CN111154035B - 树形分子印迹材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种树形分子印迹材料及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：将中心骨架分子、有机溶剂进行混料处理并加入若干种模板前体使若干所述模板前体依次与所述中心骨架分子发生缩合或者取代反应，获得树形模板分子，所述树形模板分子中具有若干不同的模板；将树形模板分子与聚合物单体、引发剂、交联剂、溶剂进行混合，使得聚合物单体发生聚合反应生成聚合物，生成的聚合物包覆于树形模板分子表面，并对获得的聚合物进行洗脱处理以去除树形模板分子，获得树形分子印迹材料。本发明制备方法得到的树形分子印迹材料中具有模板前体分子浓度比例固定、分布均匀的特点，使得检测结果一致性高，且检测结果具有良好的再现性。

Description

树形分子印迹材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子印迹材料技术领域，具体涉及一种树形分子印迹材料及其制备方法和应用。
背景技术
在化学、生物、食品检测中，通常需要使用分子印迹材料，这些分子印迹材料具有选择性富集的优点，从而有利于提高检测准确度。但是在实际应用中，往往需要多个分子进行检测，而目前以多个分子为模板的分子印迹材料极为少见。其中一个很重要的原因是不同模板分子，特别是分子结构差异较大的分子在一个聚合反应中因物理性质有差异、化学活性有差异，其被包裹的效率不一致，导致最终分子印迹材料中每个模板空穴浓度分布难以控制，最终检测结果无法重复再现。
发明内容
针对目前分子印迹存在由于其模板分子物理性质、化学性质有差异出现的被包裹的效率不一致而导致分子印迹材料模板空穴浓度分布难以控制以及最终检测结果无法重现等问题，本发明提供一种树形分子印迹材料及其制备方法。
以及，由上述制备方法获得的树形分子印迹材料的应用。
为实现上述发明的目的，本发明的技术方案如下：
一种树形分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤S01.将中心骨架分子、有机溶剂进行混料处理并加入若干种模板前体使若干所述模板前体依次与所述中心骨架分子发生缩合或者取代反应，在加入若干所述模板前体进行反应过程中，控制前一种模板前体与所述中心骨架分子反应结束后再加入后一种模板前体，按照此反应次序获得树形模板分子，所述树形模板分子中具有若干不同的模板；
步骤S02.将所述树形模板分子与聚合物单体、引发剂、交联剂、溶剂进行混合，使得所述聚合物单体发生聚合反应生成聚合物，生成的所述聚合物包覆于所述树形模板分子表面，并对获得的所述聚合物进行洗脱处理，使所述树形模板分子发生洗脱，获得树形分子印迹材料；
其中，所述中心骨架分子具有至少2个反应基团，所述反应基团具有与若干所述模板前体发生缩合或取代反应的活性。
相应地，一种树形分子印迹材料，所述树形分子印迹材料采用如上所述的制备方法制备得到。
以及，一种固相萃取柱，所述固相萃取柱包含上述所述的树形分子印迹材料。
本发明树形分子印迹材料的制备方法的有益效果在于：
相对于现有技术，本发明树形分子印迹的制备方法首先通中心骨架分子与具有不同模板前体结合在一起，获得由多个组分通过共价键形成的树形模板分子，随后将具有树形模板分子混入聚合物单体，聚合物单体发生聚合时将树形模板分子包裹，经洗脱获得树形分子印迹材料，该方法具有制备工艺简单的特点，且不会出现因各个模板分子的物化性质不同而导致的分布浓度不一，无法控制的问题。由此制备方法得到的树形分子印迹材料中具有分布均匀、模板前体分子浓度比例固定的结构，可以使得检测结果一致性高，并且检测结果具有良好的再现性。
本发明提供的树形分子印迹材料的有益效果在于：
本发明提供的树形分子印迹材料，由于采用如上的方法进行制备，具有不同的模板分子印迹，用于检测时具有检测结果一致性高、再现性好等特点，因此可广泛应用于疾病体外诊断、环境监测、食品安全检测、危化物检测等检测领域。
本发明提供的固相萃取柱，由于其中含有上述的树形分子印迹材料，因此其具有上述树形分子印迹材料的特性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
名词解释：
模板前体：在本发明中指的是形成模板分子的前体，其含有模板分子的相应特征基团；
第一模板前体、第二模板前体、第三模板前体等涉及的第一、第二、第三等不表示化学结构特征，仅仅模板前体的序号。
本发明提供一种树形分子印迹材料的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
步骤S01.将中心骨架分子、有机溶剂进行混料处理并加入若干种模板前体使若干所述模板前体依次与所述中心骨架分子发生缩合或者取代反应，在加入若干所述模板前体进行反应过程中，控制前一种模板前体与所述中心骨架分子反应结束后再加入后一种模板前体的顺序，按照此反应次序获得树形模板分子，所述树形模板分子中具有若干不同的模板；
步骤S02.将所述树形模板分子与聚合物单体、引发剂、交联剂、溶剂进行混合，使得所述聚合物单体发生聚合反应生成聚合物，生成的所述聚合物包覆于所述模板分子表面，并对获得的所述聚合物进行洗脱处理，使得树形模板分子被洗脱，获得树形分子印迹材料；
其中，所述中心骨架分子具有至少2个反应基团，所述反应基团具有所述模板前体发生缩合或取代反应的活性。
下面对本发明的制备方法技术方案做进一步的详细解释。
在本发明中，是通过中心骨架分子与若干的模板前体进行结合从而获得树形模板分子。
具体来说，中心骨架分子应当包含至少2个反应基团，从而可以与至少两种模板前体发生缩合或者取代的化学反应，形成树形模板分子。也就是说参与反映的模板前体应当含有能够与中心骨架分子发生缩合或者取代的官能团。比如中心骨架分子可以有2个反应基团、3个反应基团、4个反应基团、5个反应基团等等。
例如，当中心骨架分子有两个反应基团时，可以与两个模板前体反应，包括第一模板前体和第二模板前体，先使得第一模板前体与中心骨架分子中的一个反应基团发生化学反应，获得中间产物，再将第二模板前体与中间产物进行发生化学反应，使得中间产物中包含的中心骨架分子的另一个反应基团与第二模板前体发生缩合或者取代反应，由此中心骨架分子连接了两个不同而模板前体。其余结构的中心骨架分子按照这个思路形成树形模板分子。
值得注意的是，由于每一个模板前体与中心骨架分子的反应基团的反应活性有差异、且反应比例受到控制，将其中一个模板前体与中心骨架分子进行反应时，模板前体可以只与中心骨架分子的一个反应基团发生化学反应，而剩下反应基团未发生化学反应，只有加入第二种模板前体时，该第二模板前体才与剩下的其中一个反应基团发生化学反应，其余反应基团依次与后续加入的模板前体发生化学反应。比如当中心骨架分子含有2个反应基团时，则反应基团分别与第一、第二模板前体发生反应；当中心骨架分子含有3个反应基团时，则反应基团可以分别与三种模板前体依次发生反应；当中心骨架分子含有4个反应基团时，则4个反应基团可以分别与四种模板前体依次发生反应；当中心骨架分子含有5个反应基团时，则5个反应基团可以分别与五种模板前体依次发生反应；当中心骨架分子有6个反应基团时，可以与三种模板前体发生反应也可以与六种模板前体发生反应，当与三种模板前体反应时，可以控制三种模板前体与中心骨架分子结合的比例，如控制三种模板前体的比例为1:3:2，即其中一种模板前体与中心骨架分子的一个反应基团发生反应，另一种模板前体与中心骨架分子的三个反应基团发生反应，第三种模板前体与中心骨架分子的两个反应基团发生反应，使得三种模板前体按照比例与中心骨架分子的6个反应基团完全结合；而与六种模板前体反应时，则只需要分别与中心骨架分子的对应反应基团发生缩合或者取代即可，其余具有更多反应基团的中心骨架分子可以按照上述思想进行设计。
优选地，中心骨架分子具有的反应基团可以是羧基、氨基、羟基、叠氮、偶氮、酰卤、酰胺、酰肼、醛基、碳碳双键、碳碳三键、巯基中的任一种。比如某个中心骨架分子具有两个羧基或者三个羧基，或者某个中心骨架分子具有一个羧基、一个氨基、一个羟基等等。
进一步优选地，中心骨架分子选自多元羧酸、乙二胺、苯二胺、2-(氨基甲基)-N1,N1-二甲基丙烷-1,3-二胺、2,2-双(氨基甲基)丙烷-1,3-二胺、1,4,7,10-四氮杂环十二烷、三聚氰胺中的任一种。
多元羧酸选自均苯三乙酸、3,3,3-氨三丙酸、丁烷四羧酸、柠檬酸、衣康酸、聚马来酸中的任一种。
优选地，若干所述模板前体含有的官能团可以是羧基、氨基、羟基、叠氮、偶氮、酰卤、酰胺、酰肼、醛基、碳碳双键、碳碳三键、巯基中的任一种。
进一步优选地，若干所述模板前体可以是孔雀石绿、孔雀石绿衍生物、氯霉素、氯霉素衍生物、硝基呋喃类、硝基呋喃类衍生物、四环素、磺胺二甲嘧啶中的任一种。
孔雀石绿衍生物是孔雀石绿结构的一个二甲氨基中的甲基被具有2～6个碳基团的小分子结构所取代，并且这些2～6个碳基团的小分子结构的末端可以与中心骨架分子的反应基团发生反应，如2～6个碳基团的小分子结构的末端为氨基、羧基、醛基、叠氮、重氮等。
氯霉素衍生物可以是以氯霉素结构中的羟基作为出发点，延伸出含有2～6个碳基团结构，所述2～6个碳基团结构的末端可以与中心骨架分子的反应基团发生化学反应，所述2～6个谈集团结构的末端可以是氨基、羧基、醛基、叠氮、重氮等；或以氯霉素结构中的氨基为出发点，延伸出的2～6个碳基团结构，所述2～6个碳基团结构的末端可以与中心骨架分子的反应基团发生化学反应，所述2～6个谈集团结构的末端可以是氨基、羧基、醛基、叠氮、重氮等；或以氯霉素结构中的硝基被氨基取代，并以此氨基为出发点，延伸出的含有2～6个碳基团结构，所述2～6个碳基团结构的末端可以与中心骨架分子的反应基团发生化学反应，所述2～6个谈集团结构的末端可以是氨基、羧基、醛基、叠氮、重氮等。
硝基呋喃衍生物为硝基呋喃代谢物中的氨基为出发点，偶联有1个芳香环，并且芳环上含有2～6个碳的末端为氨基、羧基、醛基、叠氮、重氮等可以与中心骨架分子反应的基团的结构；或者是1个芳香环上含有1个硝基，且含有2～6个碳的末端为氨基、羧基、醛基、叠氮、重氮等可以与中心骨架分子反应的基团的结构。
步骤S01中的有机溶剂可以是有机化学领域的常用溶剂，只要能够将若干模板前体、中心骨架分子溶解均适用，如可以是二氯甲烷。
步骤S01模板前体与中心骨架分子的反应过程中，可以根据模板前体与中心骨架分子发生反应时所需的反应活性，加入催化剂。催化剂的加入量不受限定，只要可以使得中心骨架分子和模板前体发生缩合或者取代即可。如当中心骨架分子与模板前体发生的是羧基类的活化反应时，催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS)的混合物，且以催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝1：10～10：1，在不同的比例下，催化效率不相同，但是均可以实现催化效果，优选地，EDC：NHS＝2:1。
步骤S01的若干模板前体与中心骨架分子反应的思路可以是将第一模板前体与中心骨架分子、有机溶剂混合后，第一模板前体与中心骨架分子发生反应，得到第一产物；再将第一产物与第二模板、有机溶剂进行混合，使得第一产物与第二模板发生反应，得到第二产物，如果不需要加入第三模板前体，那么第二产物就是获得的树形模板分子；而当需要加入第三模板前体时，将第二产物与第三模板前体溶于有机溶剂中，获得混合溶液，使得第二产物与第三模板前体发生缩合或取代反应，由此得到最终的树形模板分子。要获得其他树形模板分子，均可以按照这个思路添加模板前体。比如当最终的树形模板分子中含有第四模板前体，可以在获得第三产物时，加入第四模板前体，从而获得最终的树形模板分子。
本发明的树形模板分子，可以是一个中心骨架分子上缩合或者取代两个模板前体，也可以是一个中心骨架分子上缩合或者取代三个、四个以及更多的模板前体。
在上述步骤中，中心骨架分子与模板前体的投料比例，以模板前体能够与中心骨架分子中的一个反应基团发生缩合或者取代为主，但也可与多个反应基团反应，因此可以根据具体合成的树形模板分子计算原料投料比例。当中心骨架分子的若干个反应基团均相同时，由于投料浓度、空间位阻、催化活性等因素，一次添加的一种模板前体只会与其中的部分反应基团发生缩合或者取代，而其余相同的反应基团则需要在新的模板前体与催化剂下才可以发生缩合或者取代反应，如希望第一模板前体与第二模板前体的最终比例是2:1时，可以先让第一模板前体与中心骨架分子的两个反应基团发生缩合或者取代反应，再让第二模板前体与中心骨架分子的另一个反应基团发生缩合或取代反应，从而控制模板前体与中心骨架分子结合的比例。
步骤S02中，将步骤S01得到的树形模板分子与聚合物单体进行混合，主要是当聚合物单体发生聚合反应形成聚合物时，树形模板分子通过非共价键被包含在聚合物中，当对聚合物进行洗脱时，树形模板分子被洗脱，而聚合物中则出现树形模板分子的分子印迹，具有模板分子印迹的材料就是树形分子印迹材料。
聚合物单体在交联剂和引发剂的作用下，可以发生聚合，从而在树形模板分子周围形成聚合物，经过洗脱后，树形模板分子从聚合物中脱除，留下树形模板分子的结构空穴，鉴于这些聚合物单体均为分子印迹材料技术中的常见单体，因此这里不需要展开详细的列举。当然，如甲基丙烯酸就是其中的一种聚合物单体。此外，4-乙烯苯硼酸、4-乙烯苯甲醛、4-乙烯苯胺、4-乙烯苯酚、丙烯酰胺、丙烯腈、对乙烯苯甲酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、2-(三氯甲基)丙烯酸、亚甲基丁二酸、氨基修饰硅烷等也属于本发明所说的聚合物单体。其中，氨基修饰硅烷可以是氨基丙基三乙氧基硅烷等。
步骤S02中提及的交联剂、引发剂同样是分子印迹材料技术领域中常见的交联剂、引发剂。如交联剂可以是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、二乙烯基苯中的任一种；引发剂可以是偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯等，所使用的交联剂、引发剂，在与聚合物单体混合后，在自由基反应常规需要的光或热等的条件下，使得聚合物单体通过自由基共聚合的方式发生聚合，从而获得将树形模板分子包裹的聚合物材料。
本发明涉及的溶剂，同样是分子印迹材料技术领域中常用的溶剂，如可以是甲苯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲苯、十二醇、环己醇、二甲苯中的任一种。溶剂在制备过程中，起到溶媒的作用，同时也起到致孔剂的作用。
在具体的制备过程中，还需要过滤产物，并且采用去离子水或者蒸馏水对制备得到的聚合物材料进行清洗的过程。
步骤S02中涉及的洗脱处理，可以在洗脱前对聚合物材料进行破碎处理。如可以采用研磨的方式进行研磨，或者球磨的方式进行球磨，从而实现破碎效果。
经过破碎处理的产物采用洗脱液进行洗脱。具体的洗脱液也是分子印迹材料技术领域中常见的洗脱液，如可以是质量分数为0.1％～90％的甲酸乙腈溶液、乙酸乙腈溶液、甲酸乙醇溶液、乙酸乙醇溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液中的任一种；或质量分数为0.1％～50％的氢氧化钠的甲醇溶液、氢氧化钠的乙醇溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化钠乙腈溶液、氢氧化钾的甲醇溶液、氢氧化钾乙醇溶液、氢氧化钾水溶液、氢氧化钾乙腈溶液中的任一种。通过洗脱，将包裹在聚合物内部的树形模板分子洗除。
本发明的制备方法中，先通中心骨架分子将若干具有不同模板结构的模板前体结合在一起，获得由多个组分通过共价键形成的树形模板分子，随后将获得的树形模板分子混入聚合物单体，聚合物单体发生聚合时将树形模板分子包裹，经洗脱得到树形分子印迹材料。
该制备方法具有制备工艺简单的特点，且不会出现因各个模板前体分子的物化性质不同而导致的分布浓度不一、无法控制的问题。由此制备方法得到的树形分子印迹材料中具有分布均匀、各模板前体分子浓度比例固定的树形模板分子印迹结构，可以使得检测结果一致性高，并且检测结果具有良好的再现性。
由于上述制备方法获得的树形分子印迹材料，具有检测结果一致性好、检测结果再现性良好等特性，因此其可以用于所有涉及到分子印迹检测的领域，如疾病体外诊断、环境检测、食品安全检测、危化物检测等。
本发明获得的树形分子印迹材料，可以作为固相萃取柱的填料，因此本发明还进一步提供一种包含上述树形分子印迹材料的固相萃取柱。
为更有效的说明本发明的技术方案，下面通过若干具体实施例说明。
实施例1
一种树形分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
(1).以5mM结构式如式I所示的孔雀石绿衍生物作为模板前体，以5.5mM均苯三乙酸作为中心骨架分子，溶解于二氯甲烷(作为溶剂)中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，搅拌30min后，加入6当量的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌，40℃反应过24h，分离纯化，获得第一产物。
Figure BDA0002350908580000101
(2).将3.3mM步骤(1)得到的第一产物与3mM的氯霉素(作为模板前体)溶于二氯甲烷中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，40℃反应过24h，分离纯化，获得第二产物。
(3).将1mM步骤(2)得到的第二产物与1.1mM结构式如式II所示的硝基呋喃衍生物溶于二氯甲烷中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，40℃反应过24h，分离纯化，获得树形模板分子，经检测，该树形模板分子具有如式(III)所示的结构：
Figure BDA0002350908580000102
Figure BDA0002350908580000103
(4).将300mg步骤(3)得到的树形模板分子与150μL的甲基丙烯酸(作为聚合物单体)混匀后投入20mL的甲苯(作为溶剂)中，超声处理至均匀，得到第一混合溶液。
(5).向步骤(4)得到的第一混合溶液中分别加入1.2mL的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、5mg的偶氮二异丁腈，在氮气氛围下，80℃回流反应，获得块状物；
(6).将步骤(5)得到的块状物进行球磨破碎处理，过400目的筛，随后用重量百分比浓度为10％的醋酸甲醇溶液进行反复洗脱处理，至洗脱液中检测不到树形模板分子，经干燥处理，得到多抗生素分子印迹材料，该多抗生素分子印迹材料呈粉末状。
为了验证实施例1获得的多抗生素分子印迹材料(即树形分子印迹材料)的性能，将实施例1获得的树形分子印迹材料作为固相萃取柱的填料，填装形成固相萃取柱，用于鱼肉的快速检测，具体过程如下：
将80mg多抗生素分子印迹材料，填装形成1mL的固相萃取柱；
在6g鱼肉中加标0.5ppb氯霉素、2ppb孔雀石绿、0.5ppb呋喃妥因分别为，加入10mL重量百分比浓度为1％的对甲苯磺酸乙腈溶液，涡旋3min，加入无水硫酸钠和碳酸氢钠粉末各3g，离心取上清液7mL以每秒1～2滴的速度流过固相萃取柱，再将1mL重量百分比浓度为1％的甲酸甲醇溶液以每秒(1～2)滴的速度流过固相萃取柱，收集溶液，得到待测液。
将待测液利用LC-MS(液质联用)测定其含量，得到树状分子印迹材料富集倍数，结果如表1所示。
表1(浓度单位：ppb)
Figure BDA0002350908580000111
Figure BDA0002350908580000121
备注：上述富集倍数比例指的是氯霉素浓度富集倍数：孔雀石绿浓度富集倍数：呋喃妥因浓度富集倍数。
实施例2
一种树形分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
(1).以5mM四环素作为模板前体，以5.5mM 3,3,3-氨三丙酸作为中心骨架分子，溶解于二氯甲烷(作为溶剂)中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，40℃反应过24h，分离纯化，获得第一产物。
(2).将3.3mM步骤(1)得到的第一产物与3mM的磺胺二甲嘧啶(作为模板前体)溶于二氯甲烷中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，40℃反应过24h，分离纯化，获得第二产物，该产物为树形模板分子，经检测，该树形模板分子具有式(IV)所示的结构：
Figure BDA0002350908580000122
(3).将1mM步骤(2)得到的树形模板分子与10g氨基丙基三乙氧基硅烷溶于二氯甲烷中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，加入20mL乙醇回流3h，随后加入正硅酸乙酯10mL，继续回流24h，过滤固体，以体积分数为50％的乙醇水清洗后80℃干燥过夜，获得块状物。
(4).用0.1M盐酸甲醇溶液在索氏提取器中进行反复洗脱处理，至洗脱液中检测到不到树形模板分子，经过干燥处理，得到磺胺二甲嘧啶及四环素分子印迹材料(树形分子印迹材料)，呈粉末状。
为了验证实施例2获得的磺胺二甲嘧啶及四环素分子印迹材料(即树形分子印迹材料)的性能，将实施例2获得的树形分子印迹材料作为固相萃取柱的填料，填装形成固相萃取柱，用于鸡肉的快速检测，具体过程如下：
将100mg磺胺二甲嘧啶及四环素分子印迹材料，填装形成1mL的固相萃取柱；
在6g鸡肉中加标10ppb磺胺二甲嘧啶、10ppb四环素，加入8mL重量百分比浓度为1％的乙腈溶液，涡旋3min，加入无水硫酸钠3g，离心取上清液5mL以每秒(1～2)滴的速度流过固相萃取柱，再将1mL重量百分比浓度为1％的甲酸甲醇溶液以每秒(1～2)滴的速度流过固相萃取柱，收集溶液，得到待测液。
将待测液利用LC-MS(液质联用)测定其含量，得到树状分子印迹材料富集倍数，结果如表2所示。
表2(浓度单位：ppb)
Figure BDA0002350908580000131
由表2可知，不同的化合物的比例比较稳定，富集效果也比较均一，明显优于对比例的富集效果。
实施例3
一种树形分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
(1).以1mM结构式如式V所示的孔雀石绿衍生物作为模板前体，以1.1mM乙二胺作为中心骨架分子，溶解于二氯甲烷(作为溶剂)中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，搅拌30分钟后，加入1.1mM2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌，40℃反应过24h，分离纯化，获得第一产物。
Figure BDA0002350908580000141
(2).将0.5mM步骤(1)得到的第一产物与0.6mM上述式V所示的孔雀石绿衍生物溶于二氯甲烷中，加入摩尔浓度为1％的EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)为催化剂(且催化剂中按照质量比为EDC：NHS＝2:1)，40℃反应过24h，分离纯化，获得第二产物。该产物为树形模板分子，经检测，该树形模板分子具有式VI所示的结构：
Figure BDA0002350908580000142
(3).将1mM步骤(2)得到的树形模板分子与10g氨基丙基三乙氧基硅烷溶于20mL二氯甲烷/乙醇4：1混合溶液中，回流3h，随后加入正硅酸乙酯10mL，继续回流24h，过滤固体，以体积分数为50％的乙醇水清洗后80℃干燥过夜，获得块状物。
(4).用0.1M盐酸甲醇溶液在索氏提取器中进行反复洗脱处理，至洗脱液中检测不到树形模板分子，经过干燥处理，得到显性及隐性孔雀石绿树形分子印迹材料，呈粉末状。
为了验证实施例3获得的显性及隐性孔雀石绿树形分子印迹材料的性能，将实施例3获得的树形分子印迹材料作为固相萃取柱的填料，填装形成固相萃取柱，用于鱼肉的快速检测，具体过程如下：
将100mg显性及隐性孔雀石绿树形分子印迹材料，填装形成1mL的固相萃取柱；
在3g鱼肉中加标1ppb(显性)孔雀石绿和1ppb隐形孔雀石绿，加入5mL乙腈二氯甲烷1：1溶液，涡旋3min，加入无水硫酸钠3g，离心取上清液2mL以每秒1～2滴的速度流过固相萃取柱，再将1mL质量浓度为1％的甲酸甲醇溶液以每秒1-2滴的速度流过固相萃取柱，收集溶液，得到待测液。
将待测液利用LC-MS(液质联用)测定其含量，得到树状分子印迹材料富集倍数，结果如表3所示。
表3(浓度单位：ppb)
Figure BDA0002350908580000151
对比例
一种分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
(1).称取孔雀石绿、氯霉素、结构式如下所示的呋喃妥因类似物各1mM，溶于甲苯中，与分散在甲苯中的150μL的甲基丙烯酸搅拌30min，超声混匀，得到第一混合溶液；
Figure BDA0002350908580000161
(2).第一混合溶液中分别加入1.2mL的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、5mg的偶氮二异丁腈，在氮气氛围下，80℃回流反应，获得块状物；
(3).将所述块状物进行球磨破碎处理，过400目的筛，随后用10％的醋酸甲醇溶液进行反复洗脱处理，至检测到洗脱液中无树形模板分子，经过干燥处理，得到的粉末即为多抗生素分子印迹材料。
为验证对比例得到的分子印迹材料的性能，将该分子印迹材料作为固相萃取柱的填料，填装形成固相萃取柱，用于鸡肉的快速检测，具体过程如下：
将80mg的分子印迹材料填装组成1mL固相萃取柱；
在6g鱼肉中加标0.5ppb氯霉素、2ppb孔雀石绿、0.5ppb硝基妥因，加入10mL质量浓度为1％的对甲苯磺酸乙腈溶液，涡旋3min，加入无水硫酸钠和碳酸氢钠粉末各3g，离心取上清液7mL以每秒1-2滴的速度流过固相萃取柱，再将1mL质量浓度为1％的甲酸甲醇溶液以每秒1-2滴的速度流过固相萃取柱，收集溶液，得到待测液。
将待测液利用LC-MS测定其含量，得到分子印迹材料富集倍数，具体如表4所示。
表4(浓度单位：ppb)
次数 氯霉素浓度 富集倍数 孔雀石绿浓度 富集倍数 呋喃妥因浓度 富集倍数
1 2.1 4.20 11.7 5.85 0.79 1.58
2 1.79 3.58 4.13 2.065 0.49 0.98
3 1.1 2.20 8.17 4.085 1.17 2.34
均值 / 3.33 / 4 / 1.45
CV / 1.02 / 1.89 / 0.78
由表4可知，虽然3个分子都同一个加标浓度，但其3次差异比较大。同样的投料量下，每次中不同的分子富集浓度有较大差异，说明其空穴浓度有差异，导致的材料重复性有问题。从表1～3的数据可知，采用本发明树形分子印迹材料，每次不同分子的空穴浓度差异小，不同分子的空穴比例一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种树形分子印迹材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S01.将中心骨架分子、有机溶剂进行混料处理并加入若干种模板前体使若干所述模板前体依次与所述中心骨架分子发生缩合或者取代反应，在加入若干所述模板前体进行反应过程中，控制前一种模板前体与所述中心骨架分子反应结束后再加入后一种模板前体的顺序，按照此反应次序获得树形模板分子，所述树形模板分子中具有若干不同的模板；
步骤S02.将所述树形模板分子与聚合物单体、引发剂、交联剂、溶剂进行混合，使得所述聚合物单体发生聚合反应生成聚合物，并对获得的所述聚合物进行树形模板分子的洗脱处理，获得树形分子印迹材料；
其中，所述中心骨架分子具有至少2个反应基团，每个所述反应基团具有与若干所述模板前体发生缩合或取代反应的活性。
2.如权利要求1所述的树形分子印迹材料的制备方法，其特征在于，所述反应基团选自羧基、氨基、羟基、叠氮、偶氮、酰卤、酰胺、酰肼、醛基、碳碳双键、碳碳三键、巯基中的任一种。
3.如权利要求1所述的树形分子印迹材料的制备方法，其特征在于，加入的每种所述模板前体均含有能与所述中心骨架分子的反应基团发生缩合或者取代的官能团。
4.如权利要求3所述的树形分子印迹材料的制备方法，其特征在于，所述官能团为羧基、氨基、羟基、叠氮、偶氮、酰卤、酰胺、酰肼、醛基、碳碳双键、碳碳三键、巯基中的至少一种。
5.如权利要求1所述的树形分子印迹材料的制备方法，其特征在于，所述中心骨架分子为均苯三乙酸、3,3,3-氨三丙酸、丁烷四羧酸、柠檬酸、衣康酸、聚马来酸、乙二胺、苯二胺、2-(氨基甲基)-N1,N1-二甲基丙烷-1,3-二胺、2,2-双(氨基甲基)丙烷-1,3-二胺、1,4,7,10-四氮杂环十二烷、三聚氰胺中的任一种。
6.如权利要求1所述的树形分子印迹材料的制备方法，其特征在于，若干所述模板前体均选自孔雀石绿、孔雀石绿衍生物、氯霉素、氯霉素衍生物、硝基呋喃类、硝基呋喃类衍生物、四环素、四环素衍生物、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶衍生物中的任一种。
7.一种树形分子印迹材料，其特征在于，所述树形分子印迹材料采用如权利要求1～6任一项所述的树形分子印迹材料的制备方法制备得到。
8.如权利要求7所述的树形分子印迹材料在环境监测、食品安全检测、危化物检测领域中的应用。
9.一种固相萃取柱，其特征在于，所述固相萃取柱包含权利要求7所述的树形分子印迹材料。
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