CN111693624A - 一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与儿童多发性抽动症（Tourette syndrome,TS）诊断相关的血浆代谢标志物及其应用。所述标志物为L‑精氨酸、D‑哌啶酸。本发明的标志物从代谢物角度诊断儿童TS发病的风险，结果精确客观可靠，能够很好地将TS组和正常组区分开，可以准确、敏感的评价TS发生风险，并仅需提供血样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生制定早期诊断和干预方案提供指导依据。

Description

一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物及其 应用

技术领域

本发明涉及的是代谢组学领域和医学领域，具体涉及一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物及其应用。

背景技术

Tourette综合征(Tourette syndrome，TS)，又称为多发性抽动症，是一种儿童期起病的慢性神经精神障碍性疾病，可延续至青春期，临床以突然、反复、非节律性、不自主的一个或多个部位发生运动抽动和(或)发声抽动为特征，常见的运动性抽动可表现为眨眼、挑眉、咧嘴、耸肩等，发声性抽动如喉中哼哼声、清嗓声、尖叫声、秽语等。此外，患儿多伴有注意缺陷多动障碍(ADHD)、强迫障碍(OCD)、自闭症谱系障碍(ASD)、对立违抗障碍(ODD)及其他破坏行为等共病。TS曾经被认为是一种罕见的病，但目前最新的流行病学研究资料表明本病的发病率在0.4％-3.8％之间，且有逐年增高的趋势。本病发病年龄高峰在10-12岁之间，男女性别比为3-4∶1。TS病情的复杂性和严重性，严重影响了患儿的学习、生活、社会适应等，也使得患儿和家长的生活质量受到严重的影响。虽然一般情况下，以抽动为主要症状的运动行为障碍具有自限性，且可以通过行为、心理矫正和药物干预等可得到一定程度的缓解，但仍有近半数的患儿症状迁延，病情反复，治疗难度大，甚至延续至成年。

TS的发病原因十分复杂，具体包括遗传及解剖学病变、生物化学因素(如遗传、疾病所致的脑损伤、先天脑组织解剖及发育异常、神经生化异常等)、心理及社会因素(先天气质特征、持续的负面精神刺激和长期处于紧张与压力状态、社会文化及经济发展状况等)和环境因素(父母文化程度、养育及教育方式、不和谐的家庭氛围、空气污染及不健康食物等)等方面。总之，TS的最终发病应该是一个遗传、病理等先天因素与精神、环境、感染等后天因素相互作用的结果。关于TS的发病机制，多年来研究者围绕着神经解剖学、神经电生理学、神经生物化学等各方面进行了探讨研究，但仍尚未完全阐明该病的确切发病机制。除此之外，临床上关于TS的诊断仍存在困难。TS具有致病因素多源性、发病环节多层次性和临床症状组合出现等的综合征特点，临床上尚无公认的具有特异性检查指标和良好操作性的客观化诊断标准，目前国内外均采用临床描述性方法来对本病进行临床诊断，即主要是依赖准确、全面的病史陈述，相关的体检(主要是神经系统检查)和精神状况检查，直接交谈以观察患儿抽动及其他行为表现等的结果来综合判断。

临床上可供参考的诊断标准主要为美国《精神疾病诊断统计手册》第四版(DSM-IV)、世界卫生组织制定的国际疫病分类第10版(ICD-10)及修订的中国精神疾病分类方案及诊断标准(CCMD-3)等。目前国内外大多倾向采用的是DSM-IV的诊断标准，其中关于TS的诊断标准包括①：在病程中具有多种运动性抽动及和一种或多种发声抽动，但不一定必须同时发生(抽动是突发、迅速、反复发作、无节律性、刻板的运动或发声)；②：抽动一天发生多次，在长于1年的时间内几乎每日都有发作或间歇出现，在此期间从未有连续超过3个月的无抽动发作；③18岁前发病；④疾病不是由于药物(如：兴奋剂)或常见疾病(如：Huntington病或病毒感染后脑炎)的直接生理学作用所致。然而DSM中关于TS诊断标准的上限年龄是在变化的(15岁，21岁，18岁)，并要求在1年内未有超过3个月的无抽动发作，这些与ICD-10、CCMD-3并不一致(ICD-10、CCMD-3标准中提出发病年龄在21岁之前，在1年内抽动症状缓解不超过2个月)，这些数据进一步说明了TS诊断的复杂性。这种诊断上的复杂性导致很多患者出现诊断延误，因此发现一种明确而有效的生物标志物来诊断儿童TS的发生具有重要意义，这有助于临床该病的早期准确诊断和干预。

代谢组学是研究生命在内、外环境影响下的内源代谢活动，包括对代谢产物种类、数量及其变化规律的检测和分析，从而研究集体生命活动发生和发展的本质。由于代谢物是复杂的生物合成和分解代谢途径的最终产物，代谢物分子执行和响应了身体的大部分过程，因此代谢物研究被认为是生物功能的最具信息量的表现，代谢组学也被认为是一种比其他组学方法更具有预测性的研究外源性因素刺激引起的表型变化的有力技术。目前代谢组学在医疗领域的应用十分广泛，如疾病的诊断和筛查、疗效评估、药物开发及监测患者对治疗的反应等。代谢组学可分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学主要是无偏向地检测样本中所有能检测到的代谢物分子，是通过生信方法进行差异分析和通路分析，寻找生物标志物，初步建立模型的组学方法。而靶向代谢组学则是针对特定的代谢物进行检测，由于其使用了标准品，因此可以实现代谢物的绝对定量。两者联合可应用于差异代谢物的发现和精准定量，为后续代谢分子标志物进行深入的研究和分析奠定基础。

生物标记物是随着分子生物学技术和免疫学技术的发展而提出的一类细胞生物特异性标记。而内源性化合物作为人体内产生和发现的一类化合物，除了可以应用于药物发现方面，也可以用做于疾病的标记物。到目前为止人体内究竟有多少种代谢产物还很难说清楚，但包括脂肪、糖、氨基酸等在内的各种底物以及代谢过程中生成的小分子化合物能够为了解机体健康状态提供重要信息。目前氨基酸代谢、脂质代谢、糖代谢、核苷酸代谢等在医疗中的应用十分广泛。Zheng等使用代谢组学对58例重度抑郁障碍的患者和26例健康对照者的血浆样本进行分析，最终发现肌酐、甘氨酸、L-亮氨酸等11种代谢物可以作为重度抑郁障碍患者的诊断标志物。Yoshimi等基于代谢组学对15例双相情感障碍的患者和25例对照组的血清样本进行检测，最终发现患者血清Pyruvate、N-acetylglutamic acid、α-ketoglutarate、arginine水平较正常对照组水平显著升高，β-alanine、serine水平显著降低，从而提出这6个代谢物涉及的柠檬酸、尿素循环、氨基酸代谢参与了双相情感障碍的发病。又如犬氨酸代谢通路，这是脑内色氨酸代谢的主要途径，近些年研究发现多种中枢神经系统疾病的理化改变与该通路代谢紊乱相关。Zhang等采用UHPLC-Q-MOF/MS检测产前应激导致出现抑郁症状的小鼠海马代谢物，结果发现与对照组相比两者问存在38种差异代谢物，其中L-天冬氨酸、N-乙酰天冬氨酸、胆碱和甜菜碱醛与抑郁行为的相关性最强。除此以外，其他如精神分裂症、阿尔兹海默症等的代谢组学特征也被报道。TS作为一种神经精神障碍性疾病，目前其确切的发病机制并不清楚。已有的研究表明，皮质-纹状体-丘脑-皮层(CSTC)回路与TS的发病密切相关，几种神经递质的失常，包括多巴胺、GABA、谷氨酸等在CSTC回路中起着重要作用。

但目前为止尚未有关于TS的代谢组学特征报道，因此本研究基于非靶向代谢组学筛查出TS患者与健康儿童之间的血浆差异物，进一步基于靶向代谢组学技术对差异化合物进行验证，将得到的差异性代谢物运用于TS的临床诊断，且血浆的检测是无创的，非侵入的，因此从血浆中筛选出儿童TS的早期诊断标记物，可准确、方便的为临床医生制定早期诊断和干预方案提供依据。

发明内容

发明目的：针对现有临床诊断上的不确定性，本发明所要解决的技术问题是提供一种与儿童TS诊断相关的血浆代谢标志物。

本发明还要解决的技术问题是提供了儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物在制备儿童多发性抽动症诊断试剂盒中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物的筛选方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种儿童多发性抽动症诊断试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明基于非靶向代谢组学筛选技术和靶向代谢组学验证技术，提供了一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物，所述血浆代谢标志物为L-精氨酸、D-哌啶酸中一种或两种的组合。

本发明内容还包括所述的与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物在制备儿童多发性抽动症诊断试剂盒中的应用。

其中，所述应用包括通过非靶向代谢组学筛选技术筛选出多发性抽动症患儿与健康儿童之间的血浆差异化合物，经过靶向代谢组学的进一步验证，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度筛选得到多发性抽动症患儿与健康儿童之间的差异代谢物。

所述差异代谢物为L-精氨酸、D-哌啶酸。

本发明内容还包括一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物的筛选方法，包括以下步骤：先通过非靶向代谢组学筛选技术筛选出多发性抽动症患儿与健康儿童之间的血浆差异化合物，再经过靶向代谢组学的进一步验证，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度得到多发性抽动症患儿与健康儿童之间的差异代谢物。

其中，所述筛选方法具体包括以下步骤：

1)非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组样本准备：

2)靶向UHPLC-MS/MS代谢组样本准备；

3)非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组条件设置以及非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组数据处理与分析；

4)靶向UHPLC-MS/MS代谢组条件设置及靶向UHPLC-MS/MS代谢组数据处理与分析，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度筛选得血浆代谢标志物。

本发明内容还包括一种儿童多发性抽动症诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中L-精氨酸和/或D-哌啶酸。

其中，所述试剂盒还包括标准品。

其中，所述标准品为L-谷氨酸盐酸盐、D-鸟氨酸盐酸盐、L-鸟氨酸盐酸盐、D-哌啶酸、D-脯氨酸、L-精氨酸、L-高脯氨酸、左旋肉碱。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明基于非靶向代谢组学技术筛选出TS与健康儿童之间的血浆差异化合物，经过靶向代谢组学的进一步验证，得到TS患儿与健康儿童之间的差异代谢物。靶向代谢组学定量与非靶向代谢组学定性的特征相结合，获取的疾病诊断差异代谢物的准确性、灵敏度和特异性将大大提高。此外，血浆样本的获取是微创的，这将在很大程度上减轻患儿的痛苦。本发明的标志物从微观代谢物角度诊断TS，并且操作简单，结果精确客观可靠，能够很好地将TS组和正常组区分开，为临床准确的诊断提供了便利，且这仅需提供血样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生早期准确诊断和提供早期干预方案提供参考依据。

附图说明

图1、TS组儿童与健康组儿童血浆代谢物正离子模式下的PLS-DA图；

图2、TS组儿童与健康组儿童血浆代谢物负离子模式下的PLS-DA图；

图3、TS组儿童与健康组儿童血浆代谢物正离子模式下的Volcano图；

图4、TS组儿童与健康组儿童血浆代谢物负离子模式下的Volcano图；

图5、TS组儿童与健康组儿童血浆差异代谢物正离子模式下的聚类分析热图；

图6、TS组儿童与健康组儿童血浆差异代谢物负离子模式下的聚类分析热图；

图7、TS组儿童与健康组儿童正离子模式下血浆差异代谢物的代谢通路图；

图8、选择正模式下综合两种算法的combine p value值最显著的Aspartate andasparagine metabolism信号通路中匹配到的差异代谢物；

图9、经UHPLC-MS/MS鉴定出的两组之间的8个差异代谢物；

图10、用于儿童TS发生诊断效率的L-精氨酸的ROC曲线图；

图11、用于儿童TS发生诊断效率的D-哌啶酸的ROC曲线图；

图12、用于儿童TS发生诊断效率的L-精氨酸、D-哌啶酸联合组合的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1：

1、试验材料：色谱级乙腈(Merck)、甲醇(TEDIA)；乙酸铵(Sigma)；标准品L-谷氨酸盐酸盐、D-鸟氨酸盐酸盐、L-鸟氨酸盐酸盐、D-哌啶酸、D-脯氨酸、L-精氨酸、L-高脯氨酸、左旋肉碱(购自上海阿拉丁生化科技有限公司)；AB Triple TOF 5600质谱仪(购自于ABSCIEX，Framingham，MA，USA)；Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(购自于Agilent Technologies，Santa-Clara，California，USA)；Agilent 6460 Triplequadrupole mass spectrometer(购自于Agilent Technologies，Santa-Clara，California，USA)；低温高速离心机(Eppendorf5430R)；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm，2.1×100mm column(Waters)；Agilent ZORBAX Hilic Plus 1.8μm，50×2.1mm(Aglient，USA)。

2、样本收集和样本资料的整理：

本发明共计使用儿童血浆样本49例，其中在非靶向代谢组学部分中，TS组样本30例，正常组样本10例，两组样本之间年龄、性别无显著差异(性别P＝0.559，年龄P＝0.211)；靶向代谢组学验证部分，分别选取TS儿童血浆样本35例，正常儿童血浆样本14例，两组样本之间两组样本之间年龄、性别无显著差异(性别P＝0.773，年龄P＝0.064)。

3、样本准备

每个儿童用肝素钠抗凝管取3ml血液样本，3000rcf，4℃，离心10min，取上清血浆样本，至-80℃冰箱保存直至非靶向UHPLC-Q-TOF/MS和靶向UHPLC-MS/MS分析；

非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组样本准备：1)-80℃取出血浆样本(TS组样本30例，正常组样本10例)，4℃缓慢溶解后分别取各组样本100μl，加入400μl预冷的甲醇乙腈溶液(1∶1，v/v)，涡旋60s，-20℃放置1h沉淀蛋白，14000rcf，4℃，离心20min，取上清干燥冷冻；

2)制备QC样本：QC样本用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。取各儿童血浆样本(TS组样本30例，正常组样本10例)10μl全部混合在一起得到QC样本，处理方式与步骤1)处理方式相同。将血浆样本与QC样本上机进行UHPLC-Q-TOF/MS分析。

靶向UHPLC-MS/MS代谢组样本准备：

1)取200μl血浆样本(TS儿童血浆样本35例，正常儿童血浆样本14例)，加入200μl甲醇，涡旋60s，13000rcf，4℃，离心15min，取上清液；

2)标准品制备：各标准品(L-谷氨酸盐酸盐、D-鸟氨酸盐酸盐、L-鸟氨酸盐酸盐、D-哌啶酸、D-脯氨酸、L-精氨酸、L-高脯氨酸、左旋肉碱)精密取1mg，加入1ml甲醇溶解配置母液(浓度：1mg/m1)；再取母液10μl，加入990μl甲醇稀释(浓度：10μg/ml)。标准品稀释液各取100μl混合(各标准品浓度均为1.25μg/ml)。将血浆样本与标准品上机进行UHPLC-MS/MS分析。

4、非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组条件设置

色谱条件：样品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.3mL/min；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-1min，95％B：1-14min，B从95％线性变化至65％；14-16min，B从65％线性变化至40％；16-18min，B维持在40％；18-18.1min，B从40％线性变化至95％；18.1-23min，B维持在95％。整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

质谱条件：分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后用Triple TOF 5600质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析。HILIC色谱分离后的ESI源条件如下：离子源气体1：60Psi；离子源气体2：60Psi；气帘气：30Psi；离子源温度：600℃；离子喷嘴电压：±5500V(正负两种模式)；TOF MS扫描范围：60-1000Da；子离子扫描范围：25-1000Da；TOF MS扫描积累时间：0.20s/spectra，子离子扫描累积时间：0.05s/spectra；采用高灵敏度信息依赖性获取模式采集二级质谱，去簇电压：±60V(正负两种模式)，碰撞能量：35±15eV，IDA参数设置如下：排除同位素的质量范围：4Da，每个周期要检测的候选离子：6。

5、非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组数据处理与分析

将UHPLC-Q-TOF/MS导出的原始数据经Proteo Wizard转换成mzXML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。数据标准化处理后，采用MetaboAnalystR(2.0.3)软件进行统计分析，包括偏最小二乘法判别分析PLS-DA(图1-2)、结合LogFC分析和T检验的火山图等(图3～4)、层次聚类热图(图5-6)、富集通路分析。差异代谢物筛选参数为：Adjust.P Value＜0.05和|logFC|＞1，正负离子模式下共选出1775个差异代谢物。考虑到正离子模式下差异物的聚类情况优于负离子模式，我们最终选择了正离子模式下的差异物进行下一步的通路富集分析，我们使用了两种结合Mummichog和GSEA的富集算法，P＜0.05被认为具有统计学意义(图7)。对筛选出的最显著的通路(Aspartateand asparagine metabolism通路)中的差异性化合物(图8)进行自建库匹配，并将匹配到的8个差异物进行下一步靶向UHPLC/MS/MS验证(表1)。

表1 Aspartate and asparagine metabolism通路中匹配到的差异代谢物

6、靶向UHPLC-MS/MS代谢组条件设置

样品采用Agilent 1290 Infinity LC system和Agilent 6460 triplequadrupole mass spectrometer进行分析。

色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Hilic Plus(Aglient，USA)(50×2.1mm，1.8μm)，流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-1min，5％B；1-2min，线性增加到90％B；2-3min，90％B；3-3.1min，恢复到5％；3.1-4min，5％B。流速0.3mL·min^-1，进样量5μL，柱温30℃。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)正离子模式，干燥气温度350℃，干燥气流量10L·min^-1，毛细管电压为4000V(正离子)，3500V(负离子)，多反应检测模式(MRM)。各待测成分质谱参数见表2。

表2 8种成分的MS参数

7、靶向UHPLC-MS/MS代谢组数据处理与分析

7.1)采用GraphPadPrism8统计软件对UHPLC-MS/MS导出的数据进行录入及处理，计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，采用t检验和Mann-Whitney U检验分析TS患儿和健康儿童之间的8个差异代谢物(图9)，以P＜0.05筛选出具有统计学意义的差异代谢物，并绘制ROC曲线(Receiver Operating Curve)计算AUC(Area Under the ROC Curve)分析代谢物的特异性和灵敏度，共筛选出2个差异代谢物(L-精氨酸、D-哌啶酸)，其中L-精氨酸检测的准确度为100％，D-哌啶酸检测的准确度为98.0％。

7.2)对这2个用于诊断儿童TS的差异代谢物，绘制ROC曲线计算AUC(见图10-12)。

L-精氨酸以70.0％的AUC将TS组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：65.71％，特异度为：85.71％。

D-哌啶酸以80.3％的AUC将TS组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：82.35％，特异度为：78.57％。

L-精氨酸、D-哌啶酸组合以82.6％的AUC将TS组和正常组儿童分开，最佳临界点的灵敏度为：67.65％，特异度为：92.86％。

Claims (8)

1.一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物，其特征在于，所述血浆代谢标志物为L-精氨酸、D-哌啶酸中一种或两种的组合。

2.权利要求1所述的与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物在制备儿童多发性抽动症诊断试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括通过非靶向代谢组学技术筛选出多发性抽动症患儿与健康儿童之间的血浆差异化合物，经过靶向代谢组学的进一步验证，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度得到多发性抽动症患儿与健康儿童之间的差异代谢物。

4.一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：先通过非靶向代谢组学技术筛选出多发性抽动症患儿与健康儿童之间的血浆差异化合物，经过靶向代谢组学的进一步验证，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度得到多发性抽动症患儿与健康儿童之间的差异代谢物。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法具体包括以下步骤：

1）非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组样本准备：

2）靶向UHPLC-MS/MS代谢组样本准备；

3）非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组条件设置以及非靶向UHPLC-Q-TOF/MS代谢组数据处理与分析；

4）靶向UHPLC-MS/MS代谢组条件设置及靶向UHPLC-MS/MS代谢组数据处理与分析，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度筛选得血浆代谢标志物。

6.一种儿童多发性抽动症诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测血浆中L-精氨酸和/或D-哌啶酸。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为L-谷氨酸盐酸盐、D-鸟氨酸盐酸盐、L-鸟氨酸盐酸盐、D-哌啶酸、D-脯氨酸、L-精氨酸、L-高脯氨酸、左旋肉碱。

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