CN103163226A

CN103163226A - 30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备

Info

Publication number: CN103163226A
Application number: CN2011104170883A
Authority: CN
Inventors: 刘丽宏; 李鹏飞; 李丹; 张绪得; 陶蓓蓓
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒及其制备方法。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇衍生化处理，吹干复溶后，采用C₁₈键合相硅胶为固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到10ng/ml，各项方法学指标均可满足氨基酸临床检验、工业生产和科学研究等定量需要。

Description

30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备

所属技术领域

本发明涉及一种基于液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)开发的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱-串联质谱技术对样本中30种氨基酸进行高灵敏度定量检测的方法。

本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。

背景技术

氨基酸(Amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。自然界中已发现的氨基酸有180多种，人体内重要的氨基酸有30多种。生命的产生、存在和消亡，无一不与蛋白质有关，而氨基酸正是蛋白质的基本单位，所以如果人体氨基酸发生变化，不在正常值范围内，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，最后导致疾病。目前氨基酸代谢障碍所引起的疾病已超过400多种，涉及代谢、肿瘤、免疫、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和人体生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等各个健康环节。

氨基酸在医药上也有广泛应用。目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。因此，检测复杂样本中氨基酸的含量对临床检验、工业生产和科学研究等都具有重要意义。

1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、液相色谱法等相继应用于氨基酸分析。传统的氨基酸分析技术已很难满足极微量氨基酸的准确和高通量检测需求。

液相色谱-串联质谱技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，样本在液相色谱质谱部分分别被分离及离子化，经检测器得到质谱图，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内外定性和定量分析的实用方法。研究开发一种结果准确、严格区分同分异构体、分析通量高、价格低廉、操作简便、易于推广的30种氨基酸LC-MS/MS同时定量检测试剂盒，使其能广泛应用于复杂样本中氨基酸临床、科研和工业生产，将有助于提高氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，以满足临床检验、工业生产和科学研究等对氨基酸定量检则的需要。

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。

技术方案

本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定复杂样本中30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)浓度的新型试剂盒。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇为衍生化试剂进行处理，吹干复溶后上清液进行LC-MS/MS检测，记录氨基酸和内标的峰面积。根据氨基酸对应稳定同位素内标浓度、样本中的氨基酸/对应同位素内标峰面积比值即可计算出每种氨基酸的浓度。测定结果为复杂样本中氨基酸浓度。

本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤：

1.稳定同位素内标冻干粉：12种稳定同位素标记氨基酸对照品冻干粉(含²H₄；5-¹³C-精氨酸、²H₃-亮氨酸、²H₃-甲硫氨酸、¹³C₆-苯丙氨酸、²H₃-天门冬氨酸、²H₂-瓜氨酸、²H₃-谷氨酸、²H₈-缬氨酸、¹³C₆-酪氨酸、²H₄-丙氨酸、²H₃-鸟氨酸均0.5pmoL；含¹⁵N；2-¹³C-甘氨酸2.5pmoL)，贴签标记，完成操作。

2.质控样本A的配制：精密称取10mg精氨酸对照品，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成1mg·mL^-1的精氨酸储备液。精密量取精氨酸储备液871μL，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成17.42μg·mL^-1的精氨酸(100μmol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。

3.质控样本B的配制：精密称取10mg苯丙氨酸对照品，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成1mg·mL^-1的苯丙氨酸储备液。精密量取苯丙氨酸储备液413μL，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成8.26μg·mL^-1的苯丙氨酸(50μmol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。

4.衍生化试剂组分A：色谱纯正丁醇，分装，贴签标记，完成操作。

5.衍生化试剂组分B：12mol/L盐酸，分装，贴签标记，完成操作。

6.流动相调节液A的配制：色谱纯甲酸，分装，贴签标记，完成操作。

7.流动相调节液B的配制：色谱纯七氟丁酸，分装，贴签标记，完成操作。

本发明的试剂盒使用方法如下：

取10μL样本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100μL，13200r/min离心2min。将离心后的上清液直接转移到另一1.5mL EP管中，氮气保护下50℃吹干，加入60μL衍生化试剂，密封，涡旋30s，瞬时离心，65℃孵育15min进行衍生化。衍生后的溶液再次瞬时离心，在氮气保护下50℃吹干。加入100μL复溶液复溶，涡旋30s，13200r/min离心2min，进样5μL进行LC-MS/MS分析。

有益效果

本发明试剂盒采用LC-MS/MS同时定量检测复杂样本中30种氨基酸的浓度，建立了一种高灵敏度(pmol级)和准确性的30种氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分异构体基本都能基线分离，方法操作简单、快速、高通量，可用于临床检验、工业生产和科学研究中样本的检测。同时，本发明试剂盒首次实现多种氨基酸LC-MS/MS定量检测技术国产化，它的推广应用将有助于提氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。

附图说明

图1氨基酸样本处理和检测过程

图230种氨基酸总离子流图

图3氨基酸同分异构体基线分离图

具体实施方式

1、适用仪器

液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。

2、样本要求

血浆样本：采集静脉全血样本，置于抗凝管中，采血后立即颠倒混匀5～6次，于30min以内离心分离血浆，-20℃冰冻保存待测。

尿样、脑脊液：取样后直接-20℃冰冻保存待测。

组织样本：生物组织或研磨或匀浆处理并用有机溶剂充分提取后，高速离心取上清液，用提取试剂稀释到合适的浓度，-20℃冰冻保存待测。

其它需测定游离氨基酸的样本：充分溶解或浸泡后，用甲醇水(1∶1v/v)充分提取，高速离心取上清液，用提取试剂稀释到合适的浓度，-20℃冰冻保存待测。

其它需测定全部氨基酸的样本：称取一定量样本，加入适量的盐酸(6mol/L)，密封，110℃高温水解24h，水解完自然冷却后，取出水解液过0.45μm水系滤膜。所得滤液取一定量在50℃下氮气吹干，用甲醇水(1∶1v/v)复溶并稀释到合适的浓度，-20℃冰冻保存待测。

3、检验前准备

浓缩储备液的配制：取“稳定同位素内标冻干粉”用2mL甲醇充分溶解，混匀，即为浓缩储备液，分装，密封4℃保存待用，使用效期1个月。

日常工作液的配制：取浓缩储备液，甲醇稀释100倍，分装，密封4℃保存待用，使用效期1周。

衍生化试剂的配制(盐酸正丁醇)：衍生化试剂组分A-衍生化试剂组分B(95∶5v/v)，混匀，密封4℃保存待用。

复溶液的配制：乙腈-水(4∶1v/v)，混匀，密封4℃保存待用。

4、检验方法

全血样本前处理：

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子方式检测；离子喷射电压：5500V；温度：580℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：55psi.；气体2(GS2，N₂)压力：60psi.；气帘气体(N₂)压力：20psi.；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium；解簇电压(DP)为：35V；碰撞能量(CE)为：30eV；30种氨基酸用于定量分析的离子对见表1，同位素标记的氨基酸内标及用于定量分析的离子对见表2。

表130种氨基酸及用于定量分析的离子对

色谱条件：

色谱柱：C₁₈柱(150×4.6mm，5μm粒径)；

流动相：含0.1％流动相调节液A和0.01％流动相调节液B的乙腈-含0.1％流动相调节液A和0.01％流动相调节液B的水溶液，梯度洗脱；

柱温：50℃；进样量：5μL。

测定法：

取处理好的质控样本和待测样本溶液各5μL注入液质联用仪，记录色谱图。

质控要求：

每1分析批样本随行2个质控样本(质控样本A和质控样本B)。质控样本测定结果偏差应小于20％。如质控样本测定结果不符合上述要求，则该分析批样本测试结果作废，重新检测。

表2氨基酸内标及用于定量分析的离子对

表3梯度洗脱条件

5、结果计算：

回收率的计算：计算质控样本A和质控样本B对应的精氨酸和苯丙氨酸的浓度。质控样本回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在100±20％范围内。

样本结果计算：提取30种氨基酸对应的样本和内标的MRM离子流图，进行积分处理。每5μL进样中，含有12.5pmol从日常工作液中带入的精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸同位素内标衍生物，62.5pmol甘氨酸同位素内标衍生物，没有同位素内标的18种氨基酸采用色谱峰比较邻近的同位素来进行定量，以校正系数K(特定校正系数，与使用的内标有关和加入体积有关)进行校准。

氨基酸浓度＝样本氨基酸峰面积×内标氨基酸浓度×K/内标氨基酸峰面积

Claims

1.一种高灵敏30种氨基酸同时定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的稳定同位素内标样本、质控样本、衍生化试剂、流动相调节液组成。

2.根据权利1所述的30种氨基酸同时定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)稳定同位素内标冻干粉的制备；(2)质控样本的配制；(3)衍生化试剂的制备；(4)流动相调节液的配制。

3.一种30种氨基酸同时定量检测方法，包括：

(1)浓缩储备液和日常工作液的配制：

取“稳定同位素内标冻干粉”用有机溶剂充分溶解，混匀，即为浓缩储备液，使用效期1个月；浓缩储备液用有机溶剂稀释适宜倍数，即为日常工作液，使用效期1周。

(2)样本预处理：

取一定量的样本，加入日常工作液，涡流，高速离心取上清液，吹干或冻干或挥干，加入适量的衍生化试剂衍生化一定时间，吹干或冻干或挥干，加入复溶液复溶。

(2)液相分离：

a.采用C₁₈、C₈或氰基键和硅胶作固定相；

b.流动相：甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺；三乙胺；等度或梯度洗脱；控制流速。

(3)质谱测定：电喷雾离子源；大气压化学电离源；正离子方式。

4.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于同时定量检测30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、γ-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)中的一种或多种，包含且不限于此30种氨基酸。

5.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。

6.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用盐酸正丁醇进行衍生化处理。

7.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用稳定同位素内标进行定量检测。

8.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于其所使用的流动相为：甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺；三乙胺；反相色谱等度或梯度分离。