CN113030327A - 一种基于高效液相色谱-串联质谱诊断泌尿结石的试剂盒和应用 - Google Patents

一种基于高效液相色谱-串联质谱诊断泌尿结石的试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高效液相色谱‑串联质谱检测受试者生物样本中标志物组合含量的试剂盒，属于泌尿结石标志物检测领域。其中，所述试剂盒包括所述标志物组合的分离检测试剂，所述标志物组合包括柠檬酸和异柠檬酸，进一步地，所述标志物组合还包括草酸和胱氨酸。利用本发明，可能实现柠檬酸含量的精准测定，可以进一步用于诊断受试者是否患有泌尿结石，或者用于预测受试者是否具有患泌尿结石风险，或者用于评估泌尿结石患者接受结石治疗的效果，或者用于预测泌尿结石患者治疗痊愈后是否具有复发风险，具有重大的临床意义和巨大的经济效益。

Description

一种基于高效液相色谱-串联质谱诊断泌尿结石的试剂盒和 应用
技术领域
本发明属于泌尿结石标志物检测领域，具体地，涉及一种基于高效液相色谱-串联质谱诊断泌尿结石的试剂盒和应用。
背景技术
泌尿结石(Nephrolithiasis)是晶体物质在泌尿系统的异常聚积所致，为泌尿系统的常见病，严重可引起尿路感染、腹痛、肾积水、肾功能衰竭等。泌尿结石发病率高，中国南方地区发病率高达5-10％，且易复发，手术后患者生活质量低，对患者家庭和社会负担巨大，很多患者在出现症状之后才会发现结石，无法在早期及时评价结石风险，且对于结石手术后治疗效果的评估、尚缺乏有效检测方式。结石复发率极高，因此，建立合适的风险评估模型及检测手段，对结石患者治疗效果进行评估、预测患者结石复发或者发生风险具有重要的现实意义。
传统确定结石的方法通常是医学影像如B超、X线或者CT检测，患者检查时须已经产生结石，因此，此方法并不能用于早期结石预测。在评估结石患者的治疗效果方面也有一定滞后性。
近年来，生物标志物的出现，如尿中草酸、尿酸及钙等物质，使预测结石发生及评估结石患者治疗效果成为可能。然而，人体具有一个整体的代谢系统，结石产生受多种因素综合影响，现有的生物标志物缺乏整体研究数据。
代谢组学是通过研究生物体的大范围代谢物变化情况，综合评价生物的状况。目前代谢组学已经在多个人类疾病研究领域得到应用。然而在泌尿结石方面，尚缺乏此类综合数据，因此以代谢组学方法对泌尿结石进行研究更具有现实意义。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，发明人以代谢组学为基础，综合研究了中国泌尿结石患者与对照组人群代谢物，发现了有效的生物标志物，并进一步建立了有效生物标志物的绝对定量分析方法，旨在建立提供精准诊断泌尿结石的技术体系。为了实现这个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种基于高效液相色谱-串联质谱检测受试者生物样本中标志物组合含量的试剂盒，所述试剂盒包括标志物组合的分离检测试剂，其中，所述标志物组合包括柠檬酸和异柠檬酸。
柠檬酸作为草酸钙的抑制剂，是一种重要的泌尿结石标志物。异柠檬酸和柠檬酸是同分异构体的内源性物质，其存在会影响泌尿结石的诊断结果。
在本发明的一些实施方案中，所述分离检测试剂包括衍生试剂。在本发明的一些优选实施方案中，所述衍生试剂为C3-C6醇类。使用C3-C6醇类作为衍生试剂，可以进一步通过高效液相色谱-串联质谱实现柠檬酸和异柠檬酸的分离，提高检测或诊断准确度。
进一步地，所述标志物组合还包括草酸和胱氨酸。草酸和胱氨酸同样是泌尿结石的重要标志物。将草酸和胱氨酸联合起来进行检测，可以进一步提高诊断的准确度。
在本发明的一些实施方案中，所述C3-C6醇类是指具有3～6个C原子的醇。利用醇类进行衍生，具有至少两个方面的好处：一方面，由于其不是利用氨基来衍生，因此，氨基酸上的氨基不会对醇类衍生剂产生干扰，可同时实现对氨基酸如胱氨酸的衍生。另一方面，由于醇类不存在空间位阻，可将柠檬酸与异柠檬酸内部的羟基暴露出来，扩大因羟基位置差异而使柠檬酸与异柠檬酸与色谱填料之间作用力的差异，从而达到完全基线分离的目的。进一步的，C3-C6醇衍生化以后能够提高整个分子在质谱中的响应，从而增加检测的灵敏度和准确度。
在本发明的一些具体实施方案中，所述衍生试剂为正丁醇。
更进一步地，所述分离检测试剂还包括提取试剂。在本发明的一些优选实施方案中，提取试剂包括氨水·乙酸乙酯。
在本发明的一些实施方案中，所述利用氨水·乙酸乙酯进行提取的步骤如下：
衍生化后的生物样本，经过氮气干燥，加入1-2mL 0.3％的氨水·乙酸乙酯，超声15min，震荡15min，15000rpm离心5min，取上清100-1000μL，于60℃氮气吹干，加入100-300μL甲醇复溶。
在本发明的一些具体实施方案中，所述利用氨水·乙酸乙酯进行提取的步骤如下：
衍生化后的生物样本，经过氮气干燥，加入1mL 0.3％的氨水·乙酸乙酯，超声15min，震荡15min，15000rpm离心5min，取上清500μL，于60℃氮气吹干，加入100μL甲醇复溶。
进一步地，所述试剂盒还包括同位素内标准品，内标准品也称为内标，所述同位素内标准品包括同位素标记的生物标志物组合。
在本发明的一些实施方案中，同位素标记的草酸为草酸-13C2。
在本发明的一些实施方案中，同位素标记的柠檬酸为柠檬酸-D4。
在本发明的一些实施方案中，同位素标记的胱氨酸为胱氨酸-D4。
在本发明的一些具体实施方案中，精确称取柠檬酸-D4，内标用纯水溶解，配制浓度为1-10mg/mL内标母液。进一步地，在使用时，吸取1-100μL内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个内标储备液。优选地，在使用时，吸取100μL内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个内标储备液。
在本发明的另一些具体实施方案中，精确称取草酸-13C2、柠檬酸-D4、胱氨酸-D4，称量质量依次为1-10mg、1-100mg和1-10mg，各内标分别用纯水溶解，配制浓度依次为1-10mg/mL、1-10mg/mL和1-10mg/mL内标母液。进一步地，在使用时，依次吸取1-100μL草酸-13C2、1-100μL柠檬酸-D4和1-100μL胱氨酸-D4内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个混合内标储备液。优选地，在使用时，依次吸取100μL草酸-13C2、100μL柠檬酸-D4和100μL胱氨酸-D4内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个混合内标储备液。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品为已知浓度的标志物。
在本发明的一些具体实施方案中，精确称取柠檬酸和异柠檬酸，各标准品分别用纯水配制成浓度为10-100mg/mL和10-50mg/mL的标准品母液。进一步地，依次吸取100-500μL柠檬酸和100-300μL异柠檬酸标准品母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个标准品储备液。更进一步地，利用人工尿稀释标准品储备液，可以得到一系列不同浓度的标准曲线工作液(W1-W7)，用于制作标准曲线，标准曲线工作液配制过程如下表：
Figure BDA0002973211550000041
其中，所述人工尿的配制方法如下：10mL超纯水，加180mg尿素，5mg尿酸，110mgNaCl，超声10min，混匀3min，静置5min后，取上清溶液。
在本发明的另一些具体实施方案中，精确称取草酸、柠檬酸、异柠檬酸和胱氨酸，各标准品分别用纯水配制成浓度为10-20mg/mL、100-500mg/mL、10-50mg/mL和10-50mg/mL的标准品母液。进一步地，吸取100-500μL草酸母液、100-500μL胱氨酸母液、100-500μL异柠檬酸母液、100-500μL柠檬酸标准品母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个混合标准品储备液。更进一步地，利用人工尿稀释混合标准品储备液，可以得到一系列不同浓度的标准曲线工作液(W1-W7)，用于制作标准曲线，标准曲线工作液配制过程如下表：
Figure BDA0002973211550000042
其中，所述人工尿的配制方法如下：10mL超纯水，加180mg尿素，5mg尿酸，110mgNaCl，超声10min，混匀3min，静置5min后，取上清溶液。
在本发明的一些实施方案中，利用正丁醇对所述生物样本进行衍生的步骤如下：
取10-20μL生物样本，加入10-50μL同位素标记的柠檬酸、草酸和胱氨酸内标，于60℃氮气吹干，加入100-300μL 3mol/L盐酸正丁醇溶液，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，加入100-300μL甲醇复溶。
在本发明的一些具体实施方案中，取20μL生物样本，加入20μL同位素标记的柠檬酸、草酸和胱氨酸内标，于60℃氮气吹干，加入100μL 3mol/L盐酸正丁醇溶液，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，加入100μL甲醇复溶。
在本发明中，所述生物样本为受试者尿液样本，优选地，为24h尿液样本。其中，所述24h尿液样本是指收集的受试者24h内的全部尿液。由此可以测定受试者一天尿液中所述生物标志物的总量。
在本发明的一些实施方案中，所述检测受试者生物样本中标志物组合含量基
本发明的第二方面提供一种标志物组合的分离检测试剂在制备基于高效液相色谱-串联质谱检测受试者生物样本中标志物组合含量的试剂盒中的应用，其中，所述标志物组合包括柠檬酸和异柠檬酸。
在本发明的一些实施方案中，所述分离检测试剂包括衍生试剂。在本发明的一些优选实施方案中，所述衍生试剂为C1-C6醇类。在本发明的一些具体实施方案中，所述衍生试剂为正丁醇。
进一步地，所述检测受试者生物样本中标志物组合含量包括以下步骤：
S1，利用衍生试剂对所述生物样本进行衍生；
S2，利用高效液相色谱-串联质谱对衍生后的生物样本进行检测。
在本发明的一些实施方案中，步骤S1利用衍生试剂对所述生物样本进行衍生的步骤具体为：取10-20μL生物样本，加入10-50μL同位素标记的柠檬酸、草酸和胱氨酸内标，于60℃氮气吹干，加入100-300μL 3mol/L衍生试剂，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，加入100-300μL甲醇复溶。
本发明的一些实施方案中，所述分离检测试剂还包括提取试剂。在本发明的一些具体实施方案中，提取试剂包括氨水·乙酸乙酯。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2之前进一步包括步骤：
样品衍生化后，经过氮气干燥，分别加入0.5-1.5mL 0.3％的氨水·乙酸乙酯，超声15min，震荡15min，15000rpm离心5min，取上清300-800μL，于60-80℃氮气吹干，加入50-500μL甲醇复溶，待检测。
在本发明的一些实施方案中，步骤S2利用高效液相色谱-串联质谱对衍生后的生物样本进行检测的步骤具体为：
色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃；
洗脱条件：流动相A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速0.1-0.5mL/min，等度洗脱，10-90％B流动相B，具体如下表。
时间/min B相比例
0.00 10-90％
3.5 10-90％
进一步地，所述标志物组合还包括草酸和胱氨酸。
在本发明的一些实施方案中，所述衍生试剂为正丁醇。
在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为尿液样本。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测受试者尿液样本中标志物组合含量包括以下步骤：
衍生化：取20μL待测尿液样本，加入20μL内标，于60℃氮气吹干，加入100μL 3mol/L盐酸正丁醇溶液，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，待提取；
提取：样品衍生化后，经过氮气干燥，分别加入1mL 0.3％的氨水·乙酸乙酯，超声15min，震荡15min，15000rpm离心5min，取上清500μL，于60℃氮气吹干，加入100μL甲醇复溶，待检测；
检测：
色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃，
洗脱条件：流动相A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速-0.3mL/min，等度洗脱，90％B流动相B，具体如下表：
时间/min B相比例
0.00 90％
3.5 90％
本发明的其他方面还提供：
一种标志物组合的标记试剂或检测试剂在制备用于检测受试者生物样本中标志物组合含量的试剂盒中的应用，其中，所述标志物组合包括柠檬酸和异柠檬酸。
进一步地，所述标志物组合包括草酸和胱氨酸。
所述标记试剂或检测试剂可以是本领域技术人员了解到的能够定量或者用于定量检测所述标志物组合含量的试剂。如基于高效液相色谱-串联质谱检测，所述标记试剂或检测试剂可以是同位素标记的生物标志物。
在本发明中，通过检测受试者生物样本中标志物组合含量，可以进一步用于诊断受试者是否患有泌尿结石，或者用于预测受试者是否具有患泌尿结石风险，或者用于评估泌尿结石患者接受结石治疗的效果，或者用于预测泌尿结石患者治疗痊愈后是否具有复发风险。
进一步地，由于本发明的一些实施方案采用了不同的生物标志物进行联合检测，可以实现对结石的分型，实现精准诊疗。
本发明的有益效果
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明通过衍生试剂，结合高效液相色谱-串联质谱平台，实现了柠檬酸和异柠檬的分离，提高了柠檬酸的检测准确度，进而提高了泌尿结石的诊断准确性。
通过检测受试者生物样本中标志物组合含量，可以进一步用于诊断受试者是否患有泌尿结石，或者用于预测受试者是否具有患泌尿结石风险，或者用于评估泌尿结石患者接受结石治疗的效果，或者用于预测泌尿结石患者治疗痊愈后是否具有复发风险，具有重大的临床意义和巨大的经济效益。进一步地，通过采用不同的生物标志物进行联合检测，可以实现对结石的分型，实现精准诊疗。
附图说明
图1示出了柠檬酸与异柠檬酸的结构和生化反应。
图2示出了PA衍生化柠檬酸与异柠檬酸分离效果图。
图3示出了正丁醇衍生化柠檬酸与异柠檬酸分离效果图。
图4示出了受试者24h尿液样本中异柠檬酸与草酸含量的关系。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1柠酸酸与异柠檬酸的分离
柠檬酸作为草酸钙的抑制剂，是一种重要的泌尿结石标志物。异柠檬酸和柠檬酸是同分异构体的内源性物质(图1)，以往检测方法中，不会也不能将柠檬酸和异柠檬酸分离，从而作为一个整体进行定量。发明人为了准确测定柠酸酸含量，尝试将柠檬酸和异柠檬酸分离。
(1)2-吡啶甲基胺(PA)衍生化
由于泌尿结石标志物检测通常会同时检测有机酸和氨基酸，而二者一般都含有羧基，因此发明人初步尝试衍生化羧基。
首先，利用吡啶上氨基与羧基反应：2-吡啶甲基胺(PA)是常用的与羧基反应的衍生试剂，衍生时间短，前处理简单。
衍生步骤及条件：取20μL尿液样本，加入20μL同位素标记的柠檬酸、草酸和胱氨酸内标，于60℃氮气吹干，依次加入200μL 10mM三苯基膦(TPP)，200μL2,2'-二硫二吡啶(DPDS)，200μL 1g/L 2-氨甲基吡啶(PA)，涡旋3min，于60℃静置30min，后室温下加入200μL0.1％甲酸水溶液，待检测。
色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。
洗脱条件：流动相A为0.2％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸-2mM甲酸铵甲醇溶液；流速0.2mL/min，梯度洗脱，具体如下表：
时间/min B相比例
0.00 5％
2.00 5％
6.00 70％
10.00 90％
12.00 90％
13.00 15％
15.00 15％
分离结果如图2所示。结果显示，PA无法衍生胱氨酸，柠檬酸与异柠檬酸可以衍生成功，但衍生后产物无法在液相上分开：图2中显示柠檬酸与异柠檬酸在6.63min仍旧无法分离。
发明人对此进行进一步分析，发现胱氨酸无法衍生化是由于氨基的存在严重干扰吡啶对于胱氨酸的衍生效果；柠檬酸与异柠檬酸无法分离是因为两者唯一的差异是羟基位置不同，衍生后添加上的三个基团将柠檬酸与异柠檬酸的羟基包裹住，存在空间位阻，使羟基无法充分与色谱填料作用，羟基因为位置的差异而产生的作用力差异被弱化，故而最终无法达到色谱分离。
(2)醇类衍生化
为达到成功衍生胱氨酸，同时可分离柠檬酸与异柠檬酸的效果，发明人尝试大量新的衍生剂。意外地发现，使用丁醇等醇类进行衍生化可以使得柠檬酸与异柠檬酸的羟基位置差异扩大。
衍生化步骤及条件：取20μL尿液样本，加入20μL同位素标记的柠檬酸、草酸和胱氨酸内标，于60℃氮气吹干，加入100μL 3mol/L盐酸正丁醇溶液，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，加入100μL甲醇复溶，待检测。
色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。
洗脱条件：流动相A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速0.3mL/min，等度洗脱，80％B流动相B，具体如下表。
时间/min B相比例
0.00 80％
3.5 80％
检测结果如图3所示，结果显示，全部目标物衍生成功，同时可实现柠檬酸与异柠檬酸基线分离，保留时间在3.0min左右。
发明人进一步分析发现，由于醇类衍生不是利用氨基来衍生，因此，氨基酸上的氨基不会对醇类衍生剂产生干扰。另外一方面，丁醇等醇类不存在空间位阻，可将柠檬酸与异柠檬酸内部的羟基暴露出来，扩大因羟基位置差异而使柠檬酸与异柠檬酸与色谱填料之间作用力的差异，从而达到完全基线分离的目的。
以上结果表明，利用丁醇等醇类作为衍生试剂，可以有效地实现柠檬酸和异柠檬酸的分离，从而能够准确定量柠檬酸。由此，可以解决把异柠檬酸含量计入柠檬酸含量，从而对诊断结果产生干扰的难题。
实施例2柠檬酸和异柠檬酸作为诊断标志物诊断泌尿结石
(一)标准溶液的配制。
(1)内标溶液配制：分析天平精确称取柠檬酸-D4，内标用纯水溶解，配制浓度为10mg/mL内标母液。
(2)标准品配制：分析天平精确称取柠檬酸和异柠檬酸，各标准品分别用纯水配制成浓度为10mg/mL和50mg/mL的标准品母液。
(3)内标储备液：吸取100μL内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个内标储备液。
(4)标准品储备液：依次吸取500μL和300μL柠檬酸与异柠檬酸标准品母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个标准品储备液。
(5)人工尿配制：10mL超纯水，加180mg尿素，5mg尿酸，110mgNaCl，超声10min，混匀3min，静置5min后，取上清溶液待用。
(6)标准曲线工作液：使用人工尿稀释标准品储备液，可以得到一系列不同浓度的标准曲线工作液(W1-W7)，用于制作标准曲线。标准曲线工作液配制过程如下表：
Figure BDA0002973211550000111
(二)样本前处理
尿液的离心：取待检尿液样本(受试者24h尿液)至少4mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，分离得到上清液尿液，置于-80℃保存备用。
(三)衍生化
取20μL待测尿液样本/标准曲线工作液，加入20μL内标，于60℃氮气吹干，加入100μL 3mol/L盐酸正丁醇溶液，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，待提取。
(四)提取：样品衍生化后，经过氮气干燥，分别加入1mL 0.3％的氨水·乙酸乙酯，超声15min，震荡15min，15000rpm离心5min，取上清500μL，于60℃氮气吹干，加入100μL甲醇复溶，待检测。
(五)待测尿液样本/标准曲线工作液检测
色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。
洗脱条件：流动相A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速-0.3mL/min，等度洗脱，-90％B流动相B，具体如下表：
时间/min B相比例
0.00 90％
3.5 90％
对上述待测尿液样本/标准曲线进行检测；通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测尿液样本的峰面积计算出待测尿液样本中的柠檬酸和异柠檬酸的含量。柠檬酸正常范围应该>400mg/d，如果检测到柠檬酸含量小于400mg/d，则，如果个体未被诊断具有结石，该结果表示个体患有泌尿结石或具有患泌尿结石的风险；如果患者正在治疗中，则表示患者结石治疗效果不好；如果患者已经治疗康复，则表示其仍有复发风险。
发明人利用本实施例的方法对三位受试者的尿液样本(24h尿液)进行了检测，结果如下表：
Figure BDA0002973211550000121
↓表示低于正常范围。
同时，结合其他临床信息，如医学影像B超检测和病史，发现上述1号和2号受试者患有不同程度的尿结石，3号受试者患有肾结石。
由此表明，将柠檬酸和异柠檬酸分离后，具有较高的诊断准确度，尤其是对柠檬酸和异柠檬酸总含量超过400mg/d的受试者来说，意义尤为明显。
实施例3柠檬酸和异柠檬酸联合草酸和胱氨酸在诊断泌尿结石中的应用
(一)标准溶液的配制。
(1)内标溶液配制：分析天平精确称取草酸-13C2、柠檬酸-D4、胱氨酸-D4，称量质量依次为10mg、100mg和10mg，各内标分别用纯水溶解，配制浓度依次为10mg/mL、10mg/mL和10mg/mL内标母液。
(2)标准品配制：分析天平精确称取草酸、柠檬酸、异柠檬酸和胱氨酸，称量质量依次为20mg、500mg、50mg和30mg，各标准品分别用纯水配制成浓度依次为20mg/mL、500mg/mL、50mg/mL和30mg/mL的标准品母液。
(3)混合内标储备液：依次吸取100μL草酸-13C2、100μL柠檬酸-D4和100μL胱氨酸-D4内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个混合内标储备液。
(4)混合标准品储备液：吸取500μL草酸母液、500μL胱氨酸母液、500μL异柠檬酸母液、500μL柠檬酸标准品母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个混合标准品储备液。
(5)人工尿配制：10mL超纯水，加180mg尿素，5mg尿酸，110mgNaCl，超声10min，混匀3min，静置5min后，取上清溶液待用。
(5)标准曲线工作液：使用人工尿稀释混合标准品储备液，可以得到一系列不同浓度的标准曲线工作液(W1-W7)，用于制作标准曲线。标准工作液配制过程如下表：
Figure BDA0002973211550000131
待测尿液样本(受试者24h尿液)的前处理，以及待测尿液样本/标准曲线处理的衍生化和提取步骤同实施例2。
(二)待测样本的检测
色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。
洗脱条件：流动相A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速0.5mL/min，等度洗脱，90％B流动相B，具体如下表。
时间/min B相比例
0.00 90％
3.5 90％
对上述待测尿液样本/标准曲线工作液进行检测；通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测尿液样本的峰面积计算出待测尿液样本中的草酸、柠檬酸、异柠檬酸和胱氨酸的浓度(含量)。
草酸的正常范围应在10-60mg/d，柠檬酸正常范围应该>400mg/d，胱氨酸正常范围应该<75mg/d。
如果检测到的草酸含量>60mg/d，或检测到的校正异柠檬酸含量小于400mg/d，或检测到的胱氨酸含量≥75mg/d，此时，如果个体未被诊断具有结石，该结果表示个体患有泌尿结石或具有患泌尿结石的风险；如果患者正在治疗中，则表示患者结石治疗效果不好；如果患者已经治疗康复，则表示其仍有复发风险。
发明人利用本实施例的方法，对6位受试者的尿液样本(24h尿液)进行了检测，结果如下表：
Figure BDA0002973211550000141
↑表示高于正常范围；↓表示低于正常范围。
发明人经过对大量样本进行了检测，统计发现，受试者尿液样本中异柠檬酸和草酸含量存在一个显著正相关的关系，Pearson线性相关系数r＝0.397(图4)，表明异柠檬酸作用和柠檬酸不一致，其可能能够促进草酸的形成。同时，也意味着，对柠檬酸和异柠檬酸进行分离并检测，对诊断泌尿结石具有重大的临床意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于高效液相色谱-串联质谱检测受试者生物样本中标志物组合含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括标志物组合的分离检测试剂，其中，所述标志物组合包括柠檬酸和异柠檬酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标志物组合还包括草酸和胱氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述分离检测试剂包括衍生试剂。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括同位素内标准品，所述同位素内标准品包括同位素标记的生物标志物组合。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品包括已知浓度的生物标志物组合。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述分离检测试剂还包括提取试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述提取试剂包括氨水·乙酸乙酯。
8.一种标志物组合的分离检测试剂在制备基于高效液相色谱-串联质谱检测受试者生物样本中标志物组合含量的试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物组合包括柠檬酸和异柠檬酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述标志物组合还包括草酸和胱氨酸。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述分离检测试剂包括衍生试剂。
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