CN103506093B

CN103506093B - 一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法

Info

Publication number: CN103506093B
Application number: CN201310461379.1A
Authority: CN
Inventors: 高瑞霞; 慕欣茹; 张军杰; 唐玉海
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-09-30
Also published as: CN103506093A

Abstract

本发明公开了一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法，是以表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子作为载体，以两种蛋白质作为模板分子，将模板分子固定在磁性载体表面，在3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷的作用下，形成聚合物，再将聚合物中的模板分子洗脱下来，得到的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。本发明制得的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子，材料成本低廉，制备简单，分离快速，更易实现规模化地对复杂生物体系中多种高丰度蛋白质组分的同时高效地选择性去除和富集。

Description

一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质分子印迹技术领域，涉及一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法。

背景技术

蛋白质组学已成为科学家们近年来研究的热点。蛋白质组学是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式，它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用等。基于蛋白质组学的一个重要研究方面——蛋白质表达模式的研究，它要求对蛋白质组进行表征，即所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化，这就需要从样品中分离蛋白质进而对其进行鉴定。然而，以目前的技术手段来看，要实现蛋白质组学的研究目的还存在一定的局限性，如：在蛋白质分离的分辨率、检出的灵敏度、及鉴定的自动化等方面还有待提高和解决，且其难度很大。并且，由于蛋白质无法像DNA一样被“扩增”，蛋白质组中含量低的蛋白质在大规模的检测中很难被检测到，而能对细胞功能产生重大影响的蛋白质其表达量往往是比较低的。面对生物体在其生命的不同时期合成的比基因组更庞大的整套蛋白质，实现鉴定其这一目标显得更庞大、更复杂和更富有挑战性。因此，发展新型的先进技术和先进材料，并将其用于复杂生物样品中蛋白质的分离和富集成为蛋白质组学急需解决的问题。

近年来，分子印迹技术（MIT）发展非常迅速。MIT具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性，可以根据不同的实验目的，制备出对不同模板分子或对其类似物有专一识别性的分子印迹聚合物（MIPs）。与天然的生物分子识别系统相比，人工合成的MIPs具有廉价易得、抗恶劣环境能力强和稳定性高等方面的优势。因此，这种操作简单、适用性强的技术得到了广泛的应用。然而，由于生物大分子体积庞大，空间结构复杂多变，使得目前分子印迹技术成功的例子多以小分子为模板，对生物大分子尤其是具有重要作用的功能蛋白质的印迹研究相对滞后。

磁性纳米材料具有较高的超顺磁性和矫顽力。以磁性纳米材料为载体，制得的MIPs，在吸附过程完成后，只需要一个外加磁场，就能在几秒内实现MIPs和吸附液的分离，无需离心或过滤等复杂的程序，省时又省力，大大提高了实验效率。功能化的磁性纳米材料可以通过非共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，给目标生物产品的分离带来了革命性的发展，以其优良的分散性和生物相容性在细胞学、分子生物学、生物化学和生物医学等领域得到研究工作者们的广泛关注。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法，采用表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子、功能单体和双模板蛋白质分子来制备分子印迹纳米粒子，制备所得的产物能够同时实现对复杂血样中高丰度蛋白质的高选择性去除和富集。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的制备方法，包括以下操作：

1）以目标蛋白质为模板分子，在反应缓冲液中，将模板分子、表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子和功能单体充分混合均匀，然后在20～35℃下聚合反应5～24h；

其中，模板分子与表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子的质量比为40～80:150～300，表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子与功能单体的质量比为150～300:200～500；

待反应完成后，分离出聚合反应后的固态聚合物，得到结合有模板分子的磁性分子印迹纳米粒子；

2）以0.01～0.1mol/L的碱溶液作为洗脱液，对结合有模板分子的磁性分子印迹纳米粒子洗脱2～8h，将模板分子洗脱下来，得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

所述的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子通过以下方法来制备：

将己二胺、无水醋酸钠、可溶性铁盐与乙二醇置于反应釜中，搅拌均匀，在190～210℃下反应6～12h；待反应完成后，分离固体产物，洗涤后真空干燥；

其中，己二胺：无水醋酸钠：可溶性铁盐的质量比为3～6:2～5:1～2；己二胺与乙二醇的质量比为3～6:20～30。

所述的固体产物的分离为：

反应完成后，在外加磁场下将固体产物吸附，固液分离，然后用超纯水洗涤收集到的固体产物至洗出液呈中性。

所述的模板分子为两种或两种以上的蛋白质；

所述的功能单体为3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和辛基三甲基硅烷（OTMS）；本功能单体还能起到交联剂的作用；

所述的反应缓冲液为pH=7.0的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液中功能单体的质量浓度为2.4～8.9%，模板分子的质量浓度为0.19～0.36%。

所述的模板分子为血清白蛋白和血红蛋白，以质量比计，血清白蛋白：血红蛋白=1:0.8～1.2。

所述的固态聚合物的分离为：

反应完成后，在外加磁场下将固体产物吸附，固液分离，然后用超纯水洗涤收集到的固态聚合物至洗出液呈中性。

一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子，是以表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子作为载体，以两种蛋白质作为模板分子，将模板分子固定在磁性载体表面，在3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷的作用下，形成聚合物，再将聚合物中的模板分子洗脱下来，得到的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

所述在聚合物进行聚合时，3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷的质量为0.2～0.8:0.3～1.2；模板分子与表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子的质量比为40～80:150～300，表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子与功能单体的质量比为150～300:200～500。

所述表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子的平均粒径为60～65nm。

所述的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子在高选择性地去除和富集血液中的血清白蛋白和血红蛋白中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法，是基于表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子，采用水热法合成的功能化的超顺磁性纳米粒子作为载体，不仅可实现外加磁场下的固液快速分离，而且可通过其表面的氨基基团固定模板蛋白；

采用血液中丰度较高的血清白蛋白和血红蛋白同时作为模板分子（比如牛血中的两种高丰度蛋白质：牛血清白蛋白（BSA）和牛血红蛋白（BHb）），所制备的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子可实现复杂血样中高丰度蛋白质的同时高选择性去除和富集；而且采用固定模板蛋白的分子印迹技术，使所得聚合物对特定的模板蛋白有专一的选择性和高的吸附容量。

进一步，本发明提供的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法，采用两种功能化的硅烷化试剂作为功能单体，其同时起到交联剂的作用，既可与模板蛋白相互作用，又可使所得聚合物具有良好的生物相容性。

与现有的单一模板蛋白的印迹材料相比较，本发明制得的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子，材料成本低廉，制备简单，分离快速，更易实现规模化地对复杂生物体系中多种高丰度蛋白质组分的同时高效地选择性去除和富集。

本发明提供的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子，该制备方法操作简单，条件温和，价格低廉，且制得的聚合物粒径均一，分散性好，在外加磁场下可迅速实现分离，可同时实现对复杂血样中高丰度蛋白质的高选择性去除和富集。

附图说明

图1为采用水热法合成的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子的透射电镜图；

图2为采用固定模板法制备的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的透射电镜图；

图3为磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子应用于标准混合蛋白样品和实际牛血样的SDS-PAGE分析图。

具体实施方式

本发明提供的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法，以两种或两种以上高丰度蛋白质共同作为模板分子，加入一定比例的功能单体，采用固定模板蛋白的印迹方法，在一定温度下，以一定时间聚合，碱性洗脱后，得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

2）以0.01～0.1mol/L的碱性溶液作为洗脱液，对结合有模板分子的磁性分子印迹纳米粒子洗脱2～8h，将模板分子洗脱下来，得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。所述的碱性溶液为苛性碱溶液或者碱金属的碱性溶液。

具体的，所述的表面氨基功能化的超顺磁性纳米颗粒通过以下方法来制备：

所述的固体产物的分离为：

反应完成后，在外加磁场下将固体产物吸附，固液分离，然后用超纯水洗涤收集到的固体产物至洗出液呈中性。所制备的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子的平均粒径为60～65nm。

所述的模板分子为两种或两种以上的蛋白质；可以根据需要筛除的目标蛋白来具体选择，由于本发明采用分子印迹技术，因此对蛋白质的种类、构型并无特定的要求。而且由于蛋白分子是以表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子作为载体，模板分子被固定在磁性载体表面，最后再被聚合物包裹，所以蛋白质的种类数对所制备的分子印迹聚合物也没有限定。

所述的功能单体为3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和辛基三甲基硅烷（OTMS）；所选择的功能单体还能起到交联剂的作用；

所制备的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子，是以表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子作为载体，以两种蛋白质作为模板分子，将模板分子固定在磁性载体表面，在3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷的作用下，形成聚合物，再将聚合物中的模板分子洗脱下来，得到的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

具体的以牛血清白蛋白（BSA）和牛血红蛋白（BHb）作为模板分子进行说明。

实施例1

一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(a)水热法制备表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子：

将5.0g己二胺，3.5g无水醋酸钠，1.5g氯化铁，30mL乙二醇置于反应釜中，搅拌均匀，反应温度为200℃，反应时间为6h，反应完成后，在外加磁场下将固液分离，固体产物用超纯水洗至中性，真空干燥（15Kpa,40℃）。即得表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子，其电镜图如图1所示，其颗粒粒径约为60nm。

(b)固定模板法制备分子印迹纳米粒子

以牛血清白蛋白（BSA）和牛血红蛋白（BHb）作为模板分子；将40mgBSA和40mg BHb置于100mL三口瓶中，加入20mL Tris-HCl缓冲液（0.1mmol/L，pH=7.0），再加入200mg表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子，800μL APTES，1.2mL OTMS，搅拌均匀；然后在20℃下聚合反应12h；

在外加磁场下，分离出聚合反应后的固态聚合物，即得结合有模板分子的分子印迹纳米粒子（即洗脱前的分子印迹纳米粒子）；

(c)模板蛋白的洗脱

以0.05mol/L的氢氧化钠溶液作为洗脱液，将所制备的分子印迹聚合物洗脱6h，将双模板蛋白质分子洗脱下来，即得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

所制备的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的透射电镜图如图2所示，可以应用于血样中高丰度蛋白质（血清白蛋白和血红蛋白）的高选择性去除和富集。

实施例2

一种双模板蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：

(a)水热法制备表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子：

将3.0g己二胺，2.0g无水醋酸钠，1.0g氯化铁，20mL乙二醇置于反应釜中，搅拌均匀，反应温度为190℃，反应时间为8h，反应完成后，在外加磁场下将固液分离，固体产物用超纯水洗至中性，真空干燥（15Kpa,40℃）。即得粒径约为65nm的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子。

(b)固定模板法制备分子印迹纳米粒子

将18.2mg BSA和21.8mg BHb置于100mL三口瓶中，加入20mLTris-HCl缓冲液（0.1mmol/L，pH=7.0），再加入150mg表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子，200μL APTES，300μL OTMS，搅拌均匀；然后在35℃下聚合反应5h；

在外加磁场下，分离出聚合反应后的固态聚合物，即得洗脱前的分子印迹纳米粒子；

(c)模板蛋白的洗脱

以0.1mol/L的氢氧化钠溶液作为洗脱液，将所制备的分子印迹聚合物洗脱2h，将双模板蛋白质分子洗脱下来，即得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

实施例3

(a)水热法制备表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子：

将6.0g己二胺，5.0g无水醋酸钠，2.0g氯化铁，25mL乙二醇置于反应釜中，搅拌均匀，反应温度为210℃，反应时间为10h，反应完成后，在外加磁场下将固液分离，固体产物用超纯水洗至中性，真空干燥（15Kpa,40℃）。即得粒径约为60～65nm的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子。

(b)固定模板法制备分子印迹纳米粒子

将33.3mg BSA和26.7mg BHb置于100mL三口瓶中，加入20mLTris-HCl缓冲液（0.1mmol/L，pH=7.0），再加入300mg表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子，500μL APTES，500μL OTMS，搅拌均匀；然后在30℃下聚合反应24h；

(c)模板蛋白的洗脱

以0.01mol/L的氢氧化钠溶液作为洗脱液，将所制备的分子印迹聚合物洗脱12h，将双模板蛋白质分子洗脱下来，即得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

实施例4

(a)水热法制备表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子：

将5.0g己二胺，3.0g无水醋酸钠，1.5g氯化铁，22.5mL乙二醇置于反应釜中，搅拌均匀，反应温度为200℃，反应时间为12h，反应完成后，在外加磁场下将固液分离，固体产物用超纯水洗至中性，真空干燥（15Kpa,40℃）。即得粒径约为60～65nm的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子。

(b)固定模板法制备分子印迹纳米粒子

将30mg BSA和35mg BHb置于100mL三口瓶中，加入20mL Tris-HCl缓冲液（0.1mmol/L，pH=7.0），再加入500mg表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子，600μL APTES，500μL OTMS，搅拌均匀；然后在30℃下聚合反应24h；

(c)模板蛋白的洗脱

以0.1mol/L的氢氧化钾溶液作为洗脱液，将所制备的分子印迹聚合物洗脱12h，将双模板蛋白质分子洗脱下来，即得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

将所得磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子对标准蛋白混合样品和实际牛血样中目标蛋白质的选择性去除和富集实验，考察了其吸附性能和实际应用能力。结果如图3的SDS-PAGE分析所示。

图3中，Lane0为蛋白质分子量的标准，其中66.2附近为BSA特征条带，14.4附近为BHb特征条带。Lane1为0.30mg mL-1的BHb与BSA的标准混合溶液。Lane2是经磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子吸附后的BHb与BSA的标准混合溶液。可以看到BHb与BSA的条带都已完全消失，说明所得磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子完全去除了标准混合溶液中的BHb与BSA。Lane3为经0.10mol/L氢氧化钠溶液对磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子吸附BHb与BSA的混合溶液洗脱后的洗脱液。可以看到BHb与BSA的条带又重新出现，说明所得磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子富集了标准混合溶液中的BHb与BSA。Lane4为稀释150倍的实际牛血样，可以清晰的看到BHb与BSA条带。Lane5是经磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子吸附后的牛血样。可以看到BHb与BSA的条带都已完全消失，而35.0处的条带几乎没有变化，说明所得磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子选择性地去除了实际牛血样品中的BHb与BSA。Lane6，为经0.10mol/L氢氧化钠溶液对磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子吸附实际牛血样洗脱后的洗脱液。可以看到BHb与BSA的条带又重新出现，说明所得磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子选择性地富集了牛血样中的BHb与BSA。

以上实验结果说明所得磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子可同时实现对复杂血样中目标高丰度蛋白质的高选择性去除和富集。

Claims

1.一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

1)以目标蛋白质为模板分子，在反应缓冲液中，将模板分子、表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子和功能单体充分混合均匀，然后在20～35℃下聚合反应5～24h；

所述的模板分子为血清白蛋白和血红蛋白，以质量比计，血清白蛋白：血红蛋白＝1:0.8～1.2；

所述的功能单体为3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷；本功能单体还能起到交联剂的作用；

所述的反应缓冲液为pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液中功能单体的质量浓度为2.4～8.9％，模板分子的质量浓度为0.19～0.36％；

所述的固态聚合物的分离为：反应完成后，在外加磁场下将固体产物吸附，固液分离，然后用超纯水洗涤收集到的固态聚合物至洗出液呈中性；

2)以0.01～0.1mol/L的碱性溶液作为洗脱液，对结合有模板分子的磁性分子印迹纳米粒子洗脱2～8h，将模板分子洗脱下来，得到磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

2.如权利要求1所述的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子通过以下方法来制备：

3.如权利要求2所述的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的固体产物的分离为：

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子的制备方法制得的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子，其特征在于，是以平均粒径为60～65nm的表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子作为载体，以血清白蛋白和血红蛋白作为模板分子，将模板分子固定在载体表面，在3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷的作用下，形成聚合物，在聚合物进行聚合时，3-氨丙基三乙氧基硅烷和辛基三甲基硅烷的质量为0.2～0.8:0.3～1.2；模板分子与表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子的质量比为40～80:150～300，表面氨基功能化的超顺磁性纳米粒子与功能单体的质量比为150～300:200～500，再将聚合物中的模板分子洗脱下来，得到的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子。

5.权利要求4所述的磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子在高选择性地去除和富集血液中的血清白蛋白和血红蛋白中的应用。