CN109085278A

CN109085278A - 液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109085278A
Application number: CN201810884890.5A
Authority: CN
Inventors: 吴超超; 高强; 彭军; 胡志飞
Original assignee: Hangzhou Bai Chen Medical Laboratory Co Ltd; Hangzhou Bai Qin Medical Equipment Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Baichen Medical Instrument Co.,Ltd.; HANGZHOU BAICHEN MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd.
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2018-12-25
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: CN109085278B

Abstract

本发明公开一液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，所述试剂盒内包括对应33种氨基酸的混合内标物；33种氨基酸标准品：洗脱液A：10mM甲酸铵+0.1％甲酸水溶液；洗脱液B：0.1％甲酸乙腈溶液；衍生化试剂：正丁醇+乙酰氯；稀释剂：甲醇溶液；质控品：高质控品以及低质控品，所述试剂盒可用于同时高效地检测33种氨基酸，检测灵敏度高、特异性强、前处理过程简单，可快速并同时完成多种氨基酸的分离与检测。

Description

液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及血液检测技术，特别涉及一种液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒及其应用，所述试剂盒适用于使用串联质谱法同时高效地检测干血片/血浆/血清中33种氨基酸。

背景技术

氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。关于氨基酸的研究是代谢学中最为重要的一环，在正常的情况下，氨基酸在体内的分布处于一个平衡状态，这一状态的失衡是众多疾病的诱因或表现形式。因此，氨基酸检测可以作为健康诊断和疾病筛查的重要手段，可以为及早预防疾病、改善身体营养状态和营养补充提供参考标准，氨基酸的精确检测可以揭示人体内详细的氨基酸代谢状况，从而从不同的代谢路径，如神经内分泌系统、氨能量代谢系统或者是硫代谢等方面提示人体的健康状况。

常见的氨基酸有：γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸、高脯氨酸。如果人体缺乏任何一种必需氨基酸，就可导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，最后导致疾病。同样，如果人体内缺乏某些非必需氨基酸，会产生机体代谢障碍。举例来说，精氨酸和瓜氨酸对形成尿素十分重要；胱氨酸摄入不足就会引起胰岛素减少，血糖升高。又如创伤后胱氨酸和精氨酸的需要量大增，如缺乏，即使热能充足仍不能顺利合成蛋白质。总之，氨基酸在人体内通过代谢可以发挥下列一些作用：①合成组织蛋白质；②变成酸、激素、抗体、肌酸等含氨物质；③转变为碳水化合物和脂肪；④氧化成二氧化碳和水及尿素，产生能量。

目前国内外使用的氨基酸检测方法有电化学法、分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法及气相色谱法等，高效液相色谱法是目前使用最为普遍的方法，然而目前市面上还没有可以高效地同时检测以上提及的33种氨基酸的方法，也就是说，虽然目前市面上有针对某些或者某类氨基酸的液相色谱串联质谱法，但是这些方法的检测范围是局限的。当医疗人员想要了解病患体内氨基酸的情况时，需要采用多种针对性的方法，这样不仅仅提高了检测的成本，又降低了检测的效率，也加大了病患的痛苦。

发明内容

本发明的目的在于提供一液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒及其应用，所述试剂盒可被适用于使用串联质谱法同时检测干血片/血浆/血清中的33种氨基酸，并且其检测灵敏度高、特异性强、前处理过程简单，可快速并同时完成多种氨基酸的分离与检测。

本发明提供的试剂盒用于同时检测多种氨基酸，具体而言，同时检测33种氨基酸，其中33种氨基酸为：γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸、高脯氨酸。为了便于说明，这33种氨基酸在本发明中统称之为氨基酸组，其后提到的内标物也统称为内标物组。

所述试剂盒包括以下试剂：

①混合内标物:L-丙氨酸-D₄、L-苯丙氨酸-C₁₃、L-亮氨酸-D₃、L-缬氨酸-D₈、L-精氨酸-C₁₃,D4:HCl、L-瓜氨酸-D₂、DL-谷氨酸-D₃、L-酪氨酸-¹³C₆、L-鸟氨酸-D₂:HCl、L-甲硫氨酸-D₃、L-天门冬氨酸-D₃、甘氨酸-¹³C,¹⁵N、氨基丁酸-D₃、天冬酰胺-D₃、羟脯氨酸-D₃、赖氨酸-D₉、脯氨酸-D₇、丝氨酸-D₃、色氨酸-D₅。

②标准品：γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸、高脯氨酸。

③洗脱液：

洗脱液A：10mM甲酸铵+0.1％甲酸水溶液

洗脱液B：0.1％甲酸乙腈溶液

④衍生化试剂：

正丁醇+乙酰氯。

⑤稀释剂：

稀释剂：甲醇溶液。

⑥质控品：

低质控：正常人的混合血浆；

高质控：添加γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸、高脯氨酸的混合混合血浆。

其中所述高质控和低质控中各氨基酸的指标浓度示例见表一：

表一

所述试剂盒在使用过程中，混合标准品用甲醇溶解得到标准母液和氨基酸混合标准液，混合内标物用甲醇溶液溶解得到混合内标液。

具体而言，所述标准品溶液的制备过程如下：

1、标准品母液的制备：

称取γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸，分别加入水溶液，归类为A类氨基酸，其中所述A类氨基酸中的每类氨基酸的浓度如表二所示。

称取6-氨基己酸、同型精氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸，分别加入水溶液，归类为B类氨基酸，其中所述B类氨基酸中的每类氨基酸的浓度如表二所示；

称取L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺，分别加入水溶液，归类为C类氨基酸，其中所述C类氨基酸中的每类氨基酸的浓度如表二所示；

称取异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸，分别加入水溶液，归类为D类氨基酸，其中所述D类氨基酸中的每类氨基酸的浓度如表二所示；

称取L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸，分别加入水溶液，归类为E类氨基酸，其中所述E类氨基酸中的每类氨基酸的浓度如表二所示；

称取DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸，分别加入水溶液，归类为F类氨基酸，其中所述F类氨基酸中的每类氨基酸的浓度如表二所示；

称取犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸，分别加入水溶液，归类为G类氨基酸，其中所述G类氨基酸中的每类氨基酸的浓度如表二所示；

称取高脯氨酸，分别加入水溶液，归类为H类氨基酸，其中所述H类氨基酸中的每类氨基酸的浓度表二所示。

所述标准品母液中33种氨基酸标准品浓度，表二如下所示：

表二

1.1氨基酸混合标准液的配制说明：

配制1mL混合标准液步骤如下:A类氨基酸先稀释125倍后，取100μL；B类氨基酸先稀释9倍后，取100μL；C类氨基酸稀释3.65倍后，取200μL；D类氨基酸稀释2倍后，取200μL；E类氨基酸不稀释，取200μL；F类氨基酸(Kyn和3Aib)先稀释75倍后，取100μL；G类氨基酸稀释15倍；H稀释125倍类氨基酸后混合，取100μL；以上各组分均用甲醇稀释，混合后共计1mL。

值得一提的是，氨基酸被归类为ABCDEFGH多组是根据氨基酸检测的浓度范围分类，以方便后面氨基酸的稀释混合，确保得到的标准曲线线性范围合适，另外，其分类依据也是由于同分异构体的存在，将其分开在不同组分。

2、混合内标液的制备：

在室温下用甲醇分别溶解其上提到的内标物得到内标母液，所述内标母液使用时用甲醇溶液稀释50倍得到内标工作液，控制所述内标工作液中的每个内标物的终浓度至0.5uM上下，除了Glycine-13C,15N在混合内标中的工作浓度约为2.5uM。这样的配置浓度是经过试验证明可满足使用要求，在本发明中，所述内标工作液先配置为内标母液时为了便于存放和使用。

3、洗脱液的制备：

洗脱液A：取1L超纯水，使用10mL移液枪移去11mL水，再加入1mL甲酸，使用10mL移液枪加入10mL乙酸铵储备液，超声10min充分混匀，使用抽滤装置(配用0.22μm水相膜)过滤后备用，其中所述乙酸铵储备液：称取7.71g乙酸铵，加水定容至100mL充分混匀备用(1mol/L)。

洗脱液B：取1L色谱乙腈，使用1mL移液枪移去1mL水，再加入1mL甲酸，使用充分混匀备用。

4、衍生剂试剂的制备：正丁醇和乙酰氯先置于冰箱降温30min，按比例9:1配制，注意散热，可将容器置于冰水中混合。

50mL衍生剂试剂配置：使用10mL移液枪移取正丁醇试剂45mL于100mL试剂瓶内，使用5mL移液枪取5mL乙酰氯试剂缓慢加入试剂瓶，边加边摇匀，温度降至室温后密封保存备用。

5、稀释剂的制备：

稀释剂：甲醇溶液；

6、质控品的制备：

由于基质含氨基酸浓度较高，所以直接用正产人的混合血浆做低质控；

参考参照商品化质控中各指标值向血浆中加入标准品，配制成高质控。

另外，在一些情况下高低质控直接购买自商品化质控，购买自ClinChek。在本发明的一具体实施例中，所述标准品母液的配置数据如表三所示：

表三

所述试剂盒被应用于同时检测33种氨基酸，所述试剂盒在利用液相色谱串联法同时检测33种氨基酸时的应用方法也在本发明的保护范围之内。

液相色谱串联法同时检测33种氨基酸的检测方法如下：

A.检测样本/质控品预处理：由于干血片，血浆样本以及血清样本的样本特性，其预处理方法有所不同。

A.1干血片样本预处理：

打孔器进行干血片打孔，置于干净的离心管中，每个孔中只放1个血斑。使用多通道或单通道移液枪以反向加液法向每孔中加入体积比为1:1的内标工作液和甲醇溶液，涡旋震荡，置于离心机，高速离心，取出一定体积的上清液转移到孔板中。

A.2血浆样本/血清样本/质控品/标准曲线样本预处理：

使用单通道移液枪取样于离心管，加入内标工作液，其中所述样本和氨基酸内标工作液的体积比为1:15.6，涡旋震荡，置于离心机，高速离心，使用单通道移液枪(移液枪头移完一次必须更换)取出一定体积的上清液转移到孔板。

值得注意的是，每批检测样本加入高低质控各一个；

B.使用氮吹仪，50℃加热，打开氮气流量阀至0.06-0.09MPa左右，15-18min氮气吹干；

C.使用多通道移液枪(移液枪头移完一次必须更换)加入衍生化试剂至孔板，粘性封膜密封，60℃振荡孵育30min；

D.孵育完成后取下微孔板，静置1min，揭掉板垫，使用氮吹仪，50℃加热，打开氮气流量阀至0.07MPa左右，15-20min氮气吹干；

E.使用多通道移液枪加入超纯水至孔板，封板垫密封，室温振荡孵育；

F.孵育完成后，把微孔板放入到Waters Xevo TQD样品管理器中，上样检测。

附图说明

图1到图10是根据本发明一实施例的液相色谱串联法同时检测多种氨基酸的试剂盒检测过程中得到的33种氨基酸的标准曲线。

图11到图20是根据本发明一实施例的液相色谱串联法同时检测多种氨基酸的试剂盒检测过程中得到的33种氨基酸的检测图。

值得一提的是，附图中的英文代表本文中氨基酸对应的简称。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

质谱的基本原理是将分析物离子化为各种质荷比(m/z)不同的带电粒子，应用电磁学原理，带电粒子按m/z在空间或时间上产生分离排列成的图谱，根据它们所形成的图谱、离子峰强度对分析物进行鉴定和定量。串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)就是将两台质谱仪经碰撞室串联起来，第一台质谱仪作为分离器，第二台质谱仪作为分析仪对带电粒子进行分析。由于串联质谱技术是对分析物解离后的带电粒子进行分析，所以具有较高的特异性和灵敏性，其检测水平能达到pg级，且仅需微量的样本量。

本发明提供的液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒被应用于串联质谱检测系统中被检测，本发明提供的串联质谱检测系统主要包括一个进样器、一台高效液相仪、一台串联的质谱仪和结果数据处理软件组成，能在几分钟内完成一个样本几十种氨基酸项目的检测，本发明的试剂盒检测原理为：在串联质谱法前处理采用衍生化法处理样本，通过在样本中加入盐酸正丁醇进行酯化反应，引入丁基改变待测物质分子结构，消除了潜在负离子，提高正离子模式下的离子化效率，减少潜在溶剂或其他干扰物质，同时降低了分析物极性，使其更加容易进入仪器真空环境，提高检测的灵敏度。以下如无特别说明，将以试剂盒指代所述液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒。

具体的实施方式如下：

实施例1：

1材料：

仪器：直径3.2mm的打孔器，离心管(Axygen 1.5mL)，多通道移液枪(0-200uL，Brand)，单通道移液枪(0-200uL，Brand)，离心机(TGL-16.5M，卢湘仪)，V型96孔板(249944，Thermo)，涡旋混合仪(Votex2，Scientific)，96孔板恒温震荡器(ST60-4，米欧)，氮吹仪(NDK200-1A，米欧)，粘性封膜(AB0580，Thermo)，封板垫(276002，Thermo)，超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC I-Class FTN)，三重四级杆质谱仪(Waters XEVO TQD)。

试剂：液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒,检测样本。

所述试剂盒组分如下表：

其中所述混合内标物通过所述甲醇溶液溶解后得到内标工作液，所述标准品通过所述甲醇溶液溶解后得到标准母液和氨基酸混合标准液。

2.实验过程：

2.1检测样本预处理：

2.1.1干血片样本预处理：

当检测样本为干血片时，进行如下操作：

用直径为3.2mm的打孔器进行干血片打孔，置于干净的离心管中，每个孔中只放1个血斑，使用多通道或单通道移液枪以反向加液法向每孔中加入50μL内标工作液和50μL甲醇溶液，涡旋震荡10min后置于离心机，高速离心11000rpm 10min，取出70μL上清液转移到V型96孔板，其中每组设置高低质控各一个。

2.1.2血浆/血清样本预处理：

当检测样本为血浆样本/血清样本时，进行如下操作：

使用0.5-10μL单通道移液枪取样10μL检测样本于600μL离心管，加入内标工作液156.4μL，涡旋震荡3min后，置于离心机，高速离心11000rpm10min。使用单通道移液枪(移液枪头移完一次必须更换)取出70μL上清液转移到V型96孔板。注：每批检测样本加入高低质控各一个。

2.2衍生化处理：

使用氮吹仪，50℃加热，打开氮气流量阀至0.07MPa左右，15-18min氮气吹干。使用多通道移液枪加入60μL衍生化试剂至V型96孔板，粘性封膜密封，60℃振荡孵育30min。孵育完成后取下微孔板，静置1min，揭掉板垫，使用氮吹仪，50℃加热，打开氮气流量阀至0.07MPa左右，15-20min氮气吹干，随后使用多通道移液枪加入100μL超纯水至V型96孔板，封板垫密封，室温振荡孵育3min。在孵育完成后，把微孔板放入到Waters Xevo TQD样品管理器中，上样检测。

2.3样品检测：

将检测样品置于色谱串联质谱仪中检测，条件设置为：

离子源为电喷雾电离离子源(ESI，正离子模式)；

毛细管电压3.0kV；

去溶剂气温度400℃；

去溶剂气流速800L·h-1；

锥孔反吹气流速50L·h-1；

源温度150℃；

去溶剂气和锥孔反吹气为氮气(纯度99.9％)；

碰撞气为氩气(纯度99.999％)；

扫描方式为多重反应离子监测(MRM)，优化后的离子检测参数：母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量详细数值见表三所示：

表三3、数据分析：

通过串联质谱检测得到的结果如表四所示：

表四

通过本实验得到的标准品的谱图如图1-1到图1-10所示，检测品的谱图如图2-1到图2-10所示，如图可知，33种氨基酸被定性定量地精准检测得到。

本研究采用LC-MS/MS方法同时测定了干血片/血清/血浆中33种氨基酸。可同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，可极大地避免交叉反应的干扰。与此同时，在样品的衍生化处理过程中，在样本中加入盐酸正丁醇进行酯化反应，引入丁基改变待测物质分子结构，消除了潜在负离子，提高正离子模式下的离子化效率，减少潜在溶剂或其他干扰物质，同时降低了分析物极性，使其更加容易进入仪器真空环境，提高检测的灵敏度，极大地提高了氨基酸的检测效率。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，被适用于检测干血片/血清/血浆中的33种氨基酸，其特征在于，

检测的氨基酸包括：γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸、高脯氨酸；

所述试剂盒包括如下试剂：

①混合内标物：L-丙氨酸-D₄、L-苯丙氨酸-C₁₃、L-亮氨酸-D₃、L-缬氨酸-D₈、L-精氨酸-C₁₃,D4、L-瓜氨酸-D₂、DL-谷氨酸-D₃、L-酪氨酸-¹³C₆、L-鸟氨酸-D₂:HCl、L-甲硫氨酸-D₃、L-天门冬氨酸-D₃、甘氨酸-¹³C,¹⁵N、氨基丁酸-D₃、天冬酰胺-D₃、羟脯氨酸-D₃、赖氨酸-D₉、脯氨酸-D₇、丝氨酸-D₃、色氨酸-D₅；

②标准品：含：γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸、高脯氨酸；

③洗脱液：

洗脱液A：10mM甲酸铵+0.1％甲酸水溶液

洗脱液B：0.1％甲酸乙腈溶液；

④衍生化试剂：

正丁醇+乙酰氯；

⑤稀释剂：

稀释剂：甲醇溶液；

⑥质控品：

高质控品以及低质控品。

2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，其特征在于，所述混合内标物通过所述甲醇溶液制备成混合内标液，其中所述混合内标液中除了甘氨酸的浓度为125μM，其中氨基酸的浓度为25μM。

3.根据权利要求2所述的液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，其特征在于，所述标准品通过所述甲醇溶液制备成标准品母液，其中所述标准品母液中γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸、高脯氨酸的浓度分别为：3-4μM、7-5μM、8-9μM、21-22μM、17-18μM、17-18μM、22-23μM、113-114μM、156-157μM、229-230μM、226-227μM、335-336μM、406-407μM、406-407μM、419-420μM、423-424μM、243-244μM、814-815μM、816-817μM、847-848μM、847-848μM、887-888μM、996-997μM、1246-1247μM、1345-1346μM、1473-1474μM、1507-1508μM、2107-2108μM、13-14μM、13-14μM、29-30μM、211-212μM以及10-11μM。

4.根据权利要求3所述的液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，其特征在于，所述标准品母液混合制备成氨基酸混合标准液，当需要配制1mL氨基酸混合标准液时，组分A先用甲醇溶液稀释125倍后，取100μL；组分B先用甲醇溶液稀释9倍后，取100μL；组分C先用甲醇溶液稀释3.65倍后，取200μL；组分D先用甲醇溶液稀释2倍后，取200μL；组分E不稀释，取200μL；组分F先用甲醇溶液稀释75倍后，取100μL；组分G稀释15倍，组分H稀释125倍后混合，取100μL。

5.根据权利要求4所述的液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，其特征在于，所述低质控品为正常人的混合血浆，所述高质控品为含有33种氨基酸的血浆。

6.根据权利要求1到5任一所述的液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，其特征在于，洗脱液A的制备：取1000体积份超纯水，使用移液枪移去11体积份的水，再加入1体积份的甲酸，使用移液枪加入10体积份乙酸铵储备液，超声充分混匀，使用抽滤装置过滤后备用，其中所述乙酸铵储备液为1mol/L；

洗脱液B的制备：取1000体积份的色谱乙腈，使用移液枪移去1体积份水，再加入1体积份的甲酸，使用充分混匀备用。

7.根据权利要求1到5任一所述的液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒，其特征在于，所述衍生化试剂的配置：取正丁醇和乙酰氯先置于冰箱降温，按体积比例9:1配制，可将容器置于冰水中混合。

8.权利要求1到5任一所述的试剂盒的应用，其特征在于，

采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的干血片/血清/血浆中33种氨基酸，先利用高效液相色谱将33种氨基酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述33种氨基酸的含量。

9.根据权利要求8所述的试剂盒的应用，其特征在于，

当检测样本为干血片中的氨基酸时，打孔器进行干血片打孔，置于干净的离心管中，每个孔中只放1个血斑。使用多通道或单通道移液枪以反向加液法向每孔中加入体积比为1:1的混合内标液和甲醇溶液，涡旋震荡，置于离心机，高速离心，取出一定体积的上清液转移到孔板中；

当检测样本为血浆或血清中的氨基酸时，使用单通道移液枪取样于离心管，加入氨基酸混合内标，其中所述样本和氨基酸混合内标的体积比为1:15.6，涡旋震荡，置于离心机，高速离心，使用单通道移液枪，取出上清液转移到孔板。

10.根据权利要求9所述的试剂盒的应用，其特征在于，在液相色谱串联质谱检测中，离子源为电喷雾电离离子源；毛细管电压3.0kV；去溶剂气温度400℃；去溶剂气流速800L·h-1；锥孔反吹气流速50L·h-1；源温度150℃；去溶剂气和锥孔反吹气为氮气；碰撞气为氩气；扫描方式为多重反应离子监测，各氨基酸的质谱参数为：