CN114624345A - 一种联合生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种联合生物标志物及其应用。所述联合生物标志物包括皮质醇、硝基油酸、泛醌、溶血磷脂酰胆碱中的至少两种。所述联合生物标志物为在健康对照与抑郁症组中的相对含量存在差异的代谢物的组合，可以有效地区分抑郁症与非抑郁症。

Description

一种联合生物标志物及其应用

技术领域

本申请涉及一种联合生物标志物及其应用，属于分析化学及临床检验领域。

背景技术

抑郁症(major depressive disorder，MDD)是当今社会一种常见的精神系统疾病。据世界卫生组织统计，该病已成为世界第四大疾患，预计到2020年，将成为仅次于冠心病的第二大疾病负担源。抑郁症是以情绪低落、兴趣减退、愉悦感缺失为核心症状的一系列综合征，具有患病率高、复发率高、自杀风险高、临床识别率低的特点。在我国，抑郁症的患病率约为3～5％，呈现逐年增加的趋势，且抑郁症的发病已开始出现低龄化趋势，波及大学生及中小学生群体，15％的患者最终走向自杀的结局，给患者家人和社会带来巨大的损失。

与抑郁症的高发病率形成鲜明对比的是抑郁症患者从未就医率高达60％，医疗机构对抑郁症的识别率不到20％。这主要是因为抑郁症的临床诊断主要根据病史、临床症状观察和家族病史和非特异性的实验室检查。临床症状包括心境低落、快感消失、睡眠及食欲异常、精神运动性激越或迟滞、疲乏、无价值感或过度内疚、集中注意的能力受损、自杀意念等，而这些表现缺乏一致性和特异性，在一般人群中也非常常见，却不总是与抑郁症相关。目前，没有客观的、非侵入性的方法来测量与MDD发病机理相关的生物学标志物。因此，亟待开发一种能够准确区分抑郁症的生物标志物。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种联合生物标志物，所述联合生物标志物为在健康对照与抑郁症组中的相对含量存在差异的代谢物的组合，可以有效地区分抑郁症与非抑郁症。

一种联合生物标志物，所述联合生物标志物包括皮质醇、硝基油酸、泛醌、溶血磷脂酰胆碱中的至少两种。

可选地，所述联合生物标志物包括：

皮质醇和溶血磷脂酰胆碱(20:4)；或

皮质醇、硝基油酸和溶血磷脂酰胆碱(20:4)；或

皮质醇、硝基油酸、泛醌和溶血磷脂酰胆碱(20:4)。

根据本申请的另一个方面，提供上述任一项所述的联合生物标志物在制备检测抑郁症的试剂、试剂盒或诊断设备中的应用。

可选地，所述检测为通过检测受试者生物样品中的联合生物标志物水平，并与预定阈值比较，以区分抑郁症和非抑郁症

可选地，所述检测包括：

(a)从受试生物样品中获取联合生物标志物中的每一种生物标志物相对含量；

(b)通过预定函数对这些生物标志物相对含量中的每个单独进行加权，每个回归系数为每个生物标志物所专用；；

(c)获得上述加权值的总和，得到联合生物标志物二元逻辑回归分类预测值；

(d)通过比较所述二元逻辑回归分类预测值与预定阈值的大小，如果所述二元逻辑回归分类预测值大于所述预定阈值，则将受试生物归为抑郁症，如果所述二元逻辑回归分类预测值不大于所述预定阈值，则将受试生物归为非抑郁症。

可选地，所述(a)包括：

(a-1)先采用盐析辅助液液萃取法处理所述生物样品，再提取所述生物样品中的非极性代谢物；

(a-2)获得所述非极性代谢物的质谱数据，生成峰面积信息；

(a-3)将每一种标志物的峰面积与总峰面积归一化，获得每一种标志物的相对含量。

采用准确率和ROC曲线下面积(AUC)评价联合生物标志物的诊断效果：

准确率＝(阳性预测预测值+阴性预测值)/2

阳性预测值＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％

阴性预测值＝真阴性/(真阴性+假阴性)×100％

AUC依据联合生物标志物二元逻辑回归分类预测值作受试者工作曲线获得，表示诊断系统中阳性和阴性诊断结果分布的重叠程度，反映诊断系统区分阳性和阴性诊断结果的能力。

可选地，非抑郁症包括健康对照。

可选地，抑郁症包括中度抑郁症患者和重度抑郁症患者。

该联合生物标志物可以将抑郁症与健康对照进行有效区分。

本申请原理如下：

(1)利用盐析辅助液液萃取(SALLE)处理来自受试者的样本，然后进一步提取非极性代谢物；并采用液相色谱-质谱的非靶向代谢组学技术，对健康对照、抑郁症患者的血浆样本进行代谢轮廓谱分析，获得代谢物定性、峰面积；

(1-1)所述提取非极性代谢物的方法为弱极性有机溶剂萃取；

(1-2)所述弱极性有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、石油醚中的至少一种。

(1-3)所述样本包括人类全血、血清、血浆中的至少一种。

(2)将代谢物峰面积与总峰面积归一化，获得代谢物的相对含量；或将代谢物峰面积与非放射性同位素内标峰面积归一化，获得代谢物的相对含量；

(2)基于多种生物学信息学数据处理方式，筛选生物标志物，具体实施如下：

a)多变量分析：建立健康对照组与抑郁症组样本的偏最下二乘判别分析模型，筛选重要性因子(VIP)值大于1的差异代谢物。

b)单变量分析：采用非参数检验法，筛选分别在健康对照与抑郁症组中具有显著性差异(p<0.05)的代谢物。

以上两种分析方法获得交集代谢物，删除假阳性率(FDR)>0.05的代谢物，作为获得生物标志物。

c)应用另一批健康对照和抑郁症患者血浆样本对以上获选生物标志物进行验证。

(3)利用二元逻辑回归模型将生物标志物相对含量输入，通过sigmoid函数输出得到联合生物标志物二元逻辑回归分类预测值，及各生物标志物的最佳回归系数。

除非另有定义，否则本发明文件中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通专业人员所通常理解的意义相同。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请所提供的生物标志物为联合生物标志物，即，不是单一标志物或一组单一标志物，更好地反映生物体的实际生理环境，有利于检测准确性。

2)本申请所提供的联合生物标志物为在健康对照与抑郁症组中的相对含量存在差异的代谢物的组合，可以有效地区分抑郁症与非抑郁症。

3)本申请所提供的联合生物标志物，通过检测受试者血浆中各生物标志物的相对含量，利用二元logistic逻辑回归模型，获得联合生物标志物预测分值P，以较高敏感性和特异性对健康对照与抑郁症进行划定。

附图说明

图1示出4种生物标志物在血浆样本中的相对含量分布，其中，A为皮质醇，B为硝基油酸，C为泛醌，D为溶血磷脂酰胆碱(20:4)；

图2示出3种联合生物标志物用于诊断抑郁症和健康对照的ROC曲线，其中A为联合生物标志物1，其中B为联合生物标志物2，其中C为联合生物标志物3；

图3示出3种联合生物标志物对抑郁症和健康对照的预测分值P分布，其中A为联合生物标志物1，其中B为联合生物标志物2，其中C为联合生物标志物3。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

实施例1使用LC-MS分析获取生物标志物的数值

1.样品采集

所有志愿者均于上午7:00～8:00空腹采血，志愿者包括健康对照和抑郁症患者。用含酶抑制剂及抗凝剂的真空采血管收集全血，3000rpm离心十分钟(4℃)，取上层血浆分装后置-80℃保存备用。抑郁症患者的临床诊断根据汉密尔顿抑郁量表(HAMD)进行评估。样本对象的年龄及抑郁症患病程度信息见附表1。

表1

2.分析方法

采用盐析辅助液液萃取法(SALLE)对血浆样本进行预处理：

1)解吸附：取分装好的血浆500μL置于10mL离心管，涡旋30s，加入200μL 5％磷酸(v/v)，涡旋30s；

2)萃取与除杂：加4mL 4M磷酸氢二钾，涡旋30s，加入4mL异丙醇，涡旋1min，3000rpm离心10min，将上清液4.5mL转移至5mL离心管，40℃下氮气吹干；

3)除盐：将2)所得样品中加入1mL异丙醇，超声30s，涡旋30s，7000rpm离心20min，将上清液950μL转移至1.5mL离心管；

4)质控样本：吸取各样本上述上清液90μL混合后分装成6份，作为质控样本；

5)萃取：将3)和4)所得上清液在40℃下氮气吹干，加入45μL 15％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))和30μL二氯甲烷，超声30s，涡旋30s，15000rpm离心1h，取下层溶液15μL干燥，45μL 60％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))超声30s，涡旋30s，15000rpm离心10min，取上清待分析。

采用高效液相色谱质谱分析：

液相色谱-质谱联用系统被用于生物样品中生物标志物相对含量的获取。使用LC-QTOF进行检测，色谱柱Agilent poroshell 120EC-C18(150mm×3.0mm,2.7μm)，柱温50℃。流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.35mL/min。洗脱梯度为：0～4min，20-70％B，4～10min，70～100％B，并保持2min，然后降至20％B并保持3min。质谱仪分析在正离子模式下进行，喷雾电压为3.5V，加热毛细管温度为350℃。采用Agilent MassHunterWorkstation软件记录总离子流图，质荷比范围为m/z 100～1200。

3.血浆测试结果及诊断潜力分析

使用Progenesis QI软件(美国沃特世)将通过LC-QTOF获得的非靶向分析的原始数据导出，所得数据表包括保留时间、质荷比值和峰面积信息。根据80％规则精炼数据表，并删除质控样品中峰面积％RSD低于30％的色谱峰，并计算获得总代谢物峰面积。将各代谢物峰面积分别对总代谢物峰面积归一化，获得各代谢物相对含量，基于各代谢物的相对含量进行生物标志物的筛选，筛选生物标志物，具体实施如下：

a)多变量分析：建立健康对照组与抑郁症组样本的偏最下二乘判别分析模型，筛选重要性因子(VIP)值大于1的差异代谢物。

b)单变量分析：采用非参数检验法，筛选分别在健康对照与抑郁症组中具有显著性差异(p<0.05)的代谢物。

以上两种分析方法获得交集代谢物，删除假阳性率(FDR)>0.05的代谢物，作为获得生物标志物。通过筛选结果，并依据保留时间和质荷比信息识别4种生物标志物(表2)。

表2

利用数据统计软件SPSS，二元logistic回归模型进一步将生物标志物回归为联合生物标志物。具体来讲，如表3～表5所示共建立了3个联合生物标志物组。

表3

表4

表5

实施例2对表3中联合生物标志物1进行评估

高效液相色谱-质谱分析联合生物标志物1(表3)列出的2种生物标志物在MDD患者组和健康对照组中的血浆相对含量，结果如图1所示。与健康对照组相比，皮质醇和溶血磷脂酰胆碱(20:4)相对含量显著升高(分别为图1A和图1D)。使用数据统计软件SPSS进一步将皮质醇和溶血磷脂酰胆碱(20:4)回归为联合生物标志物。回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(-4+50a+3.5b)})

a和b分别为血浆中皮质醇和溶血磷脂酰胆碱(20:4)的相对含量。所得预测分值P在MDD患者中增高，该预测分值可用于辅助判断MDD。

如图2A所示，该联合生物标志物通过预测分值P用于诊断MDD与健康对照时，得到ROC曲线下面积AUC值分别为0.792，具有较高的灵敏度(0.762)和特异性(0.702)。表6和附图3A表明，当使用该预定阈值0.5时，联合生物标志物1：皮质醇和溶血磷脂酰胆碱(20:4)在健康对照和抑郁症组中的预测分值P及准确率结果。

表6临床血浆样本中联合标志物1预测分值P及准确率

实施例3对表4中联合生物标志物2进行评估

高效液相色谱-质谱分析定量分析联合生物标志物2(表4)列出的3种生物标志物在MDD患者组和健康对照组中的血浆相对含量，结果如图1所示。与健康对照组相比，皮质醇、溶血磷脂酰胆碱(20:4)含量显著升高(分别为图1A和图1D)，硝基油酸的血浆含量显著降低(图1B)。使用数据统计软件SPSS进一步将皮质醇、硝基油酸、溶血磷脂酰胆碱(20:4)回归为联合生物标志物。回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(-3.45+45a-100b+4c)})

a、b和c分别为血浆中皮质醇、硝基油酸、溶血磷脂酰胆碱(20:4)的相对含量。所得预测分值P在MDD患者中增高，该变量值可用于辅助判断MDD。

如图2B所示，该联合生物标志物通过预测分值P用于诊断MDD与健康对照时，得到ROC曲线下面积AUC值分别为0.845，具有较高的灵敏度(0.857)和特异性(0.787)。表7和附图3B表明，当使用该预定阈值0.5时，联合生物标志物2：皮质醇、硝基油酸、溶血磷脂酰胆碱(20:4)在健康对照和抑郁症组中的预测分值P及准确率结果。

表7临床血浆样本中联合标志物2预测分值P及准确率

实施例4对表5中联合生物标志物3进行评估

高效液相色谱-质谱分析定量分析联合生物标志物3(表5)列出的4种生物标志物在MDD患者组和健康对照组中的血浆相对含量，结果如图1所示。与健康对照组相比，皮质醇和溶血磷脂酰胆碱(20:4)含量显著升高(分别为图1A和图1D)，硝基油酸和泛醌的血浆含量显著降低(分别为图1B和图1C)。使用数据统计软件SPSS进一步将皮质醇、硝基油酸、泛醌和溶血磷脂酰胆碱(20:4)回归为联合生物标志物。回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(-3.5+50a-100b-0.8c+4d)})

a、b、c和d分别为血浆中皮质醇、硝基油酸、泛醌和溶血磷脂酰胆碱(20:4)的相对含量。所得预测分值P在MDD患者中增高，该变量值可用于辅助判断MDD。

如图2C所示，该联合生物标志物通过预测分值P用于诊断MDD与健康对照时，得到ROC曲线下面积AUC值分别为0.845，具有较高的灵敏度(0.833)和特异性(0.830)。表8和附图3C表明，当使用该预定阈值0.5时，联合生物标志物3：皮质醇、硝基油酸、泛醌和溶血磷脂酰胆碱(20:4)在健康对照和抑郁症组中的预测分值P及准确率结果。

表8临床血浆样本中联合标志物3预测分值P及准确率

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (9)

1.一种联合生物标志物，其特征在于，所述联合生物标志物包括皮质醇、硝基油酸、泛醌、溶血磷脂酰胆碱中的至少两种。

2.根据权利要求1所述的联合生物标志物，其特征在于，所述联合生物标志物包括：

皮质醇和溶血磷脂酰胆碱(20:4)；或

皮质醇、硝基油酸和溶血磷脂酰胆碱(20:4)；或

皮质醇、硝基油酸、泛醌和溶血磷脂酰胆碱(20:4)。

3.根据权利要求1～2任一项所述的联合生物标志物在制备检测抑郁症的试剂、试剂盒或设备中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测为通过检测受试者生物样品中的联合生物标志物水平，并与预定阈值比较，以区分抑郁症和非抑郁症。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测包括：

(a)从受试生物样品中获取联合生物标志物中的每一种生物标志物相对含量；

(b)通过预定函数对这些生物标志物相对含量中的每个单独进行加权，每个回归系数为每个生物标志物所专用；

(c)获得上述加权值的总和，得到联合生物标志物二元逻辑回归分类预测值；

(d)通过比较所述二元逻辑回归分类预测值与预定阈值的大小，如果所述二元逻辑回归分类预测值大于所述预定阈值，则将受试生物归为抑郁症，如果所述二元逻辑回归分类预测值不大于所述预定阈值，则将受试生物归为非抑郁症。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述(a)包括：

(a-1)先采用盐析辅助液液萃取法处理所述生物样品，再提取所述生物样品中的非极性代谢物；

(a-2)获得所述非极性代谢物的质谱数据，生成峰面积信息；

(a-3)将每一种标志物的峰面积与总峰面积归一化，获得每一种标志物的相对含量。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，(a-1)中，所述提取为采用弱极性有机溶剂萃取。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述(a-2)还包括数据预处理的步骤：

根据80％规则精炼数据表，并删除质控样品中峰面积％RSD低于30％的色谱峰。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样品包括全血、血清、血浆中的至少一种。

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