CN115634671A - 一种制备维生素b12表面分子印迹微球的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种维生素B12表面分子印迹微球的制备方法。首先以商品化的固相萃取微球为基质，通过化学修饰引入间隔臂，以维生素B12为模板分子，预聚合功能单体，加入交联剂和引发剂引发自由基聚合，制备印迹维生素B12的功能微球，去除模板维生素B12得到表面分子印迹材料(MIP‑B12)，并应用该材料在分散固相萃取(d‑SPE)模式下富集生物学样品中的痕量维生素B12。本发明制备的分子印迹材料对维生素B12具有较高的吸附选择性和较低的检测限，采用绿色化学的制备方法，反应条件温和，减少有机溶剂的使用，并成功应用于生物学样品中痕量维生素B12的富集。
Description
技术领域
本发明涉及分子印迹微球的制备技术领域，具体为一种制备维生素B12表面分子印迹微球的方法。
背景技术
请参阅图2，维生素B12又称钴铵素(Cobalamin,Cbl)，是唯一一种含金 属的水溶性维生素，是人体组织代谢过程中所必需的维生素。因官能团不同， 维生素B12包括四种类型，腺苷钴胺素(Ado-Cbl)，羟钴胺素(OH-Cbl)，甲基钴 胺素(Me-Cbl)和氰钴胺素(CN-Cbl)。
维生素B12需要一种肠道分泌物内因子(Intracelular Factor,IF)的帮助才 能被吸收，其生理作用为促进红细胞的发育和成熟，预防恶性贫血，维护， 促进脱氧核酸(DNA)的合成。维生素B12缺乏表现为血液系统的疾病如巨幼 细胞性贫血和冠心病，及神经髓鞘的代谢与功能异常而造成的亚急性联合变 性神经系统病变，如老年痴呆症和抑郁症，同时维生素B12缺乏也是怀孕早期 流产、反复性流产的危险因素之一。
精准分析维生素B12的含量，有助于医生准确评估人体健康状况，从而提 高临床诊断的效率。为消除基质干扰和预富集痕量目标物，目前已发展了很 多样品前处理的方法，如固相萃取(solid phase extraction,SPE)、液-液微萃取 (liquid liquid micro-extraction,LLME)、基质固相分散(matrix solid phase dispersion,MSPD)等。基于绿色化学——低毒环保且可持续性的基本原则，分 散固相萃取(dispersive solid phaseextraction,d-SPE)是一种很受关注的方法，它 是在固相萃取的基础上，直接将吸附剂加入样品水溶液中进行预处理的方法。 但d-SPE也存在选择性不足，检测灵敏度低的问题。
分子印迹技术(Molecular imprinting technology,MIT)是一种模拟自然界中抗原和抗体的识别机制，人工构建特异性识别聚合物的技术，即将待分析物 作为模板，通过交联剂交联合适的功能单体而制备得到分子印迹聚合物 (Molecularly imprintedpolymers,MIPs)。MIT技术赋予了MIPs特异性识别目 标化合物的亲和力，在传感、分离和诊断等方面有着广泛的应用。据调研， 传统方法中制备MIPs均使用大量的有机溶剂，并且存在严重的基质干扰问题 (如蛋白质，脂质体吸附在材料表面)，考虑到多数分析物是水溶性或者存 在于富水的体系中，发展水溶性的MIPs更符合绿色化学的要求。因此，传统 方法制备MIPs聚合物微球存在使用有机毒性试剂、灵敏性不高以及生物样品 成分复杂需要前处理的技术问题。
发明内容
鉴于传统方法制备MIPs聚合物微球存在使用有机毒性试剂及灵敏性不高, 及生物样品成分复杂需要前处理的问题，本发明提供了一种制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，主要涉及微球表面的改性，表面印迹聚合物材料 技术与方法。改性材料的表面具有丰富的官能团(-NH2，-OH，-COOH，-SH， ＝CH2)，可以进一步在微球表面发生化学反应。以维生素B12为模板分子， 加入预聚合的功能单体，如葡聚糖，壳寡糖，多巴胺，聚乙二醇，聚乳酸分 子，以增强微球表面的亲水性，减少材料表面的非特异性吸附；并加入交联 剂，通过热引发聚合的方式在微球表面印迹维生素B12，脱除模板分子维生素 B12，得到表面印迹微球材料MIP-B12，并将该类型的微球材料通过分散固相 萃取的方法富集生物学样本中的维生素B12。
一种制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，步骤包括：
步骤1：活化商品化的微球表面的羟基，通过化学键合的方式，修饰微球 表面，得到末端含有活泼基团的微球；
步骤2：制备表面印迹微球，将官能团修饰后的微球溶于一定的溶剂中， 引入预聚合功能单体的模板分子维生素B12，交联剂，通过自由基聚合的方法 将维生素B12印迹在硅球表面；加热萃取去除模板分子，得到表面印迹维生素 B12的材料MIP-B12；
步骤3：通过分散固相萃取d-SPE的方式，将制备得到的MIP-B12材料应 用于富集生物学样本中的维生素B12，验证该方法所制备的表面分子印迹材料 在富集实际样本中的可靠性。
在其中一个实施例中，所述商品化的微球包括：二氧化硅微球，粒径为2 μm～10μm，孔径
比表面积为50～500m2/g，聚苯乙烯微球/ 聚丙烯酰胺微球的粒径为2μm～20μm，孔径为
比表面积为 50～1000m2/g；
所述步骤1中微球表面的活化，具体方法包括：步骤a、将商品化微球加 入盐酸或硝酸溶液，其中盐酸或硝酸溶液的体积浓度为1～10％，每克微球需 要盐酸或硝酸的体积为2～30mL，加热回流搅拌1～48h，过滤，水洗至中性；
所述步骤1中通过化学键合的方式，微球表面的修饰，具体方法包括： 步骤b、在惰气保护下，将活化的微球溶于一定的有机溶液中，量取氨丙基烷 氧基硅烷、巯基丙基烷氧基硅烷、或者羟基丙基烷氧基硅烷试剂、烯丙基烷 氧基硅烷试剂中的一种或两种以上的试剂溶于极性有机溶液，采用碱性催化 剂控制反应溶液的pH；
搅拌反应4～24h，表面修饰后的微球经过离心，水、乙醇洗涤，在100～ 160℃干燥5～12h，得到末端含有活泼基团的微球材料；
所述步骤2制备表面印迹微球，具体方法包括：步骤c、在惰气保护下， 将修饰后的微球材料溶于一定的有机溶剂中，加入维生素B12预聚合的功能单 体，功能单体包括乳酸、葡聚糖、壳寡糖、环糊精、多巴胺、聚乙二醇其中 的一种或者两种；
加入交联剂，包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、 多巴胺或TEOS；
加入自由基引发剂，包括偶氮二异丁腈，过硫酸钾或过硫酸铵，在有机 溶剂中热聚合，得到维生素B12分子嵌合在微球表面的材料；
所述步骤2中去除模板分子的具体方法包括：萃取，索氏提取及离心洗 涤；
步骤d、将MIP-B12材料与待富集的样品混合，通过分散固相萃取的方式 富集生物学样本中的维生素B12，以该材料对维生素B12的选择性为测定指标， 验证该方法制备表面分子印迹材料在富集实际样本中的可靠性。
在其中一个实施例中，所述步骤a中每克处理好的微球对应于所述步骤b 中使用的烷氧基硅烷的量为0.5mmol～5.0mmol；
所述步骤b中的惰气为高纯氮气，以四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰 胺(DMF)或者二甲基亚砜(DMSO)等极性有机试剂中的一种或二种以上 为溶剂；
氨丙基烷氧基硅烷是氨丙基三甲氧基硅烷或者氨丙基三乙氧基硅烷中的 一种或二种，巯基丙基三甲氧基烷氧基硅烷试剂、羟基丙基三甲氧基烷氧基 硅烷试剂的一种或者两种，硅烷试剂在极性溶剂中质量浓度为1～10％；
用三乙胺试剂或者二异丙基胺试剂中的一种控制溶液体系的pH值为7～ 9；控制搅拌速度，反应温度，并使用液相色谱和质谱联用的检测方法，监测 硅烷试剂反应进行的程度。
在其中一个实施例中，所述步骤c中的惰气为高纯氮气，所述有机溶剂 为苯、甲苯、THF、DMF或者DMSO中的一种或二种以上，所述步骤b中每 克微球需要有机溶剂的体积为2～20mL；
维生素B12与功能单体的量之比为0.02～5，每克微球所加入的预聚合的 维生素B12的量为0.01～8mmol/g硅胶；
交联剂与功能单体物质的量之比为0.01～5；每克微球加入的自由基引发 剂的量为0.01～0.2mmol；反应温度控制在15～110℃，搅拌速率控制在60～1000r/min，反应时间控制在6～36h；
所得到的维生素B12分子嵌合在微球表面的材料经过离心，甲苯，甲醇， 水，甲醇洗涤，在65～160℃下干燥5～24h。
在其中一个实施例中，所述步骤2中脱除模板分子B12的溶剂为甲醇， DMSO，DMF，THF中的一种试剂，所用的方法为索氏提取，萃取或者离 心洗涤方法中的一种，每克微球与溶剂的比例为1～40g/mL；
脱除模板分子的温度控制在25～200℃，萃取时间控制在5～24h，得到 表面印迹有维生素B12分子的微球材料MIP-B12经过离心，萃取溶剂洗涤，甲 醇，水，甲醇洗涤，在65～160℃干燥5～12h。
在其中一个实施例中，所述步骤d中，将MIP-B12材料溶于一定的有机溶 剂中活化，离心去除上层活化溶剂，得到活化后的微球材料；
将活化后的微球材料溶解于一定的溶剂中，溶剂为水，甲醇，乙醇，或 者乙腈试剂的一种或者两种以上；
将活化后的微球材料与待富集的样本溶液混合，超声匀浆，装填在固相 萃取小柱中，柱管体积为0.5～10mL，通过淋洗，洗脱的方法分离富集实际 样品中的维生素B12；
其中活化MIP-B12的方法是使用H2O/甲醇/甲酸(1:1:0.01)或者H2O/乙 腈/甲酸(1:1:0.01)，每克MIP-B12材料所使用的活化溶剂2～15mL；
待富集的样本溶液是指样本溶于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯或 者水溶液中，体积控制在0.1～100μL；
淋洗用的溶液为水，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，磷酸盐缓冲溶液中的一 种或者两种以上，淋洗溶液的体积为固相萃取柱体积的0.1～5倍；
洗脱用的溶液为水，甲醇，乙醇，乙腈中的一种或者两种溶液，通过甲 酸或者乙酸调控溶液的pH为2～8，洗脱溶液的体积为固相萃取柱体积的 0.1～5倍；
所用的样品为标准品维生素B12，蔬菜，牛奶，奶粉，母乳、血清等。
在其中一个实施例中，所述步骤d中选择吸附维生素B12的实验方法为： 将标准品维生素B12，混合有标准品维生素B12及其他维生素的样品，通过 d-SPE的方式分离富集，检测洗脱溶液中维生素B12的含量，评价该材料的选 择性，检测限等参数，验证该方法制备表面分子印迹材料的可靠性；
检测洗脱溶液中维生素B12含量的仪器为紫外可见分光光度计或者 HPLC；具体为检测维生素B12的特征性吸收波长下的吸光度，或者通过HPLC 的UV检测器检测维生素B12的出峰面积，对维生素B12进行定量分析。与现 有技术相比，本发明的有益效果是：
1、材料合成路线简捷。微球表面改性的方法是引入含有官能团的硅烷化 试剂，并可以进一步与其他官能团键合，反应路线简洁；
2、所选用的功能单体为可降解的单体分子，如天然产物来源的壳寡糖， 葡聚糖，聚乳酸，多巴胺分子等，符合绿色化学的概念；
3、制备得到的MIP-B12微球材料，亲水性好，可通过分散固相萃取的方 法高效富集复杂基质样本中的维生素B12。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本 发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1是HPLC检测MIP-B12材料富集维生素B12与维生素C混合样 本的结果示意图；
图2是是含有不同取代基的维生素B12的结构图；维生素B12的 英文简写为CBl,因为维生素B12中Co金属元素可以和4种不同的官 能团R连接，因此存在4种维生素B12的形式，R官能团分别为-CN， -OH，-Me,-Ado(为Adenosine的简写),对应的维生素B12英文名称 分别为CN-CBl,OH-CBl,Me-CBl,和Ado-CBl。左侧表示CBl的结构简写 式，并在下方对官能团R表示的基团进行了说明，具体为R＝CN,表 示CN-CBl；R＝OH,表示OH-CBl；R＝Me,表示Me-CBl；故在右侧表示 Adenosine的分子结构，并且在下方标出AdoCBl化合物的化学式是C72H100CoN18O17P，其分子质量为1579.6。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述 的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明以维生素B12为模板分子，以修饰后的微球为载体，选择亲水性的 功能单体与交联剂，在水溶液中制备分散型的分子印迹聚合物材料，通过d-SPE的方法富集生物学样品中痕量的维生素B12，并结合LC-MS的方法评 估方法的可行性。
本发明提供了一种制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，主要涉及微 球表面的改性，表面印迹聚合物材料技术与方法。改性材料的表面具有丰富 的官能团(-NH2，-OH，-COOH，-SH，＝CH2)，可以进一步在微球表面 发生化学反应。以维生素B12为模板分子，加入预聚合的功能单体，如葡聚糖， 壳寡糖，多巴胺，聚乙二醇，聚乳酸分子，以增强微球表面的亲水性，减少 材料表面的非特异性吸附；并加入交联剂，通过热引发聚合的方式在微球表 面印迹维生素B12，脱除模板分子维生素B12，得到表面印迹微球材料MIP-B12， 并将该类型的微球材料通过分散固相萃取的方法富集生物学样本中的维生素 B12。
本发明的步骤包括：
步骤1：活化商品化的微球表面的羟基，通过化学键合的方式，修饰微球 表面，得到末端含有活泼基团的微球；
步骤2：制备表面印迹微球，将官能团修饰后的微球溶于一定的溶剂中， 引入预聚合功能单体的模板分子维生素B12，交联剂，通过自由基聚合的方法 将维生素B12印迹在硅球表面；加热萃取去除模板分子，得到表面印迹维生素 B12的材料MIP-B12；
步骤3：通过分散固相萃取d-SPE的方式，将制备得到的MIP-B12材料应 用于富集生物学样本中的维生素B12，验证该方法所制备的表面分子印迹材料 在富集实际样本中的可靠性。
进一步的，商品化的微球包括：二氧化硅微球，粒径为2μm～10μm，孔 径
比表面积为50～500m2/g，聚苯乙烯微球/聚丙烯酰胺微球的 粒径为2μm～20μm，孔径为
比表面积为50～1000m2/g；
步骤1中微球表面的活化，具体方法包括：步骤a、将商品化微球加入盐 酸或硝酸溶液，其中盐酸或硝酸溶液的体积浓度为1～10％，每克微球需要盐 酸或硝酸的体积为2～30mL，加热回流搅拌1～48h，过滤，水洗至中性；
步骤1中通过化学键合的方式，微球表面的修饰，具体方法包括：步骤 b、在惰气保护下，将活化的微球溶于一定的有机溶液中，量取氨丙基烷氧基 硅烷、巯基丙基烷氧基硅烷、或者羟基丙基烷氧基硅烷试剂、烯丙基烷氧基 硅烷试剂中的一种或两种以上的试剂溶于极性有机溶液，采用碱性催化剂控 制反应溶液的pH；
搅拌反应4～24h，表面修饰后的微球经过离心，水、乙醇洗涤，在100～ 160℃干燥5～12h，得到末端含有活泼基团的微球材料；
步骤2制备表面印迹微球，具体方法包括：步骤c、在惰气保护下，将修 饰后的微球材料溶于一定的有机溶剂中，加入维生素B12预聚合的功能单体， 功能单体包括乳酸、葡聚糖、壳寡糖、环糊精、多巴胺、聚乙二醇其中的一 种或者两种；
加入交联剂，包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、 多巴胺或TEOS；
加入自由基引发剂，包括偶氮二异丁腈，过硫酸钾或过硫酸铵，在有机 溶剂中热聚合，得到维生素B12分子嵌合在微球表面的材料；
步骤2中去除模板分子的具体方法包括：萃取，索氏提取及离心洗涤；
步骤d、将MIP-B12材料与待富集的样品混合，通过分散固相萃取的方式 富集生物学样本中的维生素B12，以该材料对维生素B12的选择性为测定指标， 验证该方法制备表面分子印迹材料在富集实际样本中的可靠性。
本申请通过以下优选实施例1-4，以解决传统方法制备MIPs聚合物微球 存在使用有机毒性试剂及灵敏性不高,及生物样品成分复杂需要前处理的技术 问题。
实施例1：
取5g二氧化硅微球(5μm，
)，置于100mL玻璃圆底烧瓶中，加 入50mL浓度为6M的盐酸加热回流1h，水洗至中性，在150℃下干燥5h。
氮气保护，将干燥好的二氧化硅微球2.5g，溶于30mL有机溶液无水甲 苯中，取巯基丙基三甲氧基硅烷试剂1.66g，溶于20mL无水处理的四氢呋 喃溶液中，电磁搅拌下，加入二氧化硅微球溶液中，并滴加无水吡啶(也可 用三乙胺、二异丙基胺等碱性催化剂)(6mmol,480μL)，加热回流，反应12h， 停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤， 80℃下干燥固化6h，得到末端含有氨基的硅胶。
氮气保护，称量上述干燥的巯基硅胶材料2.5g，氮气保护，溶于10mL 有机溶剂无水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，电磁搅拌。
取维生素B12(200μmol,272mg)溶于甲醇/水(1/9,20mL)溶液中,加 入功能单体壳寡糖(1mmol)的水溶液(15mL),混匀，加入巯基硅胶溶液 中。氮气保护下，加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(0.1mmol)，AIBN(5 mg)，室温搅拌1h，控制反应温度90℃，搅拌反应12h，停止反应，减压抽 滤，依次用50mL N，N-二甲基酰胺和15mL无水甲苯，15mL甲醇，20mL 水，15mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化6h,得到印迹有维生素B12的微球材 料。
取上述材料1g，溶于30mL甲醇溶剂中，放入索氏提取器，在60℃下， 萃取模板分子维生素B12，减压抽滤，依次用10mL无水甲苯，15mL甲醇， 15mL水，10mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化6h，得到MIP-B12的微球材 料。
取MIP-B12材料100mg，使用乙腈/水/FA(1:1:0.01)活化，分散于水溶 剂中，加入维生素C(1mg/mL,5μL)和维生素B12(1mg/mL,5μL)标准品， 超声混匀，装填于固相萃取小柱中，用水溶液淋洗，用甲醇溶剂洗脱，应用 HPLC检测淋洗液的成分为维生素C，洗脱液的成分为维生素B12。
HPLC的色谱条件为：亲水色谱柱click Mannose(2.1×100cm,5μm, 
实验室自制)A相：乙腈；B相：水，0-25min,95％ A,5％ B。
分离结果如图示1所示，表明MIP-B12材料能够选择性富集维生素B12。
实施例2：
取5g二氧化硅微球(10μm，
)，置于100mL玻璃圆底烧瓶中，加 入50mL浓度为6M的盐酸加热回流1h，水洗至中性，在150℃下干燥5h。
氮气保护，将干燥好的二氧化硅微球2.5g，溶于30mL有机溶液无水甲 苯中，取巯基丙基三甲氧基硅烷试剂1.66g，溶于20mL无水处理的四氢呋 喃溶液中，电磁搅拌下，加入二氧化硅微球溶液中，并滴加三乙胺(5mmol)， 加热回流，反应12h，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲 醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化6h，得到末端含有氨基的硅胶。
氮气保护，称量上述干燥的巯基硅胶材料2.5g，氮气保护，溶于10mL 有机溶液无水甲苯中，电磁搅拌。
取维生素B12(200μmol,272mg)溶于甲醇/水(2/8,20mL)溶液中,加入 功能单体多巴胺(5mmol)的水溶液(50mL),混匀，加入巯基硅胶溶液中。 氮气保护下，不加交联剂，室温搅拌1h，控制反应温度90℃，搅拌反应12h， 停止反应，减压抽滤，依次用15mL无水甲苯，15mL甲醇，20mL水，15mL 甲醇洗涤，60℃下干燥固化6h。取上述材料1g，溶于30mL甲醇溶剂中， 放入索氏提取器，在65℃下，萃取模板分子维生素B12，减压抽滤，依次用 10mL无水甲苯，15mL甲醇，15mL水，10mL甲醇洗涤，60℃下干燥固 化6h，得到MIP-B12微球材料。
取MIP-B12材料100mg，使用乙腈/水/FA(1:1:0.01)活化，分散于水溶 剂中，加入维生素C(1mg/mL,5μL)和维生素B12(1mg/mL,5μL)标准品， 超声混匀，装填于固相萃取小柱中，用水溶液淋洗，甲醇溶剂洗脱，应用HPLC 检测淋洗液的成分为维生素C，洗脱液的成分为维生素B12。
取MIP-B12材料100mg，使用乙腈/水/FA(1:1:.01)活化，分散于水溶剂 中，加入伊利脱脂牛奶(100μL)超声混匀，用丙酮淋洗，用乙腈/水/FA(1:1: 0.01)洗脱，应用HPLC检测洗脱液的成分为维生素B12。
实施例3：
取聚苯乙烯微球5g(10μm，
)，置于100mL玻璃圆底烧瓶中，加 入50mL浓度为6M的盐酸加热回流1h，水洗至中性，在150℃下干燥5h。
氮气保护，将干燥好的微球2.5g，溶于30mL无水甲苯中，取烯丙基三 甲氧基硅烷试剂(3mmol)，溶于20mL无水处理的四氢呋喃溶液中，电磁 搅拌下，加入聚苯乙烯微球溶液中，并滴加二异丙基胺(3mmol)，加热回流， 反应12h，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲 醇洗涤，80℃下干燥固化6h，得到末端含有氨基的硅胶。
氮气保护，称量上述干燥的巯基硅胶材料2.5g，氮气保护，溶于10mL 无水甲苯中，电磁搅拌。
取维生素B12(200μmol,272mg)溶于甲醇/水(2/8,20mL)溶液中,加 入聚乳酸(3mmol)的水溶液(35mL),混匀，加入巯基硅胶溶液中。氮气 保护下，加聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯交联剂(6mmol)，仅仅加入引发剂 AIBN(6mg)，室温搅拌1h，控制反应温度90℃，搅拌反应24h，停止反 应，减压抽滤，依次用10mL无水甲苯，10mL甲醇，15mL水，15mL甲醇 洗涤，60℃下干燥固化12h。取上述材料1g，溶于30mL甲醇溶剂中，放入 索氏提取器，在60℃下，萃取模板分子维生素B12，减压抽滤，依次用10mL 无水甲苯，15mL甲醇，15mL水，10mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化12h， 得到MIP-B12微球材料。
取MIP-B12材料100mg，使用乙腈/水/FA(1:1:0.01)活化，分散于水溶 剂中，加入维生素C(1mg/mL,5μL)和维生素B12(1mg/mL,5μL)标准品， 超声混匀，装填于固相萃取小柱中，用水溶液淋洗，甲醇溶剂洗脱，应用HPLC 检测淋洗液的成分为维生素C，洗脱液的成分为维生素B12。
取新鲜血浆80μL,加入乙腈(20μL)，离心去除蛋白质，取上清液备用。
取MIP-B12材料100mg，使用乙腈/水/FA(1:1:.01)活化，分散于水溶剂 中，加入处理后的血浆(35μL)超声混匀，用丙酮淋洗，用乙腈/水/FA(1:1: 0.01)洗脱，应用HPLC检测洗脱液的成分为维生素B12。
实施例4：
取聚丙烯酰胺微球5g(5μm，
)，置于100mL玻璃圆底烧瓶中， 加入50mL浓度为6M的盐酸加热回流1h，水洗至中性，在120℃下干燥8 h。
氮气保护，将干燥好的微球2.5g，溶于30mL无水甲苯中，取巯基丙基 三乙氧基硅烷试剂1.700g，溶于25mL无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，电 磁搅拌下，加入聚丙烯酰胺溶液中，并滴加三乙胺胺(3mmol)，加热回流， 反应24h，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水， 甲醇洗涤，80℃下干燥固化12h，得到末端含有氨基的硅胶。
氮气保护，称量上述干燥的巯基硅胶材料2.5g，氮气保护，溶于10mL 无水甲苯中，电磁搅拌。
取维生素B12(200μmol,272mg)溶于甲醇/水(2/8,20mL)溶液中,加 入葡聚糖(2.5mmol)的水溶液(25mL),混匀，加入巯基硅胶溶液中。氮气 保护下，加二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂(5mmol)，仅仅加入引发剂AIBN (6mg)，室温搅拌1h，控制反应温度90℃，搅拌反应24h，停止反应，减 压抽滤，依次用15mL无水甲苯，15mL甲醇，15mL水，15mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化6h。取上述材料1g，溶于30mL甲醇溶剂中，放入索氏提 取器，在60℃下，萃取模板分子维生素B12，减压抽滤，依次用10mL无水 甲苯，10mL甲醇，10mL水，10mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化8h，得 到MIP-B12微球材料。
取MIP-B12材料100mg，使用乙腈/水/FA(1:1:0.01)活化，分散于水溶 剂中，加入维生素C(1mg/mL,5μL)和维生素B12(1mg/mL,5μL)标准品， 超声混匀，装填于固相萃取小柱中，用水溶液淋洗，甲醇溶剂洗脱，应用HPLC 检测淋洗液的成分为维生素C，洗脱液的成分为维生素B12。
取新鲜奶粉100mg,加入水/乙腈(50/50,100mL)，离心去除不溶物， 取上清液备用。
取MIP-B12材料100mg，使用乙腈/水/FA(1:1:.01)活化，分散于水溶剂 中，加入奶粉上层清液(30μL)超声混匀，用水淋洗，用乙腈/水/FA(1:1:0.01) 洗脱，应用HPLC检测洗脱液的成分为维生素B12。
请参阅图1，图1是HPLC检测MIP-B12材料富集维生素B12与维生素C 混合样本的结果示意图。图1说明，维生素C在MIP-B12材料上没有保留(b)， 而维生素B12得到很好的保留(a)。实验结果验证了制备MIP-B12材料方法的可 行性，能够应用于样本中维生素B12的富集和分离。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发 明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人 员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其 中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，步骤包括：
步骤1：活化商品化的微球表面的羟基，通过化学键合的方式，修饰微球表面，得到末端含有活泼基团的微球；
步骤2：制备表面印迹微球，将官能团修饰后的微球溶于一定的溶剂中，引入预聚合功能单体的模板分子维生素B12和交联剂，通过自由基聚合的方法将维生素B12印迹在硅球表面；加热萃取去除模板分子，得到表面印迹维生素B12的材料MIP-B12；
步骤3：通过分散固相萃取d-SPE的方式，将制备得到的MIP-B12材料应用于富集生物学样本中的维生素B12，验证该方法所制备的表面分子印迹材料在富集实际样本中的可靠性。
2.根据权利要求书1所述制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，其特征在于：
所述商品化的微球包括：二氧化硅微球，粒径为2μm～10μm，孔径
比表面积为50～500m2/g，聚苯乙烯微球/聚丙烯酰胺微球的粒径为2μm～20μm，孔径为
比表面积为50～1000m2/g；
所述步骤1中微球表面的活化，具体方法包括：步骤a、将商品化微球加入盐酸或硝酸溶液，其中盐酸或硝酸溶液的体积浓度为1～10％，每克微球需要盐酸或硝酸的体积为2～30mL，加热回流搅拌1～48h，过滤，水洗至中性；
所述步骤1中通过化学键合的方式，微球表面的修饰，具体方法包括：步骤b、在惰气保护下，将活化的微球溶于一定的有机溶液中，量取氨丙基烷氧基硅烷、巯基丙基烷氧基硅烷、或者羟基丙基烷氧基硅烷试剂、烯丙基烷氧基硅烷试剂中的一种或两种以上的试剂溶于极性有机溶液，采用碱性催化剂控制反应溶液的pH；
搅拌反应4～24h，表面修饰后的微球经过离心，水、乙醇洗涤，在100～160℃干燥5～12h，得到末端含有活泼基团的微球材料；
所述步骤2制备表面印迹微球，具体方法包括：步骤c、在惰气保护下，将修饰后的微球材料溶于一定的有机溶剂中，加入维生素B12预聚合的功能单体，功能单体包括乳酸、葡聚糖、壳寡糖、环糊精、多巴胺、聚乙二醇其中的一种或者两种；
加入交联剂，包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、多巴胺或TEOS；
加入自由基引发剂，包括偶氮二异丁腈，过硫酸钾或过硫酸铵，在有机溶剂中热聚合，得到维生素B12分子嵌合在微球表面的材料；
所述步骤2中去除模板分子的具体方法包括：萃取，索氏提取及离心洗涤；
步骤d、将MIP-B12材料与待富集的样品混合，通过分散固相萃取的方式富集生物学样本中的维生素B12，以该材料对维生素B12的选择性为测定指标，验证该方法制备表面分子印迹材料在富集实际样本中的可靠性。
3.根据权利要求2所述的制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，其特征在于：
所述步骤a中每克处理好的微球对应于所述步骤b中使用的烷氧基硅烷的量为0.5mmol～5.0mmol；
所述步骤b中的惰气为高纯氮气，以四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或者二甲基亚砜(DMSO)等极性有机试剂中的一种或二种以上为溶剂；
氨丙基烷氧基硅烷是氨丙基三甲氧基硅烷或者氨丙基三乙氧基硅烷中的一种或二种，巯基丙基三甲氧基烷氧基硅烷试剂、羟基丙基三甲氧基烷氧基硅烷试剂的一种或者两种，硅烷试剂在极性溶剂中质量浓度为1～10％；
用三乙胺试剂或者二异丙基胺试剂中的一种控制溶液体系的pH值为7～9；控制搅拌速度，反应温度，并使用液相色谱和质谱联用的检测方法，监测硅烷试剂反应进行的程度。
4.根据权利要求2所述的制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，其特征在于：
所述步骤c中的惰气为高纯氮气，所述有机溶剂为苯、甲苯、THF、DMF或者DMSO中的一种或二种以上，所述步骤b中每克微球需要有机溶剂的体积为2～20mL；
维生素B12与功能单体的量之比为0.02～5，每克微球所加入的预聚合的维生素B12的量为0.01～8mmol/g硅胶；
交联剂与功能单体物质的量之比为0.01～5；每克微球加入的自由基引发剂的量为0.01～0.2mmol；反应温度控制在15～110℃，搅拌速率控制在60～1000r/min，反应时间控制在6～36h；
所得到的维生素B12分子嵌合在微球表面的材料经过离心，甲苯，甲醇，水，甲醇洗涤，在65～160℃下干燥5～24h。
5.根据权利要求2任一所述的制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，其特征在于：
所述步骤2中脱除模板分子B12的溶剂为甲醇，DMSO，DMF，THF中的一种试剂，所用的方法为索氏提取，萃取或者离心洗涤方法中的一种，每克微球与溶剂的比例为1～40g/mL；
脱除模板分子的温度控制在25～200℃，萃取时间控制在5～24h，得到表面印迹有维生素B12分子的微球材料MIP-B12经过离心，萃取溶剂洗涤，甲醇，水，甲醇洗涤，在65～160℃干燥5～12h。
6.根据权利要求2任一所述的制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，其特征在于：
所述步骤d中，将MIP-B12材料溶于一定的有机溶剂中活化，离心去除上层活化溶剂，得到活化后的微球材料；
将活化后的微球材料溶解于一定的溶剂中，溶剂为水，甲醇，乙醇，或者乙腈试剂的一种或者两种以上；
将活化后的微球材料与待富集的样本溶液混合，超声匀浆，装填在固相萃取小柱中，柱管体积为0.5～10mL，通过淋洗，洗脱的方法分离富集实际样品中的维生素B12；
其中活化MIP-B12的方法是使用H2O/甲醇/甲酸，用量比例为1:1:0.01或者H2O/乙腈/甲酸，用量比例为1:1:0.01，每克MIP-B12材料所使用的活化溶剂2～15mL；
待富集的样本溶液是指样本溶于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯或者水溶液中，体积控制在0.1～100μL；
淋洗用的溶液为水，甲醇，乙醇，乙腈，丙酮，磷酸盐缓冲溶液中的一种或者两种以上，淋洗溶液的体积为固相萃取柱体积的0.1～5倍；
洗脱用的溶液为水，甲醇，乙醇，乙腈中的一种或者两种溶液，通过甲酸或者乙酸调控溶液的pH为2～8，洗脱溶液的体积为固相萃取柱体积的0.1～5倍；
所用的样品为标准品维生素B12，蔬菜，牛奶，奶粉，母乳、血清等。
7.根据权利要求6所述的制备维生素B12表面分子印迹微球的方法，其特征在于：
所述步骤d中选择吸附维生素B12的实验方法为：将标准品维生素B12，混合有标准品维生素B12及其他维生素的样品，通过d-SPE的方式分离富集，检测洗脱溶液中维生素B12的含量，评价该材料的选择性，检测限等参数，验证该方法制备表面分子印迹材料的可靠性；
检测洗脱溶液中维生素B12含量的仪器为紫外可见分光光度计或者HPLC；具体为检测维生素B12的特征性吸收波长下的吸光度，或者通过HPLC的UV检测器检测维生素B12的出峰面积，对维生素B12进行定量分析。
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