DE19912799B4 - Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial und seine Verwendung - Google Patents

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Abstract

Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, gekennzeichnet durch ein Kieselgel auf Basis von Alkalisilicaten mit darin eingebundenen superparamagnetischen Teilchen, wobei das Gel eine Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 μm hat und einen Gehalt an superparamagnetischen Teilchen im Bereich von 10 bis 80 Gew-% aufweist, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gels, hergestellt durch Vermischung einer wäßrigen Alkalisilicatlösung mit einer Suspension in Wasser oder in mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln von superparamagnetischen Eisenoxidteilchen der Formel FexOy, worin 2,0≤x≤3,5 und 3,0≤y≤4,5 gilt, oder von superparamagnetischen Ferritteilchen, wobei die Teilchen eine Teilchengröße von 10 bis 600 nm haben, und Zugabe einer C1-C6-Alkansäure bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 95 °C in einer Zeit von 1 Minute bis 24 Stunden bis zu einem pH-Wert im Bereich von 9 bis 2.

Description

  • Die Erfindung betrifft spezielle Adsorbentien auf Kieselgelbasis und deren Verwendung zur Isolierung von Nukleinsäuren. Die erfindungsgemäßen Kieselgele verfügen über superparamagnetische Eigenschaften und können mittels magnetischer Felder aus einer Probenmatrix entfernt werden.
  • Unterschiedliche Praktiken zur Festphasenextraktion eines speziellen Analyten aus einer komplexen Probenmatrix, mit dem Ziel den Analyten zu konzentrieren, von möglichst allen Verunreinigungen aus der Probenmatrix abzutrennen und der eigentlichen Analyse zuzuführen, haben in den letzten Jahren stark an Bedeutung zugenommen. Das betrifft die biochemisch/molekularbiologische Analytik und gleichermaßen die Umweltanalytik und medizinische Diagnostik. Unabhängig von der Art des Analyten und der jeweiligen Fragestellung läßt sich die Probenvorbereitung zum eigentlichen Analysengang in 4 Grundschritte unterteilen: 1. Konditionierung der festen Phase; 2. selektive oder spezifische Bindung des Analyten an die feste Phase und Entfernen der übrigen Probenmatrix; 3. Herauswaschen von eventuellen Verunreinigungen aus der festen Phase und 4. Elution des angereicherten und gereinigten Analyten.
  • Steht die Anreicherung und Isolierung von Nukleinsäuren zur Aufgabe, beispielsweise zum qualitativen Nachweis von Viren mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf DNA-Ebene oder der Reversen Transkription und nachfolgender Polymerase-Kettenreaktion auf RNA-Ebene oder der Isolierung von Templates zur DNA-Sequenzierung und/oder zur PCR aus verschiedensten biologischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Plasma, Serum oder Bakterienlysat, macht man sich die lange bekannte Eigenschaft von Nukleinsäuren zu nutze, unter chaotropen oder anderen Hochsalzbedingungen, d.h. bei hohen Konzentrationen von chaotropen oder anderen Salzen, spezifisch an silicathaltige Adsorbentien wie Glasmehl [Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-619, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387], Diamatomeenerde [Methods Enzymol. 65 (1979) 176-182] oder native Kieselerde [J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503, EP 0 389 063 B1 ] zu binden. Mit Hilfe eines ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel enthaltenen Puffers, in der Regel ist das ein niederer aliphatischer Alkohol, werden dann Verunreinigungen von dem Adsorbens gewaschen, der Träger getrocknet und die adsorbierten Nukleinsäuren mit destilliertem Wasser oder einem sogenannten Niedrigsalzpuffer, d.h. Puffer mit geringer Ionenstärke, eluiert.
  • Neben den bereits erwähnten, weitestgehend in ihrem nativen Zustand belassenen silicatischen Trägermaterialien sind auch einige synthetische Verfahren zur Darstellung von Kieselgeladsorbentien für die Nukleinsäureisolierung beschrieben worden. So die Herstellung entsprechender Derivate durch Hydrolyse von Siliciumhalogeniden allein oder in Gegenwart bestimmter, die Adsorptionseigenschaften beeinflussender Zusätze [ EP 0 600 253 B1 ] oder über die Hydrazinolyse von Siliciumtetrachlorid [ EP 0 540 170 A1 ].
  • Auch hat es Versuche gegeben, die für die Isolierung von Nukleinsäuren optimalen Adsorptions-/Desorptionseigenschaften durch chemische Behandlung von silicathaltigen Oberflächen zu erreichen. So etwa über die Behandlung von Celiten mit starken Alkalien [ EP 0 555 798 A1 ], der Oberflächenmodifizierung von Glasfasermembranen mit unterschiedlichen Reagentien wie Aluminium-(III)-chlorid oder Bortrichlorid zur Erzielung bestimmter Eigenschaften [ EP 0 649 853 A1 ]. In diesem Zusammenhang sind auch die Versuche zu sehen, durch Fluorierung mineralischer, insbesondere silicatischer Oberflächen bestimmte vorteilhafte Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren zu erreichen [ EP 0 648 777 A1 ).
  • Die Nutzung "loser" silicatischer Adsorbentien zur Isolation von Nukleinsäuren wird jedoch heute weitestgehend durch die Verwendung von Fertigsäulen, wie sie beispielsweise in DE 195 12 369 A1 und DE 41 39 664 A1 beschrieben sind verdrängt. Diese Fertigsäulen enthalten als Adsorbens eine Glasfasermembran oder in Spezialfilter eingeschlossene Adsorbentien auf Silicatbasis. Hauptvorteil dieser Anordnungen ist, daß der Verbleib von Silicatpartikeln im Nukleinsäureeluat durch unvollständige Zentrifugation oder Pipettierfehler weitestgehend vermieden wird. Das verringert die Gefahr des Verschleppens von Inhibitoren für in den weiteren Analysenschritten angewandte Enzyme, etwa thermostabile Polymerasen für die PCR-Reaktionen. Durch den zwangsläufig höheren Fertigungsaufwand sind die beschriebenen Fertigsäulen jedoch entschieden teurer als die freien Adsorbentien, was sich natürlich besonders bei sehr hohem Probenaufkommen sehr nachteilig bemerkbar macht. Auch ist die Ersparnis an Zeit, Energie und Arbeitskraft im Vergleich zum Einsatz loser Adsorbentien nicht allzu wesentlich, da weiterhin eine Reihe von Zentrifugationsschritten und Operationen zum Wechseln der Auffanggefäße während der Wasch- und Elutionsschritte erforderlich sind. Auch die Nutzung von Vakuumgeräten, welch den Durchfluß durch die Fertigsäulen unterstützen, hat hier bisher nicht den entscheidenden technologischen Durchbruch gebracht. Alle diese notwendigen manuellen Eingriffe erschweren weiterhin die angestrebte vollständige Automatisierung der Nukleinsäureisolierungsprozesse.
  • Eine bekannte und sehr elegante Variante zur Vermeidung jeglicher Filtrations- und Zentrifugationsschritte bei der Stofftrennung fest/flüssig ist der Einsatz sogenannter super paramagnetischer Materialien als Kernmaterialien für adsorbierende feste Stoffe. Superparamagnetismus verleiht bestimmten Substanzen die Eigenschaft von einem Magneten in Richtung seiner Pole angezogen zu werden und im Gegensatz zu ferromagnetischen Materialien beim Verweilen im Magnetfeld nicht selbst permanent magnetisiert zu werden. Das erlaubt ein problemloses Resuspendieren nach Entfernen des Magnetfeldes, wie es für effiziente Wasch- und Elutionsprozesse unbedingt erforderlich ist. Dem Fachmann sind die einschlägigen Materialien bekannt, so daß an dieser Stelle zwei Beispiele genügen. Sehr oft verwendete superparamagnetische Materialien sind fein verteilter Magnetit (Fe3O4) und Erdalkaliferrite.
  • Die Herstellung superparamagnetischer Adsorbentien geschieht im wesentlichen auf zwei Wegen. Einmal werden in poröse dreidimensionale Netzwerke von adsorbierenden Substanzen oder deren Precursor Gemische von Fe2+ und Fe3+ Salzen gebracht, deren Fe2+/Fe3+ Verhältnis annähernd dem Verhältnis im supermagangetischen Kern entspricht [ US 4,452,773 ; WO 90/07380] und anschließend durch Erhöhung des pH Wertes die gewünschten Oxide in den Poren gefällt und gleichzeitig eingeschlossen, so daß die adsorbierende Substanz oder deren Precursor superparamagnetische Eigenschaften erhält. Bei der zweiten Technologie geht man von Suspensionen von superparamagnetischen Materialien in verschiedenen Lösungen aus und scheidet auf diesen Materialien durch unterschiedliche chemische Reaktionen die adsorbierenden Stoffe oder deren Precursoren ab. Das kann zum Beispiel durch Vernetzung löslicher Polymere erfolgen [Bolto, J. Macromol. Sci. – Chem. A14 (1980) 107-120; Dixon et al. J. Macromol. Sci.-Chem.; A14 (1980) 153-159].
  • Silicatische Adsorbentien mit superparamagnetischen Eigenschaften, die sich für die Aufreinigung von Nukleinsäuren eignen, sind ebenfalls beschrieben. So lassen sich poröse Gläser mit Hilfe entsprechender Eisensalzlösungen (s.oben) in superparamagnetisches Glas überführen und zur DNA-Isolation nutzen [ US 05734020 ; US 05610274 ]. Auch ist die Herstellung und Nutzung superparamagnetischer Glaspartikel durch Ablage rung eines SiO2-Sols, welches durch alkalische Hydrolyse von Siliciumtetraalkylestern und entsprechenden Aluminiumverbindungen im Gemisch mit Bor-(III)-oxid auf superparamagnetischen Trägermaterialien abgelagert und anschließend durch Verschmelzung bei hohen Temperaturen unter Inertgasbedingungen zu Glaspartikeln umgesetzt wird, beschrieben [ DE 195 20 398 A1 ].
  • Beide beschriebenen superparamagnetischen Glas- bzw. Silicapartikel sind jedoch hinsichtlich ihrer Herstellung mit Nachteilen behaftet. So nutzen beide Verfahren relativ teure Ausgangsmaterialien. Außerdem ist das in DE 195 20 398 A1 beschriebene Verfahren ein langwieriger, nur unter relativ hohem technischen Aufwand umsetzbarer Mehrstufenprozeß.
  • Aus der DE 43 07 262 A1 ist bekannt, Rieselgel in Gegenwart von fein verteiltem magnetischem Material und von Mineralsäuren oder CO2 zu fällen, um ein magnetisches Rieselgel zu erhalten, an das pharmakologisch, biologisch oder biochemisch wirksame Substanzen angekoppelt werden. Das Produkt wird anschließend auf oralem Wege dem menschlichen Organismus zugeführt und dort mit Hilfe elektromagnetischer Hochgradientenfelder angereichert, um bestimmte lokale Wirksstoffkonzentrationen zu erhalten.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfach und preiswert herstellbares Adsorptionsmaterial zu entwickeln, das sich hinsichtlich seiner Adsorptionseigenschaften besonders zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen und nichtbiologischen Probenmatrizes eignet.
  • Erfindungsgemäß ist das superparamagnetische Adsorptionsmaterial gekennzeichnet durch ein Rieselgel auf Basis von Alkalisilicaten mit darin chemisch und/oder physikalisch eingebundenen superparamagnetischen Teilchen, wobei das Gel eine Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 μm hat und einen Gehalt an superparamagnetischen Teilchen im Bereich von 10 bis 80 Gew-%,
    hergestellt durch Vermischung einer wäßrigen Alkalisilicatlösung mit einer Suspension in Wasser oder in mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln von superparamagnetischen Eisenoxidteil chen der Formel FexOy, worin 2,0≤x≤3,5 und 3,0≤y≤4,5 gilt, oder von superparamagnetischen Ferritteilchen, wobei die Teilchen eine Teilchengröße von 10 bis 600 nm haben,
    und Zugabe einer C1-C6-Alkansäure bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 95 °C in einer Zeit von 1 Minute bis 24 Stunden bis zu einem pH-Wert im Bereich von 9 bis 2.
  • Unter Nukleinsäuren werden im Sinne der Erfindung oligomere und polymere Ribonukloetide bzw. 2'-Desoxyribonukleotide verstanden mit einer Kettenlänge von mehr als 10 Monomereinheiten. Die Monomereinheiten in Nukleinsäuren sind über Phosphorsäurediesterbindungen zwischen der 3'- und 5'-Hydroxylgruppe benachbarter Monomereinheiten verknüpft und an das 1'-Atom der jeweiligen Kohlenhydratkomponente ist glycosidisch eine heterocyclische Base gebunden. Nukleinsäuren können durch Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen Doppel- und Dreifachstränge ausbilden.
  • Unter Kieselgel oder Silicagel im Sinne der Erfindung werden amorphe Kondensationsprodukte monomerer Kieselsäure verstanden. Ihre grundlegenden Synthesestrategien sind dem Fachmann hinlänglich bekannt [Gmelin, Teil Silizium B S. 422 ff.]. Diese hochmolekularen Kondensationsprodukte finden eine sehr breite Anwendung als Adsorbentien in verschiedenen chromatographischen Trenn- und Reinigungsoperationen.
  • Bevorzugte Anteile an superparamagnetischen Teilchen, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gels, liegen im Bereich von 30 bis 60 Gew-%.
  • Für die vorliegende Erfindung wird vorteilhaft als Alkalisilicat Natriumsilicat, insbesondere eine Natronwasserglaslösung, eingesetzt.
  • Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des Adsorptionsmaterial der Erfindung ist zusätzlich durch funktionelle Gruppen modifiziert, wobei diese Gruppen ausgewählt sein können unter Amino-, Azido-, Carboxy-, Aldehyd, Phosphoräuremonoester-, Phosphorsäurediester-, Thiol- und Hydroxygruppen. Besonders bevorzugt sind Carboxy-, Phosphoräuremonoester- und, Phosphorsäurediestergruppen.
  • Das Adsorptionsmaterial liegt normalerweise in getrockneter und amorph zerkleinerter Form vor und kann entweder in dieser Form oder als wäßrige Suspension verwendet werden.
  • Die Teilchengröße der superparamagnetischen Eisenoxide oder Ferrite liegt vorzugsweise im Bereich von 30 bis 100 nm.
  • Es wurde gefunden, daß die Adsorptionseigenschaften des Materials, insbesondere für die Adsorption von Nukleinsäuren, durch die Reaktionsführung bei der Fällung des Kieselgels gezielt durch Wahl des Fällungsmittels entscheidend beeinflußt werden kann. Besonders geeignete Fällungsmittel sind Alkansäuren mit C2-C4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Essigsäure oder Propionsäure, oder Gemische davon.
  • Die Temperatur bei dieser Reaktion liegt vorteilhaft zwischen 40 und 90 °C. Der Zeitraum für die Ausfällung des superparamagnetischen Kieselgelmaterials mittels der Alkansäure liegt vorzugsweise im Bereich von 5 Minuten bis 15 Stunden.
  • Die Ausfällung erfolgt vorteilhaft unter Bewegung der im Gemisch vorhandenen Substanzen, insbesondere unter Rühren. Durch Führung des pH-Regimes aus dem stark alkalischen Bereich der Alkalisilicatlösungen auf Werte zwischen pH 9 und pH 2, vorzugsweise pH 8 bis pH 3, erhält man ein superparamagnetisches Kieselgel, mit dem eine selektive Desorption von DNA und RNA und damit Trennung von DNA und RNA möglich ist. Dadurch kann dieses Kieselgel zur Isolierung von Gesamtnukleinsäuren und getrennten Analyse von DNA und RNA, wie es z.B. in der Virusdiagnostik erforderlich ist, verwendet werden.
  • Desweiteren sind die erfindungsgemäßen Rieselgelpartikel durch die Einschlilsse von superparamagnetischem Material bei der Einwirkung von externen Magnetfeldern aus heterogenen Gemischen abtrennbar, wodurch Filtrations- oder Zentrifugationsoperationen nicht erforderlich sind und damit der Arbeits- und Zeitaufwand zur Isolierung der Nukleinsäuren wesentlich verkürzt wird.
  • Im einfachsten Fall zur Synthese der erfindungsgemäßen Partikel finden als superparamagnetische Substanzen die oben definierten Eisenoxide Anwendung, vorzugsweise solche, in denen 2 ≤ x ≤ 3,5 insbesondere x = 3 ist und y vorzugsweise 3 ≤ y ≤ 4,5, insbesondere y = 4 ist. Diese Substanzen können beispielsweise aus Eisensalzlösungen hergestellt werden, die ein eingestelltes, der Stöchiometrie des Eisenoxides entsprechendes Verhältnis von Eisen(II)- und Eisen(III)-Ionen haben. Durch Eintragen in Lösungen von Hydroxiden insbesondere wässrigen Laugen oder durch schrittweises Steigern des pH-Wertes der Eisensalzlösungen bis zu einem Wert um pH 9-10 mittels Hydroxiden, insbesondere wässriger Lösungen dieser Hydroxide, werden die Eisenoxidpartikel gefällt. Als superparamagnetische Trägersubstanzen sind natürlich auch andere Materialien denkbar, sofern sie den für eine effiziente Abtrennung notwendigen Paramagnetismus besitzen und in einer für die Herstellung des Kieselgels erforderlich Teilchengröße zu erhalten sind.
  • Weitere Materialien mit superparamagnetischen Eigenschaften können beispielsweise sein Erdalkaliferrite wie Bariumhexaferrit oder andere Ferrite, speziell auch Kombinationen von Metalloxiden. Einige der im Sinne der Erfindung verwendbaren superparamagnetischen Materialien sind von Hilpert [Chem. Ber. 42 (1909) 2248] beschrieben und diskutiert worden.
  • Es ist besonders hervorzuheben, daß bei dem erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterial Kieselgel und superparamagnetische Teilchen physikalisch nicht mehr voneinander zu trennen sind. Die auf diese Weise gewonnenen Kieselgele sind wie übliche Kieselgele wasch-, trocken- und zerkleinerbar, ohne daß nach einem oder mehrerer dieser Schritte eine Trennung von Kieselgel und superparamagnetischem Material erfolgt.
  • Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die oben definierten superparamagnetischen Teilchen in poröse Polymere eingebettet. Die Teilchengröße der eingebetteten Teilchen liegt allgemein im Bereich von 0,1 bis 10 μm.
  • Das poröse Polymere ist ein organisches oder anorganisches poröses Polymeres, insbesondere ein anorganisches Polymeres, wie zum Beispiel ein poröses Rieselgel.
  • Die porösen Polymerteilchen mit dem eingebetteten superparamagnetischen Material bilden vorzugsweise eine Kugelform oder nahezu eine Kugelform.
  • Das Adsorptionsmaterial dieser Ausführungsform der Erfindung läßt sich besonders gut handhaben und ist sowohl als Trockenmaterial als auch als Suspension sehr leicht resuspendierbar.
  • Die Herstellung dieser eingebetteten Teilchen kann durch Einlagerung von superparamagnetischen Eisensalzlösungen bzw. -suspensionen in einem porösen Polymermaterial und Ausfällen des Kieselgels in Anwesenheit der wäßrigen Alkalisilicatlösungen und der C1-C6-Alkansäuren erfolgen.
  • Erfindungsgemäß werden die Adsorptionseigenschaften des Kieselgels anders als beim Stand der Technik ausschließlich durch die Reaktionsführung bei der Herstellung des Kieselgels bestimmt. Für den direkten Einsatz der Kieselgele als Adsorbentien ist eine Nachbehandlung und/oder der Zusatz von zusätzlichen eigenschaftsbestimmenden Komponenten zum Reaktionsgemisch der Herstellung, wie etwa Boraten oder Aluminaten u.ä. nicht erforderlich. Selbstverständlich ist jedoch eine nachträgliche Modifizierung der Oberfläche der Rieselgelpartikel zum Erzielen bestimmter Eigenschaften, etwa dem Tragen von Ankergruppen zum kovalenten Binden von Biomolekülen möglich.
  • Die erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterialien können für die Adsorption einer Vielzahl von organischen Molekülen eingesetzt werden. Weiterhin können an das Material spezifische Liganden, wie Biotin, oder Proteine, wie Antikörper, gebunden werden.
  • Die Erfindung betrifft auch eine bevorzugte Verwendung der superparamagnetischen Kieselgele, indem man sie zur Festphasenextraktion von Nukleinsäuren in flüssiger Phase einsetzt und dabei das superparamagnetische Kieselgel mit oligomeren und/oder polymeren Ribonukleotiden oder 2'-Desoxyribonukleotiden mit einer Kettenlänge von mehr als 10 Monomereinheiten in Kontakt bringt,
    ein Magnetfeld an das erhaltene Produkt anlegt und den im Magnetfeld separierten Komplex superparamagnetisches Riesel gel/Nukleinsäuren vom Rest des Gemisches abtrennt,
    und die Nukleinsäuren von dem superparamagnetischen Kieselgel durch quantitatives Eluieren mit Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung niedriger Ionenstärke abtrennt.
  • Bevorzugt abgetrennt werden Fragmenten einer Polymerase-Kettenreaktion mit einer Größe von 50 bis 20000 Basenpaaren, insbesondere Fragmente mit einer Größe von 100 bis 3000 Basenpaaren.
  • Die Abtrennung von Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe, die aus genomischen, viralen, episomalen, bakteriellen Nukleinsäuren mit einer Größe von mehr als 100 Basenpaaren besteht ist ebenfalls bevorzugt.
  • Der Einsatz der superparamagnetischen Kieselgele in Kontakt mit einer komplexen biologischen Flüssigkeit, insbesondere mit Vollblut, Plasma oder Serum, oder mit einem biochemischen, insbesondere molekularbiologischen Reaktionsgemisch, wie Ligationsansätzen, PCR-Gemischen, Markierungsansätzen, ist ein besonders bevorzugtes Anwendungsgebiet der Erfindung.
  • Der Kontakt mit den abzutrennenden Nukleotiden kann in Anwesenheit von chaotropen Puffern, anderen Hochsalzpuffern, organischen wassermischbaren Lösungsmitteln oder wasserlöslichen Polymeren erfolgen.
  • Als chaotrope Puffer sind zu nennen Lösungen von Guanidinthiocyanat mit einer Konzentration von 4M bis 7M, vorzugsweise 6M, oder von Ammoniumthiocyanat mit einer Konzentration von 4M bis 6M.
  • Als Hochsalzlösungen sind zu nennen Lösungen von Natriumjodid oder -perchlorat mit einer Konzentration von 4M bis 8M, vorzugsweise 8M.
  • In Anwesenheit von organischen mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie beispielsweise niedere aliphatische Alkohole, wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, oder von Retonen wie Aceton lassen sich noch weiter verbesserte Bindungseigenschaften der Nukleinsäuren einstellen.
  • Zu den zugesetzten wasserlöslichen Polymeren gehören insbesondere Polyethylenglycole, aber auch Derivate der Polyvi nylalkohole, sofern sie in Wasser und organischen Lösungsmitteln löslich sind, wie beispielsweise Polyvinylalkohol-Vinylsulfonsäure-Addukte.
  • Da überraschenderweise die Adsorptionseigenschaften für Nukleinsäuren der erfindungsgemäßen Kieselgele praktisch eingestellt werden können und zwar in der Art, daß während des Elutionsprozesses bei Bedarf die Desoxyribonukleinsäuren selektiv von den Ribonukleinsäuren getrennt werden können, wird ein besonderes Anwendungsgebiet erschlossen, nämlich die Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten (Plasma, Seren, Blut etc.) auf unterschiedliche Viren.
  • Erfindungsgemäß kann die Elution der adsorbierten Desoxyribonukleinsäuren bei Temperaturen zwischen 10 und 40°C, insbesondere bei Temperaturen von 20 bis 25°C und die der adsorbierten Ribonukleinsäuren bei Temperaturen von 40 bis 80 °C insbesondere bei Temperaturen von 50 bis 60°C erfolgen. Damit ist eine selektive Trennung beider Komponenten nach gemeinsamer Adsorption aus der Probenmatrix unter den entsprechenden chaotropen Bindungspuffern möglich.
  • Die superparamagnetischen Eigenschaften des beschriebenen Kieselgels gestatten nach Adsorption der Nukleinsäuren an der Oberfläche des Kieselgels, die Abtrennung des Romplexes Kieselgel/Nukleinsäure aus der Probenmatrix mittels magnetischer Felder unter Umgehung von zeit-, material-, arbeits- und energieaufwendigen Filtrations-, Sedimentations- und/oder Zentrifugationsschritten. Damit ist dieses superparamagnetische Kieselgel besonders für den Einsatz in automatisierten Systemen geeignet.
  • Als Magneten zur Abscheidung des superparamagnetischen Adsorptionsmaterials sind übliche Permanentmagneten geeignet, insbesondere solche mit höheren Feldstärken, wie Seltenerdmagneten, z.B. Neodym-Eisen-Bor-Magneten.
  • Eine weitere Anwendungsform der Erfindung ist ein Kit zur manuellen oder automatischen Isolierung von Nukleinsäuren, wobei der Kit ein superparamagnetisches Kieselgel enthält, bestehend aus einem amorphen Kondensationsprodukt monomerer Kieselsäure mit einem darin fein verteilten superparamagnetischen Eisenoxid der allgemeinen Formel FexOy, worin 2,0≤x≤3,5 und 3,0≤y≤4,5 gilt, oder einem superparamagnetischen Ferrit, jeweils mit einer Teilchengröße von 10 bis 600 nm. Zusätzlich enthält der Kit auch Bindungs-, Wasch- und Elutionspuffer. Das superparamagnetische Kieselgel kann als Festsubstanz oder als Suspension vorliegen.
  • Die Erfindung soll nun anhand von einigen repräsentativen Beispielen erläutert werden, ohne natürlich die Anwendung auf diese Beispiele zu beschränken.
  • Beispiel 1:
  • Herstellung des superparamagnetischen Eisenoxides:
  • 9,9g Eisen(II)chlorid (FeCl2×4H2O) und 27g Eisen(III)chlorid (FeCl3×6H2O) wurden in 500ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde in 500ml 2molare Natronlauge tropfenweise eingebracht. Nach Beendigung der Fällungsreaktion konnte das ausgefallene Eisenoxid über Zentrifugation abgetrennt werden. Es schloß sich ein wiederholtes Waschen mit Wasser und Zentrifugieren bis zur Neutralität des Überstandes an. Das auf diese Weise erhaltene Eisenoxid ist direkt zur Synthese der superparamagnetischen Kieselgele geeignet oder kann getrocknet und zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden. Die mittlere Teilchengröße betrug 80 nm.
  • Beispiel 2:
  • Herstellung des superparamagnetischen Kieselgeles:
  • Zu 10ml einer Suspension von superparamagnetischem Eisenoxid im Wasser mit einem Gehalt von 0,1g pro Milliliter wurden 10ml einer Natriumsilikatlösung (Dichte ≈ 1,39 g/ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 50 °C erwärmt, und durch Eintragen von Eisessig über einen Zeitraum von 10 Minuten fällte man des Kieselgel vollständig, verdünnte anschließend die erhaltene Suspension mit 100 ml Wasser und saugte den ausgefallenen Niederschlag ab. Bei der Fällung mit Eisessig wurde zum Ende der Reaktion der pH Wert geprüft und dafür Sorge getragen, das er den Wert 2 nicht unterschritt.
  • Das Produkt wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und so von den Nebenprodukten der Reaktion gereinigt. Dem schloß sich das Trocknen des Produktes im Trockenschrank bei 120°C an.
  • Beispiel 3:
  • Verwendung des Erfindungsgemäßen Kieselgels zur Isolation von PCR-Produkten aus einem PCR-Reaktionsansatz:
  • Zu 50μl eines PCR-Reaktionsgemisches, welches ein 539 Basenpaare langes Fragment aus dem Plasmid pKS (Position 2000 bis 1461) enthält, wurden 120μl einer 8molaren Lösung von Natriumperchlorat in Wasser gegeben. Zu dieser Mischung gab man 10μl einer Suspension der im Beispiel 2 hergestellten Rieselgelpartikel mit einem Gehalt von 0,2mg/μl. Das Gemisch wurde 5 Minuten stehen gelassen, anschließend die Magnetpartikel mit der gebundenen Nukleinsäure an der Gefäßwand mit einem Permanentmagneten festgehalten und der Überstand abgegossen. Die Magnetpartikel wurden zweimal in 100μl 70%igen Ethanol resuspendiert und jedesmal mittels Magneten an der Gefäßwand gesammelt und die Waschlösung abgegossen. Dem schloß sich das Trocknen der Partikel an der Luft bei Raumtemperatur über 10 Minuten an.
  • Die gereinigten PCR-Fragmente wurden mit 20μl Wasser von den Magnetpartikeln im Verlauf von 5 Minuten eluiert.
  • Beispiel 4:
  • Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel zur Isolation von Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Plasma:
  • In der Körperflüssigkeit, aus der die Nukleinsäure isoliert werden soll, wurden mittels eines Lyseschrittes mit Proteinase K die Zellen zerstört und hochmolekulare Proteine zu oligomeren Peptiden verdaut.
  • Zu 50μl der betreffenden Lysates wurden 120μl eines Bindungspuffer bestehend aus einer 6M Lösung von Guanidinthiocyanat, gegeben. Beide Flüssigkeiten wurden gut durchmischt und mit 10μl einer Suspension des im Beispiel 2 hergestellten Kiesel gels (Gehalt 0,4mg/μl) versetzt und ebenfalls durchmischt. Der Komplex Nukleinsäure/Kieselgel wurde durch Anlegen eines Permanentmagneten an der Gefäßwand konzentriert und der überstand verworfen. Nach 2maligem Waschen des Kieselgels mit 70%igen wässrigem Ethanol und 10minütigem Trocknen bei Raumtemperatur konnten die an das Kieselgel gebundenen Desoxyribonukleinsäuren in 20μl bei Raumtemperatur Wasser eluiert werden. Die nachfolgende Elution der Ribonukleinsäure erfolgte mit 20μl RNAse-freiem Wasser bei 55°C.

Claims (19)

  1. Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, gekennzeichnet durch ein Kieselgel auf Basis von Alkalisilicaten mit darin eingebundenen superparamagnetischen Teilchen, wobei das Gel eine Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 μm hat und einen Gehalt an superparamagnetischen Teilchen im Bereich von 10 bis 80 Gew-% aufweist, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gels, hergestellt durch Vermischung einer wäßrigen Alkalisilicatlösung mit einer Suspension in Wasser oder in mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln von superparamagnetischen Eisenoxidteilchen der Formel FexOy, worin 2,0≤x≤3,5 und 3,0≤y≤4,5 gilt, oder von superparamagnetischen Ferritteilchen, wobei die Teilchen eine Teilchengröße von 10 bis 600 nm haben, und Zugabe einer C1-C6-Alkansäure bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 95 °C in einer Zeit von 1 Minute bis 24 Stunden bis zu einem pH-Wert im Bereich von 9 bis 2.
  2. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich durch funktionelle Gruppen modifiziert ist, ausgewählt unter Amino-, Azido-, Carboxy-, Aldehyd, Phosphorsäuremonoester-, Phosphorsäurediester-, Thiol- und Hydroxygruppen.
  3. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in getrockneter und amorph zerkleinerter Form vorliegt.
  4. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalisilicat Natriumsilicat ist, insbesondere eine Natronwasserglaslösung.
  5. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkansäure eine C2-C4-Alkansäure ist.
  6. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkansäure Essigsäure oder Propionsäure ist.
  7. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße der superparamagnetischen Eisenoxide oder Ferrite im Bereich von 30 bis 100 nm liegt.
  8. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur bei der Alkansäurezugabe mehr als 40 °C beträgt.
  9. Adsorptionsmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die superparamagnetischen Teilchen in poröse Polymere eingebettet sind und die Teilchengröße der Polymeren mit den eingebetteten Teilchen im Bereich von 0,1 bis 10 μm liegt.
  10. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Polymere ein poröses Kieselgel ist.
  11. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die porösen Polymerteilchen mit dem eingebetteten superparamagnetischen Material eine Kugelform oder nahezu Kugelform aufweisen.
  12. Verwendung eines superparamagnetischen Kieselgels gemäß Anspruch 1 bis 11, indem man zur Festphasenextraktion von Nukleinsäuren in flüssiger Phase das superparamagnetische Kieselgel mit oligomeren und/oder polymeren Ribonukleotiden oder 2'-Desoxyribonukleotiden mit einer Kettenlänge von mehr als 10 Monomereinheiten in Kontakt bringt, ein Magnetfeld an das erhaltene Produkt anlegt und den im Magnetfeld separierten Komplex superparamagnetisches Kieselgel/Nukleinsäuren vom Rest des Gemisches abtrennt, und die Nukleinsäuren von dem superparamagnetischen Kieselgel durch quantitatives Eluieren mit Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung niedriger Ionenstärke abtrennt.
  13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Abtrennung von Fragmenten einer Polymerase-Kettenreaktion mit einer Größe von 50 bis 20000 Basenpaaren, vorzugsweise zur Trennung von Fragmenten mit einer Größe von 100 bis 3000 Basenpaaren.
  14. Verwendung nach Anspruch 12 zur Abtrennung von Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe, die aus genomischen, viralen, episomalen, bakteriellen Nukleinsäuren mit einer Größe von mehr als 100 Basenpaaren besteht.
  15. Verwendung nach Anspruch 12 in Kontakt mit einer komplexen biologischen Flüssigkeit, insbesondere mit Vollblut, Plasma oder Serum, oder einem biochemischen, insbesondere molekularbiologischen Reaktionsgemisch.
  16. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in Kontakt mit Nukleinsäuren und in Anwesenheit von chaotropen Puffern, anderen Hochsalzpuffern, organischen wassermischbaren Lösungsmitteln oder wasserlöslichen Polymeren.
  17. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierung der an das Gel gebundenen Nukleinsäuren bei 10 bis 40 °C für Desoxyribonukleinsäuren durchgeführt wird.
  18. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierung der an das Gel gebundenen Nukleinsäuren bei 41 bis 80 °C für Ribonukleinsäuren durchgeführt wird.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 18 mit einem Kit zur manuellen oder automatischen Isolierung von Nukleoti den, wobei der Kit ein superparamagnetisches Kieselgel enthält, bestehend aus einem amorphen Kondensationsprodukt monomerer Kieselsäure mit einem darin fein verteilten superparamagnetischen Eisenoxid der allgemeinen Formel FexOy, worin 2,0≤x≤3,5 und 3,0≤y≤4,5 gilt, oder einem superparamagnetischen Ferrit, jeweils mit einer Teilchengröße von 10 bis 600 nm in flüssiger Phase.
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