CN110286191A - 一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用 - Google Patents

一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110286191A
CN110286191A CN201910567782.XA CN201910567782A CN110286191A CN 110286191 A CN110286191 A CN 110286191A CN 201910567782 A CN201910567782 A CN 201910567782A CN 110286191 A CN110286191 A CN 110286191A
Authority
CN
China
Prior art keywords
xiaoyao san
metabolic
biological sample
metabolic markers
xiaoyao
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910567782.XA
Other languages
English (en)
Inventor
秦雪梅
高耀
田俊生
令狐婷
武嫣斐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi University
Original Assignee
Shanxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi University filed Critical Shanxi University
Priority to CN201910567782.XA priority Critical patent/CN110286191A/zh
Publication of CN110286191A publication Critical patent/CN110286191A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48785—Electrical and electronic details of measuring devices for physical analysis of liquid biological material not specific to a particular test method, e.g. user interface or power supply
    • G01N33/48792—Data management, e.g. communication with processing unit
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Human Computer Interaction (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于代谢组学技术领域，提供一种生物样品中逍遥散代谢标志物及其检测方法和应用，明确逍遥散治疗抑郁症的药理作用机制。所述代谢标志物为4‑羰基2,3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸。采用UPLC‑Q‑TOF/MS技术分析逍遥散给药组和对照组病人血浆和代谢轮廓变化，然后采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析(OPLS‑DA)来筛选逍遥散治疗8周后代谢标志物发生的变化。本研究作为首次逍遥散的临床代谢组学研究，我们发现了逍遥散代谢水平的影响，并在代谢通路层面对它的作用机制做出了初步的阐述，为预测逍遥散治疗抑郁症的药理机制提供新的方法。

Description

一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用
技术领域
本发明属于代谢组学技术领域，涉及一种生物样品中代谢标志物检测方法和应用，具体为生物样品中逍遥散代谢标志物及其检测方法和应用，该代谢标志物在制备抑郁症药物疗效评估试剂盒中的应用。
背景技术
代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，一门迅速发展的组学技术，是系统生物学的重要组成部分。整体性是代谢组学理论的基本观点，主要是通过核磁共振、质谱联用等技术手段来研究生物体系受刺激或扰动后代谢产物的变化及其规律。这些代谢产物水平的变化与相关代谢途径有重要关联，通过研究代谢物水平以及相关代谢途径的变化，可以从整体上了解机体的变化，从而为疾病的准确诊断及阐释药物的作用机制提供科学依据。目前，代谢组学研究方法已广泛应用于各类精神神经疾病的病理机制和药物作用机制的研究。
抑郁症是以情绪异常低落为主要临床表现的精神疾病，严重者可能导致自杀，具有发病率、复发率、致残率高等特点，到2020年将成为全球仅次于缺血性心脏病的第二位疾病负担源，其危害已引起全世界医药卫生界的重视。目前上市的抗抑郁西药种类和机制有限，且都有一定的不足。前期临床试验数据表明，逍遥散可以显著治疗抑郁症。逍遥散对神经递质、血浆皮质醇、免疫蛋白的含量有影响，也通过调节海马及杏仁核上的相关受体，达到保护神经元的作用，还具有调节HPA 轴的功能，起到抗抑郁作用。然而，逍遥散治疗抑郁症缺乏反映该方整体作用特点的药效学客观评价体系，这一问题是困扰逍遥散中药方剂现代化的关键科学问题，也是实现该中药国际化的瓶颈。故而，一种能够明确该药物作用机制的方法急待研究。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种生物样品中逍遥散代谢标志物及其检测方法和应用，该代谢标志物在制备抑郁症药物疗效评估试剂盒中的应用。明确逍遥散治疗抑郁症的药理作用机制。
本发明由如下技术方案实现的：一种生物样品中逍遥散代谢标志物，所述代谢标志物为4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸。
检测所述的生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，步骤如下：
（1）生物样品处理：生物样品在冰水混合物中解冻后，取200μL并加入800μL乙腈，充分震荡均匀后，4℃下13000 rpm离心20min，取上清液800μL，置于氮气下吹干；加入200μL的v/v 为80%的乙腈-水后，涡旋2 min，0.22 μm滤膜滤过，待UPLC-Q-TOF/MS分析；其中：所述生物样品包括受试抑郁症患者服用逍遥散前和8周后的血浆样本；
（2）采用UPLC-Q-TOF/MS检测所述待测溶液，进行代谢轮廓分析，获得数据集；其中：
液相条件：流动相A，含0.1%甲酸的水；流动相B，含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱：0~2min，2% B; 2~3 min，2% B -35% B；3~28 min，35% B-98%B；28~30 min，98% B；30-32 min，98% B-2%B；32-34 min，2% B；进样量: 5 μL; 流速，0.2 mL/min; 柱温: 35 ℃; WatersACQUITYUPLC HSST3 色谱柱( 2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；
质谱条件: 采用HESI离子化方式; 喷雾电压：正极，3.5 kV; 负极，2.5 kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35 arb，辅助气流速：10 arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100~1500，正负离子切换采集模式; 分辨率采用MS Full Scan35000 FWHM，MS /MS 17500 FWHM，NCE 为12.5 eV，25 eV和37.5 eV；
（3）根据所得到的数据用分析软件SIMCA-P 14.0构建偏最小二乘法判别分析OPLS-DA模型；
构建的模型中S-PLOT载荷图和计算VIP分值，同时获得相应的P值，以VIP值大于1 .0且P值小于0 .05为条件，筛选出能够区分空白组和逍遥散给药组的代谢标志物；
采用受试者工作特征曲线（ROC）分析方法对筛选得到的代谢标志物进行逍遥散疗效的诊断能力判定；
采用Metpa分析方法对筛选得到的代谢标志物进行富集分析。
所述生物样品还包括空白生物样品，其是指未服用逍遥散的受试抑郁症患者正常饮食下的空白血浆样品。
所述代谢轮廓分析具体步骤为：将采集到的所有数据导入SIEVE软件包，自动完成谱峰识别、滤噪的前处理程序，处理参数设置如下：时间范围：0-32min；质量范围：150-1500Da；质量偏差：0.01；最小强度：1%；质量窗：0.02；保留时间窗口：0.02；消除噪音水平：10；变化峰强度阈值：300；最后输出保留时间、精确质荷比和峰面积组成的三维矩阵；
利用Xcalibur工作站自带工具将UPLC-Q-TOF/MS采集到全部raw格式文件转换为NetCdf格式文件。
步骤（3）中构建偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型的方法为：
采用R软件调用XCMS数据包对 UPLC-Q-TOF/MS原始图谱先后进行滤噪、峰检测、峰对齐以及峰提取操作并生成csv格式文件；相关处理参数为：xcmsSet (full width at half-maximum：fwhm = 4；S/N cutoff xcmsSet (fwhm =4，snthresh =10，max = 20)，group (bw= 20)；将所生成csv格式文件导入Excel中进行峰面积归一化处理后进行多元统计分析；
将归一化后的数据导入SIMCA-P 14.0软件中，采用OPLS-DA去除与实验观察无关的随机信息，最大化提取与实验有关的变化来寻找两组之间的差异代谢物；并对OPLS-DA模型进行预测；最后结合S-plot图和计算VIP分值；采用软件SPSS 17.0进行方差分析以确定其统计学意义，最终确定与疾病以及药物疗效相关的差异代谢物，并作相应差异代谢物柱状图。
步骤（3）中所述代谢标志物以ROC的值≥0.7为条件进行筛选。
所述的生物样品中逍遥散代谢标志物在制备抑郁症药物疗效评估试剂盒中的应用，所述4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸加合作为整体指标，其ROC曲线下面积大于0.7。
本发明所述的代谢轮廓分析是指在特定代谢过程中对结构相似或性质相关的预设代谢物采用针对性的分析技术进行定量测定，如：某一类结构相似、性质相关的化合物等。
本发明运用Student 's T-test统计分析 (如：采用SPSS软件等进行计算)方法，判断差异代谢物是否具有统计学意义。
本发明所述代谢产物主要为脂质类代谢物和氨基酸类代谢物。
本发明所述4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚以及乙酰磷酸的ROC曲线下面积大于0.7（见表2），且四种物质加合所得的ROC曲线下面积最大，说明这四个差异代谢物对于逍遥散的临床抗抑郁疗效评价具有诊断价值，且这四种物质加合作为整体指标，对逍遥散抗抑郁疗效评价更具临床价值。
抑郁症的病理改变主要涉及中枢神经系统功能、免疫功能、神经内分泌功能及神经可塑性等。由此建立的假说主要有单胺假说、神经递质受体假说、情感性精神障碍的神经肽假说、神经内分泌功能假说、脑/神经细胞和信号水平异常、免疫功能异常假说等神经生物学争论。抑郁症是一种与代谢密切相关疾病，其发生和发展通过氨基酸代谢、能量代谢、肠微生物代谢、酮体代谢等途径。抑郁症病理机制不是某个代谢途径异常或某个特定区域单独受到扰动的结果，而是多个代谢途径异常或者多个区域的联合效应。因此，将基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学技术应用于逍遥散临床治疗患者的血浆样本的代谢轮廓分析，是揭示逍遥散治疗抑郁症药效机制的有效手段。同时，采集血浆样本，进行整合的代谢组学分析，将更加全面的表征逍遥散在人体内调控代谢通路的轨迹和效能。
在本发明中，采用UPLC-Q-TOF/MS技术分析逍遥散给药组和对照组病人血浆和代谢轮廓变化，然后采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)来筛选逍遥散治疗8周后代谢标志物发生的变化。本研究作为首次逍遥散的临床代谢组学研究，我们发现了逍遥散代谢水平的影响，并在代谢通路层面对它的作用机制做出了初步的阐述，为预测逍遥散治疗抑郁症的药理机制提供新的方法。
附图说明
图1、正离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流色谱图。
图2、负离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流色谱图。
图3、不同离子模式下训练集和验证集中抑郁症患者治疗前后血浆样本的OPLS-DA散点图以及相应的S-plots。DP，抑郁症组；Pre-DP，抑郁症预测组；XYS, 逍遥散组；Pre-XYS, 逍遥散组预测组。
图4、抑郁症患者血浆中差异代谢物相关代谢通路图。
具体实施方式
（一）数据采集
山西医科大学第一附属医院精神卫生科就诊的早期抑郁症患者。
入组病例的筛选：根据《中国精神疾病分类及诊断标准》(CCMD-3)诊断标准诊断为单次或反复抑郁发作的患者；17分＜基线时的HAMD17项评分＜24分，年龄18～65岁；男女不限，门诊或者住院患者；抑郁症状至少1个月。
逍遥散方药：柴胡、当归、白芍、炒白术、茯苓各60 g，炙甘草30 g、生姜、薄荷各20g。每日１剂，分早晚两次温服，每次180 mL，相当于毎mL含生药1.0 g，服用８wk。
本实施例以抑郁症患者为受试对象，并将其随机分为试验组与对照组。从收集的血浆样本中选择了22例完全符合要求的受试者经逍遥散治疗前后的血浆样本。
其中试验组：抑郁症患者加服逍遥散，每日１剂，分早晚两次温服，每次180 mL，连续使用8周。
对照组：抑郁症患者未服逍遥散。
采集早期抑郁症患者的血液置于真空采血管中，室温下3000 r/min离心10 min，取上清液，分装，−80 ℃冰箱中保存。
血液样品经样品前处理后，使用Waters ACQUITYUPLC HSST3 色谱柱( 2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱进行色谱分析。液相条件：流动相A，含0.1%甲酸的水；流动相B，含0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脱：0~2 min，2% B; 2~3 min，2% B -35% B；3~28 min，35% B-98%B；28~30 min，98% B；30-32 min，98% B-2%B；32-34 min，2% B。进样量：5 μL; 流速，0.2mL/min；柱温: 35 ℃；质谱条件：采用HESI离子化方式；喷雾电压：正极，3.5 kV; 负极，2.5kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35 arb，辅助气流速：10 arb；扫描模式为Full Scan /dd-MS2，采集范围为m/z100~1500，正负离子切换采集模式；分辨率采用MSFull Scan 35000 FWHM，MS /MS 17500 FWHM，NCE 为12.5 eV，25 eV和37.5 eV。
（二）数据处理
将上述分析条件采集到的所有数据导入SIEVE软件包 (Thermo-Fisher公司,USA)，该软件包可以自动完成谱峰识别、滤噪等前处理程序，处理参数设置如下：时间范围（retention time range）：0-32min；质量范围（mass range）：150-1500Da；质量偏差（masstolerance）：0.01；最小强度（minimum intensity）：1%；质量窗（mass window）：0.02；保留时间窗口（retention time window）：0.02；消除噪音水平（noise elimination level）：10；变化峰强度阈值（marker intensity threshold）：300。最后输出保留时间、精确质荷比和峰面积组成的三维矩阵。
利用Xcalibur工作站自带工具将UPLC-Q-TOF/MS采集到全部raw格式文件转换为NetCdf格式文件。
采用R软件调用XCMS数据包 (http://metlin.scripps.edu/ download/)对UPLC-Q-TOF/MS原始图谱先后进行滤噪、峰检测、峰对齐以及峰提取等操作并生成csv格式文件。相关处理参数为：xcmsSet (full width at half-maximum：fwhm = 4；S/N cutoffxcmsSet (fwhm =4，snthresh =10，max = 20)，group (bw = 20)。
将所生成csv格式文件导入Excel中进行峰面积归一化处理后用于多元统计分析。
采用如上的方法，将选定的抑郁症组和逍遥散给药后8个周患者的血浆液样本进行代谢轮廓分析。典型的正离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流色谱图如图1所示，典型的负离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流色谱图如图2所示。
（三）代谢组学数据分析
为了寻找与抑郁症以及逍遥散抗抑郁疗效相关的生物标志物，将归一化后的数据导入SIMCA-P 14.0 (Umetric，Sweden)软件中，采用OPLS-DA去除与实验观察无关的随机信息，从而最大化提取与实验有关的变化来寻找两组之间的差异代谢物。并对OPLS-DA模型进行预测，最后结合S-plot图中各点所代表的代谢物变量对分类的贡献程度（规定VIP＞1），并采用软件SPSS 17.0进行方差分析以确定其统计学意义，最终确定与疾病以及药物疗效相关的差异代谢物，并作相应差异代谢物柱状图。根据这些代谢物在体内的生物学功能、代谢通路以及动态变化的过程，分析逍遥散抗抑郁的疗效。
为了寻找与逍遥散抗抑郁作用相关的潜在生物标志物，我们对抑郁症患者治疗前后的血浆样本进行了OPLS-DA分析，得到图3。从图3中可以看出，正离子和负离子模式下，训练集中逍遥散组和抑郁症组样本明显分开（见图3A和3E），说明逍遥散对抑郁症患者体内血浆的代谢轮廓有一定调控作用。并且正离子模式和负离子检测模式下的验证集对逍遥散看抑郁症疗效表现出很好的预测能力。应用S-plot对得分图进行变量加载，并结合变量重要性（VIP）分析。然后对“S”曲线上VIP > 1 的代谢物的相对峰面积用SPSS 软件进行独立样本t 检验，得到20个与逍遥散抗抑郁疗效相关的潜在生物标志物（表1）。
表1：经LC-MS鉴定与逍遥散抗抑郁作用相关的潜在生物标志物。
（四）受试者工作特征曲线（ROC）分析
为了评价这些差异代谢物的临床诊断价值，将上述所得到的与逍遥散抗抑郁疗效相关的差异代谢产物进行受试者工作特征曲线分析（ROC, Receiver OperatingCharacteristic）。结果显示，训练集中，4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚以及乙酰磷酸的ROC曲线下面积大于0.7（见表2），且四种物质加合所得的ROC曲线下面积最大，说明这四个差异代谢物对于逍遥散的临床抗抑郁疗效评价具有诊断价值，且这四种物质加合作为整体指标，对逍遥散抗抑郁疗效评价更具临床价值。而验证集中这四种单个差异代谢物的ROC曲验证集中也显示出了同样的趋势，数值上小于训练集中的ROC曲线下面积。但不同的是，在验证集中，4-羰基2,3烯基己二酸、肌酐和硫胱醚三种物质加合后所得的ROC曲线下面积最大（见表2）。这种差异有可能是由于样本量限制所造成的，其最终结果有待于扩大样本进一步分析。
表2：差异代谢物ROC曲线下面积
注：A，4-羰基2,3烯基己二酸；B, 肌酐；C, 硫胱醚; D, 乙酰磷酸
（五）统计分析
采用SPSS软件，运用Student’s T-test统计分析方法，比较不同处理组之间的差异代谢物是否具有统计学意义。当P值小于0 .05时，则认为差异具有显著性。
采用如上统计方法，将代谢物的相对离子强度导入到SPSS软件进行t检验分析，结果表明所有差异代谢物的P值均小于0 .05，证明用本方法鉴定差异代谢生物标志物的准确性。
（六）代谢通路富集分析
在正常状态下，生物机体中各代谢物及其代谢途径通过相互制约而处于平衡状态。但是当机体发生病变或或被外界环境刺激时，这种平衡就会被打破，表现为体内代谢物水平的变化以及相关代谢路径发生紊乱。本实施例找到了神经酰胺（Stearic amide和Palmitic amide），肉碱（Carnitine C10:4和Carnitine C14:2）、溶血性磷酸酰胆碱（LPC10:3、LPC 16:1、 LPC 21:4、 LPC 19:0、LPC 18:0、LPC 23:5和 Unknown）、氧化磷酸酰胆碱（PC O 38:0）、植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、环己烷十一酸（Cyclohexaneundecanoicacid）、4-羰基2,3烯基己二酸（4-oxo hex-2-ene dioic acid）、肌酐（Creatinine）、硫胱醚（L-Cystathionine）、乙酰磷酸（Acetylphosphate）、4-乙酰氨基丁酸（4-Acetamidobutanoic acid）及十六碳二烯酸（Heptadecadienoic acid）20种与逍遥散抗抑郁疗效相关的差异代谢物，主要涉及甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）、鞘脂代谢（Sphingolipid metabolism）、脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism）、牛磺酸和亚牛磺酸代谢（Taurine and hypotaurine metabolism）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（Cysteine and methionine metabolism）以及精氨酸和脯氨酸代谢（Arginine andproline metabolism）等代谢通路（见图4）。由此可见，这些通路是逍遥散发挥抗抑郁的药效作用，调控机体代谢水平的关键途径。
（七）代谢通路相互作用图构建
在研究逍遥散给药组与对照组之间的代谢生物标志物差异中，发现了20个潜在代谢生物标志物。这些标志物的变化与相应代谢通路的关系密切，包括了甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢等通路。为了挖掘这些标志性代谢物之间的关系，通过搜索KEGG PATHWAY数据库，构建代谢通路图如图4所示。通过代谢生物标志物变化的可视化，可以更好地归纳、总结逍遥散给药组在代谢水平的通路改变。
本实施例通过结合UPLC-Q-TOF/MS数据与多元统计分析方法(OPLS-DA)，构建了逍遥散治疗抑郁症机制研究的代谢组学方法。通过此方法研究，我们发现了20种血浆的代谢标志物，这些标志物的变化与相应代谢通路的关系密切，包括了甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢等通路。
抑郁症的病理改变主要涉及中枢神经系统功能、免疫功能、神经内分泌功能及神经可塑性等。由此建立的假说主要有单胺假说、神经递质受体假说、情感性精神障碍的神经肽假说、神经内分泌功能假说、脑/神经细胞和信号水平异常、免疫功能异常假说等神经生物学争论。抑郁症是一种与代谢密切相关疾病，其发生和发展通过氨基酸代谢、能量代谢、肠微生物代谢、酮体代谢等途径。抑郁症病理机制不是某个代谢途径异常或某个特定区域单独受到扰动的结果，而是多个代谢途径异常或者多个区域的联合效应。
本实施例通过代谢组学的方法发现逍遥散可以调节甘油磷脂代谢发挥抗抑郁作用。溶血性甘油磷脂酰胆碱是由卵磷脂水解形成的，而卵磷脂有利于大脑的神经系统发育，促进神经传导。已有文献报道，与健康人相比，抑郁症患者血浆中磷脂水平偏高。抑郁症患者血浆中溶血性甘油磷脂酰胆碱（LPC 10:3、LPC 16:1、LPC 21:4、LPC 19:0、LPC 18:0）升高，经过逍遥散治疗后均出现显著回调并恢复到健康水平，表明逍遥散通过调节甘油磷脂代谢改善抑郁症状。
本实施例通过代谢组学的方法发现逍遥散可以调节鞘脂代谢发挥抗抑郁作用。鞘脂是脂类化合物中具有信号传导功能的一大类化合物，可以水解释放出神经酰胺。神经酰胺也可由丝氨酸和棕榈酸合成，是诱导细胞凋亡的重要细胞信号，也可以介入多种信号通路。抑郁症患者血浆中鞘磷脂和神经酰胺含量升高，服用逍遥散后，出现明显回调，表明逍遥散可能通过改善鞘磷脂代谢达到抗抑郁疗效。
本实施例通过代谢组学的方法发现逍遥散可以调节脂肪酸代谢发挥抗抑郁作用。脂肪酸是机体内含量最多的能量底物。在脂肪酸β-氧化过程中，酰基肉碱的作用是携带长链脂肪酸从细胞质转入线粒体，在机体生命活动中扮演着重要的角色。服用逍遥散后，抑郁症患者血浆中酰基肉碱类物质（Carnitine C14:2，Carnitine C10:4）含量回归正常水平，表明逍遥散可以通过改善脂肪酸代谢来改善抑郁症患者能力缺乏导致的活动减少以及睡眠质量不佳的症状。
本实施例通过代谢组学的方法发现逍遥散可以调节半胱氨酸和蛋氨酸代谢发挥抗抑郁作用。近年来，研究表明，丝氨酸在维持中枢神经系统正常功能方面起着非常重要的作用。丝氨酸的缺乏可以引起精神障碍以及中枢神经系统的衰退。逍遥散治疗后，抑郁症患者血浆中硫胱醚水平出现回调，表明逍遥散可能通过调控半胱氨酸和蛋氨酸代谢发挥抗抑郁疗效。
本实施例通过代谢组学的方法发现逍遥散可以调节牛磺酸和亚牛磺酸代谢发挥抗抑郁作用。乙酰磷酸（Acetylphosphate）是牛磺酸和亚牛磺酸代谢的重要中间产物。在牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路中，乙酰磷酸由磺基乙醛转化而来，并且通过乙酰转移酶和乙酸激酶转化为乙酰辅酶A和乙酸乙酯。牛磺酸是一种重要的神经递质。当人体缺乏牛磺酸时，中枢神经系统中的γ-氨基丁酸受体会受到严重制约，从而导致抑郁症的发生。经过逍遥散治疗后，抑郁症患者血浆中乙酰磷酸水平回调到正常水平，说明逍遥散的抗抑郁作用与牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路有关。
本实施例通过代谢组学的方法发现逍遥散可以调节精氨酸和脯氨酸代谢发挥抗抑郁作用。4-乙酰氨基丁酸（4-Acetamidobutanoic acid）是γ-氨基丁酸（GABA）的前体，是精氨酸和脯氨酸代谢中一个重要的中间体由精氨酸代谢转化而成。GABA是一种重要的抑制性神经递质，当人体内GABA缺乏时，会产生焦虑、抑郁等症。经过逍遥散治疗后，抑郁症患者血浆中4-乙酰氨基丁酸处于正常水平，说明逍遥通过调节精氨酸和脯氨酸代谢发挥抗抑郁作用。
由此得出逍遥散在主要影响抑郁症患者甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢等代谢通路的调节，与临床实践中相符合，也与以往的研究符合。
综上，本实施例采用LC-MS代谢组学技术完成了对临床抑郁症患者服用逍遥散前后血浆的测试以及分析。实验结果显示，服用逍遥散后，抑郁症患者血浆中这些代谢物水平出现明显回调现象，基本处于正常水平，主要涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢等代谢通路的调节，对逍遥散抗抑郁症作用机制的研究具有重要意义。另外，ROC曲线下面积分析结果显示，4-羰基2,3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸的ROC曲线下面积大于0.7，具有临床诊断价值，为逍遥散抗抑郁临床疗效评价体系的建立奠定基础。
本实施例，利用服用逍遥散后血浆的代谢标志物变化，成功预测了其在改善甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢的作用。而这与逍遥散临床研究的结果是一致的。本实施例也为预测其他中药复方制剂的药理机制提供了可行的方法。

Claims (8)

1.一种生物样品中逍遥散调节差异代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为神经酰胺（Stearic amide和 Palmitic amide），肉碱（Carnitine C10:4和Carnitine C14:2）、溶血性磷酸酰胆碱（LPC 10:3、LPC 16:1、 LPC 21:4、 LPC 19:0、LPC 18:0、LPC 23:5和Unknown）、氧化磷酸酰胆碱（PC O 38:0）、植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、环己烷十一酸（Cyclohexaneundecanoic acid）、4-羰基2,3烯基己二酸（4-oxo hex-2-ene dioic acid）、肌酐（Creatinine）、 硫胱醚（L-Cystathionine）、 乙酰磷酸（Acetylphosphate）、4-乙酰氨基丁酸（4-Acetamidobutanoic acid）及十六碳二烯酸（Heptadecadienoic acid）20种。
2.根据权利要求1所述的一种生物样品中逍遥散调节差异代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸。
3.检测权利要求1或2所述的生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）生物样品处理：生物样品在冰水混合物中解冻后，取200μL并加入800μL乙腈，充分震荡均匀后，4℃下13000 rpm离心20min，取上清液800μL，置于氮气下吹干；加入200μL的v/v 为80%的乙腈-水后，涡旋2 min，0.22 μm滤膜滤过，待UPLC-Q-TOF/MS分析；其中：所述生物样品包括受试抑郁症患者服用逍遥散前和8周后的血浆样本；
（2）采用UPLC-Q-TOF/MS检测所述待测溶液，进行代谢轮廓分析，获得数据集；其中：
液相条件：流动相A，含0.1%甲酸的水；流动相B，含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱：0~2min，2% B; 2~3 min，2% B -35% B；3~28 min，35% B-98%B；28~30 min，98% B；30-32 min，98% B-2%B；32-34 min，2% B；进样量: 5 μL; 流速，0.2 mL/min; 柱温: 35 ℃; WatersACQUITYUPLC HSST3 色谱柱( 2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；
质谱条件: 采用HESI离子化方式; 喷雾电压：正极，3.5 kV; 负极，2.5 kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35 arb，辅助气流速：10 arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100~1500，正负离子切换采集模式; 分辨率采用MS Full Scan35000 FWHM，MS /MS 17500 FWHM，NCE 为12.5 eV，25 eV和37.5 eV；
（3）根据所得到的数据用分析软件SIMCA-P 14.0构建偏最小二乘法判别分析OPLS-DA模型；
构建的模型中S-PLOT载荷图和计算VIP分值，同时获得相应的P值，以VIP值大于1 .0且P值小于0 .05为条件，筛选出能够区分空白组和逍遥散给药组的代谢标志物；
采用受试者工作特征曲线（ROC）分析方法对筛选得到的代谢标志物进行逍遥散疗效的诊断能力判定；
采用Metpa分析方法对筛选得到的代谢标志物进行富集分析。
4.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：所述生物样品还包括空白生物样品，其是指未服用逍遥散的受试抑郁症患者正常饮食下的空白血浆样品。
5.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：所述代谢轮廓分析具体步骤为：将采集到的所有数据导入SIEVE软件包，自动完成谱峰识别、滤噪的前处理程序，处理参数设置如下：时间范围：0-32min；质量范围：150-1500Da；质量偏差：0.01；最小强度：1%；质量窗：0.02；保留时间窗口：0.02；消除噪音水平：10；变化峰强度阈值：300；最后输出保留时间、精确质荷比和峰面积组成的三维矩阵；
利用Xcalibur工作站自带工具将UPLC-Q-TOF/MS采集到全部raw格式文件转换为NetCdf格式文件。
6.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：步骤（3）中构建偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型的方法为：
采用R软件调用XCMS数据包对 UPLC-Q-TOF/MS原始图谱先后进行滤噪、峰检测、峰对齐以及峰提取操作并生成csv格式文件；相关处理参数为：xcmsSet (full width at half-maximum：fwhm = 4；S/N cutoff xcmsSet (fwhm =4，snthresh =10，max = 20)，group (bw= 20)；将所生成csv格式文件导入Excel中进行峰面积归一化处理后进行多元统计分析；
将归一化后的数据导入SIMCA-P 14.0软件中，采用OPLS-DA去除与实验观察无关的随机信息，最大化提取与实验有关的变化来寻找两组之间的差异代谢物；并对OPLS-DA模型进行预测；最后结合S-plot图和计算VIP分值；采用软件SPSS 17.0进行方差分析以确定其统计学意义，最终确定与疾病以及药物疗效相关的差异代谢物，并作相应差异代谢物柱状图。
7.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：步骤（3）中所述代谢标志物以ROC的值≥0.7为条件进行筛选。
8.权利要求2所述的生物样品中逍遥散调节代谢标志物在制备抑郁症药物疗效评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸加合作为整体指标，其ROC曲线下面积大于0.7。
CN201910567782.XA 2019-06-27 2019-06-27 一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用 Pending CN110286191A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910567782.XA CN110286191A (zh) 2019-06-27 2019-06-27 一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910567782.XA CN110286191A (zh) 2019-06-27 2019-06-27 一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110286191A true CN110286191A (zh) 2019-09-27

Family

ID=68019225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910567782.XA Pending CN110286191A (zh) 2019-06-27 2019-06-27 一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110286191A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110954606A (zh) * 2019-10-08 2020-04-03 华中科技大学同济医学院附属协和医院 用于诊断结核性胸膜炎的胸水代谢物组合、试剂盒及方法
CN111693624A (zh) * 2020-06-22 2020-09-22 南京市中医院 一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物及其应用
CN111721862A (zh) * 2020-06-12 2020-09-29 山西大学 一种基于稳定同位素示踪代谢组学鉴定抑郁症能量代谢异常通路的方法
CN111896728A (zh) * 2020-07-07 2020-11-06 山西大学 一种检测柴胡石油醚部位抗抑郁量-效与量-毒关系的组合标志物及其应用
CN113125588A (zh) * 2021-03-17 2021-07-16 广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所 一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用
CN114544822A (zh) * 2020-11-24 2022-05-27 重庆医科大学 检测血浆中溶血磷脂酰胆碱(22:0)的试剂在制备抑郁症检测试剂盒中的用途
CN114544821A (zh) * 2020-11-24 2022-05-27 重庆医科大学 检测血浆中磷脂酰乙醇胺（36:4）的试剂在制备抑郁症检测试剂盒中的用途
CN114624345A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种联合生物标志物及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104777314A (zh) * 2009-08-12 2015-07-15 福满代谢组技术有限公司 抑郁症的生物标记物、抑郁症的生物标记物的测定方法、计算机程序及记录介质
CN105228521A (zh) * 2013-01-31 2016-01-06 布雷恩勒布斯有限公司 诊断抑郁症和监控治疗效果的新的诊断方法
WO2017087852A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Stress biomarkers and related non-invasive detection methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104777314A (zh) * 2009-08-12 2015-07-15 福满代谢组技术有限公司 抑郁症的生物标记物、抑郁症的生物标记物的测定方法、计算机程序及记录介质
CN105228521A (zh) * 2013-01-31 2016-01-06 布雷恩勒布斯有限公司 诊断抑郁症和监控治疗效果的新的诊断方法
WO2017087852A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Stress biomarkers and related non-invasive detection methods

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUNTAO DAI 等: "Metabolomics study on the anti-depression effect of xiaoyaosan on rat model of chronic unpredictable mild stress", 《JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY》 *
刘彩春: "逍遥散临床治疗抑郁症的血浆代谢组学研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
贾广成 等: "逍遥散对CUMS模型大鼠行为学及血浆内单胺类神经递质的影响", 《中国实验方剂学杂志》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110954606A (zh) * 2019-10-08 2020-04-03 华中科技大学同济医学院附属协和医院 用于诊断结核性胸膜炎的胸水代谢物组合、试剂盒及方法
CN111721862A (zh) * 2020-06-12 2020-09-29 山西大学 一种基于稳定同位素示踪代谢组学鉴定抑郁症能量代谢异常通路的方法
CN111721862B (zh) * 2020-06-12 2022-03-18 山西大学 一种基于稳定同位素示踪代谢组学鉴定抑郁症能量代谢异常通路的方法
CN111693624A (zh) * 2020-06-22 2020-09-22 南京市中医院 一种与儿童多发性抽动症诊断相关的血浆代谢标志物及其应用
CN111896728A (zh) * 2020-07-07 2020-11-06 山西大学 一种检测柴胡石油醚部位抗抑郁量-效与量-毒关系的组合标志物及其应用
CN111896728B (zh) * 2020-07-07 2023-10-13 山西大学 一种检测柴胡石油醚部位抗抑郁量-效与量-毒关系的组合标志物及其应用
CN114544822A (zh) * 2020-11-24 2022-05-27 重庆医科大学 检测血浆中溶血磷脂酰胆碱(22:0)的试剂在制备抑郁症检测试剂盒中的用途
CN114544821A (zh) * 2020-11-24 2022-05-27 重庆医科大学 检测血浆中磷脂酰乙醇胺（36:4）的试剂在制备抑郁症检测试剂盒中的用途
CN114544821B (zh) * 2020-11-24 2023-10-24 重庆医科大学 检测血浆中磷脂酰乙醇胺（36:4）的试剂在制备抑郁症检测试剂盒中的用途
CN114544822B (zh) * 2020-11-24 2023-10-24 重庆医科大学 检测血浆中溶血磷脂酰胆碱(22:0)的试剂在制备抑郁症检测试剂盒中的用途
CN114624345A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种联合生物标志物及其应用
CN113125588A (zh) * 2021-03-17 2021-07-16 广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所 一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110286191A (zh) 一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用
Liu et al. Plasma metabolomics of depressed patients and treatment with Xiaoyaosan based on mass spectrometry technique
Wang et al. Thyroxine and reserpine-induced changes in metabolic profiles of rat urine and the therapeutic effect of Liu Wei Di Huang Wan detected by UPLC-HDMS
Liu et al. Plasma-metabolite-biomarkers for the therapeutic response in depressed patients by the traditional Chinese medicine formula Xiaoyaosan: A 1H NMR-based metabolomics approach
Tian et al. Dynamic analysis of the endogenous metabolites in depressed patients treated with TCM formula Xiaoyaosan using urinary 1H NMR-based metabolomics
Su et al. Urinary metabonomics study of anti-depressive effect of Chaihu-Shu-Gan-San on an experimental model of depression induced by chronic variable stress in rats
Liu et al. Integrating hippocampal metabolomics and network pharmacology deciphers the antidepressant mechanisms of Xiaoyaosan
Zhang et al. Metabolomics study on the hepatoprotective effect of scoparone using ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadruple time-of-flight mass spectrometry
Liu et al. Biomarkers of primary dysmenorrhea and herbal formula intervention: an exploratory metabonomics study of blood plasma and urine
Li et al. Comparative metabolomics analysis on hematopoietic functions of herb pair Gui-Xiong by ultra-high-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry and pattern recognition approach
Li et al. Urine and plasma metabonomics coupled with UHPLC-QTOF/MS and multivariate data analysis on potential biomarkers in anemia and hematinic effects of herb pair Gui-Hong
Wang et al. Amino acid metabolism, lipid metabolism, and oxidative stress are associated with post-stroke depression: a metabonomics study
Zhang et al. Metabonomic study of biochemical changes in the rat urine induced by Pinellia ternata (Thunb.) Berit.
CN109507337A (zh) 一种基于血尿中代谢产物预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病机制的新方法
Zhang et al. Lipidomics to investigate the pharmacologic mechanisms of ginkgo folium in the hyperuricemic rat model
Zhang et al. Metabolomic study of raw and bran-fried Atractylodis Rhizoma on rats with spleen deficiency
Chen et al. Urine metabolomics reveals new insights into hyperlipidemia and the therapeutic effect of rhubarb
Wu et al. A HILIC-UHPLC–MS/MS untargeted urinary metabonomics combined with quantitative analysis of five polar biomarkers on osteoporosis rats after oral administration of Gushudan
Singh et al. Personalised therapeutic management of epileptic patients guided by pathway-driven breath metabolomics
Yuan et al. HS-GC-IMS-Based metabonomics study of Baihe Jizihuang Tang in a rat model of chronic unpredictable mild stress
Liu et al. Deciphering the Q-markers of nourishing kidney-yin of Cortex Phellodendri amurense from ZhibaiDihuang pill based on Chinmedomics strategy
Li et al. Non-target metabolomic analysis reveals the therapeutic effect of Saposhnikovia divaricata decoction on collagen-induced arthritis rats
Li et al. Time-series metabolomics insights into the progressive characteristics of 3, 5-diethoxycarbonyl-1, 4-dihydrocollidine-induced cholestatic liver fibrosis in mice
Liu et al. Fecal metabonomics study of raw and bran-fried Atractylodis Rhizoma in spleen-deficiency rats
CN109946411A (zh) 用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物及其筛选方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190927

RJ01 Rejection of invention patent application after publication