CN105289532A - 一种维生素b12分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用。该分子印迹固相萃取磁性材料是通过可逆加成-断裂链转移聚合技术（RAFT）和纳米反应器的技术，形成以苯甲基改性的纳米磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄为磁核体，以维生素B12分子印迹聚合物为外壳的固相萃取材料，通过填入固相萃取柱，对维生素B12进行分离提取。方法的回收率高（平均加标回收率为87.4%），相对标准偏差小（RSD%为0.8～6.3%），分离选择性高，灵敏度高（方法的检出限为0.082μg），具有有机溶剂使用更少、操作更为简单、快速、高效等特点。

Description

一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用。

背景技术

维生素B12，又称钴胺素，是一种含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素，分子结构是以钴离子为中心的咕啉环和5,6-二甲基苯并咪唑为碱基组成的核苷酸（化学式为C₆₃H₈₈O₁₄N₁₄PCo，分子量为1355.37）。维生素B12是机体生长不可缺少的微量营养物质。自然界的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。人体缺乏维生素B12，会引起恶性贫血，恶心和食欲不振等症状。但过量的维生素B12也会产生毒副作用，如注射过量可出现哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能会导致神经兴奋、心前区痛和心悸等现象。

食品多是由各种物质组成的混合物，而其中被检测的物质往往又是微量甚至是痕量的，因此样品前处理过程对分析结果的准确性、可靠性至关重要。分子印迹固相萃取是今年发展起来的一种新型样品前处理技术，利用分子印迹聚合物（MIP）的特异选择性为吸附，制备固相萃取材料。由于MIP对模板分子具有特异选择性和亲和性，而且其受酸、碱、有机溶剂和加热等环境因素影响较小，可以克服食品样品体系复杂、预处理程序繁琐等不利因素，实现复杂食品样品集体中低浓度目标化合物的分离富集，提高固相萃取的净化效果及分析检测方法的灵敏度和准确性。

分子印迹固相萃取磁性材料是由一种磁性材料和非磁性的分子印迹聚合物复合而成的新型功能材料。它以纳米级的磁性微球体为内，外部键合分子印迹聚合物。这种分子印迹固相萃取磁性材料既具有MIP的许多特点，如对模板分子的特异吸附性和分离选择性，通过吸附或共价结合的方式与待分离组分结合；同时，又结合固相萃取柱的特点，在完成对模板分子的识别和吸附后，用少量洗脱液即可完成目标化合物的洗脱。因此特别适合于复杂体系中目标物的分离富集。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法与应用，从而实现对维生素B12的选择性吸附和分离，并将此材料应用于功能饮料中维生素B12的选择性分离、富集和纯化，结合高效液相色谱法实现食品中微量维生素B12的快速分离检测，利于在食品安全检测中推广和应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术手段是：维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，该分子印迹固相萃取磁性材料是通过可逆加成-断裂链转移聚合技术（RAFT）和纳米反应器的技术，形成以苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体为内核，以维生素B12分子印迹聚合物为外壳的固相萃取材料，通过填入固相萃取柱，对维生素B12进行分离提取。此材料对维生素B12分子的立体机构具有“记忆”功能，能实现对维生素B12的特异性、选择性分离和富集。

一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，通过以下步骤实现：

1）磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体的合成

15.4~28.6g的FeCl₃.6H₂O和0.7~1.3g的活性磁性高岭土（KLT）分散于150~250mL的二次蒸馏水；超声处理20~40min后，搅拌11~13h；开启搅拌，通氮气除氧，加入5.6~10.4g的FeCl₂﹒4H₂0；将溶液置于90±2℃的油浴中加热，向此溶液中逐滴地加入12~22mL质量分数为23～27%的氨水溶液；溶液继续加热0.8～1.2h后，冷却至室温；产物在水中通过磁铁提取和分离；最后，产物在60±2℃的干燥箱中干燥。

2）苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄的制备

将280~520mg的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体分散于5~10mL的甲苯中；加入308~572μL的4-甲基氯苯基三氯硅烷，在充氮气的条件下，慢慢地加入三乙胺：甲苯体积比为0.23～0.25：18～22的溶液，得到的混合物在氮气保护下搅拌11~13h；最后的产物通过磁铁进行分离，并用甲醇提取；得到的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体在60±2℃的真空干燥箱内干燥而得；

1～5mL的苯基溴化镁分散于5～10mL的超干四氢呋喃中，所得的溶液置于50±2℃的油浴中，并向溶液中逐滴加入280～520μL的干燥二硫化碳，油浴0.8～1.2h后，向溶液中加入100～180mg的上述苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体，超声处理8～12min后，在充氮气保护下，继续在50±2℃的油浴中反应23～25h；所得的产物通过磁铁进行分离，并依次用四氢呋喃、甲醇和丙酮进行提取；最后产物在60±2℃的真空干燥箱中干燥，得苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体；

3）MIP磁性微球体的制备

将9.3~17.3mg的维生素B12置于具塞锥形瓶中，加入5～15mL的二甲基亚砜，依次加入2.8~5.2mmol的甲基丙烯酸、14~26mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯和63~117mg的苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体，超声处理8～12min后，向溶液中加入22.4~41.6mg的偶氮二异丁腈；此混合物在充氮气保护下，于50±2℃的油浴中反应0.8～1.2h，在磁核的表面生成含维生素B12的分子印迹聚合物；

4）分子印迹聚合物中维生素B12的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中的产物，用甲醇：乙酸体积比为8:2溶液洗脱，直至在洗脱液中检测不到模板分子，即得维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄MIP；

进一步地，该维生素B12分子固相萃取磁性材料以表面苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体为内核，以维生素B12分子印迹聚合物为外壳制备。

进一步地，所述的分子印迹聚合物，以维生素B12为模板分子，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）为交联剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂制备。

进一步地，所述的维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，采用可逆加成-断裂链转移聚合法以苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄为磁性核，以维生素B12为模板分子、甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）为交联剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，按投料比63~117mg：9.3~17.3mg：2.8~5.2mmol：14~26mmol：22.4~41.6mg发生聚合反应，再洗脱出去模板分子维生素B12而得。

进一步地，所述的磁性高岭土（KLT）/Fe3O4、维生素B12、甲基丙烯酸（MAA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、偶氮二异丁腈（AIBN）的投料比为90mg：13.3mg：4mmol：20mmol：32mg。

进一步地，步骤1）所述的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体的合成具体步骤为：22.05g的FeCl₃.6H₂O和1g的活性磁性高岭土用200mL的二次蒸馏水分散；超声处理30min后，搅拌12h；开启搅拌，通氮气除氧，加入8.07gFeCl₂﹒4H₂0；溶液置于90℃的油浴中加热，向此溶液中逐滴地加入17mL质量分数为25%的氨水溶液；溶液继续加热1h后，冷却至室温；产物在水中通过磁铁提取和分离；最后，产物在60℃的干燥箱中干燥。

进一步地，步骤2）所述的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体的制备为：将400mg的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体分散于8mL的甲苯中，加入440μL的4-甲基氯苯基三氯硅烷，在充氮气的条件下，慢慢地加入三乙胺：甲苯为240μL：20mL的溶液，得到的混合物在氮气保护下搅拌12h；最后的产物通过磁铁进行分离，并用甲醇提取；得到的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄在60℃的真空干燥箱内干燥而得；

3mL的苯基溴化镁分散于8mL的超干四氢呋喃中，所得的溶液置于50℃的油浴中，并向溶液中逐滴加入400μL的干燥二硫化碳，油浴1h后，向溶液中加入140mg的上述苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体，超声处理10min后，在充氮气保护下，继续在50℃的油浴中反应24h；所得的产物通过磁铁进行分离，并依次用四氢呋喃、甲醇和丙酮进行提取，最后产物在60℃的真空干燥箱中干燥而得，得苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体。

进一步地，步骤3）所述的MIP磁性微球体的制备为：将13.3mg的维生素B12置于具塞锥形瓶中，加入10mL的二甲基亚砜中，依次加入4mmol的甲基丙烯酸，20mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯和90mg的苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄;超声处理10min后，向溶液中加入32mg的偶氮二异丁腈;此混合物在充氮气保护下，于50℃的油浴中反应1h，在磁核的表面生成含维生素B12的分子印迹聚合物。

进一步地，步骤4）所述的分子印迹聚合物中维生素B12的洗脱：用强磁铁分离步骤（3）中的产物，用的甲醇：乙酸=8:2（v：v）溶液研磨，直至在清洗的溶液中检测不到模板分子，即得维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄MIP。

本发明的另一目的通过以下技术方案实现：

一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料在功能饮料中维生素B12的选择性分离、富集和纯化的应用，具体应用步骤为：

填柱与活化：将0.4～0.8g的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄MIP分散于5～15mL的甲醇中后填入10～14mL的固相萃取柱中，向柱中分别加入5～15mL的水和甲醇进行活化；

②上样：向柱中加入2～8mL含一定量（0，16，32，48和64μg）维生素B12的功能饮料，静置吸附13～17min；

③淋洗：用10～20mL的23～27%的甲醇水溶液进行淋洗；

④上机测定：收集淋洗液，并用氮气吹干；加入1～3mL的甲醇溶液混匀后，过0.22μm的滤膜得到的溶液用HPLC测定。

进一步地，步骤①中所述的填柱与活化：将0.6g的磁性高岭土/Fe₃O₄MIP分散于10mL的甲醇中后填入12mL的固相萃取柱中，向柱中分别加入10mL的水和10mL的甲醇进行活化；

进一步地，步骤②中所述的上样：向柱中加入2mL含0、16、32、48或64μg维生素B12的功能饮料，静置吸附15min；

进一步地，步骤③中所述的用15mL体积分数为25%的甲醇水溶液进行淋洗；

进一步地，步骤④中所述的上机测定：收集淋洗液，并用氮气吹干；加入2mL的甲醇溶液混匀后，过0.22um的滤膜，得到的溶液用HPLC测定。

与现有技术相比，本发明具有如下优点与技术效果：

本发明提供了一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法与应用，该材料对模板分子维生素B12具有特异吸附性和分离选择性，用于功能饮料样品分析前处理中微量维生素B12的选择吸附和分离，可以很好地清除基体干扰，实现对含维生素B12的功能饮料样品的快速分离检测，方法的回收率高（平均加标回收率为87.4%），相对标准偏差小（RSD%为0.8～6.3%），分离选择性高，灵敏度高（方法的检出限为0.082μg），具有有机溶剂使用更少、操作更为简单、快速、高效等特点。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明的实施，但本发明的实施和保护不限于此。

材料和试剂：

高岭土KLT（安谱实验室科技有限公司，上海），Fe₃O₄·6H₂O（广州化学试剂厂），氨水（AR，西陇化学有限公司），甲苯（AR），4-甲基氯苯基三氯硅烷（AlfaAesar(Tianjin)chemicalco.,LTD.），三乙胺（AR，Zhiyuanchemicalreagentco.,LTD.），乙醇，丙酮（AR，TianjinBaishichemicalindustryco.,LTD.），苯基溴化镁（PMB），四氢呋喃（THF），二硫化碳（AR），二甲亚砜（AR），二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA），4-吡啶基乙烯（Aladdin），偶氮二异丁腈（AIBN），三氯甲烷（AR），乙酸（AR），甲醇（GR），乙二胺-N-丙基（PSA），金属-有机骨架材料。

仪器：

LC-20AT高效液相色谱，附二极管阵列检测器；电子天平；KQ-3200-B超声波清洗装置；真空干燥箱；DF-101-S集热式恒温磁力搅拌器（油浴）。

实施例1

一、维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备

（1）磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体的合成

22g的FeCl₃.6H₂O和1g的活性磁性高岭土（KLT）用200mL的二次蒸馏水分散。超声处理30min后，搅拌12h。启动搅拌，充氮气排氧，加入8g的FeCl₂.4H₂0，得溶液。溶液置于90℃的油浴中加热，向此溶液中逐滴地加入17mL的25%（wt%）的氨水溶液。溶液继续加热1h后，冷却至室温。产物在水中通过磁铁提取和分离。最后，产物在60℃的干燥箱中干燥，得磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体。

（2）苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄的制备

将400mg的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体分散于8mL的甲苯中。加入440μL的4-甲基氯苯基三氯硅烷，在充氮气的条件下，慢慢地向其中加入三乙胺甲苯溶液（其中三乙胺240μL，甲苯20mL），得到的混合物在氮气保护下搅拌12h。最后的产物通过磁铁进行分离，并用甲醇提取。得到的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄在60℃的真空干燥箱内干燥而得。

3mL的苯基溴化镁分散于8mL的超干四氢呋喃中，所得的溶液置于50℃的油浴中，并向溶液中逐滴加入400μL的干燥二硫化碳。油浴1h后，向溶液中加入140mg的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄，超声处理10min后，在充氮气保护下，继续在50℃的油浴中反应24h。所得的产物通过磁铁进行分离，并依次用四氢呋喃（THF）、甲醇和丙酮进行提取。最后产物在60℃的真空干燥箱中干燥，得苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体。

（3）MIP磁性微球体的制备

将13.3mg的维生素B12置于具塞锥形瓶中，加入10mL的二甲基亚砜，依次加入4mmol的甲基丙烯酸(MAA)，20mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和90mg的苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄于溶液中。超声处理10min后，向溶液中加入32mg的偶氮二异丁腈(AIBN)。此混合物在充氮气保护下，于50℃的油浴中反应1h，在核磁的表面生成含维生素B12的分子印迹聚合物。

（4）分子印迹聚合物中维生素B12的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中的产物，用的甲醇：乙酸=8:2（v：v）溶液清洗，直至在清洗的溶液中检测不到维生素B12，即得维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，标记为磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄MIP。

二、维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料应用于功能饮料1家得乐中B12的选择性分离、富集和纯化

（1）填柱与活化

称取0.6g制备好的分子印迹固相萃取磁性材料，分散于10mL的甲醇中后填入12mL固相萃取小柱中，依次加入10mL的水和10mL的甲醇进行活化；

（2）上样

吸取5mL的市售功能饮料1家得乐，准确加入维生素B12对照品32μg，混合均匀后，样品用尼龙滤膜去除色素后，倒入固相萃取柱中，静置15min；

（3）淋洗

加入15mL的体积分数为25%的水溶液进行淋洗；

（4）上机，计算回收率

收集淋洗液，氮气吹干后，用甲醇定容2mL，过0.22μm的滤膜，得到的溶液用HPLC定量分析，计算加标回收率，加标回收率为87.5%。

实施例2

一、维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法

（1）磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体的合成

22g的FeCl₃.6H₂O和1g的活性磁性高岭土（KLT）用200mL的二次蒸馏水分散。超声处理30min后，搅拌12h。启动搅拌，充氮气排氧，加入8g的FeCl₂.4H₂0，得溶液。溶液置于90℃的油浴中加热，向此溶液中逐滴地加入17mL的25%（wt%）的氨水溶液。溶液继续加热1h后，冷却至室温。产物在水中通过磁铁提取和分离。最后，产物在62℃的干燥箱中干燥，得磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体。

（2）苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄的制备

将400mg的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体分散于8mL的甲苯中。加入440μL的4-甲基氯苯基三氯硅烷，在充氮气的条件下，慢慢地向其中加入三乙胺甲苯溶液（其中三乙胺240μL，甲苯20mL），得到的混合物在氮气保护下搅拌12h。最后的产物通过磁铁进行分离，并用甲醇提取。得到的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄在62℃的真空干燥箱内干燥而得。

3mL的苯基溴化镁分散于8mL的超干四氢呋喃中，所得的溶液置于50℃的油浴中，并向溶液中逐滴加入400μL的干燥二硫化碳。油浴1h后，向溶液中加入140mg的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄，超声处理10min后，在充氮气保护下，继续在50℃的油浴中反应24h。所得的产物通过磁铁进行分离，并依次用四氢呋喃（THF）、甲醇和丙酮进行提取。最后产物在62℃的真空干燥箱中干燥，得苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体。

（3）MIP磁性微球体的制备

将17.3mg的B12分散于15mL的二甲基亚砜中，依次加入5.2mmol的甲基丙烯酸(MAA)，26mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和117mg的苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄于溶液中。超声处理10min后，向溶液中加入41.6mg的偶氮二异丁腈(AIBN)。此混合物在充氮气保护下，于52℃的油浴中反应1h，在磁核的表面生成含维生素B12的分子印迹聚合物。

（4）分子印迹聚合物中维生素B12的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中的产物，用的甲醇：乙酸=8:2（v：v）溶液清洗，直至在清洗的溶液中检测不到维生素B12，即得维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，标记为磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄MIP。

二、维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料应用于功能饮料2脉动中维生素B12的选择性分离、富集和纯化

（1）填柱与活化

称取0.8g制备好的维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，分散于15mL的甲醇中后填入固相萃取小柱中，依次加入15mL的水和15mL的甲醇进行活化；

（2）上样

吸取8mL的市售功能饮料2脉动，准确加入维生素B12对照品64μg，混合均匀后，样品用尼龙滤膜去除色素后，倒入固相萃取柱中，静置15min；

（3）淋洗

加入20mL体积分数为27%甲醇的水溶液进行淋洗；

（4）上机，计算回收率

收集淋洗液，氮气吹干后，用甲醇定容2mL，过0.22μm的滤膜，得到的溶液用HPLC定量分析，计算加标回收率，加标回收率为88.4%。

实施例3

一、维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法

（1）磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体的合成

22g的FeCl₃.6H₂O和1g的活性磁性高岭土（KLT）用200mL的二次蒸馏水分散。超声处理30min后，搅拌12h。启动搅拌，充氮气排氧，加入8g的FeCl₂.4H₂0，得溶液。溶液置于90℃的油浴中加热，向此溶液中逐滴地加入17mL的25%（wt%）的氨水溶液。溶液继续加热1h后，冷却至室温。产物在水中通过磁铁提取和分离。最后，产物在58℃的干燥箱中干燥，得磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体。

（2）苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄的制备

将400mg的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土磁性微球体分散于8mL的甲苯中。加入440μL的4-甲基氯苯基三氯硅烷，在充氮气的条件下，慢慢地向其中加入三乙胺甲苯溶液（其中三乙胺240μL，甲苯20mL），得到的混合物在氮气保护下搅拌12h。最后的产物通过磁铁进行分离，并用甲醇提取。得到的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄在58℃的真空干燥箱内干燥而得。

3mL的苯基溴化镁分散于8mL的超干四氢呋喃中，所得的溶液置于50℃的油浴中，并向溶液中逐滴加入400μL的干燥二硫化碳。油浴1h后，向溶液中加入140mg的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄，超声处理10min后，在充氮气保护下，继续在50℃的油浴中反应24h。所得的产物通过磁铁进行分离，并依次用四氢呋喃（THF）、甲醇和丙酮进行提取。最后产物在58℃的真空干燥箱中干燥，得苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体。

（3）MIP磁性微球体的制备

将9.3mg的B12分散于5mL的二甲基亚砜中，依次加入2.8mmol的甲基丙烯酸(MAA)，14mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和63mg的苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄于溶液中。超声处理10min后，向溶液中加入22.4mg的偶氮二异丁腈(AIBN)。此混合物在充氮气保护下，于48℃的油浴中反应1h，在磁核的表面生成含维生素B12的分子印迹聚合物。

（4）分子印迹聚合物中维生素B12的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中的产物，用的甲醇：乙酸=8:2（v：v）溶液清洗，直至在清洗的溶液中检测不到维生素B12，即得维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，标记为磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄MIP。

二、维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料应用于功能饮料3红牛中维生素B12的选择性分离、富集和纯化

（1）填柱与活化

称取0.4g制备好的维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，分散于5mL的甲醇中后填入固相萃取小柱中，依次加入5mL的水和5mL的甲醇进行活化；

（2）上样

吸取2mL的市售功能饮料3红牛，准确加入维生素B12对照品16μg，混合均匀后，样品用尼龙滤膜去除色素后，倒入固相萃取柱中，静置15min；

（3）淋洗

加入10mL体积分数为23%的甲醇水溶液进行淋洗；

（4）上机，计算回收率

收集淋洗液，氮气吹干后，用甲醇定容1mL，过0.22μm的滤膜，得到的溶液用HPLC定量分析，计算加标回收率，加标回收率为88.4%。

Claims (10)

1.一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1）磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体的合成：将15.4~28.6g的FeCl₃.6H₂O和0.7~1.3g的活性磁性高岭土分散于150~250mL的二次蒸馏水中；超声处理20~40min后，搅拌11~13h；开启搅拌，通氮气除氧，加入5.6~10.4g的FeCl₂﹒4H₂0；将溶液置于90±2℃的油浴中加热，向此溶液中逐滴地加入12~22mL质量分数为23～27%的氨水溶液；继续加热溶液0.8～1.2h后，冷却至室温；产物在水中通过磁铁提取和分离；最后产物在60±2℃的干燥箱中干燥即得磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体；

2）苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体的制备：将280~520mg的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体分散于5~10mL的甲苯中；加入308~572μL的4-甲基氯苯基三氯硅烷，在充氮气的条件下，慢慢地加入三乙胺：甲苯体积比为（0.23～0.25）：（18～22）的溶液，得到的混合物在氮气保护下搅拌11~13h；最后的产物通过磁铁进行分离，并用甲醇提取；得到的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体在60±2℃的真空干燥箱内干燥而得；

1～5mL的苯基溴化镁分散于5～10mL的超干四氢呋喃中，所得的溶液置于50±2℃的油浴中，并向溶液中逐滴加入280～520μL的干燥二硫化碳，油浴0.8～1.2h后，向溶液中加入100～180mg的上述苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体，超声处理8～12min后，在充氮气保护下，继续在50±2℃的油浴中反应23～25h；所得的产物通过磁铁进行分离，并依次用四氢呋喃、甲醇和丙酮进行提取；最后产物在60±2℃的真空干燥箱中干燥，得苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体；

3）MIP磁性微球体的制备：将9.3~17.3mg的维生素B12置于具塞锥形瓶中，加入5～15mL的二甲基亚砜，依次加入2.8~5.2mmol的甲基丙烯酸、14~26mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯和63~117mg的苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体，超声处理8～12min后，向溶液中加入22.4~41.6mg的偶氮二异丁腈；此混合物在充氮气保护下，于50±2℃的油浴中反应0.8～1.2h，在磁核的表面生成含维生素B12的分子印迹聚合物，得MIP磁性微球体；

4）分子印迹聚合物中维生素B12的洗脱：用强磁铁分离步骤3）中的产物，用甲醇：乙酸体积比为8:2溶液洗脱，直至在洗脱液中检测不到维生素B12，即得维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料，标记为磁性高岭土/Fe₃O₄MIP。

2.根据权利要求1所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，其特征在于，该维生素B12分子固相萃取磁性材料以苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体为磁性内核，以维生素B12分子印迹聚合物为外壳制备。

3.根据权利要求1和2任意一项所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，其特征在于，所述维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料采用可逆加成-断裂链转移聚合法以苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体为磁性内核，以维生素B12为模板分子，以甲基丙烯酸为功能单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，以偶氮二异丁腈为引发剂，按投料比63~117mg：9.3~17.3mg：2.8~5.2mmol：14~26mmol：22.4~41.6mg发生聚合反应，再洗脱出去模板分子维生素B12而得。

4.根据权利要求3所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，其特征在于，所述苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体、维生素B12、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯与偶氮二异丁腈的投料比为90mg：13.3mg：4mmol：20mmol：32mg。

5.根据权利要求1所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体的合成具体步骤为：22.05g的FeCl₃.6H₂O和1g的活性磁性高岭土用200mL的二次蒸馏水分散；超声处理30min后，搅拌12h；开启搅拌，通氮气除氧，加入8.07gFeCl₂﹒4H₂0；溶液置于90℃的油浴中加热，向此溶液中逐滴地加入17mL质量分数为25%的氨水溶液；溶液继续加热1h后，冷却至室温；产物在水中通过磁铁提取和分离；最后，产物在60℃的干燥箱中干燥。

6.根据权利要求1所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体的制备为：将400mg的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄高岭土微球体分散于8mL的甲苯中，加入440μL的4-甲基氯苯基三氯硅烷，在充氮气的条件下，慢慢地加入三乙胺：甲苯为240μL：20mL的溶液，得到的混合物在氮气保护下搅拌12h；最后的产物通过磁铁进行分离，并用甲醇提取；得到的苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄在60℃的真空干燥箱内干燥而得；

3mL的苯基溴化镁分散于8mL的超干四氢呋喃中，所得的溶液置于50℃的油浴中，并向溶液中逐滴加入400μL的干燥二硫化碳，油浴1h后，向溶液中加入140mg的上述苯甲基改进型的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体，超声处理10min后，在充氮气保护下，继续在50℃的油浴中反应24h；所得的产物通过磁铁进行分离，并依次用四氢呋喃、甲醇和丙酮进行提取，最后产物在60℃的真空干燥箱中干燥而得，得苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄微球体。

7.根据权利要求1所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的MIP磁性微球体的制备为：将13.3mg的维生素B12置于具塞锥形瓶中，加入10mL的二甲基亚砜中，依次加入4mmol的甲基丙烯酸，20mmol的二甲基丙烯酸乙二醇酯和90mg的苯甲基改性的磁性高岭土（KLT）/Fe₃O₄;超声处理10min后，向溶液中加入32mg的偶氮二异丁腈;此混合物在充氮气保护下，于50℃的油浴中反应1h，在磁核的表面生成含维生素B12的分子印迹聚合物，得MIP磁性微球体。

8.由权利要求1所述制备方法制得的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料。

9.权利要求8所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料在功能饮料中维生素B12的选择性分离、富集和纯化的应用，其特征在于，具体应用步骤为：

1）填柱与活化：将0.4～0.8g的磁性高岭土/Fe₃O₄MIP分散于5～15mL的甲醇中后填入10～14mL的固相萃取柱中，向柱中分别加入5～15mL的水和甲醇进行活化；

2）上样：向柱中加入2～8mL含0、16、32、48或64μg维生素B12的功能饮料，静置吸附13～17min；

3）淋洗：用10～20mL体积分数为23～27%的甲醇水溶液进行淋洗；

4）上机测定：收集淋洗液，并用氮气吹干；加入1～3mL的甲醇溶液混匀后，过0.22μm的滤膜，得到的溶液用HPLC测定。

10.根据权利要求9所述的一种维生素B12分子印迹固相萃取磁性材料的应用，其特征在于，更具体应用步骤为：

1）填柱与活化：将0.6g的磁性高岭土/Fe₃O₄MIP分散于10mL的甲醇中后填入12mL的固相萃取柱中，向柱中分别加入10mL的水和10mL的甲醇进行活化；

2）上样：向柱中加入2mL含0、16、32、48或64μg维生素B12的功能饮料，静置吸附15min；

3）淋洗：用15mL体积分数为25%的甲醇水溶液进行淋洗；

4）上机测定：收集淋洗液，并用氮气吹干；加入2mL的甲醇溶液混匀后，过0.22um的滤膜，得到的溶液用HPLC测定。