CN112881668B - 两种血清代谢物单独或联合用于制备诊断干燥综合征的试剂盒的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了两种血清代谢物单独或联合用于制备诊断干燥综合征的试剂盒的用途。本发明提供的血清代谢物PipecolinicAcid、LinoleicAcid可以单独或联合诊断区分健康人和干燥综合征患者，诊断准确率高，因而具有开发成诊断干燥综合征的试剂盒的前景。

Description

两种血清代谢物单独或联合用于制备诊断干燥综合征的试剂 盒的用途
技术领域
本发明属于疾病诊断领域，涉及疾病诊断标志物的发现和应用，具体涉及两种血清代谢物单独或联合用于制备诊断干燥综合征的试剂盒的用途。
背景技术
干燥综合征(Sjogren’s syndrome，SS)是一种自身免疫性疾病，以淋巴细胞侵袭唾液腺和泪腺为特征，伴有B细胞亢进。SS的主要临床表现为眼干和口干，除此之外还有其他外分泌腺及腺体外其他器官的受累而出现多系统损害的症状。SS包括原发性和继发性两类，继发性与系统性自身免疫性疾病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮或系统性硬化症有关。原发性SS在我国人群的患病率为0.3％～0.7％，在老年人群中患病率为3％～4％。本病女性多见，男女发病率比为1:9～20，发病年龄多在40岁～50岁。
目前，干燥综合征的发病机制尚不清楚，且尚无根治方法。临床上主要是采取措施改善症状，控制和延缓因免疫反应而引起的组织器官损害的进展以及继发性感染。
生物标志物可以作为反映生物体结构和功能发生改变的信号指标，用于检测复杂疾病的发生和进展。近年来“组学”领域的生物标志物作为辅助手段用于预先、准确、灵敏地判断出疾病发生情况，取得了较好的效果。多个生物标志物联合诊断可以区分疾病的类型以及疾病所处的阶段，辅助临床治疗。而且以血清标志物为例，该方法具有简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用，对患者非常友好。
本发明发现了两种血清代谢物可以单独或联合用于诊断干燥综合征，特提出本发明。
发明内容
本发明旨在克服现有技术不足，提供两种血清代谢物单独或联合用于制备诊断干燥综合征的试剂盒的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
两种血清代谢物单独或联合用于制备诊断干燥综合征的试剂盒的用途，所述干燥综合征为继发性干燥综合征，所述血清代谢物为Pipecolinic Acid、Linoleic Acid。
一种诊断干燥综合征的试剂盒，所述干燥综合征为继发性干燥综合征，该试剂盒中含有用于检测血清代谢物Pipecolinic Acid和/或Linoleic Acid的检测试剂。
有益效果：
1、本发明提供的诊断指标为血清代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创；
2、本发明提供的血清代谢物Pipecolinic Acid、Linoleic Acid单独或联合可有效诊断区分健康人和干燥综合征患者，诊断准确率高，因而具有开发成诊断干燥综合征的试剂盒的前景。
附图说明
图1为目标血清代谢物在健康受试者和干燥综合征患者血清中的含量水平比较；
图2为目标代谢物联合区分健康受试者vs干燥综合征的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：血清代谢物对干燥综合征的诊断效能
一、实验样本和试剂
收集江苏省中医院225例健康受试者和210例干燥综合征患者。健康受试者为体检健康的正常人，干燥综合征患者根据2012年美国风湿病学会(ACR)干燥综合征的分类标准确诊。各组患者的年龄、性别和体重指数匹配，无显著性差异。按表1将各组受试者或患者随机分为训练集样本和验证集样本。
表1训练集样本和验证集样本数量
健康受试者 干燥综合征患者
训练集 135 125
验证集 90 85
总样本数 225 210
排除标准：①明确诊断的原发性干燥综合征患者及其它自身免疫性和慢性疾病患者；②合并有心脑血管、肝、肾脏和造血系统等严重原发性疾病；③患有精神疾病不能合作者；④妊娠或哺乳期妇女，或准备妊娠者；⑤近1个月内参加其它临床试验者；⑥不愿接受本研究者。
主要实验试剂：液相色谱级乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和甲基叔丁基醚(MTBE)购自德国默克公司(Darmstadt,Germany)，异丙醇、甲酸和甲酸铵购自ROE(DE,USA)；超纯水采用了Milli-Q系统(Millipore,Billerica,MA,USA)；N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)、含1％三甲基氯硅烷(TMCS)、盐酸甲氧胺、吡啶和1,2-13C2-肉蔻酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、GC-MS技术测定血清中各代谢物的含量水平
检测仪器：采用Trace 1310气相色谱仪搭配AS 1310自动进样器进行色谱分离，TG-5MS气相色谱柱，使用TSQ 8000三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)进行全扫描；
色谱条件：色谱柱为TG-5MS气相色谱柱(0.25mm×30m，0.25μm)。载气为He2，设置恒定流速为1.2mL/min，采用分流模式，分流流速为24.0mL/min，分流比为20：1，进样口温度为250℃，升温程序：起始温度60℃，保持1min后，以20℃/min速率升至320℃，保持5min，样品进样体积为1μL。
质谱方法：采用EI模式，离子传输线温度为250℃，离子源温度为280℃，电离能为70eV，m/z采集范围为50-500，采集时间3.5-19min。
样本处理：先将血清样本在冰上解冻，然后往40μL血清中加入225μL冰甲醇(含内标5μg/mL)，涡旋10s后，加入750μL冰甲基叔丁基醚(MTBE)，在4℃震荡10min，加入188μL超纯水，涡旋20s后在4℃、14000r/min的条件下离心2min，吸取350μL上清至1.5mL的离心管中，挥干，-20℃保存。剩余液体再次离心2min，吸取250μL下层液体，加入750μL甲醇：异丙醇＝1：1，涡旋15s。然后在4℃下，振荡6min，再次离心2min，14000r/min。最后，取475μL上清于EP管中，挥干，一个备份，一个分析。干燥的下层物质加入1μL的1,2-13C2肉蔻酸(内标，5mg/mL)和30μL甲氧胺吡啶溶液(10mg/mL)，涡旋1min，振荡1.5h(30℃，600r/min)，再次加入30μL的BSTFA(含1％的TMCS)溶液后，涡旋1min，振荡0.5h(37℃，600r/min)。取上清50μL置于进样管中用作GC-MS分析。SS和HC患者的样本分析按随机号顺序进样，每10个样本插一个QC。
以各样本中Pipecolinic Acid、Linoleic Acid的检测峰面积代表PipecolinicAcid、Linoleic Acid的含量水平。
3、数据处理方法
训练集中，运用Logistic回归建立两个目标血清代谢物回归方程，产生一组新变量logit[P]，对该新变量进行ROC曲线分析，并根据ROC曲线得到最佳cut-off值；验证集中，根据SPSS 25.0软件给出的预测概率计算两个目标血清代谢物的诊断准确率。
三、实验结果
1、目标血清代谢物在健康受试者和干燥综合征患者血清中含量水平的差异
训练集中，代谢物Pipecolinic Acid和Linoleic Acid在健康受试者和干燥综合征患者血清中的含量水平存在明显差异，如图1所示。
2、目标血清代谢物对健康受试者vs干燥综合征的诊断区分效能
2.1训练集构建二元逻辑回归方程
在训练集中，以各样本的血清代谢物Pipecolinic Acid和Linoleic Acid的含量水平为两个自变量，以组别(健康受试者、干燥综合征)为应变量，构建得到二元逻辑回归方程logit[p]＝-1.074+2.591X1+6.482X2，其中：X1为Pipecolinic Acid的含量水平，X2为Linoleic Acid的含量水平。
2.2训练集确定最佳鉴别阈值
在训练集中，将各样本的血清代谢物Pipecolinic Acid和Linoleic Acid的含量水平代入上述二元逻辑回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图2所示)，AUC高达0.982(高于Pipecolinic Acid或Linoleic Acid单独诊断区分健康受试者vs干燥综合征的ROC曲线下面积0.797和0.762)，具有较高的准确性。根据ROC曲线计算Youden指数，Youden指数最大值时对应的logit[p]值为能进行诊断区分健康受试者和干燥综合征的最佳cut-off值0.387。
2.3验证集验证诊断准确率
在验证集中，将各样本的血清代谢物Pipecolinic Acid和Linoleic Acid的含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标代谢物区分健康受试者vs干燥综合征的准确率97.7％(171/175)。
综上可见：
1、本发明提供的诊断指标为血清代谢物，只需要采取少量血液即可检测，基本无创；
2、本发明提供的血清代谢物Pipecolinic Acid、Linoleic Acid单独或联合可有效诊断区分健康人和干燥综合征患者，诊断准确率高，因而具有开发成诊断干燥综合征的试剂盒的前景。
实施例2：诊断试剂盒
一种诊断干燥综合征的试剂盒，所述干燥综合征为继发性干燥综合征，该试剂盒中含有用于检测血清代谢物Pipecolinic Acid和/或Linoleic Acid的检测试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.检测血清代谢物Pipecolinic Acid的检测试剂、检测血清代谢物Linoleic Acid的检测试剂单独或联合用于制备诊断干燥综合征的试剂盒的用途，所述干燥综合征为继发性干燥综合征。
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