CN105670915A - 磁珠预分装采血管及其对血液dna的预处理工艺 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种磁珠预分装采血管及其对血液DNA的预处理工艺；在市售的普通采血管中提前预分装具有超顺磁性的磁珠，磁珠表面修饰有对DNA具有富集作用的基团。本案将传统的血样采集、血样运输、实验室中对血液DNA进行提取整个过程中的部分步骤进行重新切割整合，血样采集完毕后在采血管中即可实现目标DNA与磁珠的结合完成DNA粗提步骤。将传统的血液样本存储和运输转化为DNA样本的存储和运输；DNA样本的保存和运输可实现在常温环境下进行，避免了血液样本所需要的冷链运输等苛刻条件；并且与血液样本直接运输相比较，能够更好的保证DNA的稳定性和完整性，避免了血样长时间运输中容易出现的DNA降解现象，方法更加简便高效。

Description

磁珠预分装采血管及其对血液DNA的预处理工艺
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种磁珠预分装采血管以及利用其对血液样本便捷的进行DNA粗提、存储和运输等预处理的工艺方法。
背景技术
随着基因组学及基因测序技术的快速发展，尤其是一代基因测序技术向二代基因测序技术的发展，基因测序所需的时间及成本都获得了极大下降。基于基因测序的精准医疗正逐渐成为重大疾病诊断、个性化医疗、胎儿遗传病学分析和个体识别等领域的基本手段。人体DNA最主要的来源之一就是血液，如：存在于血细胞中的基因组DNA、存在于血液中但游离于血细胞之外的游离DNA(cfDNA)、来自于肿瘤细胞的DNA(ctDNA)、以及孕妇血液中来自于胎儿的DNA，因此对血液DNA进行提取和检测，即液体活检(LiquidBiopsy)，是重大疾病伴随诊断、胎儿遗传病诊断、基因克隆、基因测序、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组技术等领域的有力手段。
传统血液DNA的提取和检测包括如下几个步骤：1、血液样品的采集、运输和保存；2、血液样品中DNA的提取和纯化；3、对血液样品中DNA进行测序等分析化验。其中第1步和第2步的目的为获取目标DNA，现阶段在获取目标DNA的工作中，众多研究者主要关注第2步，即如何更好提取、分离和纯化血液样品中DNA，而实际上第1个步骤也极大影响着DNA的提取和纯化效率。步骤1大致过程如下：在医院进行血样采集，装入已经加入抗凝剂的特定采血管，如果检测对象为丰度极低的cfDNA或ctDNA，为避免基因组的干扰，采血管中还需要加入能够防止血细胞破裂的保护剂；随后将所采集血样运输至检测地点，一般来讲需要进行低温并在特定的器皿中进行血液样品的运输和保存，为防止运输和保存过程中DNA发生降解，还需要在采血管中加入特殊保护剂以保证血液中DNA的稳定性和完整性。步骤2是在实验室将上述采集到的血液样品用相应的核酸提取试剂盒进行目标DNA的分离和纯化，常用的方法有柱式法和磁珠法。为保证目标DNA稳定和减少分解，甚至需要从采血开始到目标DNA的提取在2个小时内完成，对血液样本的运输距离、运输条件和运输方式要求极高。
传统方法在此过程中有较大的局限性：1、当前用于进行DNA，尤其是cfDNA和ctDNA检测，血样采集、运输和保存需要使用特殊采血管，采血管中添加有针对血细胞层面防止血细胞破裂的保护剂、防止DNA降解的保护剂、以及抗凝剂等，成本高昂，一般来讲每只采血管的成本要在200元左右；2、后期的储存和运输条件要求苛刻，血液原始样品不易保存，保存时间有限，越长的运输时间会造成越多的DNA降解发生，导致接下来DNA提取的完整性、稳定性、数量都将有所下降。如果血样采集地点在边远地区，如山区和西部等落后地区，由于路途较远，运输时间长，即使使用昂贵的采血装备也难以实施。3、如果血样需要冷冻运输，血液样品的反复冻融则会极大损害血液样品中DNA的稳定性，影响检测结果。
综上所述，血液和血液DNA保存、运输和提取中存在诸多问题，有必要开发一种更加便捷的血液DNA的预处理工艺及相关设备，能够在现场快速采取血样后进行预处理，以便于后期的运输和存储，并适合后期血液DNA纯化的快速、自动化、高通量的要求。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种磁珠预分装采血管以及利用其对血液样本便捷的进行DNA粗提、存储和运输的方法。其将DNA提取纯化的部分工作向前整合到血样采集步骤中，直接从新鲜血液中对目标DNA进行初步富集，并在外加磁场的作用下使之与血液中其它杂质实现分离，对DNA进行有针对性的稳定化后用于运输和存储，将传统的血液样品运输转化为DNA样本运输，DNA样本的保存和运输可实现在常温环境下进行，避免了血液样本所需要的冷链运输等苛刻条件；并且与血液样本直接运输相比较，能够更好的保证DNA的稳定性和完整性，避免了血样长时间运输中容易出现的DNA降解现象，方法更加简便和高效。
本发明的技术方案概述如下：
一种磁珠预分装采血管，其特征在于，在市售的普通的采血管中提前预分装入磁珠，所述磁珠具有超顺磁性，且磁珠表面修饰有对DNA具有富集作用的基团，粒径为纳米级或者微米级材料。
优选的是，所述的磁珠预分装采血管，其中，所述采血管中还预分装入必要的具有特定功能的预处理液。
优选的是，所述的磁珠预分装采血管，其中，所述预分装入的特定功能的预处理液组分主要如下：离液盐、钠盐、表面活性剂、pH调节剂、核酸保护剂、蛋白变性剂、醇类或其组合，预处理液可针对血液中不同目标DNA类型而不同，比如目标检测DNA为cfDNA或者ctDNA，则预处理液中包含有细胞稳定剂，它用于防止血细胞破裂引入基因组DNA干扰；如果目标检测DNA为基因组DNA，则预处理液中包含有裂解剂，它使得血细胞裂解释放基因组DNA的同时实现DNA与磁珠的结合。
优选的是，所述具有特定功能的预处理液中的离液盐可以是盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠中的一种或者两种混合。
优选的是，所述具有特定功能的预处理液中的钠盐可以是氯化钠、硫酸钠、碳酸钠中、高氯酸钠的任意一种。
优选的是，所述具有特定功能的预处理液中的表面活性剂可以是Tritonx-100、Tween-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的任意一种。
优选的是，所述具有特定功能的预处理液中的核酸保护剂可以是EDTA。
优选的是，所述的磁珠预分装采血管，其中，所述磁珠的浓度为2-5mg/mL。
一种采用如上述方案中任一项所述的磁珠预分装采血管对血液DNA的预处理工艺，包括：
步骤1)：将血液样本装入所述磁珠预分装采血管，混匀，使血液DNA与磁珠结合；
步骤2)：将所述磁珠预分装采血管置于磁力架装置中进行磁性分离，待磁珠被完全吸附后，弃去母液；
步骤3)：在所述磁珠预分装采血管中加入清洗液，混匀清洗，磁性分离，待磁珠被完全吸附后，弃去清洗液；
步骤4)：加入DNA稳定液、摇匀，即完成对血液DNA的预处理。
优选的是，所述的预处理工艺，其中，所述清洗液包括有：盐酸胍或异硫氰酸胍、异丙醇或乙醇、氯化钠。
优选的是，所述的预处理工艺，其中，所述DNA稳定液包括有：盐酸胍或异硫氰酸胍、异丙醇或乙醇、氯化钠、Tris-HCl；所述DNA稳定液的pH值为6-8。
优选的是，所述的预处理工艺，其中，在步骤4)之后，还包括将所述磁珠预分装采血管置于磁性装置中，使磁珠聚集，以方便存储和运输。
本发明的有益效果是：
1、本发明将传统的血样采集、血样运输、实验室中对血液DNA进行提取整个过程中的部分步骤进行重新切割整合，血样采集完毕后在采血管中即可实现目标DNA与磁珠的结合完成DNA粗提步骤，然后再将DNA粗提产物运输到实验室进行后续纯化步骤，将传统的血液样本存储和运输转化为DNA样本的存储和运输；DNA样本的保存和运输可实现在常温环境下进行，避免了血液样本所需要的冷链运输等苛刻条件；并且与血液样本直接运输相比较，降低了运输难度，并且能够更好的保证DNA的稳定性和完整性，避免了血样长时间运输中容易出现的DNA降解现象，方法更加简便和高效。
2、本发明可通过改变缓冲液类型、磁珠可以提取并保存血液中不同类型DNA，如血液中基因组DNA、cfDNA或者ctDNA等。
3、本发明可以避免对血样品进行低温运输，延长DNA保持完整性的时间，使得离检验实验室较远的偏远地区的DNA样本采集、运输和保存成为现实。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案实施例中所用的磁珠都具有超顺磁性，且磁珠表面修饰有对DNA具有富集作用的基团；但该基团的具体类别不受限定，因为根据不同的目标DNA，需要采用不同种类的具有特异性吸附富集功能的基团。
实施例1：
本实施方式是一种磁珠预分装采血管及其用于便捷血液DNA预处理(包括：粗提、运输和存储)的方法，针对血液中基因组DNA进行提取，包括如下步骤：
步骤1)、将1mL新鲜血液样本采入已经预装入10mg磁珠和3mL缓冲液的采血管，上下颠倒混匀；
步骤1)中的缓冲液包括如下组分：5M的异硫氰酸胍，50mM的氯化钠，0.1％的Tween-20，100mM尿素，80mMTris-HCl，20mMEDTA，pH值6～8。
步骤2)、将上述采血管在室温下使用旋涡仪漩涡或者摇床摇晃5～10min，完成血液基因组DNA与磁珠的结合；
步骤3)、将采血管置于磁力架装置中，磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒液态物质；
步骤4)、在上述采血管中加入3.5mL清洗液，用手轻摇10～30s,磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒清洗液；
步骤4)中的清洗液包括如下组分：2M盐酸胍，60mM的氯化钠，75％体积比的异丙醇；
步骤5)、加入1.5mL稳定液、摇匀，即完成血液DNA的预处理，可用于随后运输和储存。
步骤5)中的稳定液包括如下组分：1.6mol/L的盐酸胍，40mM的氯化钠，60％体积比的异丙醇，100mMTris-HCl,pH值6～8。
实施例2：
本实施方式是一种磁珠预分装采血管及其用于便捷血液DNA预处理的方法，针对血液中基因组DNA进行提取，包括如下步骤：
步骤1)、将5mL新鲜血液样本采入已经预装入60mg磁珠和16mL缓冲液的采血管，上下颠倒混匀；
步骤1)中的缓冲液包括如下组分：6M的盐酸胍，60mM的氯化钠，0.2％的Tween-20，50mMTris-HCl,10mMEDTA，pH值6～8。
步骤2)、将上述采血管在室温下使用旋涡仪漩涡或者摇床摇晃5～10min，完成血液DNA与磁珠的结合；
步骤3)、将采血管置于磁力架装置中，磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒液态物质；
步骤4)、在上述采血管中加入18mL清洗液，用手轻摇10～30s,磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒清洗液；
步骤4)中的清洗液包括如下组分：1M盐酸胍，30mM的氯化钠，80％体积比的乙醇；
步骤5)、加入8mL稳定液、摇匀，即完成血液DNA的预处理，可用于随后运输和储存。
步骤5)中的稳定液包括如下组分：1.2M的碘化钾，45mM的氯化钠，65％体积比的异丙醇，50mMTris-HCl,pH值6～8。
实施例3：
本实施方式是一种磁珠预分装采血管及其用于便捷血液DNA预处理的方法，针对血液中cfDNA进行提取，包括如下步骤：
步骤1)、将1mL新鲜血液样本采入已经预装入10mg磁珠和4mL缓冲液的采血管，上下颠倒混匀；
步骤1)中的缓冲液包括如下组分：4M的异硫氰酸胍，60mM的氯化钠，0.4％的Tritonx-100，75％体积比的乙醇，80mMTris-HCl，5mMEDTA，pH值6～8。
步骤2)、将上述采血管在室温下使用旋涡仪漩涡或者摇床摇晃5～10min，完成血液DNA与磁珠的结合；
步骤3)、将采血管置于磁力架装置中，磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒液态物质；
步骤4)、在上述采血管中加入3mL清洗液，用手轻摇10～30s，磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒清洗液；
步骤4)中的清洗液包括如下组分：2M盐酸胍，25mM的氯化钠，70％体积比的异丙醇；
步骤5)、加入1mL稳定液、摇匀，即完成血液DNA的预处理，可用于随后运输和储存。
步骤5)中的稳定液包括如下组分：1M的异硫氰酸胍，45mM的氯化钠，55％体积比的乙醇，150mMTris-HCl，pH值6～8。
实施例4：
本实施方式是一种磁珠预分装采血管及其用于便捷血液DNA预处理的方法，针对血液中ctDNA进行提取，包括如下步骤：
步骤1)、将2mL新鲜血液样本采入已经预装入24mg磁珠和5.5mL缓冲液的采血管，上下颠倒混匀；
步骤1)中的缓冲液包括如下组分：5M的异硫氰酸胍，50mM的氯化钠，0.5％的Tween-20，75％体积比的乙醇，100mMTris-HCl,8mMEDTA，pH值6～8。
步骤2)、将上述采血管在室温下使用旋涡仪漩涡或者摇床摇晃5～10min，完成血液DNA与磁珠的结合；
步骤3)、将采血管置于磁力架装置中，磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒液态物质；
步骤4)、在上述采血管中加入8mL清洗液，用手轻摇10～30s，磁性分离30～90s，待磁珠被完全吸附后，倾倒清洗液；
在步骤4)中的清洗液包括如下组分：1.5M异硫氰酸胍，35mM的氯化钠，80％体积比的异丙醇；
步骤5)、加入2mL稳定液、摇匀，即完成血液DNA的预处理，可用于随后运输和储存。
在步骤5)中的稳定液包括如下组分：1M的异硫氰酸胍，50mM的氯化钠，60％体积比的乙醇，120mMTris-HCl，pH值6～8。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (6)

1.一种磁珠预分装采血管，其特征在于，在市售的普通的采血管中提前预分装入磁珠，所述磁珠具有超顺磁性，且磁珠表面修饰有对DNA具有富集作用的基团。
2.根据权利要求1所述的磁珠预分装采血管，其特征在于所述磁珠为纳米级或微米级。
3.根据权利要求1所述的磁珠预分装采血管，其特征在于，所述采血管中还预分装入必要的具有特定功能的预处理液。
4.根据权利要求3所述的磁珠预分装采血管，其特征在于，所述必要的具有特定功能的预处理液根据血液中不同目标DNA类型而改变，当目标DNA为cfDNA或者ctDNA，则所述预处理液中包括有细胞稳定剂以防止血细胞破裂引入基因组DNA干扰；当目标DNA为基因组DNA，则所述预处理液中包括有裂解剂，以使得血细胞裂解并在释放基因组DNA的同时实现目标DNA与磁珠的结合。
5.一种采用如权利要求1-4中任一项所述的磁珠预分装采血管对血液DNA的预处理工艺，其特征在于，包括：
步骤1)：将血液样本装入所述磁珠预分装采血管，混匀，使血液DNA与磁珠结合；
步骤2)：将所述磁珠预分装采血管置于磁力架装置中进行磁性分离，待磁珠被完全吸附后，弃去母液；
步骤3)：在所述磁珠预分装采血管中加入清洗液，混匀清洗，磁性分离，待磁珠被完全吸附后，弃去清洗液；
步骤4)：加入DNA稳定液、摇匀，即完成对血液DNA的预处理。
6.根据权利要求5所述的预处理工艺，其特征在于，在步骤4)之后，还包括将所述磁珠预分装采血管置于磁性装置中，使磁珠聚集，以方便存储和运输。
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