CN105353007A - 一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征是：首先将玻碳电极用硅烷偶联剂和纳米金修饰。在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，二甲基丙烯酸乙二醇酯：12~22%，甲基丙烯酸甲酯：2.5~10%，N,N-二甲基甲酰胺：63~83%，偶氮二异丁酸二甲酯：1.0~2.0%，香豆素：1.0~4.0%，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，75~80℃搅拌反应10~12h，用乙醇与盐酸混合溶液除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物。再将聚合物涂到修饰电极上，制得香豆素分子印迹电化学传感器，该传感器与电化学工作站连接构成能够专一模板分子识别传感器。本发明制得的传感器成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速，可反复使用。

Description

一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品、食品、生物样品中的香豆素技术。

背景技术

香豆素（香豆内酯）广泛存在于天然黑香豆、香蛇鞭菊、野香荚兰和兰花等香车草植物中，可用于制造香料，作为定香剂。香豆素类药物与维他命K的结构相似，是一类口服抗凝药物，双香豆素还可以用于对付鼠害。香豆素类化合物具有多种衍生物，而且不同的衍生物具有不同的药用价值，该类化合物的母核结构有简单香豆素类、呋喃香豆素类、吡喃香豆素类三种类型，是中药中的一类重要的活性成分，如补骨脂内酯（psolalen）具有光敏活性作用，用于治疗白斑病。奥斯脑(osthole)是来源于蛇床子和毛当归的一种香豆素活性成分，具有抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的药理活性。海棠果内酯(calophylloide)具有很强的抗凝血作用。滨蒿内酯(scoparon)是生药茵陈蒿平肝利胆、松弛平滑的主要活性成分，所以准确识别香豆素对确定药物活性十分重要。香豆素的化学结构为邻羟基硅酸内酯，其分子式为C₉H₆O₂，相对分子质量为146.14。香豆素不溶于水，较易溶于热水。纯品无色片状或粉末状结晶。目前，检测香豆素的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱，色谱法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，也限制了其应用。另外，由于香豆素类的衍生物的分子结构十分相近很难分开，测定时互相干扰，准确检测香豆素很困难。因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便使用的检测香豆素的方法十分重要。

分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。

依据此技术制备的分子印迹电化学传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全中的香豆素含量准确定量测定十分必要，对于香豆素生产和药理研究也具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，主要是以香豆素为模板，在玻碳电极表面通过硅烷偶联剂、纳米金粒子的修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法制备香豆素分子印迹电化学传感器。

仪器与试剂

CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），玻碳电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）

γ-巯丙基三乙氧基硅烷；无水乙醇；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、甲基丙烯酸甲酯；偶氮二异丁酸二甲酯，N,N-二甲基甲酰胺，香豆素；氯金酸、水合肼、明胶；磷酸缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，特征在于该方法具有以下工艺步骤：

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.5μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为20~30%的γ-巯丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，室温浸泡4~6h，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.12mol/L氯金酸溶液中，室温下浸泡10~12h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；

（3）香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，二甲基丙烯酸乙二醇酯：12~22%，甲基丙烯酸甲酯：2.5~10%，N,N-二甲基甲酰胺：63~83%，偶氮二异丁酸二甲酯：1.0~2.0%，香豆素：1.0~4.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，75~80℃搅拌反应10~12h，将得到的产物用乙醇与盐酸（体积比为乙醇：盐酸为20:1）混合溶液萃取3~5h，除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物；

（4）香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的明胶溶液中，制得25g/L的香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μL滴加到步骤（2）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得香豆素分子印迹电化学传感器。

本发明的优点及效果是：

本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，在纳米金修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无纳米金修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的香豆素分子印迹电化学传感器的响应大大提高。该印迹传感器对香豆素表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与香豆素的浓度在5.0×10^-8~1.0×10^-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为4.2×10^-8mol/L将本发明制备的香豆素分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中香豆素的检测中，回收率在95.98~105.1%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。

具体实施方式

实施例1

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.5μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为25%的γ-巯丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，室温浸泡5h，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.12mol/L氯金酸溶液中，室温下浸泡11h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；

（3）香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，17mL的二甲基丙烯酸乙二醇酯，6mL甲基丙烯酸甲酯，72mLN,N-二甲基甲酰胺，1.5g偶氮二异丁酸二甲酯，3.5g香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，75℃搅拌反应11h，将得到的产物用乙醇：盐酸体积比为20:1混合溶液萃取4h，除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物；

（4）香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的明胶溶液中，制得25g/L的香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例2

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.5μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为20%的γ-巯丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，室温浸泡6h，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.12mol/L氯金酸溶液中，室温下浸泡10h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；

（3）香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，20mL的二甲基丙烯酸乙二醇酯，4mL甲基丙烯酸甲酯，73mLN,N-二甲基甲酰胺，1.0g偶氮二异丁酸二甲酯，2.0g香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，80℃搅拌反应12h，将得到的产物用乙醇：盐酸体积比为20:1混合溶液萃取3h，除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物；

（4）香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的明胶溶液中，制得25g/L的香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例3

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.5μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为00%的γ-巯丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，室温浸泡4h，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.12mol/L氯金酸溶液中，室温下浸泡12h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；

（3）香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，12mL的二甲基丙烯酸乙二醇酯，3mL甲基丙烯酸甲酯，80mLN,N-二甲基甲酰胺，2.0g偶氮二异丁酸二甲酯，3.0g香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，78℃搅拌反应10h，将得到的产物用乙醇：盐酸体积比为20:1混合溶液萃取5h，除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物；

（4）香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的明胶溶液中，制得25g/L的香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例4

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.5μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为22%的γ-巯丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，室温浸泡4.5h，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.12mol/L氯金酸溶液中，室温下浸泡10.5h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；

（3）香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，22mL的二甲基丙烯酸乙二醇酯，2.5mL甲基丙烯酸甲酯，70mLN,N-二甲基甲酰胺，1.5g偶氮二异丁酸二甲酯，4.0g香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，75℃搅拌反应10.5h，将得到的产物用乙醇：盐酸体积比为20:1混合溶液萃取3.5h，除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物；

（4）香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的明胶溶液中，制得25g/L的香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例5

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.5μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为28%的γ-巯丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，室温浸泡6h，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.12mol/L氯金酸溶液中，室温下浸泡11.5h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；

（3）香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，15mL的二甲基丙烯酸乙二醇酯，10mL甲基丙烯酸甲酯，69mLN,N-二甲基甲酰胺，2.0g偶氮二异丁酸二甲酯，2.5g香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，80℃搅拌反应11.5h，将得到的产物用乙醇：盐酸体积比为20:1混合溶液萃取4.5h，除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物；

（4）香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的明胶溶液中，制得25g/L的香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例6

将上述实施例1~5所制备的香豆素分子印迹电化学传感器，用于香豆素的检测，步骤如下：

（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的香豆素标准溶液，底液为pH6.0的磷酸盐缓冲溶液；

（2）工作曲线绘制：将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中，采用循环伏安法在-0.30~0.3V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I ₀ ，含有不同浓度的香豆素标准溶液的响应电流即为I _i ，响应电流降低的差值为△I=I ₀ -I _i ，△I与香豆素标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△I~c工作曲线；

（3）香豆素的检测：用待测样品代替步骤（1）中的香豆素标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中香豆素的含量；

所述K₃[Fe(CN)₆]溶液的浓度为6mmol/L；

所述pH6.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度在50mmol/L。

香豆素的浓度在5.0×10^-8~1.0×10^-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为4.2×10^-8mol/L将本发明制备的香豆素分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中香豆素的检测中，回收率在95.98~105.1%之间。

Claims (5)

1.一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征是：在于该方法具有以下工艺步骤：

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.5μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为20~30%的γ-巯丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，室温浸泡4~6h，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.12mol/L氯金酸溶液中，室温下浸泡10~12h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的水合肼溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；

（3）香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，二甲基丙烯酸乙二醇酯：12~22%，甲基丙烯酸甲酯：2.5~10%，N,N-二甲基甲酰胺：63~83%，偶氮二异丁酸二甲酯：1.0~2.0%，香豆素：1.0~4.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通氮气除氧10min，氮气氛围，75~80℃搅拌反应10~12h，将得到的产物用乙醇与盐酸（体积比为乙醇：盐酸为20：1）混合溶液萃取3~5h，除去模板分子，干燥，即得香豆素分子印迹聚合物；

（4）香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的明胶溶液中，制得25g/L的香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液12μL滴加到步骤（2）制备的纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得香豆素分子印迹电化学传感器。

2.根据权利要求1中所述的一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述的二甲基丙烯酸乙二醇酯与甲基丙烯酸甲酯摩尔比为2：1。

3.根据权利要求1中所述的一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述的乙醇与盐酸体积比为20：1。

4.根据权利要求1中所述的一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述的氮气氛围为升温后氮气一直通入直到反应结束。

5.根据权利要求1中所述的一种香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法所制备的香豆素分子印迹电化学传感器。