht-eukaryotische DNS
wenigstens eine DNS und/oder RNS ist, ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus viraler DNS, viraler RNS, prokaryotischer DNS, DNS aus Pilzen und bakterieller DNS.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die nicht- eukaryotische DNS DNS aus Prokaryoten, bevorzugt aus gram-positiven oder gram-negativen Bakterien, oder DNS aus Pilzen, bevorzugt aus Hefe, ist.
4. Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Schritt a) im Bereich von etwa 5 bis etwa 40°C, bevorzugt im Bereich von etwa 20 bis etwa 37 °C, durchgeführt wird.
5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die DNase- beschichteten magnetischen Partikel eine Teilchengröße von > 10 nm bis < 800 pm, bevorzugt eine Teilchengröße von > 100 nm bis < 20 pm, besonders bevorzugt eine Teilchengröße von > 900 nm bis < 1 ,3 pm aufweisen.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die DNase-beschichteten magnetischen Partikel eine Teilchengröße zwischen > 500 nm und < 2 pm besitzen, bevorzugt wobei die Partikel eine Teilchengröße zwischen > 500 nm und < 2 pm besitzen und der d 0,9 der Partikel zwischen 900 nm und 1 ,3 pm liegt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die DNase-beschichteten magnetischen Partikel mit einer oder mehreren DNase(n) vom Typ I beschichtet sind oder die Partikel mit einer oder mehreren Dnasen vom Typ II beschichtet sind oder die Partikel mit einer oder mehreren Dnasen vom Typ I und einer oder mehreren Dnasen vom Typ II beschichtet sind, bevorzugt, wobei eine oder mehrere DNase(n) stabiler als der
entsprechende Wildtyp ist (sind), eine höhere Aktivität gegen
eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist (aufweisen) oder eine höhere Spezifität gegen eukaryotische oder bakterielle DNS als der entsprechende Wildtyp aufweist
(aufweisen).
8. Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die DNase auf den magnetischen Kern der DNase-beschichteten
magnetischen Partikel über einen Spacer, bevorzugt Gelatine, BSA, PEG oder Tosyl, immobilisiert ist.
9. Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die DNase-beschichteten magnetischen Partikel vor Schritt a) als
Suspension zu der Probe dazugeben werden.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Konzentration der Partikel in der Suspension im Bereich von etwa 0,1 und etwa 100 mg / ml, bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 und etwa 50 mg / ml, und besonders bevorzugt im Bereich von etwa 1 und etwa 20 mg / ml liegt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Dnase-Konzentration durch die DNase-beschichteten Partikel in der Suspension im Bereich von etwa 100 und etwa 20.000 U / ml, bevorzugt im Bereich von etwa 100 und etwa 10.000 U / ml, besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 2000 U / ml, und ganz besonders bevorzugt im Bereich von etwa 300 und etwa 600 U / ml liegt.
12. Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Probe im Schritt a) zusätzlich divalente Kationen, vorzugsweise Mg2+ und/oder Mn2+, enthält.
13. Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei vor Schritt a) eine Lyse von eukaryotischen Zellen durchgeführt wird.
14. Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Verfahren zusätzlich den folgenden Schritt umfasst c) PCR oder RT-PCR-Anwendung mit dem in Schritt b) erhaltenen Reaktionsgemisch.
15. Ein Kit umfassend mindestens ein DNase-beschichtetes magnetisches Partikel zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche.
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