CN105642239B - 核酸提取用磁性微珠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
核酸提取用磁性微珠的制备方法,涉及磁性微珠的制备方法。本发明是要解决现有生物磁珠粒径大,表面能小,核酸吸附效率低的问题。方法1:一、制备Fe3O4/SiO2磁性微珠;二、磁性微珠洗涤;三、制备表面键合环氧基的磁性微珠;四、制备表面键合二醇基的磁性微珠。方法2:一、制备Fe3O4/SiO2磁性微珠;二、磁性微珠洗涤;三、制备表面键合环氧基的磁性微珠;四、制备表面包覆亚氨基二乙酸的磁性微珠。本发明方法制备的磁珠粒径小,为纳米级;提高了磁珠的表面能,延长磁珠在提取液中的悬浮时间,能够与目标提取物更有效地接触,提高目标提取物的提取率。本发明用于制备核酸提取用磁性微珠。
Description
技术领域
本发明涉及磁性微珠的制备方法。
背景技术
随着分子生物学技术的不断广泛应用,分子生物学技术已从以往的小规模的实验室研究逐渐转变成诸如疾病诊断、基因组测序、疾病基因的流行病学调研等需要大规模的程序化的操作的实用手段。以人类基因组测序为例,需要年复一年的核酸提取、纯化、测序。许多优秀的高级科研人员的大量的时间被花费在简单的重复劳动之中,实在是一种巨大的浪费。同时手工操作的不可避免的不规范性容易造成误差,人类基因组测序一般要重复3次以上,又进一步加重工作强度。
磁性高分子微珠简称磁性微珠,是由磁性材料与高分子材料通过化学或物理方法复合而成的一种具有众多优异性能的功能材料。磁性材料主要有铁酸盐、铁磁矿、纯铁粉、Fe3O4等,高分子材料有天然高分子材料及合成高分子材料两种,天然高分子材料有淀粉、明胶、纤维素、壳聚糖等,合成高分子材料有聚苯乙烯、聚苯乙烯醇、消化纤维等。磁性微珠可以通过磁珠表面改性或者功能团嫁接等方式将功能团(-OH、-COOH、NH2等)引入磁性微珠表面,进而得到具有功能化的磁性微珠。
磁性高分子微珠作为近年发展起来的一种新型磁性材料,不但具有纳米效应,即表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和体积效应,还具有磁学性质,如超顺磁性与高磁化率等特性。其应用已经从传统的技术领域发展到高新技术领域,从单纯的磁学范围扩展到与磁学相关的交叉学科领域。以核酸分离领域应用最为广泛。
传统的核酸分离需要乙醇沉淀、氯仿萃取、离心分离、层膜析出、清晰、富集等操作,其步骤繁琐、耗时费力,而分离效果及效率并不理想。磁性微珠在核酸分离中的应用,加快了核酸富集分离的自动化程度,提高了分离效果和效率,大大降低了其他物质对核酸的分离干扰,对推进核酸快速富集分离提取技术的发展起到了积极的作用。
目前磁珠纯化技术正在朝着全自动操作,提取和分离样本多样化、系统化方向发展。国产化磁珠的研制成功必将大幅度提高生物学科研工作效率、推动生物学科研究和产业化快速发展。但现有提取核酸用的生物磁珠粒径大,存在表面能小、核酸吸附效率低的问题。
发明内容
本发明是要解决现有生物磁珠粒径大,表面能小,核酸吸附效率低的问题,提供核酸提取用磁性微珠的制备方法。
本发明核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、向0.5mol/L柠檬酸溶液中加入纳米Fe3O4,用NH3·H2O调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌2h,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散45min,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并加入NH3·H2O调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加正硅酸乙酯,升温至80℃,强力搅拌下反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇反复冲洗,干燥箱干燥48小时,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠加入乙醇-水溶液中,再分别加入质量浓度为28%的浓氨水和TEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥12h,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡30min,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于无水甲苯中,在氮气保护下加入环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,在110℃下回流反应8h,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠;
四、将烘干得到表面键合环氧基的磁性微珠分散于pH值为3的质量浓度为35%的稀盐酸溶液中,在100℃下加热回流2h,产物以去离子水洗涤至中性后,再分别以无水乙醇和丙酮洗涤,过滤收集磁性微珠,烘干得到表面键合二醇基的磁性微珠。
步骤一中柠檬酸溶液的体积与纳米Fe3O4的质量比为30mL:5g。
步骤一中纳米Fe3O4与正硅酸乙酯的质量比为1:1。
步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1。
步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠与乙醇-水溶液的比为1g:(38~39)mL。
步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠与氨水的比为5g:(3~5)mL。
步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠与TEOS的比为5g:(1~2)mL。
步骤三中磁性微珠与无水甲苯的比为1g:(5~6)mL。
步骤三中磁性微珠与环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷的比为5g:(1~2)mL。
步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%。
步骤四中表面键合环氧基的磁性微珠的质量与稀盐酸溶液的体积比为1g:10mL。
本发明另一种核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、向0.5mol/L柠檬酸溶液中加入纳米Fe3O4,用NH3·H2O调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌2h,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散45min,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并加入NH3·H2O调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加正硅酸乙酯,升温至80℃,强力搅拌下反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇反复冲洗,干燥箱干燥48小时,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠加入乙醇-水溶液中,再分别加入质量浓度为28%的浓氨水和TEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥12h,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡30min,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于无水甲苯中,在氮气保护下加入环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,在110℃下回流反应8h,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠;
四、将NaOH溶于去离子水中,随后加入亚氨基二乙酸使其溶解,所得亚氨基二乙酸钠溶液在60℃下加热至溶解,然后于剩余溶液中加入大量甲醇溶液,使得亚氨基二乙酸钠盐析出,过滤收集固体,60℃下真空烘干,得到亚氨基二乙酸钠;
将步骤三得到的表面键合环氧基的磁性微珠与亚氨基二乙酸钠先后加于甲醇中,搅拌下反应48h,磁性微珠产物依次以水、甲醇处理以除去过量的亚氨基二乙酸钠后,浸泡于pH值为3的质量浓度为35%的稀HCl中30min,然后以去离子水洗涤产物至中性,再以甲醇、丙酮各洗涤一遍,过滤收集,烘干得到表面包覆亚氨基二乙酸的磁性微珠。
步骤一中柠檬酸溶液的体积与纳米Fe3O4的质量比为30mL:5g。
步骤一中纳米Fe3O4与正硅酸乙酯的质量比为1:1。
步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1。
步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠与乙醇-水溶液的比为1g:(38~39)mL。
步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠与氨水的比为5g:(3~5)mL。
步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠与TEOS的比为5g:(1~2)mL。
步骤三中磁性微珠与无水甲苯的比为1g:(5~6)mL。
步骤三中磁性微珠与环氧丙基丙氧基硅烷的比为5g:(1~2)mL。
步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%。
步骤四中NaOH的质量与去离子水的体积比为2g:30mL。
步骤四中NaOH与亚氨基二乙酸的质量比为2:3。
步骤四中表面键合环氧基的磁性微珠与亚氨基二乙酸钠的质量比为4:0.2。
步骤四中亚氨基二乙酸钠的质量与甲醇的体积比为0.2g:20mL。
本发明的有益效果:
本发明方法制备的磁珠粒径达到20纳米左右,磁珠表面形成均匀稳定的高分子包覆层,通过二次包覆与功能团嫁接,实现纳米磁珠对核酸的有效提取。利用纳米磁性微珠表面嫁接的活性官能团(-COOH、-COH、-NH2、-OH等)与核酸中的-COOH或-NH2偶联,将核酸分子吸附在磁珠表面。利用磁性微珠的超顺磁性,通过外加磁场,将磁珠移动到指定区域,去除细胞裂解液,然后在低盐浓度环境下使用洗脱液将核酸从磁珠表面洗脱下来,从而提取核酸。
该磁珠可以通过外加磁场对核酸进行有效的控制分离。不但降低了产品的成本,同时加快了核酸提取的速度、简化了提取步骤,为核酸富集分离全自动化提供技术基础。
本发明方法制备的磁珠粒径小,为纳米级;提高了磁珠的表面能,延长磁珠在提取液中的悬浮时间,能够与目标提取物更有效地接触,提高目标提取物的提取率;利用纳米Fe3O4的超顺磁性和磁场定向移动特性,对目标提取物进行富集和分离。
磁性微珠不仅仅局限于核酸分离领域的应用,其应用还可向生物医药、食品、化工、环保等多个领域进行应用拓展。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、向0.5mol/L柠檬酸溶液中加入纳米Fe3O4,调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加正硅酸乙酯,升温至60~80℃,搅拌反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇冲洗,干燥箱干燥,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;纳米Fe3O4的粒径为13nm;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠加入乙醇-水溶液中,再分别加入质量浓度为28%的浓氨水和TEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于无水甲苯中,在氮气保护下加入环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,回流反应,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠;
四、将烘干得到表面键合环氧基的磁性微珠分散于pH值为3的质量浓度为35%的稀盐酸溶液中,在100℃下加热回流2h,产物以去离子水洗涤至中性后,再分别以无水乙醇和丙酮洗涤,过滤收集磁性微珠,烘干得到表面键合二醇基的磁性微珠。
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%;步骤四中表面键合环氧基的磁性微珠的质量与稀盐酸溶液的体积比为1g:10mL。
本实施方式利用纳米Fe3O4的超顺磁性和磁场定向移动特性,对磁珠用特异包覆技术进行表面包覆,并对磁珠进行二次表面修饰以及功能团嫁接。该磁珠可以根据实际需要对目标物有针对性的进行表面功能团嫁接。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一中用NH3·H2O调节pH值。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤一中在氮气保护下搅拌2h。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤一中超声波分散时间为45min。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤一中干燥时间为48h。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:步骤一中柠檬酸溶液的体积与纳米Fe3O4的质量比为30mL:5g,纳米Fe3O4与正硅酸乙酯的质量比为1:1。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是:步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与乙醇-水溶液的体积比为1g:(38~39)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与氨水的体积比为5g:(3~5)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠质量与TEOS的体积比为5g:(1~2)mL。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是:步骤二中干燥时间为12h。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是:步骤二中浸泡时间为30min。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是:步骤三中磁性微珠的质量与无水甲苯的体积比为1g:(5~6)mL,磁性微珠的质量与环氧丙基丙氧基硅烷的体积比为5g:(1~2)mL。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一:本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是:步骤三中回流反应的条件为在110℃下回流反应8h。其它与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二:本实施方式核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、向0.5mol/L柠檬酸溶液中加入纳米Fe3O4,调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加正硅酸乙酯,升温至60~80℃,搅拌反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇冲洗,干燥箱干燥,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;纳米Fe3O4的粒径为13nm;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠加入乙醇-水溶液中,再分别加入质量浓度为28%的浓氨水和TEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于无水甲苯中,在氮气保护下加入环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,回流反应,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠;
四、将NaOH溶于去离子水中,随后加入亚氨基二乙酸使其溶解,所得亚氨基二乙酸钠溶液在60℃下加热至溶解,然后于剩余溶液中加入大量甲醇溶液,使得亚氨基二乙酸钠盐析出,过滤收集固体,60℃下真空烘干,得到亚氨基二乙酸钠;
将步骤三得到的表面键合环氧基的磁性微珠与亚氨基二乙酸钠先后加于甲醇中,搅拌下反应48h,磁性微珠产物依次以水、甲醇处理以除去过量的亚氨基二乙酸钠后,浸泡于pH值为3的质量浓度为35%的稀HCl中30min,然后以去离子水洗涤产物至中性,再以甲醇、丙酮各洗涤一遍,过滤收集,烘干得到表面包覆亚氨基二乙酸的磁性微珠。
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%;步骤四中NaOH的质量与去离子水的体积比为2g:30mL,NaOH与亚氨基二乙酸的质量比为2:3,表面键合环氧基的磁性微珠与亚氨基二乙酸钠的质量比为4.5:0.2,亚氨基二乙酸钠的质量与甲醇的体积比为0.2g:20mL。
具体实施方式十三:本实施方式与具体实施方式十二不同的是:步骤一中用NH3·H2O调节pH值。其它与具体实施方式十二相同。
具体实施方式十四:本实施方式与具体实施方式十二或十三不同的是:步骤一中在氮气保护下搅拌2h。其它与具体实施方式十二或十三相同。
具体实施方式十五:本实施方式与具体实施方式十二至十四之一不同的是:步骤一中超声波分散时间为45min。其它与具体实施方式十二至十四之一相同。
具体实施方式十六:本实施方式与具体实施方式十二至十五之一不同的是:步骤一中干燥时间为48h。其它与具体实施方式十二至十五之一相同。
具体实施方式十七:本实施方式与具体实施方式十二至十六之一不同的是:步骤一中柠檬酸溶液的体积与纳米Fe3O4的质量比为30mL:5g,纳米Fe3O4与正硅酸乙酯的质量比为1:1。其它与具体实施方式十二至十六之一相同。
具体实施方式十八:本实施方式与具体实施方式十二至十七之一不同的是:步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与乙醇-水溶液的体积比为1g:(38~39)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与氨水的体积比为5g:(3~5)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠质量与TEOS的体积比为5g:(1~2)mL。其它与具体实施方式十二至十七之一相同。
具体实施方式十九:本实施方式与具体实施方式十二至十八之一不同的是:步骤二中干燥时间为12h。其它与具体实施方式十二至十八之一相同。
具体实施方式二十:本实施方式与具体实施方式十二至十九之一不同的是:步骤二中浸泡时间为30min。其它与具体实施方式十二至十九之一相同。
具体实施方式二十一:本实施方式与具体实施方式十二至二十之一不同的是:步骤三中磁性微珠的质量与无水甲苯的体积比为1g:(5~6)mL,磁性微珠的质量与环氧丙基丙氧基硅烷的体积比为5g:(1~2)mL。其它与具体实施方式十二至二十之一相同。
具体实施方式二十二:本实施方式与具体实施方式十二至二十一之一不同的是:步骤三中回流反应的条件为在110℃下回流反应8h。其它与具体实施方式十二至二十一之一相同。
为验证本发明的有益效果进行以下试验:
实施例一:
核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、称取30mL0.5mol/L柠檬酸溶液于三颈瓶中,加入5g纳米Fe3O4,用NH3·H2O调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌2h,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散45min,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并加入NH3·H2O调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加5g正硅酸乙酯,升温至80℃,强力搅拌下反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇反复冲洗,干燥箱干燥48小时,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠4.0g加入192.0mL乙醇-水溶液中,再分别加入4.0mL质量浓度为28%的浓氨水和1.2mLTEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥12h,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡30min,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于30mL无水甲苯中,在氮气保护下加入1.5mL环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,在110℃下回流反应8h,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠。
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%。
利用本实施例得到的表面键合环氧基的磁性微珠进行核酸提取的方法如下:
在血样中加入裂解液,搅拌均匀,然后加入蛋白酶,微热;在混合液中加入磁性微珠,将混合液充分混合,处理时间为30分钟;加磁场,分离混合液,分离吸附核酸的磁性微珠,清洗分离,得到含核酸液体。
本实施例磁性微珠用量/μL:50;血液DNA回收率:58%;A260/280:1.53。
实施例二:
核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、称取30mL0.5mol/L柠檬酸溶液于三颈瓶中,加入5g纳米Fe3O4,用NH3·H2O调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌2h,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散45min,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并加入NH3·H2O调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加5g正硅酸乙酯,升温至60℃,强力搅拌下反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇反复冲洗,干燥箱干燥48小时,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠4.0g加入192.0mL乙醇-水溶液中,再分别加入4.0mL质量浓度为28%的浓氨水和1.2mLTEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥12h,再将磁性微珠放入pH值为1的质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡30min,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于30mL无水甲苯中,在氮气保护下加入2.0mL环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,在110℃下回流反应8h,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠。
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%。
利用本实施例得到的表面键合环氧基的磁性微珠进行核酸提取的方法如下:
在血样中加入裂解液,搅拌均匀,然后加入蛋白酶,微热;在混合液中加入磁性微珠,将混合液充分混合,处理时间为30分钟;加磁场,分离混合液,分离吸附核酸的磁性微珠,清洗分离,得到含核酸液体。
本实施例
磁性微珠用量/μL:50;血液DNA回收率:68%;A260/280:1.67。
实施例三:
核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、称取30mL0.5mol/L柠檬酸溶液于三颈瓶中,加入5g纳米Fe3O4,用NH3·H2O调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌2h,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散45min,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并加入NH3·H2O调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加5g正硅酸乙酯,升温至70℃,强力搅拌下反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇反复冲洗,干燥箱干燥48小时,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠4.0g加入192.0mL乙醇-水溶液中,再分别加入4.0mL质量浓度为28%的浓氨水和1.2mLTEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥12h,再将磁性微珠放入pH值为1的质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡30min,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于30mL无水甲苯中,在氮气保护下加入1.5mL环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,在110℃下回流反应8h,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠。
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%。
利用本实施例得到的表面键合环氧基的磁性微珠进行核酸提取的方法如下:
在血样中加入裂解液,搅拌均匀,然后加入蛋白酶,微热;在混合液中加入磁性微珠,将混合液充分混合,处理时间为30分钟;加磁场,分离混合液,分离吸附核酸的磁性微珠,清洗分离,得到含核酸液体。
本实施例
磁性微珠用量/μL:50;血液DNA回收率:76%;A260/280:1.87。
实施例四:
核酸提取用磁性微珠的制备方法,按以下步骤进行:
一、称取30mL0.5mol/L柠檬酸溶液于三颈瓶中,加入5g纳米Fe3O4,用NH3·H2O调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌2h,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散45min,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并加入NH3·H2O调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加5g正硅酸乙酯,升温至80℃,强力搅拌下反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇反复冲洗,干燥箱干燥48小时,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠4.0g加入192.0mL乙醇-水溶液中,再分别加入4.0mL质量浓度为28%的浓氨水和1.2mLTEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥12h,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡30min,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于30mL无水甲苯中,在氮气保护下加入1.5mL环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,在110℃下回流反应8h,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠。
四、将烘干得到表面键合环氧基的磁性微珠分散于pH值为3的稀盐酸溶液(40mL)中,在100℃下加热回流2h。产物以去离子水洗涤至中性后,再分别以乙醇、丙酮洗涤,过滤收集,烘干得到表面键合二醇基的磁性微珠。
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%。
利用本实施例得到的表面键合环氧基的磁性微珠进行核酸提取的方法如下:
在血样中加入裂解液,搅拌均匀,然后加入蛋白酶,微热;在混合液中加入磁性微珠,将混合液充分混合,处理时间为30分钟;加磁场,分离混合液,分离吸附核酸的磁性微珠,清洗分离,得到含核酸液体。
磁性微珠用量/μL:50;血液DNA回收率:75%;A260/280:1.81。
实施例五:
一、称取30mL0.5mol/L柠檬酸溶液于三颈瓶中,加入5g纳米Fe3O4,用NH3·H2O调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌2h,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散45min,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并加入NH3·H2O调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加5g正硅酸乙酯,升温至80℃,强力搅拌下反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇反复冲洗,干燥箱干燥48小时,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠4.0g加入192.0mL乙醇-水溶液中,再分别加入4.0mL质量浓度为28%的浓氨水和1.2mLTEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥12h,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡30min,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%。
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于30mL无水甲苯中,在氮气保护下加入1.5mL环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,在110℃下回流反应8h,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠。
四、将1.66g NaOH溶于30mL去离子水中,随后于其中加入2.66g亚氨基二乙酸使其溶解。所得亚氨基二乙酸钠溶液在60℃下真空加热除去其中大部分水分。于剩余溶液中加人大量甲醇溶液,使得亚氨基二乙酸钠盐析出,过滤收集,60℃下真空烘干。将表面键合环氧基的磁性微珠与亚氨基二乙酸钠(0.2g)先后加于甲醇(20mL)中,搅拌下反应48h。磁性微珠产物以甲醇、水处理以除去过量的亚氨基二乙酸钠后,浸泡于pH值为3的稀HCl中。30min后,以去离子水洗涤产物至中性,再以甲醇、丙酮各洗涤一遍,过滤收集,烘干得到表面包覆亚氨基二乙酸的磁性微珠。
利用本实施例得到的表面键合环氧基的磁性微珠进行核酸提取的方法如下:
在血样中加入裂解液,搅拌均匀,然后加入蛋白酶,微热;在混合液中加入磁性微珠,将混合液充分混合,处理时间为30分钟;加磁场,分离混合液,分离吸附核酸的磁性微珠,清洗分离,得到含核酸液体。
磁性微珠用量/μL:50;血液DNA回收率:84%;A260/280:1.94。
Claims (8)
1.核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于该方法按以下步骤进行:
一、向30mL、0.5mol/L柠檬酸溶液中加入5g纳米Fe3O4,调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加正硅酸乙酯,纳米Fe3O4与正硅酸乙酯的质量比为1:1,升温至60~80℃,搅拌反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇冲洗,干燥箱干燥,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;纳米Fe3O4的粒径为13nm;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠加入乙醇-水溶液中,再分别加入质量浓度为28%的浓氨水和TEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于无水甲苯中,在氮气保护下加入环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,回流反应,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠;
四、将烘干得到表面键合环氧基的磁性微珠分散于pH值为3的质量浓度为35%的稀盐酸溶液中,在100℃下加热回流2h,产物以去离子水洗涤至中性后,再分别以无水乙醇和丙酮洗涤,过滤收集磁性微珠,烘干得到表面键合二醇基的磁性微珠;
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%;步骤四中表面键合环氧基的磁性微珠的质量与稀盐酸溶液的体积比为1g:10mL。
2.根据权利要求1所述的核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与乙醇-水溶液的体积比为1g:(38~39)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与氨水的体积比为5g:(3~5)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠质量与TEOS的体积比为5g:(1~2)mL。
3.根据权利要求1所述的核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于步骤三中磁性微珠的质量与无水甲苯的体积比为1g:(5~6)mL,磁性微珠的质量与环氧丙基丙氧基硅烷的体积比为5g:(1~2)mL。
4.根据权利要求1所述的核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于步骤三中回流反应的条件为在110℃下回流反应8h。
5.核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于该方法按以下步骤进行:
一、向30mL、0.5mol/L柠檬酸溶液中加入5g纳米Fe3O4,调节溶液的pH值至5.5,在氮气保护下搅拌,然后将纳米Fe3O4取出,用丙酮洗涤,再将纳米Fe3O4放入去离子水中超声波分散,之后加入无水乙醇,形成乙醇-水体体系,并调节溶液的pH值至6,然后向含有纳米Fe3O4的乙醇-水体溶液滴加正硅酸乙酯,纳米Fe3O4与正硅酸乙酯的质量比为1:1,升温至60~80℃,搅拌反应8h,最后将纳米Fe3O4依次用去离子水和无水乙醇冲洗,干燥箱干燥,得到Fe3O4/SiO2磁性微珠;纳米Fe3O4的粒径为13nm;
二、将步骤一制备的Fe3O4/SiO2磁性微珠加入乙醇-水溶液中,再分别加入质量浓度为28%的浓氨水和TEOS,于室温振荡反应3h,然后取出磁性微珠用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,之后于60℃真空干燥,再将磁性微珠放入质量浓度为35%的稀盐酸溶液中浸泡,然后重新用去离子水洗涤至中性,再依次用无水乙醇和丙酮洗涤;
三、将步骤二洗涤后的磁性微珠分散于无水甲苯中,在氮气保护下加入环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷试剂,回流反应,得到改性磁珠,将所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液和甲醇洗涤并抽干,烘干后得到表面键合环氧基的磁性微珠;
四、将NaOH溶于去离子水中,随后加入亚氨基二乙酸使其溶解,所得亚氨基二乙酸钠溶液在60℃下加热至溶解,然后于剩余溶液中加入大量甲醇溶液,使得亚氨基二乙酸钠盐析出,过滤收集固体,60℃下真空烘干,得到亚氨基二乙酸钠;
将步骤三得到的表面键合环氧基的磁性微珠与亚氨基二乙酸钠先后加于甲醇中,搅拌下反应48h,磁性微珠产物依次以水、甲醇处理以除去过量的亚氨基二乙酸钠后,浸泡于pH值为3的质量浓度为35%的稀HCl中30min,然后以去离子水洗涤产物至中性,再以甲醇、丙酮各洗涤一遍,过滤收集,烘干得到表面包覆亚氨基二乙酸的磁性微珠;
其中步骤二所述乙醇-水溶液中无水乙醇和水的体积比为5:1;步骤三中甲醇水溶液的体积浓度为50%;步骤四中NaOH的质量与去离子水的体积比为2g:30mL,NaOH与亚氨基二乙酸的质量比为2:3,表面键合环氧基的磁性微珠与亚氨基二乙酸钠的质量比为5:0.2,亚氨基二乙酸钠的质量与甲醇的体积比为0.2g:20mL。
6.根据权利要求5所述的核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于步骤二中Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与乙醇-水溶液的体积比为1g:(38~39)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠的质量与氨水的体积比为5g:(3~5)mL,Fe3O4/SiO2磁性微珠质量与TEOS的体积比为5g:(1~2)mL。
7.根据权利要求5所述的核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于步骤三中磁性微珠的质量与无水甲苯的体积比为1g:(5~6)mL,磁性微珠的质量与环氧丙氧基丙氧基硅烷的体积比为5g:(1~2)mL。
8.根据权利要求5所述的核酸提取用磁性微珠的制备方法,其特征在于步骤三中回流反应的条件为在110℃下回流反应8h。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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