CN105032376B - 混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，采用三种模板物质依次经过溶解、预聚合、聚合，洗脱模板物质、干燥，装柱等步骤制备而成，本发明的制备过程简单，易于控制，所制的混合三模板分子印迹聚合物稳定性好、强度高，均匀度好，耐酸碱，对三唑类、菊酯类和三嗪类物质的特异吸附效率高，不需要研磨，可直接装填成柱。本发明还提供了上述萃取柱在吸附三唑类、菊酯类及三嗪类物质方面的应用。本发明适用于制备混合三模板分子印迹固相萃取柱，所制产品可进一步用于食品、饲料及其它样品中三唑类、菊酯类及三嗪类农药多残留分析时样品的净化和富集。

Description

混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于化学合成、分析化学、超分子化学及食品安全领域，涉及一种分子印迹聚合物的制备及其应用，具体地说是一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法及其应用。

背景技术

戊唑醇、联苯三唑醇和烯唑醇等均属三唑类杀菌剂，其为广谱内吸杀菌剂，主要用于防治植物病害，对病原微生物有杀死作用或抑制生长作用，因其高效、广谱、低毒以及长效性而广泛地应用于农作物等病虫害的防治，同时该类农药在农作物、土壤和水体中的残留也给生物安全和人体健康带来了负面影响。

胺菊酯、三氟氯氰菊酯和四氟甲醚菊酯等都属于拟除虫菊酯类杀虫剂，是高效、广谱、速效杀虫剂、杀螨剂，以触杀和胃毒作用为主，无内吸作用。它们能有效地防治棉花、果树、蔬菜、大豆等作物上的多种害虫，也能防治动物体上的寄生虫。

西玛津、莠去津和莠灭净等都属于三嗪类除草剂，三嗪类除草剂作为预防农田杂草生长的高效除草剂在世界范围内广泛使用，由于其用量较大、性质较稳定、残留时间较长，而且具有较高水溶性，因此在使用过程中可能对土壤、农作物、地表水和其它饮用水源造成污染，从而对人类健康和环境造成严重的危害。研究表明：该类化合物及其降解产物在水体中的残留会损害免疫系统而危害人体、动植物和水生生物的健康。另外，这类化合物可能引起人类癌症及先天性缺陷，同时能够干扰荷尔蒙的正常功能，世界多国已将其列入内分泌干扰剂化合物名单。

在我国，三唑类杀菌剂、菊酯类除虫剂和三嗪类除草剂这三类农药的产量和使用量都很大，对生态环境和食品安全造成极大的危害。为确保我国的生态环境及食品安全，建立针对此三类农药的快速、高效、准确的检测方法是环境及食品安全分析工作者的迫切任务。而由于这些物质在自然环境中的残留浓度很低，并且存在多种干扰物质，常规的监测分析方法不能对其进行有效的测定。另外，复杂基体所带来的基质效应也对此三类农药的分析提出了挑战影响，如何在样品前处理过程中尽量减少基质效应对分析效果的影响是研究者面临的重大挑战。因此，探索一种识别性强、干扰小的富集方法具有十分重要的意义。而分子印迹固相萃取技术恰好克服了传统固相萃取的缺点，而且还具有对目标物特异性选择的特点，很好地分离富集复杂样品中的痕量分析物，从而降低检测限，提高分析的精密度和准确性，为痕量组分的富集和分析提供极大的方便。

分子印迹技术(Molecular imprinted technology， MIT) 就是制备分子印迹聚合物的技术，也叫模板技术，是在模拟生物体内抗原与抗体之间相互作用的基础上发展起来的一种新型技术。通过模板分子、功能单体和交联剂的相互作用从而合成的具有三维空间结构的“受体”，其对模板分子有特异“记忆”功能，体现了高度的选择性、特殊的亲和性及卓越的分子识别能力。分子印迹聚合物(Molecular imprinted Polymers， MIPs)的制备是将模板分子与功能单体、交联剂和引发剂等在特定的分散体系中进行共聚合，制得高交联刚性聚合物。然后通过物理或化学的方法除去MIPs中的模板分子，得到具有确定空间构型的空穴和功能基团在空穴内精确排布的聚合物。因此，MIPs具有从复杂样品中选择性提取目标分子或与其结构相近的某一类化合物的能力，适合作为固相萃取填料、固相微萃取涂层以及分子印迹薄膜来分离富集复杂样品中的痕量分析物，克服样品体系复杂、预处理繁琐等不利因素，达到样品分离纯化的目的。

大多数MIPs的制备都采用单一模板分子，这样合成的聚合物不能同时对多种分析物具有较高的亲和力。而在实际检测中往往不是单一一种分析物，所以采用单一模板合成的 MIPs 对其它同族的化合物的吸附不能显示高的吸附量和高的选择性。近年来有些学者提出了双模板及多模板分子印迹的概念，使得新材料设计有了更加灵活的选择方式。与单一类型印迹分子相比，两种及多种不同印迹分子的组合能够为被分析物的重新结合和释放创造更合适的印迹空穴。混合模板制备的 MIPs 可缩短检测时间降低检测成本，通过一次聚合可同时测定多类多种农药，因此有望得到更好的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，采用三种物质作为模板，依次经过溶解、预聚合、聚合、模板洗脱、干燥、装柱等步骤聚合而成，本发明的制备过程简单，易于控制，所制混合三模板分子印迹聚合物稳定性好、强度高，耐酸碱，不需要研磨，可直接装填成柱，对三唑类、菊酯类和三嗪类物质的吸附效率高。

本发明的另外一个目的，是提供上述方法所制混合三模板分子印迹固相萃取柱的在吸附三唑类物质、菊酯类物质和三嗪类物质上的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，按照如下步骤顺序进行：

⑴溶解

取一种三唑类化合物、一种菊酯类化合物和一种三嗪类化合物，作为三模板物质，溶于致孔剂中，加入功能单体，得A；其中：

所述三唑类化合物、菊酯类化合物、三嗪类化合物的摩尔比为1：1-3：1；

所述功能单体，与所述三唑类化合物、菊酯类化合物和三嗪类化合物的总量间的摩尔比为2-10：1；

所述三模板物质与致孔剂的重量体积比为1：100-250 mmol/mL;

⑵预聚合

将A于频率200Hz下超声30-60min，在4℃环境中放置6-12h，得B；

⑶聚合

向B中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，于频率200Hz下超声30-60min，通入高纯氮气至充满容器后，将容器密封后得C；

将C置于55-80℃下，水浴反应10-24h，得D；

⑷模板洗脱

将D用甲醇-乙酸混合溶液脱除三模板物质，然后用甲醇浸泡除去过量乙酸，得E；

⑸干燥

将E于30-45℃下烘干，得F；

⑹装柱

将F浸入水中填充到具砂芯层析柱中，抽干水，得目标产品，即混合三模板分子印迹固相萃取柱。

作为本发明的限定：

所述三唑类化合物为联苯三唑醇；

所述菊酯类化合物为三氟氯氰菊酯；

所述三嗪类化合物为莠去津；

所述功能单体为α-甲基丙烯酸；

所述致孔剂为乙腈；

所述交联剂的摩尔量，与所述三唑类化合物、菊酯类化合物和三嗪类化合物的总量间的摩尔比为15-40：1；

所述引发剂的摩尔量，与所述三唑类化合物、菊酯类化合物和三嗪类化合物的总量间的摩尔比0.4-1.2：1；

所述萃取柱的高度为2cm；

所述甲醇-乙酸混合溶液，由体积比为9:1的甲醇与乙酸配得。

本发明还提供了上述方法制备的混合三模板分子印迹固相萃取柱的应用，它应用于吸附三唑类物质、菊酯类物质和三嗪类物质。

作为本发明的混合三模板分子印迹固相萃取柱的应用的一种限定，所述的混合三模板分子印迹固相萃取柱在用于吸附三唑类物质、菊酯类物质和三嗪类物质前，先用水润湿，再用甲醇活化。

作为本发明的混合三模板分子印迹固相萃取柱的应用的进一步限定，它用于食品、饲料和其它样品中三唑类、菊酯类农药和三嗪类农药残留分析时，样品的净化和残留农药的富集。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

本发明提供的混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，包括溶解、预聚合、聚合、模板洗脱、干燥、装柱等步骤，制成的萃取柱对三唑类、菊酯类和三嗪类物质有特异性识别作用，该萃取柱具有以下优点：

①混合三模板分子印迹聚合物稳定性好、强度高，耐酸碱，聚合物上具有多个特异性的空间位点，可实现特异性吸附；

②混合三模板分子印迹聚合物为球形聚合物，形状规整，粒径小且均匀，比表面积大，可直接填装成柱，不需要研磨、过筛等繁琐的过程；

③混合三模板分子印迹固相萃取柱可实现同时对三唑类、菊酯类和三嗪类物质吸附，吸附效率高，且吸附量较大。

本发明适用于制备混合三模板分子印迹固相萃取柱，所制产品可进一步应用于食品、饲料及其它样品中三唑类、菊酯类和三嗪类农药残留分析时样品的净化和富集。

附图说明

图1为联苯三唑醇化学结构式；

图2为三氟氯氰菊酯化学结构式；

图3为莠去津化学结构式；

图4为实施例1中混合三模板分子印迹聚合物印迹原理示意图；

图5为不同功能单体体系的紫外吸收光谱图（a：混合三模板物质-MAA体系,b：混合三模板物质-AM体系。其中T为混合三模板物质吸光值；E1为混合物体系实际测定吸光值；E2为混合物体系理论吸光值）；

图6为不同比例混合三模板物质与功能单体对体系紫外光谱的影响（a：混合三模板物质-MAA体系,b：混合三模板物质-AM体系，c：混合物最大吸收波长和对应吸光值变化曲线。其中T为混合三模板物质；1-6分别是混合三模板物质与MAA浓度比为1:0-1:10；1’-6’分别是混合三模板物质与AM浓度比为1:0-1:10）

图7不同致孔剂对体系紫外光谱的影响（a：混合三模板物质-MAA-乙腈体系,b：混合三模板物质-MAA-甲醇体系，c：混合三模板物质-MAA-甲苯体系。其中T为混合三模板物质）

图8为三种模板物质的混合物的红外吸收光谱图；

图9为无模板分子非印迹聚合物的红外吸收光谱图；

图10为实施例1中混合三种模板分子印迹聚合物的红外吸收光谱图；

图11为实施例1中印迹聚合物在不同放大倍数下的扫描电子显微镜（SEM）图；

图12为实施例1制备的混合三模板分子印迹固相萃取柱的选择吸附性能图；

图13为大米样品提取液的高效液相色谱图；

图14为大米样品提取液过柱后洗脱液的高效液相色谱图；

图15为大米样品加标提取液通过实施例1中所制柱后洗脱液的高效液相色谱图。

其中，图12和图15：1-西玛津，2-莠灭净，3-莠去津，4-戊唑醇，5-联苯三唑醇，6-烯唑醇，7-胺菊酯，8-三氟氯氰菊酯，9-四氟甲醚菊酯；

本发明下面将结合说明书附图和具体实施例作进一步详细说明。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。

实施例1 一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法

本实施例中混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备，按照如下的步骤顺序进行：

⑾溶解

分别将1mol的联苯三唑醇、1mol的三氟氯氰菊酯和1mol莠去津组成的混合三模板物质溶于550L致孔剂乙腈中，再加入18mol的功能单体α-甲基丙烯酸，得A1；

⑿预聚合

将A1置于频率200Hz下超声60min，放在4℃冰箱中6h，得B1；

⒀聚合

向B1中加入45mol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和2mol引发剂偶氮二异丁腈，在频率200Hz下超声30min后，通入高纯氮气10min，将容器密封，得C1；

将C1置于60℃下，水浴反应24h，得D1；

⒁模板洗脱

将D1用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液脱除模板物质，然后用甲醇浸泡除去过量乙酸，得E1；

⒂干燥

将E1于40℃下烘干，得F1；

⒃装柱

将F1浸入水中填充到具砂芯层析柱中，抽干水，装柱高度为2cm，即得混合三模板分子印迹固相萃取柱。

本实施例制备方法简单，过程易于控制，成本低，固相萃取柱稳定性好、强度高，耐酸碱，柱中印迹聚合物具有特异性的空间位点，可实现特异性吸附。

实施例2-6 混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法

实施例2-6分别为一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，制备过程与实施例1相似，不同之处仅在于：制备过程中相应的技术参数有所不同，具体的结果见表1。

表1 混合三模板分子印迹固相萃取柱制备过程中的技术参数

实施例2-6制备方法简单，过程易于控制，成本低，印迹聚合物无需研磨可直接装柱，柱稳定性好、强度高、耐酸碱，柱中印迹聚合物具有特异性的空间位点，可实现特异性吸附。

实施例7 功能单体的选择及模板分子与功能单体比例筛选试验

本实施例对聚合过程中，功能单体的选择及模板物质与功能单体的比例进行了探究。本实施例采用了紫外光谱分别对混合三模板物质-MAA体系及混合三模板物质-AM体系进行了紫外光谱扫描。

分别配制一定浓度的MAA-乙腈溶液（MAA为α-甲基丙烯酸）和AM-乙腈溶液（AM为丙烯酰胺）以及混合三模板物质-乙腈溶液，同时配制功能单体与模板物质的混合乙腈溶液，使其摩尔浓度比分别为1:0、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10，在波长190-300nm之间进行紫外光谱扫描。

（1）如果模板物质与功能单体不发生作用，则同一波长下紫外吸光值应该是两种物质吸光值的加和，即混合物的理论吸光值；模板物质与功能单体混合体系的实际吸光值为该混合体系在该波长下实测的紫外吸光值，并且实际吸光值与理论吸光值的差值越大，表明二者的相互作用（键合的趋势）越大。

图5为不同功能单体体系的紫外吸收光谱图,由图5a可以看出，MAA功能单体与混合三模板物质的理论吸光值与实际吸光值的差值为0.65。由图5b可以看出，AM功能单体与混合三模板物质的理论吸光值与实际吸光值的差值为0.40。从差值上可以看出混合三模板分子与MAA结合力更大，证明了利用MAA合成的分子印迹聚合物对三模板物质具有更好的稳定性和特异识别能力。

（2）合成分子印迹聚合物时，模板物质与功能单体的比例不同其对模板分子的特异性吸附能力的表现也不同，过少的功能单体形成的识别位点少，而过多的功能单体会导致非特异性识别位点增加从而降低吸附性能。

由图6a和6b可知，吸收峰的最大吸收波长发生了红移，这说明混合三模板物质与功能单体之间形成了相互作用。从图6c可以看出，混合三模板物质与MAA相互作用最大吸收波长处吸光值变化最快，说明MAA的加入对混合物体系影响更大。

实施例8 致孔剂种类选择试验

本实施例分别对混合三模板物质-MAA-乙腈体系、混合三模板物质-MAA-甲醇体系及混合三模板物质-MAA-甲苯体系进行了紫外光谱扫描。

从图7a可知在乙腈中，随着MAA加入量增加，溶液吸收强度增大，且溶液最大吸收波长发生红移，从205nm红移到210nm，红移量为5nm，结果表明混合三模板分子与MAA之间产生了较强的分子间作用力。

在甲醇中随着MAA加入量增加，溶液从206nm红移到208nm，仅红移2 nm，小于在乙腈溶液中的红移量，同时从图7b可知，随着MAA加入量增加,溶液的吸收峰也增强，结果表明混合三模板物质与MAA之间也产生了分子间作用力，但弱于在乙腈溶液中的作用力。

由图7c可知，在甲苯中，随着混合三模板物质与MAA浓度比降低，溶液最大吸收波长未发生红移，而且随着MAA加入量增加，溶液的吸收强度略有增加。这说明当甲苯作为致孔剂时，混合三模板物质与MAA之间未产生明显的分子间作用力。综上所述，本试验选择乙腈为致孔剂。

实施例9 致孔剂用量选择试验

致孔剂的用量对聚合物的形成起到关键作用，若溶剂量过低导致聚合物交联紧密成为块状，即传统的本体聚合方式；溶剂量过高则导致聚合物交联度低不能形成微球沉淀。在其它合成条件不变的情况下（即制备过程与实施例1相似，不同之处仅在与致孔剂的用量不同），通过改变溶剂用量研究了其对分子印迹聚合物粒径及机械强度的影响。

本实施例对致孔剂的用量进行了探究，三模板物质的总摩尔量为3mol,实验选取致孔剂的用量为200-850L。结果表明，随着致孔剂用量的增加，聚合物微球的粒径逐渐减小，机械强度也在逐渐降低。具体地：

当乙腈用量在300L以下时，体系生成块状聚合物（不属于沉淀聚合产物），虽然机械强度高，但聚合物需研磨才能使用，破坏了部分价键，进而降低了聚合物的识别性能。

当乙腈用量为300-750L时，微球粒径均匀，比表面积大，机械强度较强，吸附性能良好。当乙腈的用量大于750L，聚合物微球粒径虽然很小，但机械强度很低，将其装柱后容易塌陷，影响正常使用。

当乙腈的用量过大时，生成聚合物为蛋清膏状，不能形成微球沉淀。

实施例10 聚合温度选择试验

本实施例对聚合过程中的温度进行了实验探究，印迹聚合物的制备过程与实施例1相似，不同之处仅在于聚合的温度不同。

本实施例对30-100℃范围内的聚合温度进行了探究，结果表明，随着反应温度的升高，引发与聚合速率均加快，但是温度过高容易引发爆聚，实验结果表明：

聚合温度大于80℃时，体系容易发生爆聚；

温度在70℃时，体系在10h左右即生成大量分子印迹聚合物；

60℃时，体系在15h左右出现大量分子印迹聚合物；

55℃时，反应20h以后，才生成较多的分子印迹聚合物；

在50℃下聚合，反应24h之后，反应液变为澄清的亮黄色，无聚合物出现。

温度越低，生成聚合物的识别性能越好；但是温度过低，无法达到引发剂AIBN的热分解温度，聚合反应将不能发生。

实施例11 混合三模板分子印迹聚合物的表征

为了更好地说明实施例1中制备的混合三模板分子印迹聚合物的结构特征，本实施例分别对三种模板物质的混合物、非印迹聚合物和洗脱模板分子的印迹聚合物进行红外光谱扫描，并对实施例1中⒂步骤得到的分子印迹聚合物进行了扫描电子显微镜（SEM）测试。

⑴红外光谱表征

分别对三种模板物质的混合物、非印迹聚合物和洗脱模板分子的印迹聚合物进行红外光谱扫描，结果分别如图8、图9和图10所示。

图8中可以明显看到联苯三唑醇、三氟氯氰菊酯和莠去津的特征峰。对比图8、图9和图10可以看到聚合物的特征峰明显与三种模板物质混合物的特征峰不同。如图9所示：

3586.7cm^-1处出现的宽峰为羟基伸缩振动峰，表明MAA与交联剂EDMA成功聚合。

2987.9cm^-1和2955.3cm^-1分别是甲基和亚甲基中C-H的不对称伸缩振动吸收峰。

聚合物中的C=O伸缩振动在1732.9cm^-1处表现出来。

甲基和亚甲基中C-H弯曲振动吸收峰出现在1456.3cm^-1和1391.0cm^-1处。

1257.6cm^-1和1158.4cm^-1分别是C-O-C的对称和不对称伸缩振动峰，也证明EDMA成功聚合。

此外，对比图9和图10可以看出，非印迹聚合物（无模板分子）和洗脱模板的分子印迹聚合物的红外光谱相似，说明它们具有相同的官能团组成。

⑵SEM表征

通过扫描电镜对实施例1中⒂步骤得到的印迹聚合物进行了表征，结果如图11所示。

从图中可以看出，沉淀聚合法制备的分子印迹聚合物为球形聚合物，大部分球形聚合物的形状规整，颗粒的平均粒径小而均匀，大约为150nm，相比于本体聚合法制备的聚合物，无需研磨，不会破坏印迹聚合物上的印迹空穴，而且由于是微球形聚合物，所以比表面积比不规则的本体聚合物要大，吸附性相对来说也高很多。

实施例12 混合三模板分子印迹聚合物的吸附性能研究

本实施例对实施例1制备的混合三模板分子印迹聚合物进行了选择性吸附的研究。

⑴印迹聚合物对模板分子选择性吸附的研究

在其它合成条件不变的情况下（即制备步骤与实施例1相似，不同之处仅在于模板分子不同），分别制备联苯三唑醇单模板分子印迹聚合物，三氟氯氰菊酯单模板分子印迹聚合物，莠去津单模板分子印迹聚合物，联苯三唑醇-三氟氯氰菊酯双模板分子印迹聚合物，联苯三唑醇-莠去津双模板分子印迹聚合物，三氟氯氰菊酯-莠去津双模板分子印迹聚合物及无任何模板分子的非印迹聚合物。

将无模板分子的非印迹聚合物作为第一组，实施例1制备的混合三模板分子印迹聚合物作为第二组，联苯三唑醇单模板分子印迹聚合物作为第三组，三氟氯氰菊酯单模板分子印迹聚合物作为第四组，莠去津单模板分子印迹聚合物作为第五组，联苯三唑醇单模板分子印迹聚合物、三氟氯氰菊酯单模板分子印迹聚合物及莠去津单模板分子印迹聚合物这三种单模板聚合物的混合物（三种印迹聚合物之间的摩尔比为1:1:1）作为第六组，将联苯三唑醇-三氟氯氰菊酯双模板分子印迹聚合物、联苯三唑醇-莠去津双模板分子印迹聚合物及三氟氯氰菊酯-莠去津双模板分子印迹聚合物这三种双模板分子印迹聚合物的混合物（三种印迹聚合物之间的摩尔比为1:1:1）作为第七组。分别将等量的一至七组聚合物作为吸附剂，测定它们对本发明的三种模板物质的选择性吸附情况。在过饱和的分析物浓度下，分子印迹聚合物及非印迹聚合物的吸附量及印迹因子见表2。

表2 分子印迹聚合物及非印迹聚合物对模板分子的吸附量及印迹因子

上表中Q为聚合物吸附模板分子的量，IF表示为印迹因子IF=Q_{印迹聚合物}/Q_{非印迹聚合物}。

由表2可知，第二组中三模板分子印迹聚合物的吸附因子都显著大于其它组聚合物微球混合物的吸附因子，说明三模板分子同时印迹到聚合物微球上，并且对联苯三唑醇、三氟氯氰菊酯和莠去津都具有很好的选择吸附性能，且其选择吸附性能优于单模板分子印迹聚合物的混合物及双模板分子印迹聚合物的混合物。亦即说明混合三模板印迹聚合物已同时将三模板物质良好地印迹在聚合物上。

⑵混合三模板印迹聚合物对模板分子及其结构类似物选择性吸附能力的测定

为了进一步研究实施例1制备的印迹聚合物对三唑类、菊酯类和三嗪类物质的选择吸附性能，将实施例1制备的印迹聚合物及无模板分子的非印迹聚合物通过含有三唑类、菊酯类和三嗪类农药的一定浓度溶液中，研究其对模板物质及模板物质结构类似物的选择性吸附能力。

具体的结果见图12。

由图12可知，分子印迹聚合物对九种农药均有吸附，吸附效果依次为西玛津>莠去津>莠灭净>联苯三唑醇>戊唑醇>烯唑醇>胺菊酯>三氟氯氰菊酯>四氟甲醚菊酯，说明多种物质存在时分子印迹聚合物对其吸附性能存在差异，主要原因是九种农药的结构与分子量的大小不同。分子量最小的西玛津吸附量最大，而四氟甲醚菊酯的分子量虽比模板分子三氟氯氰菊酯小，但因结构有差异，竞争性吸附过程四氟甲醚菊酯的吸附量却小于三氟氯氰菊酯。

实施例13 混合三模板分子印迹固相萃取柱在大米样品检测中的应用

⑴样品处理

①样品的提取

准确称取5g大米样品（来自超市），捣碎、研磨，用20mL乙腈溶液分两次提取，超声15min，于4000r/min离心10min，合并两次上清液，浓缩后，用乙腈定容至5mL。

②样品的净化

分子印迹固相萃取柱使用前先用10mL水过柱，然后用10mL甲醇活化。加入样品提取液1mL过柱，再用20mL水淋洗，最后用10mL甲醇洗脱，洗脱液用甲醇定容至10mL，过0.45μm的微孔滤膜过滤，待高效液相色谱仪检测。

色谱柱Symmetry ® C₁₈柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：甲醇-水，梯度洗脱程序见表3；进样量：20μL；柱温：30℃；检测波长范围：200-300nm。表3为梯度洗脱程序。

表3 梯度洗脱程序

其中，大米样品提取液的高效液相色谱图如图13所示，大米样品提取液过柱后洗脱液的高效液相色谱图如图14所示，通过图13和图14对比可知，分子印迹固相萃取柱对大米样品净化效果好，对杂质不具有吸附能力。

⑵线性关系与检测限

将西玛津、莠灭净、莠去津、戊唑醇、联苯三唑醇、烯唑醇、胺菊酯、三氟氯氰菊酯和四氟甲醚菊酯分别配制成浓度为0.0005-100μg/mL的一系列不同浓度的标准溶液，绘制标准曲线。其线性关系和检测限如表4所示。

表4 线性关系与检测限

由表4可知，西玛津的线性范围为0.001-50μg/mL，莠灭净和莠去津的线性范围为0.01-100μg/mL，戊唑醇、联苯三唑醇、烯唑醇和三氟氯氰菊酯的线性范围为0.03-100μg/mL，胺菊酯和四氟甲醚菊酯的线性范围为0.05-100μg/mL；九种目标物的线性相关系数≥0.9996；检测限在0.5-20ng/mL。

⑶大米、青菜、苹果、鸡饲料中九种被测物的加标回收率实验

分别在大米、青菜、苹果、鸡饲料样品中同时加入含有西玛津、莠灭净、莠去津、戊唑醇、联苯三唑醇、烯唑醇、胺菊酯、三氟氯氰菊酯和四氟甲醚菊酯的标准品，进行样品提取，加标提取液过柱后洗脱，其中青菜、苹果、鸡饲料样品提取液的制备与本实施例⑴中①的制备步骤相同，不同之处仅在于大米样品换为青菜、苹果样品，样品研磨后须加入无水硫酸钠，样品净化过程与本实施例⑴中②相同。

大米、青菜、苹果、鸡饲料样品在0.1µg/mL和10µg/mL 2个添加水平下，进行加标回收率试验，分析结果如表5所示，九种农药平均回收率在82.4%-99.4%之间，相对标准偏差（RSDs）在1.56%-3.55%之间（n=5），由此说明本发明制备混合三模板分子印迹固相萃取柱对三唑类、菊酯类和三嗪类物质的回收率高，精密度好。

表5 样品回收率及精密度试验

实施例14-17 混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法

实施例14-17分别为一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，制备步骤以及相应的技术参数与实施例1相似，不同之处仅在于实施例14中的三唑类模板分子为戊唑醇，菊酯类模板分子为四氟甲醚菊酯，三嗪类模板分子为莠灭净；实施例15中的三唑类模板分子为烯唑醇，菊酯类模板分子为三氟氯氰菊酯，三嗪类模板分子为西玛津；实施例16中的三唑类模板分子为联苯三唑醇，菊酯类模板分子为胺菊酯，三嗪类模板分子为莠灭净；实施例17中的三唑类模板分子为烯唑醇，菊酯类模板分子为四氟甲醚菊酯，三嗪类模板分子为莠去津。

实施例14-17中所制备的混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法简单，过程易于控制，成本低，聚合物耐酸碱，且无需研磨可直接填装成柱，柱上具有特异性的空间位点，可实现特异性吸附。

实施例18 实施例2-6、14-17所制混合三模板分子印迹固相萃取柱的表征、吸附性能研究及在大米样品检测中的应用

本实施例分别依据实施例7-13中所述的方法、步骤对实施例2-6、14-17所制混合三模板分子印迹固相萃取柱进行了表征、吸附性能研究及在大米样品检测中应用，实结果证明：实施例2-6、14-17所制萃取柱具有特异性的空间位点，可实现特异性吸附，所制的三模板分子印迹聚合物为球形聚合物，大部分球形聚合物的形状规整，颗粒的平均粒径小而均匀，对模板物质及模板物质结构类似物具有选择性吸附能力，分子印迹固相萃取柱对大米样品净化效果好，对杂质不具有吸附能力。

实施例1-6和实施例14-17，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于它按照如下步骤顺序进行：

⑴溶解

取一种三唑类化合物、一种菊酯类化合物和一种三嗪类化合物，作为三模板物质，溶于致孔剂中，加入功能单体，得A；其中：

所述三唑类化合物、菊酯类化合物、三嗪类化合物的摩尔比为1：2：1；

所述功能单体，与所述三模板物质总量间的摩尔比为6-10：1；

所述三模板物质与致孔剂的重量体积比为1：100-250 mmol/mL;

⑵预聚合

将A于频率200Hz下超声30-60min后，在4℃环境中放置6-12h，得B；

⑶聚合

向B中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，于频率200Hz下超声30-60min，再通入高纯氮气至充满容器后，将容器密封，得C；

将C置于70℃下，水浴反应10-24h，得D；

⑷模板洗脱

将D用甲醇-乙酸混合溶液脱除三模板物质，然后用甲醇浸泡除去过量乙酸，得E；

⑸干燥

将E于30-45℃下烘干，得F；

⑹装柱

将F浸入水中填充到具砂芯层析柱中，抽干水，得目标产品，即混合三模板分子印迹固相萃取柱；

所述交联剂的摩尔量，与所述三唑类化合物、菊酯类化合物和三嗪类化合物的总量间的摩尔比为15-40：1；

所述引发剂的摩尔量，与所述三唑类化合物、菊酯类化合物和三嗪类化合物的总量间的摩尔比0.4-1.2：1。

2.根据权利要求1所述的混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于：

所述三唑类化合物为联苯三唑醇；

所述菊酯类化合物为三氟氯氰菊酯；

所述三嗪类化合物为莠去津；

所述功能单体为α-甲基丙烯酸；

所述致孔剂为乙腈。

3.根据权利要求1中所述的混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于：所述萃取柱的高度为2cm。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的混合三模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于：所述甲醇-乙酸混合溶液，由体积比为9:1的甲醇与乙酸配得。

5.一种根据权利要求1-4中任意一项所述方法制备的混合三模板分子印迹固相萃取柱的应用，其特征在于：它应用于吸附三唑类物质、菊酯类物质和三嗪类物质。

6.根据权利要求5所述的混合三模板分子印迹固相萃取柱的应用，其特征在于：所述的混合三模板分子印迹固相萃取柱在用于吸附三唑类物质、菊酯类物质和三嗪类物质前，先用水润湿，再用甲醇活化。

7.根据权利要求5或6所述的混合三模板分子印迹固相萃取柱的应用，其特征在于：它用于对食品、饲料或其它样品中三唑类、菊酯类农药和三嗪类农药残留分析时，通过吸附作用实现样品的净化和残留农药的富集。