发明内容
为解决上述问题,本发明的目的是提供一种核酸提取磁珠的制备方法,其工艺流程简单,操作简便,原料成本低,适宜于工业化大批量生产;制得的核酸提取磁珠,其为核壳结构磁珠,具有良好的生物相容性,并能与核酸特异性结合;而且还提供上述核酸提取磁珠在核酸提取中的应用。
为实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:
一种核酸提取磁珠的制备方法,其包括以下步骤:
S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
分别配制浓度为0.1~1mol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液,按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5~2.0混合;上述混合液搅拌均匀后,加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液,聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10~1/5,通入氩气除氧30 min,调整反应体系温度60~70℃,再向混合液中滴加质量浓度为25%氨水至体系PH值为10~11,在温度为70~80℃条件下反应3~6h,冷却至室温后,磁分离出黑色沉淀,依次用质量浓度为1%氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性,-10~-20℃冷冻干燥24~48h,得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒;
其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后,用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100~300nm,饱和磁化强度较高为57.4~79.4 emu/g;
S2、纳米硅基磁珠的制备
将步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2~500g分散到0.1~3L无水乙醇中超声波处理30~60min后,加入20~1000ml浓度为10~50g/L的分散剂,搅拌均匀后,向混合液中加入质量浓度为25%氨水至体系PH值为10,再滴加0.25~500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液,控制滴加速度为0.1~0.5ml/min,体系温度为30~50℃,滴加完毕后反应3~5h,磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒,用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6~7,超声分散15~30min,分散在万分之二NaN3水中,即得到硅基包被磁珠。
进一步地,上述步骤S2中采用的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种混合。
上述方法制得的硅基磁珠,其为核壳结构,包括Fe3O4纳米颗粒内核,SiO2外壳层,SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面;硅基磁珠经超声分散处理1h后,用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm ~1μm,饱和磁化强度为43.0~74.5emu/g。
上述方法制得的核酸提取磁珠,无外加磁场时,呈黑色悬浮液状态,放置有永磁铁时,核酸提取磁珠能够与水快速分离。
上述方法制得的核酸提取磁珠,其应用于新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、种子、全血、血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。
上述方法制得的核酸提取磁珠,其应用于生物检材中核酸提取,包括以下步骤:
(1)、裂解
取适量生物检材样本于EP管中,加入样本体积1~3倍的细胞裂解液、5~20μl蛋白酶K,混合均匀,再把EP管置于恒温水箱中65~80℃温育10~30min;
(2)、结合
将EP管从温浴设备中取出,加入振荡混匀的样本体积1/15~1/10的核酸提取磁珠、样本体积2倍的异丙醇,上下颠倒混匀,结合5~10 min,将EP管置于磁力架上进行磁分离,吸弃废液;
(3)、洗涤
a、加入样本体积3~5倍的洗涤液Ⅰ,点振5~10次,然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
b、加入样本体积2~3倍的洗涤液Ⅱ,点振5~10次,然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
c、重复上述步骤b,室温下开盖干燥5min;
(4)、洗脱
加入50~300μl的洗脱液,缓慢抽吸混匀,65℃温浴10min,每隔2~3min轻摇EP管混匀,然后磁分离,小心吸取上清液至新的EP管中,进行下游实验;
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶,取上述提取的全血基因组进行电泳,25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
进一步地,上述的步骤(1)裂解中,对于动植物组织之类的固体样本,先研磨,离心取上清。
由于采用如上所述的技术方案,本发明具有如下优越性:
本发明核酸提取磁珠的制备方法,其采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒,利用超声辅助溶胶–凝胶法制备核酸提取磁珠,工艺流程简单,操作简便,适于批量化生产;制得的核酸提取磁珠,饱和磁化强度较高为43.0~74.5emu/g,剩磁和矫顽力接近于零,能够在较小的磁场作用下达到快速彻底的固液分离效果,当撤去外加磁场后又能很快到分散到溶液中;制得的核酸提取磁珠,通过在Fe3O4纳米颗粒外表面包覆SiO2壳层,能很大程度地降低粒子的零电点和屏蔽磁偶极子的互相作用,使粒子具有良好的水溶性、化学稳定性及生物相容性,且SiO2表面存在丰富的羟基,可使复合粒子容易进一步生物功能化,能够有效吸附核酸,可用于提取含有常规量核酸(动植物、血液、细菌、质粒等)的生物检材,同时也能对含有痕量核酸(血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌、病毒等)的样本进行提取与纯化。
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明;但是,以下实施例仅仅是例证,本发明并不局限于这些实施例。
实施例一
一种核酸提取磁珠的制备方法,包括以下具体步骤:
S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
称取无水三氯化铁300g溶解于1L超纯水中,称取六水硫酸亚铁铵392g溶解于1L超纯水中,把两种溶液转入5L反应釜中200r/min搅拌30min后,称取45g聚乙二醇-8000溶解于400ml超纯水中转入反应釜;通氩气除氧30min,调整反应温度为60℃,调整转速为500r/min,向溶液中滴加25%氨水至体系pH值为11,升温至80℃,调整转速为100r/min条件下反应3h;反应完毕后冷却至室温,停止搅拌关闭氩气,取出反应物,磁分离出黑色沉淀,依次用质量浓度为1%氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物3次至洗涤液为中性,-10℃冷冻干燥48h,得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒;
S2、纳米硅基磁珠的制备
称取上述步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒100g分散到3L无水乙醇中,超声处理30min后,加入1L浓度为50 g/L乙二胺四乙酸钠的水溶液;200r/min搅拌30min后,向体系中加入质量浓度为25%氨水至体系pH值为10;再滴加体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液30ml,控制滴加速度为0.5ml/min,体系温度为50℃,滴加完毕后反应3h;取出反应物,磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒,用无水乙醇清洗3遍后,超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7,超声分散30min,分散在万分之二NaN3水中即得到硅基包被磁珠,将其固含量调整为100mg/ml。
由图1中纳米Fe3O4粒子的磁滞回线可以看出,Fe3O4粒子饱和磁化强度M高为79.4emu/g,剩磁和矫顽力接近于0,为超顺磁性。
图2是步骤S2制备的纳米硅基磁珠在无外加磁场时在水中的黑色悬浮状态;图3是步骤S2制备的纳米硅基磁珠在外加磁场时,纳米硅基磁珠与水快速分离,放置后的分离状态。
由图4中纳米硅基磁珠的磁滞回线可以看出,纳米硅基磁珠饱和磁化强度M高为73.2emu/g,剩磁和矫顽力接近于0,为超顺磁性。
由图5可以看出,纳米硅基磁珠在放大200倍的光学显微镜下,呈现较好的分散性。
由图6可以看出,纳米硅基磁珠在透射电镜下观察呈多分散状态。
实施例二
一种核酸提取磁珠的制备方法,包括以下具体步骤:
S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
与实施例一中步骤S1相同;
S2、纳米硅基磁珠的制备
称取上述步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒100 g分散到3L无水乙醇中,超声处理30min后,加入1L浓度为50 g/L柠檬酸三钠的水溶液;200r/min搅拌30min后,向体系中加入质量浓度为25%氨水至体系pH值为10;再滴加体积比为50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液100ml,控制滴加速度为0.5ml/min,体系温度为30℃,滴加完毕后反应4h;取出反应物,磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒,用无水乙醇清洗3遍后,超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7,超声分散30min,分散在万分之二NaN3水中即得到硅基包被磁珠,将其固含量调整为100mg/ml。
实施例三
一种核酸提取磁珠的制备方法,包括以下具体步骤:
S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
与实施例一中步骤S1相同;
S2、纳米硅基磁珠的制备
称取上述步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒500 g分散到4L无水乙醇中,超声处理30min后,加入1L浓度为50 g/L乙二胺四乙酸钠的水溶液;200r/min搅拌30min后,向体系中加入质量浓度为25%氨水至体系pH值为10;再滴加体积比为50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液130ml,控制滴加速度为0.5ml/min,体系温度为50℃,滴加完毕后反应5h;取出反应物,磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒,用无水乙醇清洗3遍后,超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7,超声分散30min,分散在万分之二NaN3水中即得到硅基包被磁珠,将其固含量调整为100mg/ml。
实施例四
将上述实施例一中制得的纳米硅基磁珠应用于人全血基因组DNA的提取,具体步骤为:
(1)、裂解
取150μl抗凝全血于EP管中,加入30μl的细胞裂解液、10μl蛋白酶K,混合均匀(可用漩涡振荡器,1800rpm),再把EP管置于恒温水箱中70℃温育30min;
(2)、结合
将EP管从温浴设备中取出,加入振荡混匀的纳米硅基磁珠10μl、异丙醇300μl,上下颠倒混匀5 min,将EP管置于磁力架上进行磁分离,吸弃废液(吸净管盖及管底残液);
(3)、洗涤
a、加入800μl洗涤液Ⅰ,点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
b、加入500μl洗涤液Ⅱ,点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
c、重复上述步骤b,室温下开盖干燥5min;
(4)、洗脱
加入100μl的洗脱液,缓慢抽吸混匀,70℃温浴5min,每隔3min轻摇EP管混匀,然后磁分离,小心吸取上清液至新的EP管中,进行下游实验;
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶,取上述提取的全血基因组进行电泳,25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果,由图7可以看出,电泳图中条带均为平行样,提取结果批间差异小,产量及纯度高。
实施例五
将上述实施例一中制得的纳米硅基磁珠应用于植物基因组DNA的提取,具体步骤为:
(1)、裂解
取新鲜三叶草叶片100mg,于研钵中稍加研磨至无块状,加入400μl 细胞裂解液、5 μl 蛋白酶K、10 μl DTT,研磨均匀,然后转移至1.5ml EP管中,混合均匀(可用漩涡振荡器,1200rpm),再把EP管置于恒温水箱中65℃温育30min;
(2)、结合
将EP管从温浴设备中取出,12000r离心10min;取200 μl上清,加入振荡混匀的纳米硅基磁珠10μl、结合液200μl(也可加入200μl异丙醇,产量高于结合液,但是提取双子叶植物种子的核酸时,异丙醇的量为上清体积的0.6倍为宜),上下颠倒混匀5 min,将EP管置于磁力架上进行磁分离,吸弃废液(吸净管盖及管底残液);
(3)、洗涤
a、加入500μl洗涤液Ⅰ,点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
b、加入500μl洗涤液Ⅱ,点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
c、重复上述步骤b,室温下开盖干燥5min;
(4)、洗脱
加入100μl的洗脱液,缓慢抽吸混匀,65℃温浴10min,每隔3min轻摇EP管混匀,然后磁分离,小心吸取上清液至新的EP管中,进行下游实验;
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶,取上述提取的全血基因组进行电泳,25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果,由图7可以看出,电泳图中条带均为平行样,提取结果批间差异小,产量及纯度高。
实施例六
将上述实施例一中制得的纳米硅基磁珠应用于人血清游离DNA的提取,具体步骤为:
(1)、裂解
a、对于易裂解样本,取200μl血清到1.5mlEP管中,加入200μl 细胞裂解液、10μl 蛋白酶K,混合均匀(可用漩涡振荡器,1800rpm),然后把EP管置于恒温水箱中80℃温育10min,每隔3min,混匀一次;b、对于难裂解样本,取300μl血清到1.5mlEP管中,加入200μl 细胞裂解液、10μl蛋白酶K,混合均匀(可用漩涡振荡器,1800rpm),然后把EP管置于恒温水箱中80℃温育10min,每隔3min,混匀一次;
(2)、结合
a、对于易裂解样本,将EP管从温浴设备中取出,加入振荡混匀的纳米硅基磁珠20μl、异丙醇100 μl;b、对于难裂解样本,将EP管从温浴设备中取出,加入振荡混匀的纳米硅基磁珠20μl、异丙醇150 μl;室温下颠倒混匀,结合5min,将EP管置于磁力架上进行磁分离,吸弃废液(吸净管盖及管底残液);
(3)、洗涤
a、加入800μl洗涤液Ⅰ,点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
b、加入800μl洗涤液Ⅱ,点振10次(若磁珠有结块现象,加大震荡力度和洗涤时间,尽量使磁珠分散),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
c、将EP管置于磁力架上,晾干若干分钟,至没有乙醇味道,一般为10min,根据室内温度和湿度可适当延长或缩短晾干时间;
(4)、洗脱
加入100μl的洗脱液,缓慢抽吸混匀,65℃温浴10min,每隔3min轻摇EP管混匀,然后磁分离,小心吸取上清液至新的EP管中,进行下游实验;
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶,取上述提取的全血基因组进行电泳,25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
纳米硅基磁珠应用于人血清游离DNA提取后荧光定量PCR扩增数据,如以下表1所示,与之对应的荧光定量PCR扩增曲线图如图9所示,可以看出PCR扩增的效率高、CT值差异小。