CN113125615B - 三种代谢标志物单独或联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒方面的应用 - Google Patents

三种代谢标志物单独或联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三种代谢标志物单独或联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒方面的应用。本发明提供的代谢标志物arabitol、asparagine和stearic acid可以单独或任两个联合或三个联合诊断区分健康人和系统性红斑狼疮患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断系统性红斑狼疮的试剂盒的前景。另外，本发明提供的诊断指标为血清代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创。

Description

三种代谢标志物单独或联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试 剂盒方面的应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及代谢标志物在疾病诊断方面的应用，具体涉及三种代谢标志物单独或联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒方面的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种跟遗传、性激素、感染等多种因素相关的系统性自身免疫病。其以全身多系统多脏器受累、反复的复发与缓解、体内存在大量自身抗体为主要临床特点，患者可表现为环形红斑、精神改变、贫血等症状。
在实际的临床实践中，被广泛用于SLE诊断或疾病活动性的少数标志物仍然局限于抗核抗体、补体、几种自身抗体。
更多的诊断标志物有待开发。近年来“组学”领域的生物标志物作为辅助手段用于预先、准确、灵敏地判断出疾病发生情况，取得了较好的效果。生物标志物诊断可以区分疾病的类型以及疾病所处的阶段，辅助临床治疗。而且以血清标志物为例，该方法具有简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用，对患者非常友好。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供三种代谢标志物单独或联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒方面的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
三种代谢标志物单独或两两联合或三个联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒方面的应用，所述三种代谢标志物为arabitol(阿拉伯醇)、asparagine(天冬酰胺)和stearic acid(硬脂酸)。
一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，含有检测三种代谢标志物中一种或任意两种或全部三种的检测试剂，其特征在于：所述三种代谢标志物为arabitol、asparagine和stearic acid。
有益效果：
本发明提供的代谢标志物arabitol、asparagine和stearic acid可以单独或任两个联合或三个联合诊断区分健康人和系统性红斑狼疮患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断系统性红斑狼疮的试剂盒的前景。另外，本发明提供的诊断指标为血清代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创。
附图说明
图1为三种血清代谢物在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中的含量水平比较；
图2为arabitol区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图3为asparagine区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图4为stearic acid区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图5为arabitol联合asparagine区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图6为arabitol联合stearic acid区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图7为asparagine联合stearic acid区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图8为arabitol，asparagine和stearic acid联合区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：代谢标志物对系统性红斑狼疮的诊断效能
一、实验样本和试剂
收集江苏省中医院130例健康受试者和130例系统性红斑狼疮患者。健康受试者为体检健康的正常人，系统性红斑狼疮患者根据美国风湿病学会系统性红斑狼疮分类标准纳入。各组患者的年龄、性别和体重指数匹配，无显著性差异。按表1将各组受试者或患者随机分为训练集样本和验证集样本。
表1训练集样本和验证集样本样本数量
健康受试者(SS) 系统性红斑狼疮患者(HCS)
训练集 85 85
验证集 45 45
总样本数 130 130
排除标准：①合并有其他风湿科疾病；②合并有心脑血管、肝、肾脏和造血系统等严重原发性疾病；③患有精神疾病不能合作者；④近1个月内参加其它临床试验者；⑤不愿接受本研究者。
主要实验试剂：乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚、异丙醇、甲酸、甲酸铵、N，O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺、1％三甲基氯硅烷、甲氧胺盐酸盐、吡啶和1，2-13C2-肉豆蔻酸。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、GC-MS技术测定血清中目标代谢物的含量水平
检测仪器：Trace 1310gas chromatograph；TSQ 8000triple quadrupole massspectrometer(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)。
样本处理：将40μl血清与225μl冰甲醇混合。然后将每个样品涡旋10秒后加入750μl的冷MTBE，将混合物涡流10秒，在热混合器中4℃振荡10分钟。加入室温超纯水188μl，涡旋20秒后4℃，14000rcf离心2min。上清液与750μl甲醇：异丙醇(1：1)结合，在轨道混合器中摇动10分钟，4℃，14000rcf离心2min。取475μl的上清液在SpeedVac样品浓缩器中于45℃干燥2h，干燥后的等分与1μl的1，2-13C2-肉豆蔻酸(5mg/ml)和30μl盐酸甲氧胺在吡啶(10mg/ml)中混合，摇床旋转1min，30℃摇动90min。向样品中加入30μl含1％TMCs的BSTFA，37℃摇动30min，转移到有玻璃插件的样品瓶中，用GC-MS进行分析。SS和HCS患者的样本分析顺序是随机的，质控样本每批次注射一次，每批10个样本。以各样本中目标血清代谢物的检测峰面积代表其含量水平。
3、数据处理方法
训练集中，运用Logistic回归建立目标血清代谢物回归方程，产生一组新变量logit[P]，对该新变量进行ROC曲线分析，并根据ROC曲线得到最佳cut-off值；验证集中，根据SPSS25.0软件给出的预测概率计算目标血清代谢物的诊断准确率。
三、实验结果
1、目标血清代谢物在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中含量水平的差异
训练集中，代谢物阿拉伯醇、天冬酰胺和硬脂酸在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中的含量水平存在明显差异，如图1所示。
2、目标血清代谢物对健康受试者vs系统性红斑狼疮的诊断区分效能
2.1训练集构建回归方程
在训练集中，以各样本的血清代谢物阿拉伯醇含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.32-5.98X1，其中：X1为阿拉伯醇的含量水平。
在训练集中，以各样本的血清代谢物天冬酰胺含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.913+4.086X1，其中：X1为天冬酰胺的含量水平。
在训练集中，以各样本的血清代谢物硬脂酸含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-3.581+4.075X1，其中：X1为硬脂酸的含量水平。
在训练集中，以各样本的血清代谢物阿拉伯醇、天冬酰胺的含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝1.816-8.41X1+8.864X2，其中：X1为阿拉伯醇的含量水平，X2为天冬酰胺的含量水平。
在训练集中，以各样本的血清代谢物阿拉伯醇、硬脂酸的含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-2.570-2.806X1+3.079X2，其中：X1为阿拉伯醇的含量水平，X2为硬脂酸的含量水平。
在训练集中，以各样本的血清代谢物天冬酰胺、硬脂酸的含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-3.071+3.246X1+4.203X2，其中：X1为天冬酰胺的含量水平，X2为硬脂酸的含量水平。
在训练集中，以各样本的血清代谢物阿拉伯醇、天冬酰胺、硬脂酸的含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.15-6.175X1+7X2+1.51X3，其中：X1为阿拉伯醇的含量水平，X2为天冬酰胺的含量水平，X3为硬脂酸的含量水平。
2.2训练集确定最佳鉴别阈值
在训练集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图2所示)，AUC可达0.918，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.548。
在训练集中，将各样本的血清代谢物天冬酰胺含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图3所示)，AUC可达0.852，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.431。
在训练集中，将各样本的血清代谢物硬脂酸含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图4所示)，AUC可达0.937，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.629。
在训练集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇和天冬酰胺含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图5所示)，AUC可达0.980，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.230。
在训练集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇和硬脂酸含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图6所示)，AUC可达0.941，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.621。
在训练集中，将各样本的血清代谢物天冬酰胺和硬脂酸含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图7所示)，AUC可达0.957，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.439。
在训练集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇，天冬酰胺和硬脂酸含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图8所示)，AUC可达0.979，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.594。
2.3验证集验证诊断准确率
在验证集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率91.11％(82/90)。
在验证集中，将各样本的血清代谢物天冬酰胺含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率93.33％(84/90)。
在验证集中，将各样本的血清代谢物硬脂酸含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率80％(72/90)。
在验证集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇和天冬酰胺含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率97.78％(88/90)。
在验证集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇和硬脂酸含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率91.11％(82/90)。
在验证集中，将各样本的血清代谢物天冬酰胺和硬脂酸含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率98.89％(89/90)。
在验证集中，将各样本的血清代谢物阿拉伯醇，天冬酰胺和硬脂酸含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率97.78％(88/90)。
上述实施例表明，本发明提供的代谢标志物arabitol、asparagine和stearicacid可以单独或任两个联合或三个联合诊断区分健康人和系统性红斑狼疮患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断系统性红斑狼疮的试剂盒的前景。另外，本发明提供的诊断指标为血清代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创。
实施例2：诊断试剂盒
一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，含有检测arabitol、asparagine、stearicacid中一种或任意两种或全部三种的检测试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.一种代谢标志物在制备诊断系统性红斑狼疮的血清检测试剂盒中的应用，所述代谢标志物为arabitol、asparagine和stearic acid中的一种或任两种或三种；其中，所述诊断指诊断区分系统性红斑狼疮患者和健康人。
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