CN100586965C - 苯二氮类药物分子印迹固相萃取剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

苯二氮类药物分子印迹固相萃取剂的制备方法，首先将丙烯酸类功能单体、苯二氮类药物模板分子溶于致孔剂中，振荡预作用后，在所得溶液中加入交联剂、引发剂，通氮气排氧，抽真空封管，光引发或热引发反应得到分子印迹固相萃取剂粗品，然后再经洗脱、洗涤和干燥获得萃取剂的纯品。本方法与现有方法相比步骤少、产率高、可降低模板分子的包埋，产品对苯二氮类药物均有特异性识别，应用时能克服目前方法中杂质干扰严重的缺点，快速、定性、定量地进行检测。

Description

苯二氮类药物分子印迹固相萃取剂的制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种苯二氮

类药物的分子印迹固相萃取剂的制备方法，更具体地说，是涉及一种对苯二氮

类药物具有专一识别性能的固相萃取剂的制备方法。

二、背景技术

苯二氮

类药物具有镇静、催眠、松弛中枢骨骼肌作用。该药物急性中毒的临床表现主要在肌肉和中枢神经系统方面，出现肌无力、肌张力低下、共济运动失调、发音困难、嗜睡等症状，严重中毒时表现为昏迷、瞳孔散大、呼吸抑制、休克，甚至导致死亡。以安定为例，血液浓度在1-30μg/mL就表现出中毒症状，浓度超过50μg/mL将导致死亡。因此准确快速诊断是制定有效抢救措施的关键。

目前，国内外常用的分离富集方法，多是以液液萃取提取体液中的药物，干燥后再进行测定，该方法需要消耗较大量的有机溶剂，而且急性中毒送检的样品一般是血液、胃液、呕吐物或尿液等，成分复杂，液液萃取法的选择性不高，测定时杂质干扰严重，无法准确定性、定量。另外，亦有以固相萃取技术对体液进行前处理的方法，但普通的吸附材料，如C18等，选择性比较差，同样无法准确的定性、定量。

近年来分子印迹聚合物的有关文献日益增多，但目前没有以苯二氮

类药物为模板、并用沉淀法制备的相关技术。现有的技术一般以本体聚合法合成分子印迹聚合物，得到的产品为柱状或块状，必须经过研磨、筛选等步骤，在产率上带来较大的损失，而且其粒径往往在几十个微米以上，很不均匀，模板分子被包埋在聚合物内部，在洗脱时难以完全洗脱，在产品以后的实际使用中未洗脱的模板分子会发生渗漏，令实际样品无法准确定量测定。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种苯二氮类药物的分子印迹固相萃取剂的制备方法，它与现在常用的本体聚合方法相比可以减少制备步骤、提高产率、降低模板分子的包埋，所获得的萃取剂对该类药物均有特异性识别，在实际应用时能克服目前通用方法中杂质干扰严重的缺点，快速、定性、定量地检测此类药物。

具体的讲，本发明包括如下步骤：

(1)分子印迹固相萃取剂粗品的合成：将一种丙烯酸类功能单体、一种苯二氮

类药物模板分子溶于致孔剂中，振荡预作用20～40min，在所得溶液中加入交联剂、引发剂，通氮气排氧10～30min，抽真空封管，光引发或热引发反应得到分子印迹固相萃取剂粗品，其中各反应物的用量(摩尔比)为：模板分子∶功能单体∶交联剂＝1∶2～6∶10～40，引发剂的质量为交联剂质量的1～2％，致孔剂的体积占总体积的90～99％；

(2)粗品纯化：将步骤(1)得到的粗品干燥后加入有机溶剂洗提，洗提液为甲醇/水(表示甲醇和水的混合液，后面内容同理)、乙腈/水、乙酸/乙腈、或乙酸/甲醇等，加热回流，洗脱模板分子，得到初步纯化后的萃取剂；

(3)洗涤：将初步纯化后的萃取剂干燥后再用有机溶剂甲醇或乙腈洗去步骤(2)中残留的有机溶剂；

(4)干燥：将步骤(3)所得产品干燥即可得到所要制备的固相萃取剂纯品。

在步骤(1)中，所述的丙烯酸类功能单体采用丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)或三氟甲基丙烯酸(TFMAA)。模板分子为苯二氮

类药物的一种，如安定(地西泮，Diazepam，)、氯硝西泮(Clonazepam)、硝西泮(Nitrazepam)、艾司唑仑(Estazolam)、阿普唑仑(Alprazolam)或三唑仑(Triazolam)。致孔剂为一种或两种强极性或弱极性溶剂，如二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙腈、甲苯/氯仿、或乙腈/氯仿等，优选是甲苯/氯仿(3∶1，V/V)或乙腈/氯仿(3∶1，V/V)。交联剂采用常用交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)或三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)。引发剂采用偶氮二异丁腈(AIBN)。反应条件为50～70℃水浴加热引发或0-10℃冰水浴紫外光引发，反应时间为16～72h。

在步骤(2)中，所述的有机溶剂的体积为致孔剂体积的50～150倍，溶剂中两种组分的体积比为：前一组分∶后一组分＝1～3∶9～7，干燥时采用真空干燥箱50～70℃抽真空干燥至恒重。

在步骤(3)中，所述的有机溶剂的用量以及干燥方法同步骤(2)，加热回流，若在溶剂中能检测(采用常用的高效液相色谱方法)到模板分子，则重复步骤(2)、(3)直到溶剂中检测不到模板分子为止。

在步骤(4)中，所述的干燥方法同步骤(2)。

本发明的原理如下：模板分子和功能单体在一定条件下形成可逆复合物，加入交联剂，在引发剂的作用下，同功能单体的双键共聚形成高交联的聚合物，固定模板分子，用洗提液将模板分子抽提出来，得到具有与模板分子匹配的特定空间或大小的孔穴。其基本原理如图1所示。

与现有技术相比，本发明的优点或效果在于：

1.在合成方法上采用沉淀聚合，增加了溶剂的量，得到的分子印迹聚合物为粉末状沉淀，粒径0.3～4μm，大小均一，使用时无须研磨筛分，产率较高；

2.由于采用了沉淀聚合的方法，降低了模板分子包埋在聚合物内部难以洗脱的缺点，对以后的实际使用没有渗漏的影响；

3.本发明只以苯二氮

类药物的一种(如安定)作为模板分子，但合成的产品对与其结构相似的苯二氮

类药物均有特异性吸附；

4.在实际应用上，与普通的固相萃取、液液萃取等方法相比，分子印迹聚合物对模板分子及其类似物，即所有的苯二氮

类药物均有特异性吸附，具有很高的选择性和灵敏度，彻底排除了体液中杂质的干扰。

四、附图说明

图1为本发明方法的合成原理示意图。

图2为实施例1合成的分子印迹固相萃取剂的形态图。

图3为实施例2合成的分子印迹固相萃取剂的形态图。

图4为实施例3合成的分子印迹固相萃取剂的形态图。

图5为实施例1所得产品萃取效果的高效液相色谱(HPLC)图。

图6为实施例2所得产品萃取效果的高效液相色谱(HPLC)图。

图7为实施例3所得产品萃取效果的高效液相色谱(HPLC)图。

五、具体实施方式

图1为本发明方法的合成原理示意图，其中a为功能单体，b为交联剂，c为模板分子，1表示模板分子与功能单体形成复合物；2表示交联剂与功能单体交联固定模板分子，3表示抽提洗去模板分子，4表示对模板分子的识别。

实施例1

称取模板分子安定(Diazepam，Dz)0.25mmol，功能单体甲基丙烯酸(MAA)1.5mmol于三角锥瓶中，加入20mL甲苯/氯仿(3∶1，V/V)中，振荡预作用40min。加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)5mmol，引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)10mg，通氮气排氧20min，转移溶液于安培瓶中，抽真空封管，50～70℃水浴加热反应16h；产品干燥后加入致孔剂体积75倍的甲醇/乙酸(8∶2，V/V)150mL洗提液，加热回流；更换有机溶剂，选用甲醇加热回流，洗去残留乙酸，60～70℃抽真空干燥至恒重，称量，计算其产率为92.4％。在此实验中，模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1∶6∶20，致孔剂的体积约占总体积的95％，引发剂质量为交联剂质量的1％，聚合物形态如图2所示。

实施例2

其它同实施例1，所不同的是：功能单体为三氟甲基丙烯酸(TFMAA)，为氯硝西泮(Clonazepam)，功能单体与模板分子预作用时间为20min，交联剂为三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)，模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为：＝1∶2∶10，致孔剂为乙腈/氯仿(3∶1，V/V)，约占总体积的99％，引发剂质量为交联剂质量的2％，反应条件为0～10℃冰水浴紫外光引发反应72h；初步纯化用洗提液为乙腈/水(3∶7，V/V)，体积为致孔剂体积的50倍，选用乙腈加热回流，洗去残留的水，50～60℃干燥至恒重，称量，计算其产率为91.0％。聚合物形态图如图3所示。

实施例3

其它同实施例1，所不同的是：模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1∶4∶40，功能单体与模板分子预作用时间为30min，致孔剂为氯仿，体积约占总体积的90％，反应条件为50～70℃水浴加热引发反应48h；初步纯化用洗提液为甲醇/乙酸(9∶1，V/V)，体积为致孔剂体积的100倍，计算其产率为95.7％。聚合物形态图如图4所示。

由图2、3和4可知，合成的聚合物产品颗粒较小，粒径均匀，无须研磨、筛分，避免不必要的损失，因此其产率较高，降低了模板分子在聚合物内部的包埋。

为了验证所合成的产品的萃取效果，特做实验如下：

实验1：称取100mg实施例1的产品，用甲醇作载体，装到一根空的固相萃取柱中(SUPELCO，内径0.4cm)，得到固相萃取柱(MISPE柱)，10×1mL甲醇活化(表示每次用1mL，操作10次。后面同理)，10×1mL乙腈/水1∶9(V/V)平衡。1mL浓度均为1μg/mL的氯硝西泮、阿普唑仑、安定的乙腈/水1∶9(V/V)溶液装载，3mL乙腈/水1∶9(V/V)溶液洗涤，2×1mL乙腈/水4∶6(V/V)洗脱，N₂吹干洗脱液，残渣用1mL甲醇溶解，20μL进样，HPLC。色谱图如图5所示。

在图5中，1为氯硝西泮，2为阿普唑仑，3为安定；“A”表示经MISPE处理后的色谱曲线；“B”表示1μg/mL甲醇标准溶液的色谱曲线，氯硝西泮、阿普唑仑、安定的回收率分别为89.6％、93.8％、94.9％。该产品除了对模板分子安定有特异性吸附，对与其结构相似的氯硝西泮、阿普唑仑也有选择性吸附。

实验2：其它同实验1，所不同的是装载液为处理后的血样，血样处理步骤如下：吸取血清1mL，加入氯硝西泮、阿普唑仑、安定使其浓度为10μg/mL，加入1.5mL乙腈沉淀蛋白，静置离心。吸取上层清液于10mL容量瓶中，水定容，得处理后血样(其中三种溶质的浓度均为1μg/mL，溶剂为体积比约为15∶85的乙腈/水)。用作固相萃取剂的是实施例2中所制备的产品。洗脱液不直接吹干，而是置于5mL容量瓶定容。色谱图如图6所示。

在图6中，1为氯硝西泮，2为阿普唑仑，3为安定，“A”表示经MISPE处理后的色谱曲线，“B”表示1μg/mL甲醇标准溶液的色谱曲线。氯硝西泮、阿普唑仑、安定的平均回收率分别为93.8％、94.0％、101.0％。比较可知，用血清做实际样品实验时，对杂质a、b、c均无吸附作用。

实验3：其它同实验2，所不同的是血样处理时用成分更为复杂的全血，只加入安定，加入1mL乙腈沉淀蛋白。用作固相萃取剂的是实施例3中所制备的产品。洗脱用溶剂为3×1mL甲醇/乙酸6∶4(V/V)。色谱图如图7所示。

在图7中，“A”表示经MISPE处理后的色谱曲线；“B”表示乙腈沉淀蛋白后直接进样的色谱曲线，三次测定安定的平均回收率为100.3％。比较可知，用全血做实际样品实验时，经MIP-SPE处理后的血样，杂质大大减少，特别是对安定的测定有干扰的杂质a完全无吸附，使安定达到基线分离，可进行定量检测。

综上所述，本发明制备了一种对苯二氮

类药物有特异性识别的分子印迹固相萃取剂，该方法与现有的本体聚合方法相比可以减少制备步骤、提高产率、降低模板分子的包埋，所制得的萃取剂对该类药物均有特异性识别，在实际应用时能克服目前通用方法中杂质干扰严重的缺点，在利用高效液相色谱进行检测时能达到基线分离，快速、定性、定量地检测此类药物。

Claims (7)

1、一种苯二氮

类药物分子印迹固相萃取剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)分子印迹固相萃取剂粗品的合成：将功能单体和模板分子溶于致孔剂中，振荡预作用20～40min，在所得溶液中加入交联剂、引发剂，通氮气排氧10～30min，抽真空封管，光引发或热引发反应得到分子印迹固相萃取剂粗品，其中各反应物的摩尔比为：模板分子∶功能单体∶交联剂＝1∶2～6∶10～40，引发剂的质量为交联剂质量的1～2％，致孔剂的体积占总体积的90～99％；所述的功能单体采用丙烯酸、甲基丙烯酸或三氟甲基丙烯酸中的一种；所述的模板分子为安定、氯硝西泮、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑或三唑仑中的一种；

(2)粗品纯化：将步骤(1)得到的粗品干燥后加入洗提液中洗提，洗提液为甲醇的水溶液、乙腈的水溶液、乙酸与乙腈的混合溶液或乙酸与甲醇的混合溶液，加热回流，洗脱模板分子，得到初步纯化的萃取剂；

(3)洗涤：将初步纯化的萃取剂干燥后再用有机溶剂甲醇或乙腈洗去步骤(2)中残留的有机溶剂；

(4)干燥：将步骤(3)所得产品干燥即可得到所要制备的固相萃取剂纯品。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的致孔剂为二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙腈、甲苯与氯仿的混合溶液或乙腈与氯仿的混合溶液；交联剂采用乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；引发剂采用偶氮二异丁腈(AIBN)；反应条件为50～70℃水浴加热引发或0-10℃冰水浴紫外光引发，反应时间为16～72h。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的致孔剂为甲苯与氯仿的混合溶液，体积比为甲苯∶氯仿＝3∶1；或乙腈与氯仿的混合溶液，体积比为乙腈∶氯仿＝3∶1。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述洗提液的体积为致孔剂体积的50～150倍，洗提液中两种组分的体积比为：前一组分∶后一组分＝1～3∶9～7。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的有机溶剂的体积为致孔剂体积的50～150倍。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(3)中，加热回流后，采用高效液相色谱方法检测溶剂中是否含有模板分子，如果有则重复步骤(2)和步骤(3)，直到溶剂中检测不到模板分子为止。

7、如权利要求1～6任一权利要求所述的方法，其特征在于：在步骤(2)、(3)和(4)中，干燥时采用真空干燥箱50～70℃抽真空干燥至恒重。

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