CN103396512B - 混合模板分子印迹聚合物及其固相萃取柱的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化学合成、分析化学及超分子化学领域，具体是混合模板分子印迹聚合物及其固相萃取柱的制备方法和应用。传统的食品及饲料样品前处理技术主要有液液萃取、索氏提取，存在处理时间长、操作繁琐、回收率不稳定、重复性差、选择性差、有机溶剂用量大，污染环境、易乳化、不易实现自动化等缺点。本发明的制备方法主要有以下几个步骤制备：选择合适的模板物质与功能单体之间的配比；合成混合模板分子印迹聚合物；制备混合模板分子印迹固相萃取柱。本发明主要应用于联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇残留分析时样品的净化和富集。

Description

混合模板分子印迹聚合物及其固相萃取柱的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化学合成、分析化学及超分子化学领域，具体是混合模板分子印迹聚合物及其固相萃取柱的制备方法和应用，主要用于在食品及饲料中三唑类杀菌剂残留分析时样品的净化和富集。
背景技术
联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇都属三唑类杀菌剂，其为广谱内吸杀菌剂，主要用来防治由黑星菌属(Venturia)和核盘菌属(Sclerotinia)引起的果树病害，以及球腔菌属(Mycosphaerella)引起的香蕉病害和花生叶斑病；
按中国农药毒性分级标准，三唑类杀菌剂属于低毒杀菌剂，大鼠急性经口LD50﹥4000mg/kg，雄小鼠急性经口LD50约为2000mg/kg。超标使用必然会导致食品及饲料的安全出现隐患，相关检测部门应给与高度的重视。
化学杀菌剂对于人体和动物体内分泌有不良的干扰作用。这些物质主要导致：
⑴损害神经系统；
⑵机体的生殖机能下降或异常现象；
⑶降低生物体的免疫能力并诱发肿瘤。
食品及饲料样品组成比较复杂，被分析物处于痕量状态，易受到干扰，样品前处理成为食品安全分析的关键步骤。传统的样品前处理技术主要有液液萃取、索氏提取，存在处理时间长、操作繁琐、回收率不稳定、重复性差、选择性差、有机溶剂用量大，污染环境、易乳化、不易实现自动化等缺点。而分子印迹固相萃取技术恰好克服了以上传统方式的缺点，而且还具有对目标物特异性选择的特点。
传统固相萃取的缺点是：⑴被分析物的实际回收率低；⑵固相萃取物与吸附剂之间的作用力是非特异性的，萃取和洗脱条件比较苛刻；⑶选择性差，处理杂质不完全，易造成色谱柱污染；⑷不可反复使用。
近年来兴起的分子印迹技术是指制备在空间构型和结合位点上与某一目标化合物（模板分子或印迹分子）完全匹配的高分子聚合物的技术，它被形象的比喻为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”技术。
分子印迹固相萃取具有以下优点:(1)对目标物能进行特异性吸附；(2)能耐高温、高压、有机溶剂；(3)重复使用次数高；⑷稳定性好、使用寿命长等优点。MIPs作为SPE的吸附剂可以弥补普通吸附剂选择性差的不足而且要比免疫吸附剂的稳定性好，还可以重复使用，使痕量被分析物在复杂样品得到中分离富集。克服医药、生物及环境样品体系复杂、预处理繁琐等不利因素，达到分离纯化的目的,从而降低检测限,提高分析的精密度和准确性，为痕量组分的富集和分析提供极大的方便，因此已成为分子印迹技术在食品及饲料分析中最具应用前景的研究热点。
发明内容
本发明的目的是想提供一种混合模板分子印迹聚合物及其固相萃取柱的制备方法和应用，以克服现有技术的缺陷。
本发明采用本体聚合方法制备联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇（其化学结构式如图1-3）分子印迹聚合物，所制备的聚合物颗粒经研磨、漂洗、过筛、洗脱、干燥等一系列处理后，再经高效液相色谱法对其进行评价分析即可得到具有特异性吸附效果的聚合物材料。
本发明通过以下步骤实现：
a.先将三种模板分子联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇共同溶于致孔剂中，加入功能单体α-甲基丙烯酸，得到混合溶液；混合模板物质联苯三唑醇、腈菌唑及烯唑醇和功能单体的摩尔比为1:1.5:1.5:6，致孔剂添加量为15mL；聚合温度55℃，聚合时间为24h；
b.将步骤a）的混合溶液振动频率50kHz超声1h混匀；
c.在步骤b得到的溶液中加入交联剂和引发剂，交联剂加入量为混合模板物质总摩尔量的4倍；引发剂加入量为混合模板物质总摩尔量的0.06倍；然后振动频率50kHz超声30min，之后通入高纯氮气15min，抽真空1min；
d.将步骤c得到的反应体系置于55℃水浴中振摇24h，使其形成乳白色块状聚合物，即为印迹聚合物；
e.将步骤d中的印迹聚合物研磨后，过200目筛，再用水洗涤沉降，至上层水清澈，烘干后，用体积比为95:5的甲醇-乙酸混合溶液索氏提取至无模板物质为止；然后用甲醇浸泡1h，所得聚合物45℃温度下，烘干6h，即得到具有特异性识别的分子印迹聚合物；
f.称取步骤e中所制备的分子印迹聚合物150g，用湿法装填固相萃取柱，
先用甲醇润湿，再用水淋洗，即制备成混合模板分子印迹固相萃取柱。
进一步，所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈。
本发明的混合模板分子印迹固相萃取柱应用于联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇残留分析时样品的净化和富集。
本发明的有益效果是分子印迹固相萃取柱可用于食品及饲料中联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇的选择性吸附和富集，适合食品和环境检测单位、科研单位及食品及饲料企业对产品的监控时使用。与普通的固相萃取柱相比，分子印迹固相萃取柱具有制备过程简单、特异性好、重现性高、分离效果好、回收率高、可反复使用、精密度高等特点。
附图说明
图1联苯三唑醇化学结构式；
图2腈菌唑化学结构式；
图3烯唑醇化学结构式；
图4混合模板分子印迹聚合物聚合过程；
图5青椒样品原液色谱图；
图6青椒样品过柱后洗脱液的色谱图；
图7青椒加标后过柱洗脱液色谱图。
具体实施方式
实施例
一、混合模板分子印迹固相萃取柱的制备方法
混合模板物质分子印迹聚合物的制备
将联苯三唑醇（0.05mmol）、腈菌唑（0.075mmol）及烯唑醇（0.075mmol）和1.2mmolα-甲基丙烯酸酯（MAA）放入50mL的安瓿瓶中，加15mL乙腈使其反应，振动频率50kHz超声1h，再加交联剂EDMA8mmol和引发剂AIBN0.02g。振动频率50kHz超声30min，混匀后通入N2脱氧15min后，抽真空1min后密封，在55℃的恒温水浴中静置24h，得块状固体印迹聚合物（MIP）。经研磨、粉碎，过200目筛，再用水洗涤沉降3次，（上层水清澈时，）除去过细粉末。将最终得到的MIP颗粒用甲醇:乙酸（体积比95:5）洗脱至无模板分子，最后用甲醇浸泡1h除去残留的乙酸，洗脱后的聚合物放入真空干燥器中（45℃）干燥6h，得到混合模板分子聚合物（MIPs）。
混合模板分子印迹固相萃取柱的制备
称取步骤所得的混合模板分子印迹聚合物150mg，溶于水中装入内径为1.5cm的固相萃取空柱内，用固相萃取装置将匀浆液抽干后，先用甲醇润湿柱子，再用水淋洗柱子，最后在上端再加上少许脱脂棉，轻轻挤压使柱子填充紧实备用；即得混合模板分子印迹固相萃取柱。
二、混合模板分子印迹固相萃取柱在实际样品检测中的应用
1、样品的提取
准确称取5g样品组织，匀浆，加入6g无水硫酸钠（饲料样品不加），再加入10mL乙腈溶液，振动频率50kHz超声提取15min，离心后取上清液。
2、样品的净化
分子印迹固相萃取柱使用前先用10mL甲醇过柱，然后用水清洗至无甲醇。加入提取后的上清液过柱，再用水淋洗柱子，最后用10mL甲醇洗脱模板，洗脱液供高效液相色谱仪检测。净化效果如图5-7所示，其中1为腈菌唑，2为联苯三唑醇，3为烯唑醇。
3、线性关系与检测限
将联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇分别配制成质量浓度为200，100,50,20,10,5,2,1,0.5，0.1，0.05μg/mL的一系列标准溶液，绘制标准曲线。其线性关系和检测限如表1所示。
表1腈菌唑、联苯三唑醇和烯唑醇的线性关系及检测限
4）回收率和精密度试验
采用本方法对青椒、香蕉、猪饲料样品在1μg/mL和10μg/mL2个添加水平下，进行添加回收率试验，分析结果如表2、表3、表4所示，三种杀菌剂平均回收率在71.8%-91.3%之间，相对标准偏差（RSD）在0.8%-3.0%之间（n=5）。说明本方法的回收率和精密度良好。
表2青椒的回收率和精密度试验
表3香蕉的回收率和精密度试验
表4猪饲料的回收率和精密度试验
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (3)

1.一种混合模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于制备步骤如下：
a.先将三种模板分子联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇共同溶于致孔剂中，加入功能单体α-甲基丙烯酸，得到混合溶液；混合模板物质联苯三唑醇、腈菌唑及烯唑醇和功能单体的摩尔比为1:1.5:1.5:6，致孔剂乙腈添加量为15mL；聚合温度55℃，聚合时间为24h；
b.将步骤a的混合溶液振动频率50kHz超声1h混匀；
c.在步骤b得到的溶液中加入交联剂和引发剂，交联剂加入量为混合模板物质总摩尔量的4倍；引发剂加入量为混合模板物质总摩尔量的0.06倍；然后振动频率50kHz超声30min，之后通入高纯氮气15min，抽真空1min；
d.将步骤c得到的反应体系置于55℃水浴中振摇24h，使其形成乳白色块状聚合物，即为印迹聚合物；
e.将步骤d中的印迹聚合物研磨后，过200目筛，再用水洗涤沉降，至上层水清澈，烘干后，用体积比为95:5的甲醇-乙酸混合溶液索氏提取至无模板物质为止；然后用甲醇浸泡1h，所得聚合物45℃温度下烘干6h，即得到具有特异性识别的分子印迹聚合物；
f.称取步骤e中所制备的分子印迹聚合物150g，用湿法装填固相萃取柱，先用甲醇润湿，再用水淋洗，即制备成混合模板分子印迹固相萃取柱。
2.如权利要求1所述的一种混合模板分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于：所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈。
3.一种根据权利要求1所述的方法制备的混合模板分子印迹固相萃取柱的应用，其特征在于：应用于联苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇残留分析时样品的净化和富集。
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