CN103954675A - 一种s-腺苷甲硫氨酸分子印迹传感器的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种SAM分子印迹传感器的制备方法，其特征是：首先将玻碳电极用纳米金和碳纳米管修饰，溶胶-凝胶印迹技术、层层自组装法和电聚合法相结合，在纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器，本发明制备的SAM分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对SAM表现出较高的亲和性和选择性。该SAM分子印迹传感器与电化学工作站连接构成能够专一模板分子识别传感器。本发明制得的传感器成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速，可反复使用。

Description

一种S-腺苷甲硫氨酸分子印迹传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种S-腺苷甲硫氨酸分子印迹传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品、生物样品中的S-腺苷甲硫氨酸技术。

背景技术

细胞内的甲基化反应存在通用甲基供体—S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，AdoMet，SAM），SAM含有活性甲基，细胞内几乎所有用于甲基化修饰的甲基都来自SAM甲硫高能键。由于甲基化反应的广泛性，可以说，SAM是细胞内参加反应的重要性仅次于ATP的一种辅酶，细胞内SAM浓度的微小改变，便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响。SAM在细菌体内主要是由SAM合成酶（MetK）通过甲硫氨酸(Met)和ATP来合成。当E.coli的SAM合成酶水平下降，造成细胞内甲基供体SAM缺乏时，细胞就不会正常分裂。如果将来自T3噬菌体的AdoMet水解酶基因导入E.coli菌体细胞，使胞内SAM水平下降时，大肠埃希氏菌也形成了不分裂的长丝状菌体。进一步研究表明，丝状菌体中，引发E.coli细胞分裂的Z环复合体装配可以正常起始，但不会完成，而当亮氨酸调节的SAM合成酶水平恢复正常，细胞内甲基供体SAM不再缺乏时，细胞分裂也随即恢复正常。很明显，细菌细胞的生长分裂与胞内SAM浓度是密切相关的。

通用甲基供体SAM受甲基转移酶催化去甲基后，生成的通用产物是S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocystein，SAH），SAH被发现对胞内蛋白质和核酸的甲基化过程具有普遍的反馈抑制作用，是转甲基化反应的有效竞争性抑制剂。在哺乳动物细胞内，SAH通过SAH水解酶（SAH hydrolase，SAHH）催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸（Parveen, N.; Cornell, K. A.. Methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, a critical enzyme for bacterial metabolism. Mol Microbiol, 20117，9(1)：7-20,），而在大多数病原微生物的细胞内，SAH的代谢则采用完全不同的方式——通过S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocystein nucleosidase，SAHN）催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH进一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的作用下生成高半胱氨酸和4,5二羟-2,3-乙酰基丙酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD），高半胱氨酸最后通过几种甲硫氨酸合成酶（MetH、MetE）重新生成SAM的前体——甲硫氨酸，或者经过多步酶催化生成半胱氨酸。

目前，已报道的测定SAM的方法有HPLC、分光光度法。都依赖甲基转移酶、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶和S-核糖基高半胱氨酸酶的催化作用将SAM分解为高半胱氨酸，再对高半胱氨酸显色反应，操作比较繁琐，准确度也不理想。由于样品的基质比较复杂，给检测带来了困难，因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便、快速的检测SAM的方法十分重要的意义。

分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。

依据此技术制备的分子印迹传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全中的SAM含量准确定量测定十分必要，对于SAM生产和药理研究也具有重要的意义。

 

发明内容

本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种SAM分子印迹传感器的制备方法，主要是以SAM为模板，在玻碳电极表面通过γ-巯丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、碳纳米管及金纳米粒子之间的电化学作用而制备的分子印迹传感器。

仪器与试剂

CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），玻碳电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。

碳纳米管（孔径2~50nm）；γ-巯丙基三乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷；2-乙氧基乙醚，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；氯金酸；SAM；高锰酸钾、硫酸、硝酸钠、磷酸缓冲溶液，所用试剂均为分析纯。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种SAM分子印迹传感器的制备方法，特征在于该方法具有以下工艺步骤：

（1）纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氩气吹干，在玻碳电极表面滴加5~10μL碳纳米管的N,N-二甲基甲酰胺分散液（0.5g/L），置于红外灯下，挥发干溶剂后，放入0.1mol/L氯金酸溶液浸泡20~30h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极；

（2）氧化碳纳米管的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入39~62%浓硫酸，0.5~3.0%碳纳米管，1.0~8.0%高锰酸钾，超声分散60~90min，缓慢加入30~55%去离子水，各组分含量之和为百分之百，然后在80~90℃搅拌反应6~8 h，冷却至室温，过滤，用1 mol/LHCl洗涤，再用去离子水反复洗涤至滤液为中性，干燥，得到氧化碳纳米管；

（3）印迹溶胶的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，γ-巯丙基三乙氧基硅烷：7~18%，甲基三甲氧基硅烷：1.0~4.0%，2-乙氧基乙醚：55~78%，0.1 mol/LHCl：8~18%，去离子水：1.0~8.0%，搅拌1~2 h，再加入SAM：0.05~1.0%，各组分含量之和为百分之百，继续搅拌20~30min，即得印迹溶胶；

（4）SAM分子印迹传感器的制备方法：取步骤（3）的印迹溶胶于小烧杯中，将步骤（1）制备的碳纳米管修饰玻碳电极放入其中，在-0.20~0.4V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描20~30圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测SAM的分子印迹传感器。

本发明的优点及效果是：

本发明将溶胶-凝胶印迹技术、纳米金粒子、层层自组装法和电聚合法相结合，在碳纳米管修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无碳纳米管修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的SAM分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对SAM表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与SAM的浓度在3.0×10^-7~2.0×10^-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为3.69×10^-8mol/L将本发明制备的SAM分子印迹传感器成功用于药品、食品中SAM的检测中，回收率在96.12~104.8%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。

具体实施方式

实施例1

（1）纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氩气吹干，在玻碳电极表面滴加7μL碳纳米管的N,N-二甲基甲酰胺分散液（0.5g/L），置于红外灯下，挥发干溶剂后，放入0.1mol/L氯金酸溶液浸泡24h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极；

（2）氧化碳纳米管的制备：在反应器中，分别加入10mL浓硫酸，0.5g碳纳米管，2.0g高锰酸钾，超声分散80min，缓慢加入19mL去离子水，然后在85℃搅拌反应7 h，冷却至室温，过滤，用1 mol/LHCl洗涤，再用去离子水反复洗涤至滤液为中性，干燥，得到氧化碳纳米管；

（3）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，12 mLγ-巯丙基三乙氧基硅烷，1.2mL甲基三甲氧基硅烷，70mL2-乙氧基乙醚，10mL0.1 mol/LHCl，6.5mL去离子水，搅拌1.5 h，再加入0.3g SAM，继续搅拌25min，即得印迹溶胶；

（4）SAM分子印迹传感器的制备方法：取步骤（3）的印迹溶胶于小烧杯中，将步骤（1）制备的碳纳米管修饰玻碳电极放入其中，在-0.20~0.4V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描25圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测SAM的分子印迹传感器。

实施例2

（1）纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氩气吹干，在玻碳电极表面滴加5μL碳纳米管的N,N-二甲基甲酰胺分散液（0.5g/L），置于红外灯下，挥发干溶剂后，放入0.1mol/L氯金酸溶液浸泡30h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极；

（2）氧化碳纳米管的制备：在反应器中，分别加入20mL浓硫酸，1.5g碳纳米管，2.0g高锰酸钾，超声分散60min，缓慢加入20mL去离子水，然后在80℃搅拌反应8h，冷却至室温，过滤，用1 mol/LHCl洗涤，再用去离子水反复洗涤至滤液为中性，干燥，得到氧化碳纳米管；

（3）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，5 mLγ-巯丙基三乙氧基硅烷，0.5mL甲基三甲氧基硅烷，50mL2-乙氧基乙醚，5.0mL0.1 mol/LHCl，2.0mL去离子水，搅拌1 h，再加入0.1g SAM，继续搅拌30min，即得印迹溶胶；

（4）SAM分子印迹传感器的制备方法：取步骤（3）的印迹溶胶于小烧杯中，将步骤（1）制备的碳纳米管修饰玻碳电极放入其中，在-0.20~0.4V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描20圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测SAM的分子印迹传感器。

实施例3

（1）纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氩气吹干，在玻碳电极表面滴加10μL碳纳米管的N,N-二甲基甲酰胺分散液（0.5g/L），置于红外灯下，挥发干溶剂后，放入0.1mol/L氯金酸溶液浸泡20h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极；

（2）氧化碳纳米管的制备：在反应器中，分别加入15mL浓硫酸，0.5g碳纳米管，3.0g高锰酸钾，超声分散90min，缓慢加入22mL去离子水，然后在90℃搅拌反应6h，冷却至室温，过滤，用1 mol/LHCl洗涤，再用去离子水反复洗涤至滤液为中性，干燥，得到氧化碳纳米管；

（3）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，10 mLγ-巯丙基三乙氧基硅烷，1.0mL甲基三甲氧基硅烷，35mL2-乙氧基乙醚，7.0mL0.1 mol/LHCl，2.0mL去离子水，搅拌2h，再加入0.2g SAM，继续搅拌20min，即得印迹溶胶；

（4）SAM分子印迹传感器的制备方法：取步骤（3）的印迹溶胶于小烧杯中，将步骤（1）制备的碳纳米管修饰玻碳电极放入其中，在-0.20~0.4V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描30圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测SAM的分子印迹传感器。

实施例4

（1）纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氩气吹干，在玻碳电极表面滴加8μL碳纳米管的N,N-二甲基甲酰胺分散液（0.5g/L），置于红外灯下，挥发干溶剂后，放入0.1mol/L氯金酸溶液浸泡28h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极；

（2）氧化碳纳米管的制备：在反应器中，分别加入10mL浓硫酸，1.0g碳纳米管，4.0g高锰酸钾，超声分散70min，缓慢加入24mL去离子水，然后在85℃搅拌反应7h，冷却至室温，过滤，用1 mol/LHCl洗涤，再用去离子水反复洗涤至滤液为中性，干燥，得到氧化碳纳米管；

（3）印迹溶胶的制备：在反应器中，分别加入，10 mLγ-巯丙基三乙氧基硅烷，1.2mL甲基三甲氧基硅烷，35mL2-乙氧基乙醚，8.0mL0.1 mol/LHCl，2.0mL去离子水，搅拌2h，再加入0.1g SAM，继续搅拌20min，即得印迹溶胶；

（4）SAM分子印迹传感器的制备方法：取步骤（3）的印迹溶胶于小烧杯中，将步骤（1）制备的碳纳米管修饰玻碳电极放入其中，在-0.20~0.4V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描25圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测SAM的分子印迹传感器。

实施例5

将上述实施例1~4所制备的SAM分子印迹传感器，用于SAM的检测，步骤如下：

（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的SAM标准溶液，底液为pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液；

（2）工作曲线绘制：将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统， 连接CHI660B电化学工作站，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中，采用循环伏安法在-0.20~0.4V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I ₀ ，含有不同浓度的SAM标准溶液的响应电流即为I _i  ，响应电流降低的差值为△I=I ₀ -I _i ，△I与SAM标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△I ~c工作曲线；

（3）SAM的检测：用待测样品代替步骤（1）中的SAM标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中SAM的含量；

所述K₃[Fe(CN)₆]溶液的浓度为5mmol/L；

所述pH7.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度在70mmol/L。

响应电流与SAM的浓度在3.0×10^-7~2.0×10^-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为3.69×10^-8mol/L将本发明制备的SAM分子印迹传感器成功用于药品、食品中SAM的检测中，回收率在96.12~104.8%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。

Claims (4)

1.一种SAM分子印迹传感器的制备方法，其特征是：在于该方法具有以下工艺步骤：

（1）纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用高纯水超声清洗，用氩气吹干，在玻碳电极表面滴加5~10μL碳纳米管的N,N-二甲基甲酰胺分散液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，放入0.1mol/L氯金酸溶液浸泡20~30h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金和碳纳米管修饰玻碳电极；

（2）氧化碳纳米管的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入39~62%浓硫酸，0.5~3.0%碳纳米管，1.0~8.0%高锰酸钾，超声分散60~90min，缓慢加入30~55%去离子水，各组分含量之和为百分之百，然后在80~90℃搅拌反应6~8 h，冷却至室温，过滤，用1 mol/LHCl洗涤，再用去离子水反复洗涤至滤液为中性，干燥，得到氧化碳纳米管；

（3）印迹溶胶的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，γ-巯丙基三乙氧基硅烷：7~18%，甲基三甲氧基硅烷：1.0~4.0%，2-乙氧基乙醚：55~78%，0.1 mol/LHCl：8~18%，去离子水：1.0~8.0%，搅拌1~2 h，再加入SAM：0.05~1.0%，各组分含量之和为百分之百，继续搅拌20~30min，即得印迹溶胶；

（4）SAM分子印迹传感器的制备方法：取步骤（3）的印迹溶胶于小烧杯中，将步骤（1）制备的碳纳米管修饰玻碳电极放入其中，在-0.20~0.4V电位范围内，扫描速率为50mV/s，采用循环伏安法扫描20~30圈至扫描曲线稳定，再将该电极用去离子水反复浸泡，洗脱模板分子，即得检测SAM的分子印迹传感器。

2.根据权利要求1所述的一种SAM分子印迹传感器的制备方法，其特征是：步骤（1）中所述的碳纳米管的N,N-二甲基甲酰胺分散液的质量体积浓度为0.5g/L。

3.根据权利要求1中所述的一种SAM分子印迹传感器的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述的γ-巯丙基三乙氧基硅烷与甲基三甲氧基硅烷体积比为10：1。

4. 根据权利要求1中所述的一种SAM分子印迹传感器的制备方法，其特征是：所制备的检测SAM的分子印迹传感器应用于SAM的检测，其检测步骤如下：

（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的SAM标准溶液，底液为pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液；

（2）工作曲线绘制：将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统， 连接CHI660B电化学工作站，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中，采用循环伏安法在-0.20~0.4V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I ₀ ，含有不同浓度的SAM标准溶液的响应电流即为I _i  ，响应电流降低的差值为△I=I ₀ -I _i ，△I与SAM标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△I ~c工作曲线；

（3）SAM的检测：用待测样品代替步骤（1）中的SAM标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中SAM的含量；

所述K₃[Fe(CN)₆]溶液的浓度为5mmol/L；

所述pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度在70mmol/L。