CN110389180B

CN110389180B - 醛固酮在制备用于评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN110389180B
Application number: CN201810358307.7A
Authority: CN
Inventors: 杜杰; 王媛; 檀鑫; 李凤娟; 王雪
Original assignee: BEIJING INSTITUTE OF HEART LUNG AND BLOOD VESSEL DISEASES
Current assignee: BEIJING INSTITUTE OF HEART LUNG AND BLOOD VESSEL DISEASES
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN110389180A

Abstract

本发明公开了醛固酮在制备用于评估或辅助评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用。本发明还公开了一种评估或辅助评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒，其包括用于检测心力衰竭患者生物样品中醛固酮含量的产品。所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：对于HFpEF患者，当所述生物样品中醛固酮的浓度在较高的二分位时(即浓度大于53.7pg/mL时)，与较低二分位相比(即浓度小于53.7pg/mL时)，则判定所述患者具有全因住院率和全因死亡率/全因住院率的升高风险。

Description

醛固酮在制备用于评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及醛固酮在制备用于评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用。

背景技术

心力衰竭是一种以高住院率为特征的进展性疾病。近半数心衰患者的左室射血分数(LVEF)是正常或接近正常的，这部分患者被定义为射血分数保留性心衰患者(HFpEF)，HFpEF的发病率在逐年增加。这表明目前HFpEF的精确临床诊断存在困难，而且各个中心所使用的LVEF临界值(40％～55％)可能不同。HFpEF真正的病理机制尚不明确。鉴于此类疾病诊断与病理机制的不确定性，当前并无针对HFpEF的循证治疗方法，尚无有效的方法能够减少HFpEF患者的发病率及死亡率，需要有新的生物标志物协助HFpEF的诊疗和管理。

发明内容

本发明的目的是提供一种醛固酮的新用途。

本发明所提供的醛固酮的新用途是其在制备用于评估或辅助评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用。

所述醛固酮的结构式如式I所示：

所述心力衰竭患者尤其是指射血分数保留性心衰患者(HFpEF，LVEF≥40％)。

所述心力衰竭患者发生不良事件风险是指所述心力衰竭患者出院后全因住院和/或全因死亡不良事件的发生风险。

本发明的再一个目的是提供一种评估或辅助评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒。

所述试剂盒包括用于检测心力衰竭患者生物样品中醛固酮含量的产品。

所述生物样品为血液样品、血清样品、血浆样品或由此获得的血液脂质部分或血液脂蛋白部分；

所述检测心力衰竭患者生物样品中醛固酮含量的产品包括对所述生物样品中醛固酮进行提取、用LC-MS/MS进行测定所需的试剂(如醛固酮等)。

所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：

对于HFpEF患者，当所述生物样品中醛固酮的浓度在较高的二分位时(即浓度大于53.7pg/mL时)，与较低二分位相比(即浓度小于53.7pg/mL时)，则判定所述患者具有全因住院率和全因死亡率/全因住院率的升高风险。

所述心力衰竭患者发生不良事件风险是指所述心力衰竭患者具有再入院和/或发展死亡的升高风险。

上述用于评估或辅助评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒的使用方法，包括下述步骤：

1)检测心力衰竭患者生物样品中醛固酮含量；

2)确定所述患者生物样品中醛固酮的浓度；

3)对于HFpEF患者，当所述生物样品中醛固酮的浓度在较高的二分位时(即浓度大于53.7pg/mL时)，与较低二分位相比(即浓度小于53.7pg/mL时)，则判定所述患者具有全因住院率和全因死亡率/全因住院率的升高风险。

检测血浆中的醛固酮之前常规的方法是基于抗原抗体免疫反应，快速并且易于操作，但它的问题是存在交叉反应，实验室之间的重现性较差。Schirpenbach等人报道了使用目前四种方法检测醛固酮，所得浓度相差2-3倍。液质联用方法作为一个有力的分析技术越来越多的应用于临床。与免疫法不同，基于质谱的检测方法灵敏度和特异性都会增加。本发明建立了小体积液质联用技术检测血浆中的醛固酮水平，有效减少生物样本库的损耗。

附图说明

图1为健康个体和心力衰竭患者不同分组中醛固酮的浓度。

图2为醛固酮水平和左心室射血分数之间的关系图。(HFrEF是指射血分数下降的心衰，LVEF<40％；HFpEF是指射血分数保留的心衰，LVEF≥40％。

图3为HF,HFrEF，HFpEF患者中的Kaplan-Meier曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中生物样品(包括血液样品、血清样品、血浆样品或由此获得的血液脂质部分或血液脂蛋白部分)中醛固酮的检测方法按照下述方法进行：

LC-MS/MS样品加标液液萃取。

在配备有超高压液相色谱串联质谱系统Ultimate 3000串联TSQ Quantiva三重四级杆质谱仪(Thermo Fisher Corp.)进行检测。将通过质谱法获得的所检测峰的质量和计数转化为相应醛固酮浓度列表。产生标准曲线(calibration curve)以确定所检测的醛固酮的动态定量范围。

应用严格的阈值，从而将背景噪声与实际醛固酮峰分离。控制每个样品，并且仅当满足接受标准时方能接受。将所检测峰的质量和计数转化为相应醛固酮名称的列表，并根据醛固酮与内标的比值，应用标准曲线进行定量，并由样品体积获得它们的浓度。标准曲线由将已知量的外参标准品(醛固酮)与无醛固酮血浆混合制得。

样本提取操作步骤如下：

1：标准品稀释

1)醛固酮储备液的配制

精密称取标准粉末适量，加入甲醇溶液，制得浓度为1000ug/ml的醛固酮溶液，-20℃保存；

2)内标溶液的配制

配置醛固酮内标标准液：取醛固酮内标原液(100ug/mL)100ul加入900ul甲醇中配置10ug/mL内标标准液，配置1ug/mL的内标稀释液，然后用20％甲醇梯度稀释至10ng/mL。

3)工作液的配制

取醛固酮适量，用20％甲醇稀释成系列浓度工作液，其中醛固酮系列浓度分别为100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000和50000pg/mL。

4)标准曲线的配制

分别取上述含醛固酮系列浓度工作液10μL，加入20％甲醇溶液90μL，对应标曲10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000pg/mL，按照“样品前处理”步骤处理样品后进样分析。

注意：1)纯标梯度保存一周，保存超过一周的纯标梯度不可使用。应重新配制。

2:样本前处理：

1)取离心管若干，在90ul不同浓度标准曲线和血浆样本中各加入10uL的10ng/mL醛固酮内标溶液，涡旋混匀。

2)在每个离心管内加入800uL萃取液，涡旋三分钟，5000RPM转速下离心五分钟。

3)从每个离心管内吸取700uL上层清液至1.5毫升离心管内，氮吹15分钟。下层液体内继续加入800uL萃取液，吸取800uL上层清液，加入第一次氮吹的离心管中。继续氮吹，约15分钟，直至吹干。

4)在氮吹完的离心管中加入100uL50％甲醇溶液，涡旋一分钟，14000RPM转速离心10分钟，取80uL置于上样瓶，进样体积为20微升。

3:色谱柱处理

色谱柱新换上时，对于醛固酮检测，要先用100％B液冲洗30min，再用15％B液，85％A液冲洗30min；晚上离开不跑样时，要用100％B液封柱。

注意：不要用100％A相去冲柱子，因为是反相柱，会对柱子造成影响。

将样品提取物(20μL)在40℃的柱温下加载到连接至Hypersil GOLD 50*2.1mm1.9um C18色谱柱上。流动相A是水，流动相B是甲醇，流速0.3mL/min，梯度如表1所示。离子源温度设置为300℃；具体参数使用Xcalibur 4.0操作软件进行分析，通过醛固酮外标/内标的峰面积比对实际浓度作图构建标准曲线，根据标准曲线和样品中醛固酮/内标的峰面积比计算样本中相应醛固酮的含量。醛固酮的线性范围是10-5000pg/mL,标准曲线r²>0.995，血浆中醛固酮的批内精密度通过检测动态范围内的三个浓度(20、500和4000pg/mL)，每个浓度点6个样本，进行检测，所得结果为8.7％、3.6％和2.8％。血浆中醛固酮批间的精密度对应三个浓度分别为9.9％、5.7％和6.1％。血浆中醛固酮的提取回收率批次内的结果为94.1％、94.2％和94.3％；批间提取回收率分别为92.8％、98.2％和97.6％；均接近与100％。

表1流动相梯度设置

实施例1

对138例心衰患者随访平均221天后，11人去世，26人再次入院。结局事件为全因死亡、全因住院和全因死亡或者全因住院。心衰患者中较高的基线醛固酮水平与较高的全因死亡率以及全因死亡率或者全因住院率显著相关(log rank<0.05)。HFrEF患者中较高的基线醛固酮水平与较高的全因死亡率显著相关(log rank<0.05)。HFpEF患者中较高的基线醛固酮水平与较高的全因住院率和全因死亡率/全因住院率显著相关(log rank<0.05)

如图1所示，入院诊断为心力衰竭或心功能大于2级(NYHA分级)患者血浆中醛固酮含量为112±13.29pg/mL，年龄性别匹配的正常对照血浆样本中醛固酮含量为52.3±2.609pg/mL，HFrEF患者血浆中醛固酮含量为142.4±23.06pg/mL，HFpEF患者血浆中醛固酮含量为79.16±11.37pg/mL，HFrEF与正常对照相比，醛固酮水平显著升高，进行log10转换后，p＝0.0008。将心力衰竭组根据LVEF值分为两组，HFrEF(LVEF<40％)和HFpEF(LVEF≥40％)组。在HFrEF组血浆中醛固酮含量显著增高，p＝0.0237。

如图2所示，入院诊断为心力衰竭或心功能大于2级(NYHA分级)患者血浆中醛固酮水平与LVEF值负相关，说明醛固酮水平与心脏功能相关。

如图3所示，对138例心衰患者随访平均221天后，11人去世，26人再次入院。结局事件为全因死亡、全因住院和全因死亡或者全因住院。心衰患者中较高的基线醛固酮水平与较高的全因死亡率以及全因死亡率或者全因住院率显著相关(log rank<0.05)；HFrEF患者中较高的基线醛固酮水平与较高的全因死亡率显著相关(log rank<0.05)；HFpEF患者中较高的基线醛固酮水平与较高的全因住院率和全因死亡率或者全因住院率显著相关(logrank<0.05)。对于HFpEF患者，当所述生物样品中醛固酮的浓度在较高的二分位时(即浓度大于53.7pg/mL时)，与较低二分位相比(即浓度小于53.7pg/mL时)，则判定所述患者具有全因住院率和全因死亡率/全因住院率的升高风险。

图3中HF，HFrEF，HFpEF患者的Kaplan-Meier曲线，利用SPSS软件v.20.0进行，对心力衰竭患者醛固酮数据进行了log10转换，对转换后的醛固酮水平，按照是否大于中位数进行分组，其中大于中位数的组为高于二分位组，低于中位数的组为低于二分位组，经过SPSS软件v.20.0对数据的处理，得到log rank值，如果log rank<0.05，则表明醛固酮水平与事件发生之间有显著相关性。对于HFpEF组，醛固酮数据进行log10转换后，醛固酮log10水平的平均值为1.73，对应醛固酮浓度值为53.7pg/mL。

Claims

1.醛固酮在制备用于评估或辅助评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒中的应用；

所述心力衰竭患者是指射血分数保留性心衰患者，其中左室射血分数≥40％；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述评估或辅助评估心力衰竭患者发生不良事件风险的试剂盒，包括用于检测心力衰竭患者生物样品中醛固酮含量的产品；

所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：在HFpEF患者中醛固酮的浓度大于53.7pg/mL时，与浓度小于53.7pg/mL的患者相比，则判定所述患者具有全因住院率和全因死亡率/全因住院率的升高风险；

所述检测心力衰竭患者生物样品中醛固酮含量的产品包括对所述生物样品中醛固酮进行提取、用LC-MS/MS进行测定所需的试剂；

所述心力衰竭患者是指射血分数保留性心衰患者，其中左室射血分数≥40％；所述心力衰竭患者发生不良事件风险是指所述心力衰竭患者出院后全因住院和/或全因死亡不良事件的发生风险。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生物样品为血液样品、血清样品、血浆样品或由此获得的血液脂质部分或血液脂蛋白部分。