CN113552260B - 甘油-3-半乳糖苷在早期糖尿病肾病诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了甘油‑3‑半乳糖苷在早期糖尿病肾病诊断中的应用。本发明提供的血清代谢物甘油‑3‑半乳糖苷可以诊断区分健康人和糖尿病肾病早期患者，诊断准确率较高，具有开发制备成诊断早期糖尿病肾病的试剂盒的前景，填补市面上没有此类检测试剂盒的空白。

Description

甘油-3-半乳糖苷在早期糖尿病肾病诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及代谢标志物在疾病诊断中的应用，具体涉及甘油-3-半乳糖苷在早期糖尿病肾病诊断中的应用。
背景技术
生物标志物可以作为反映生物体结构和功能发生改变的信号指标，用于检测复杂疾病的发生和进展。近年来“组学”领域的生物标志物作为辅助手段用于预先、准确、灵敏地判断出疾病发生情况，取得了较好的效果。多个生物标志物联合诊断可以区分疾病的类型以及疾病所处的阶段，辅助临床治疗。而且以血清标志物为例，该方法具有简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用，对患者非常友好。
为了开发诊断早期糖尿病肾病的诊断试剂，特提出本发明。
发明内容
本发明目的在于提供甘油-3-半乳糖苷在早期糖尿病肾病诊断中的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
甘油-3-半乳糖苷在制备诊断早期糖尿病肾病的血清检测试剂盒中的应用。
一种诊断早期糖尿病肾病的血清检测试剂盒，含有检测甘油-3-半乳糖苷的检测试剂。
有益效果：
本发明提供的代谢物甘油-3-半乳糖苷可以有效诊断区分健康人和早期糖尿病肾病患者，诊断准确率较高，具有开发制备成诊断早期糖尿病肾病的试剂盒的前景，填补市面上没有此类检测试剂盒的空白。
附图说明
图1为甘油-3-半乳糖苷在HC和DKDE患者血清中的含量水平；
图2为甘油-3-半乳糖苷诊断区分HC vs DKDE的ROC曲线；
图3为甘油-3-半乳糖苷基于随机森林算法诊断区分HC vs DKDE的准确率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：甘油-3-半乳糖苷对糖尿病肾病的诊断效能
一、实验样本和试剂
共招募了5个队列来研究DKD患者的血清代谢组谱，包括在初级中心(南京中医药大学附属医院，N.J.)建立的1个发现队列和1个内部测试队列。在中南大学湘雅三院(C.S.)、同济大学同济医院(T.J.)、厦门大学中山医院(X.M.)设立3个外测队列。发现队列包括来自南京中医药大学附属医院的441名HCs、446名2-DM患者、121名DKD-E患者和94名DKD-A住院患者。在整个发现队列中进行血清代谢组学研究。然后从初级中心收集了内部测试队列样本，其中健康人群33例，2型糖尿病患者51例，DKD-E患者44例，DKD-A患者46例。此外，代谢组学数据还来自三个外部研究所：C.S.队列(29个健康、28个2-DM、27个DKD-E和26个DKD-A)、T.J.队列(45个2-DM、29个DKD-E和17个DKD-A)和X.M.队列(23个2-DM、9个DKD-E和4个DKD-A)。
入组标准：①20-75岁；②2型糖尿病诊断标准(所有患者)；③符合DKD微量白蛋白尿和大量白蛋白尿诊断标准；④eGFR≥90ml/min/1.73m2(2-DM组)，eGFR＞30ml/min/1.73m2(DKD-E和DKD-A组)；⑤血压＜140/90mmHg；⑥签署知情同意书。
排除标准：①明确诊断的原发性肾脏疾病；②可引起蛋白尿的其他系统性疾病；③近1个月内有糖尿病急性并发症及泌尿系感染；④合并有心脑血管、肝、肾脏和造血系统等严重原发性疾病；⑤患有精神疾病不能合作者；⑥妊娠或哺乳期妇女，或准备妊娠者；⑦近1个月内参加其它临床试验者；⑧不愿接受本研究者。
主要实验试剂：甲醇，MTBE，异丙醇，乙腈，醋酸铵，氢氧化铵。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、GC-MS技术测定血清中目标代谢物的含量水平
样本处理：将40μl血清与225μl冰甲醇混合。然后将每个样品涡旋10秒后加入750μl的冷MTBE，将混合物涡流10秒，4℃轨道混合器中振荡10分钟。加入室温超纯水水188μl，涡旋20秒后4℃，14000rcf离心2min。上清液与750μl甲醇：异丙醇(1：1)结合，在轨道混合器中摇动10分钟，4℃，14000rcf离心2min。取475μl的上清液在SpeedVac样品浓缩器中于45℃干燥成对预测样本分组摇动30min，转移到有玻璃插件的样品瓶中，用GC-MS进行分析。质控样本每批次注射一次，每批10个样本。
在配备AS 1310自动进样器的Trace 1310气相色谱仪上进行分析，该自动进样器连接到TSQ 8000三重四极杆质谱仪(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo FisherScience)。为了检测和消除保留时间漂移，在每批样品的分析过程中将标准正构烷烃混合物(C8-C40)注入GC/MS。
以各样本中各目标代谢物的检测峰面积表示其含量水平。
3、数据处理方法
对每个代谢物进行非参数Wilcox秩和检验。调整p值后，以5％的假发现率(FDR<0.05)和大于0.2的绝对log2倍变化来定义显著差异表达的代谢物，甘油-3-半乳糖苷表达水平差异显著。采用LDA、SVM、RF、LogI和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)五种机器学习算法，对发现队列中的成对预测样本分组进行5次交叉验证，生成ROC曲线。然后进一步测量内部和三个外部测试队列中代谢物的表达，从发现队列训练的分类器被应用于这些测试队列以评估模型性能。
三、实验结果
1、甘油-3-半乳糖苷在DKDE、HC血清中含量水平的差异
与HCs相比，DKDE患者血清中甘油-3-半乳糖苷的相对含量明显上调(如图1所示)。
2、甘油-3-半乳糖苷诊断区分DKDE患者的ROC曲线
为了验证识别的差异表达代谢物在预测DKD状态中的诊断价值，分别采用了LDA、SVM、RF、LogI和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)五种机器学习算法。对发现队列中的成对预测样本分组进行了5次交叉验证，生成了ROC曲线，甘油-3-半乳糖苷对HC与DKDE的预测准确率可达82％(图2)。
3、甘油-3-半乳糖苷基于随机森林算法诊断区分DKDE患者的预测概率
最佳截止值是从发现队列中训练出来的，并应用于测试队列进行预测。点图显示了发现和测试队列中每个患者的随机森林预测结果的概率，其中虚线截止点表示预测的二进制分裂。基于发现阶段ROC的最高预测概率，HC与DKDE的最佳截断值为0.433，C.S.队列的预测准确率达到62.5％。
上述实施例表明，本发明提供的代谢物甘油-3-半乳糖苷可以有效诊断区分健康人和早期糖尿病肾病患者，诊断准确率较高，具有开发制备成诊断早期糖尿病肾病的试剂盒的前景，填补市面上没有此类检测试剂盒的空白。
实施例2：诊断试剂盒
一种诊断区分健康人与糖尿病、糖尿病肾病早期的试剂盒，含有用于检测血清甘油-3-半乳糖苷的检测试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.甘油-3-半乳糖苷在制备诊断早期糖尿病肾病的血清检测试剂盒中的应用；其中，所述“糖尿病肾病”中的“糖尿病”指2型糖尿病。
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