CN110057955B - 乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，涉及患者体内异性血清标志物的筛选方法，具体涉及乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法。本发明的筛选方法，包括以下步骤：血清样本的收集和贮存、血清样本的处理方法、正相和反相色谱技术条件、质谱数据采集和分析、非靶向代谢组数据处理、有显著性差异的结果筛选、筛选结果的验证和应用。

Description

乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及患者体内异性血清标志物的筛选方法， 具体涉及乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎的病原为乙肝炎病毒，缩写为HBV，乙型肝炎病毒为DNA 病毒。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。 临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可 有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少 数可发展为肝癌。
我国是乙肝病毒感染率较高的，在没有实施乙肝疫苗预防接种及血液筛查等 干预措施前，人群乙肝病毒表面抗原(HBsAg)流行率为10％左右。
慢性乙型肝炎是威胁我国人民身体健康的主要疾病之一。虽然在HBV预防 性疫苗广泛使用后，乙肝病毒新发感染率有了显着下降，但是针对已经建立慢性 感染的乙肝患者，目前为止，仍旧缺乏有效的治疗策略，究其原因，是由于乙型 病毒性肝炎感染率高、病程复杂、预后较差、难以治愈。乙型肝炎是我国负担最 重的疾病之一，而中国也正在努力甩掉“乙肝大国”的帽子。
我国新发乙肝病例数近年来明显下降，从2005年的7.5/10万，下降到2015 年的4.9/10万。但是，我国既往感染者众多，部分感染者得不到及时诊治，由 此导致的死亡人数短期内不会出现下降趋势。据世界卫生组织估计，我国每年因 乙肝感染导致的死亡人数为30万例，占全球的1/2。
HBV等输血相关病原体对我国血液安全的有重要的影响，对于献血人群不能 做HBV现场的相关检测，只有献完血后，才集中做检测常规乙型肝炎五项检测， 和HBV核酸检测，其缺陷在于，等待检测结果时间长，检测方法复杂，试剂成 本高。
为了有效解决上述问题，本发明发现血浆代谢标志物在诊断或监测HBV的 应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乙型肝炎患者体内的特异性的血清代谢标志物 的筛选方法。
本发明利用反相色谱和亲水色谱和质谱联用技术，对乙型肝炎病毒感染者以 及正常人的血清进行代谢组学分析和比对，从而寻找乙型肝炎病毒感染者的特异 性的血清代谢标志物。
本发明所述乙型肝炎特异性的血清代谢标志物的筛选方法，包括以下步骤： 血清样本的收集和贮存、血清样本的处理方法、正相和反相色谱技术条件、质谱 数据采集和分析、非靶向代谢组数据处理、有显著性差异的结果筛选、筛选结果 的验证和应用。
具体的，本发明所述的筛选方法，包括以下步骤：
(1)血清或血浆样本的收集和贮放方法：
选取HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免三项呈阳性或两阳性的患者，取患者的血 清或血浆两小时之内保存到-80℃，作为HBV实验组，同时找出同年龄段的正常 人，取其血清或血浆作为对照组，
(2)血清样本的处理方法：
血清样本处理方法有两种，a、反相色谱分析血清样本处理方法，采用C18反相 色谱柱，b、亲水色谱分析血清样本处理方法，采用Hillic色谱柱，
(3)正相和反相色谱技术条件：
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用C18反相色谱和HILLIC亲水色谱对血清样本进行分析，
(4)质谱数据采集和分析：
将上述的色谱柱与质谱相联，质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，
(5)非靶向代谢组数据处理：
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理， 最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库 和脂质数据库进行一级分子量匹配，
(6)有显著性差异的结果筛选：
利用EZinfo 3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP 值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV实验组和对照组中代谢差异物，
(7)筛选结果的验证和应用：
对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定 量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间， AUC在0.81-0.97之间。
其中，步骤2血清样本处理方法有两种，分别为：
a、反相色谱分析血清样本处理方法：用体积比3:1的氯仿和甲醇混合物提 取脂溶性物质用于反相色谱分析，色谱柱为C18反相色谱柱，
b、亲水色谱分析血清样本处理方法：用乙腈提取水溶性物质用于亲水色谱 的分析，色谱柱为Hillic色谱柱。
其中，步骤4质谱数据采集和分析：
将上述的色谱柱与质谱相联，质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆 轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温 度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃，翘气和 辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率 70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围 50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量 处理均由该软件操作。
其中，步骤6代谢差异物为：
Creatinine、L-Proline、L-Arginine、PC(P-16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PE(18:2(9Z,12 Z)/18:1(9Z))、PC(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))、PC(P-16:0/18:1(11Z))、PE(18:2(9Z,12Z)/ 18:0)、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P-18: 0/18:2(9Z,12Z))、PE(18:0/18:1(11Z))、LysoPE(18:0/0:0)、PE(16:0/18:1(11Z))、或PE (18:2(9Z,12Z)/16:0)中的一种或多种。
上述代谢差异物为乙型肝炎病毒相关的特异性血清代谢标志物。
优选的，本发明所述的筛选方法，包括以下步骤：
(1)血清样本的收集和贮存：
选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项 呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-8 0℃保存，作为HBV实验组，
选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组，
(2)反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟，
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600ul，体积比为3:1氯 仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100ul水，混匀，
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入400ul， 体积比为1:1的异丙醇：乙腈进行复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上 层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测，
(3)亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化，30-60分钟，
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈，
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上 层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测，
(4)正相和反相色谱技术条件：
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱 对上述血清处理后的样本进行分析，
C18反相色谱柱流动相:A(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温：50℃， Hillic亲水色谱柱流动相:A(乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(水,0.1％甲酸,10m M乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃，
(5)质谱数据采集和分析：
将上述的色谱柱与质谱相联，采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气 压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮 气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动 增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质 系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软 件操作，
(6)非靶向代谢组数据处理：
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理， 最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间 依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如 加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和 脂质数据库进行一级分子量匹配，
(7)有显著性差异的结果筛选：
利用EZinfo 3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP 值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV组和对照组代谢差异物，
(8)筛选结果的验证和应用：
对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定 量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间， AUC在0.81-0.97之间。
进一步优选的，本发明所述的筛选方法，包括以下步骤：
(1)血清样本的收集和贮存：
选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项 呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-8 0℃保存，作为HBV实验组，
选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组，
(2)反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟，
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600ul，体积比为3:1氯 仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100ul水，混匀，
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入400ul 异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100ul， 置于200ul内衬管中，待测，
(3)亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟，
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈，
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上 层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测，
(4)正相和反相色谱技术条件：
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱 对上述血清处理后的样本进行分析，
1)C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3，型号1.8um 2.1mm*100mm；
2)C18反相色谱柱流动相:A(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温： 50℃，C18反相色谱测定脂质洗脱程序如下：
Figure BDA0002045991470000061
3)Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7um 2.1mm*100mm)；
4)Hillic亲水色谱柱流动相:A(乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(水,0.1％甲酸,1 0mM乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃，洗脱程序如下：
Figure BDA0002045991470000062
Figure BDA0002045991470000071
(5)质谱数据采集和分析：
将上述的色谱柱与质谱相联，采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气 压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮 气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动 增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质 系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软 件操作，
(6)非靶向代谢组数据处理：
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理， 最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间 依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如 加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和 脂质数据库进行一级分子量匹配，
(7)有显著性差异的结果筛选：
利用EZinfo 3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP 值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV组和对照组代谢差异物，
(8)筛选结果的验证和应用：
对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定 量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间， AUC在0.81-0.97之间。
根据实施例之一，本发明的筛选方法，包括以下步骤：
(1)血清样本的收集和贮存：
选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项 呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-8 0℃保存，作为HBV实验组，
选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组，
(2)反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟，
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600ul，体积比为3:1氯 仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100ul水，混匀，
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入400ul 异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100ul， 置于200ul内衬管中，待测，
(3)亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟，
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上 层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测，
(4)色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析，
1、C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8um 2.1mm*100mm)；
2、C18反相色谱柱流动相:A(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；洗脱程序:见表1，流速：0.3ml/min；进样量 为1.0μL；柱温：50℃，
表1 C18反相色谱测定脂质洗脱程序
Figure BDA0002045991470000081
Figure BDA0002045991470000091
3、Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7um 2.1mm*100mm)；
4、Hillic亲水色谱柱流动相:A(乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(水,0.1％甲酸, 10mM乙酸铵)；洗脱程序:见表2,流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃，
表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序:
Figure BDA0002045991470000092
(5)质谱数据采集和分析：采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪， 正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气压力3 0psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰 撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控 制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由 Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作， 所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用Progenesis QI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理， 最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间 依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如 加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和 脂质数据库进行一级分子量匹配，
指控样本的前处理方法和其他样品一样，首先采用5个空白样本平衡色谱柱， 再采用3个质控样本平衡柱条件，然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于 监测整个液质系统的稳定性和重复性，同时计算质控样本中提取的代谢特征的变 异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除，
(6)质控评估
首先使用无监督技术PCA(主成分分析)对QC样本和其他实验样本进行分析， QC样品是相同的成分，他们应该在PCA得分图中聚在一起，
(7)样本分析
1、PCA分析
对样本进行主成分分析能从总体上反映样本之间的代谢差异和组内样本之间的变异度的大小，在使用EZinfo 3.0软件正式分析前，对数据组进行归一化处理，
2、OPLS-DA分析
采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析，
3、组间潜在生物标志物鉴定
本次实验采用对照组和HBV实验组的OPLS-DA模型的VIP值(阈值>1)，并结合 t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物，并分别比较了这些差异代谢 物在对照组和HBV实验组，HBV实验组中是否存在差异，差异性代谢物的定性 方法为：搜索在线数据库，与对照组的倍数大于1找出了15个有意义的差异性 化合物。
本发明的另一个目的在于提供一组血浆代谢标志物组合物在制备乙型肝炎 病毒感染者与非乙型肝炎病毒感染者相区分的试剂中的应用。
该代谢标志物组合物包括以下成分：Creatinine、L-Proline、L-Arginine、PC(P -16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PE(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z))、PC(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))、 PC(P-16:0/18:1(11Z))、PE(18:2(9Z,12Z)/18:0)、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE (P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))、PE(18:0/18:1(11Z))、LysoP E(18:0/0:0)、PE(16:0/18:1(11Z))、或PE(18:2(9Z,12Z)/16:0)中的一种或多种。
本发明的另一个目的在于提供能够将乙型肝炎病毒感染者与非乙型肝炎病 毒感染者相区分的特异性血清代谢标志物：
Creatinine、L-Proline、L-Arginine、PC(P-16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PE(18:2(9 Z,12Z)/18:1(9Z))、PC(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))、PC(P-16:0/18:1(11Z))、PE(18:2(9Z,1 2Z)/18:0)、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P -18:0/18:2(9Z,12Z))、PE(18:0/18:1(11Z))、LysoPE(18:0/0:0)、PE(16:0/18:1(11Z))、或 PE(18:2(9Z,12Z)/16:0)中的一种或多种。
本发明的另一个目的在于提供乙型肝炎病毒感染者特异性血清代谢标志物， 该代谢标志物同上。
本发明的另一个目的在于提供代谢标志物在监测和诊断乙型肝炎病毒感染 者在肝炎发展过程中的应用。该代谢标志物同上。
本发明利用反相色谱和亲水色谱技术分离血清样品有机相和水溶性分子，质 谱检测质子离子峰，通过代谢组数据库对代谢物进行鉴定，对乙型肝炎病毒感染 者以及正常人的血清进行代谢组学分析和比对，从而寻找乙型肝炎病毒感染者的 特异性的血清代谢标志物。其结果对于阐明乙型肝炎病毒感染者血清代谢标志物 含量变化规律，以及代谢物在监测和诊断乙型肝炎病毒感染者的发展过程中的作 用具有重要的意义。
本发明与现有技术相比较，其优点在于：1)对HBV患者及正常人的血清进 行代谢组学分析并比对，从而寻找HBV患者诊断的特异性的血清代谢标志物。其 结果对于阐明HBV患者血清特征性代谢物含量变化规律以及代谢物在肝炎的发 生发展过程中的作用具有重要的意义；2)应用此筛选方法可以获得有效的HBV 患者早期诊断靶点，并为建立HBV患者诊断模型提供数据基础；3)本发明采用 一种全新的血液代谢组学的方法检测乙型肝炎病毒感染者血液中代谢标志物，区 别于以往的HBV核酸检测和血液免疫检测，为乙型肝炎病毒感染者提供一种全 新的治疗靶标。
对于本发明中出现的英文，在此作出解释和说明：
Creatinine：肌酐
L-Proline：L-脯氨酸
L-Arginine：L-精氨酸
PC(P-16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))：磷酯酰胆碱(P-16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))
PE(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z))：磷酯酰乙醇胺(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z))
PC(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))：磷酯酰胆碱(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))
PC(P-16:0/18:1(11Z))：磷酯酰胆碱(P-16:0/18:1(11Z))
PE(18:2(9Z,12Z)/18:0)：磷酯酰乙醇胺(18:2(9Z,12Z)/18:0)
PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))：磷酯酰乙醇胺(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))
PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))：磷酯酰乙醇胺(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))
PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))：磷酯酰乙醇胺(P-18:0/18:2(9Z,12Z))
PE(18:0/18:1(11Z))：磷酯酰乙醇胺(18:0/18:1(11Z))
LysoPE(18:0/0:0)：溶血性的磷酯酰乙醇胺(18:0/0:0)
PE(16:0/18:1(11Z))：磷酯酰乙醇胺(16:0/18:1(11Z))
PE(18:2(9Z,12Z)/16:0)：磷酯酰乙醇胺(18:2(9Z,12Z)/16:0)
附图说明：
图1为HBG-Con和质控的PCA得分图(C18柱,N＝2)
图2为HBG-Con和质控的PCA得分图(HILLIC柱,N＝2)
图3为HBG-Con组的OPLS-DA得分图(C18柱,N＝2，R2Y＝0.95,Q2＝0.922)
图4为图5对应的HBG-Con两组的OPLS-DA排序验证图
图5为HBG-Con组的OPLS-DA得分图(HILLIC柱,N＝3，R2Y＝0.984,Q2＝0.96)
图6为图8对应的HBG-Con两组的OPLS-DA排序验证图
图7为15个标志物的ROC曲线(特异性和敏感性检测)
图8为15个标志物的不同组合(2，3，5，7，10，15)的预测准确率
图9为HBV-Con组预测概率分布图
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、筛选乙型肝炎病毒感染者血液中代谢标志物的方法
一、取患乙型肝炎病人30例(HBG)，诊断标准HBV核酸检测阳性或HBV酶免 两项或三项阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，清晨空腹血清，1小时 之内-80℃保存，同样年龄健康体检血清30例(Con)，1小时之内-80℃保存， 待样品收集完后，按下列方法统一处理。
二、反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟。
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600ul，体积比为3:1氯 仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100ul水，混匀。
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入400ul 异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100ul， 置于200ul内衬管中，待测。
三、亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟。
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀。12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上 层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测。
四、色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析。
1、C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8um 2.1mm*100mm)；
2、C18反相色谱柱流动相:A(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；洗脱程序:见表1，流速：0.3ml/min；进样量 为1.0μL；柱温：50℃。
表1 C18反相色谱测定脂质洗脱程序
Figure BDA0002045991470000131
3、Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7um 2.1mm*100mm)；
4、Hillic亲水色谱柱流动相:A(乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(水,0.1％甲酸, 10mM乙酸铵)；洗脱程序:见表2,流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃。
表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序:
Figure BDA0002045991470000132
Figure BDA0002045991470000141
五、质谱数据采集和分析：采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪 (QExactive质谱仪)。正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV。毛细管加热 温度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃。翘气 和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr。一级全扫描参数为：分辨 率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围 50–1500。液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定 量处理均由该软件操作。
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理， 最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间 依次为1至19和1至12分钟。峰提取的强度限定为模式3。各种添加剂离子如 加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和 脂质数据库进行一级分子量匹配。
为了评价样品采集过程中系统的稳定性和重复性，我们使用质控样本。质控 样本是所有样本均移取固定体积混合均匀后得到的。指控样本的前处理方法和其 他样品一样。为了得到可信赖的且可重复性的代谢物，三个因素需要考虑即1) 保留时间，2)信号强度，3)质量准确度。本次实验采用了，首先采用5个空白 样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6-8个样本插入 1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。同时计算质控样本中提 取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除。
六、质控评估
首先使用无监督技术PCA(主成分分析)对QC样本和其他实验样本进行分析。 QC样品是相同的成分，他们应该在PCA得分图中聚在一起。在图1和图2中分 别显示了ESI反相色谱正离子和亲水色谱正离子分离的PCA得分图，相对聚集在 一起的QC样品表明，系统重复性好，所采集的数据是值得进一步研究。
七、样本分析
1、PCA分析
对样本进行主成分分析能从总体上反映样本之间的代谢差异和组内样本之间的变异度的大小，在使用EZinfo 3.0软件正式分析前，对数据组进行归一化处理， 以获得更加直观且可靠的结果，归一化的目的是使所有变量的尺度(某种数字特 征，如均值和标准差)在同一等级上，从而避免复杂生物样品中不同代谢物的浓 度差别较大导致的某些浓度过高或过低代谢物的信号被掩盖，进而影响对生物标 记物的辨识。
对于PCA这种非监督性模型分析来说，判别模型质量好坏的主要参数为R2X，该 值代表模型的解释率，Q2代表了模型的可预测变量。PCA分析是一种非监督性 的模型分析方法，该模型能够根据数据的相似性对其进行归类，因而相对于监督 性的模型分析方法如PLS-DA，OPLS-DA分析来说，PCA可以更真实地反映组间差 异以及识别组内变异。为了判别组间是否具有差异，采用PCA建模方法对样本 进行分析。两种扫描模式的PCA模型的得分图见图1和图2，其中包括绿色的质 控部分。
2、OPLS-DA分析
为了获得导致这种显著差异的代谢物信息，我们进一步采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析。判别模型质 量好坏的主要参数为R2Y(该值代表模型的解释率)及Q2值(该值为模型的预 测率)。C18反相色谱柱扫描模式的OPLS-DA模型的得分图和验证图见图3和图4， HILLIC正相色谱扫描模式的OPLS-DA模型的得分图和验证图见图5和图6。
3、组间潜在生物标志物鉴定
本次实验采用CON组和HBG组的OPLS-DA模型的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表 达代谢物。并分别比较了这些差异代谢物在正常组和HBG组，HBG组中是否存 在差异。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(HMDB)(比较质谱的 质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限制0.01Da)。结果分别见下表，其中 包含了差异代谢物的名称、HMDB编码、质荷比、保留时间、vip值和单方差分 析的p值。共有21个，与对照组的倍数大于1找出了15个有意义的差异性化合 物。
Figure RE-GDA0002089632530000151
Figure RE-GDA0002089632530000161
实施例2、
一组乙型病毒肝炎患者的代谢标志物的靶向检测，主要包括以下步骤:
1、取患乙型肝炎病人70例(HBV)，诊断标准HBV核酸检测阳性或HBV酶免两 项或三项阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，清晨空腹血清，1小 时之内-80℃保存，同样年龄健康体检血清30例(Con)，1小时之内-80℃ 保存，待样品收集完后，按下列方法统一处理。
2、反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于-80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟。
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加内标10ul，加入600ul 氯仿：甲醇3:1，超声1h，加入100ul水，混匀。
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入 400ul异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶 液100ul，置于200ul内衬管中，待测。
4)内标沉淀剂配置：内标溶液加氯仿：甲醇3:1稀释60倍。
3、亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟。
2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加内标10ul，再加入300μl 的乙腈
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀。12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取 上层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测。
4)内标沉淀剂配置方法：内标用1mL(乙腈：水＝1：1)溶解，混匀后用乙腈稀释25倍4、液相质谱联用对下列化合物进行采集和分析，根据标准品，计算出每个样品 每种化合物的浓度
差异性化合物 Accepted Description
C1 Creatinine
C2 L-Proline
C3 L-Arginine
C4 PC(P-16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))
C5 PE(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z))
C6 PC(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))
C7 PC(P-16:0/18:1(11Z))
C8 PE(18:2(9Z,12Z)/18:0)
C9 PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))
C10 PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))
C11 PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))
C12 PE(18:0/18:1(11Z))
C13 LysoPE(18:0/0:0)
C14 PE(16:0/18:1(11Z))
C15 PE(18:2(9Z,12Z)/16:0)
5、按代谢物浓度做经典的常规的ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性， 特异性和可信区间。AUC在0.81-0.97之间。
Figure RE-GDA0002089632530000171
Figure RE-GDA0002089632530000181
6、用Multivariate Exploratory ROC Analysis：ROC curves are generated byMonte-Carlo cross validation(MCCV)using balanced sub-sampling.2/3的样品用以评估分组特性，余下的1/3用以验证样品的正确性。每一模型重复多次。每一图 像基于CV(the cross validation)进行95％可信区间计算。见图7、图8.
7、用两组成份就可以把HBV和正常组区分开来，见图9：
C18检测PCA图(图4)，模型参数：N为3，R2X为0.491,Q2为0.403
C18检测OPLS-da图(图5)，模型参数：N为2，R2Y为0.95,Q2为0.922.筛选 差异结合OPLS-da的VIP>1和P<0.05。
模型验证如图6所示：
HILIC检测PCA图(图7)，模型参数：N为2，R2X为0.324,Q2为0.222
HILIC检测OPLS-da图(图8)，:模型参数：N为3，R2Y为0.984,Q2为0.96.筛 选差异结合OPLS-da的VIP>1和P<0.05。
模型验证如图9所示。

Claims (4)

1.乙型肝炎特异性的血清代谢标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血清样本的收集和贮存：
选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-80℃保存，作为HBV实验组，
选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组，
(2)反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟，
2)取100μ l血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600μ l，体积比为3:1氯仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100μ l水，混匀，
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300μ l浓缩干燥，加入400μ l，体积比为1:1的异丙醇：乙腈进行复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100μ l，置于200μ l内衬管中，待测，
(3)亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化，30-60分钟，
2)取100μ l血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈，
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上层溶液100μ l，置于200μ l内衬管中，待测，
(4)正相和反相色谱技术条件：
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析，
1)C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3，型号1.8μ m 2.1mm*100mm；
2)C18反相色谱柱流动相:A:乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵，B：乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵；流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温：50℃，C18反相色谱测定脂质洗脱程序如下：
Figure FDA0002935025390000011
Figure FDA0002935025390000021
3)Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide，型号1.7μ m 2.1mm*100mm；
4)Hillic亲水色谱柱流动相:A：乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵，B：水,0.1％甲酸,10mM乙酸铵；流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃，洗脱程序如下：
Figure FDA0002935025390000022
(5)质谱数据采集和分析：
将上述的色谱柱与质谱相联，采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作，
(6)非靶向代谢组数据处理：
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用Progenesis QI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配，
(7)有显著性差异的结果筛选：
利用EZinfo 3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV组和对照组代谢差异物，
(8)筛选结果的验证和应用：
对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间，AUC在0.81-0.97之间。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血清样本的收集和贮存：
选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-80℃保存，作为HBV实验组，
选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组，
(2)反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟，
2)取100μ l血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600μ l，体积比为3:1氯仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100μ l水，混匀，
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300μ l浓缩干燥，加入400μ l异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100μ l，置于200μ l内衬管中，待测，
(3)亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟，
2)取100μ l血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈，
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上层溶液100μ l，置于200μ l内衬管中，待测，
(4)正相和反相色谱技术条件：
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析，
1)C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3，型号1.8μ m 2.1mm*100mm；
2)C18反相色谱柱流动相:A：乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵，B：乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵；流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温：50℃，C18反相色谱测定脂质洗脱程序如下：
Figure FDA0002935025390000041
3)Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide，型号为1.7μ m 2.1mm*100mm；
4)Hillic亲水色谱柱流动相:A：乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵，B：水,0.1％甲酸,10mM乙酸铵；流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃，洗脱程序如下：
Figure FDA0002935025390000042
(5)质谱数据采集和分析：
将上述的色谱柱与质谱相联，采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作，
(6)非靶向代谢组数据处理：
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配，
(7)有显著性差异的结果筛选：
利用EZinfo 3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV组和对照组代谢差异物，
(8)筛选结果的验证和应用：
对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间，AUC在0.81-0.97之间。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血清样本的收集和贮存：
选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-80℃保存，作为HBV实验组，
选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组，
(2)反相色谱分析血清样本处理方法
1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟，
2)取100μ l血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600μ l，体积比为3:1氯仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100μ l水，混匀，
3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300μ l浓缩干燥，加入400μ l异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100μ l，置于200μ l内衬管中，待测，
(3)亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟，
2)取100μ l血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈
3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上层溶液100μ l，置于200μ l内衬管中，待测，
(4)色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析，
1、C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3，型号为1.8μ m 2.1mm*100mm；
2、C18反相色谱柱流动相:A：乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵，B：乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵；洗脱程序：见表1，流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温：50℃，
表1 C18反相色谱测定脂质洗脱程序
Figure FDA0002935025390000061
3、Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide，型号为1.7μ m 2.1mm*100mm；
4、Hillic亲水色谱柱流动相:A：乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵，B：水,0.1％甲酸,10mM乙酸铵；洗脱程序:见表2,流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃，
表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序：
Figure FDA0002935025390000072
(5)质谱数据采集和分析：采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作，所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用Progenesis QI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配，
指控样本的前处理方法和其他样品一样，首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件，然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性，同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除，
(6)质控评估
首先使用无监督技术PCA对QC样本和其他实验样本进行分析，QC样品是相同的成分，他们应该在PCA得分图中聚在一起，
(7)样本分析
1、PCA分析
对样本进行主成分分析能从总体上反映样本之间的代谢差异和组内样本之间的变异度的大小，在使用EZinfo 3.0软件正式分析前，对数据组进行归一化处理，
2、OPLS-DA分析
采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析对两组样本进行统计分析，
3、组间潜在生物标志物鉴定
本次实验采用对照组和HBV实验组的OPLS-DA模型的VIP值，阈值>1，并结合t-test的p值，p＜0.05来寻找差异性表达代谢物，并分别比较了这些差异代谢物在对照组和HBV实验组，HBV实验组中是否存在差异，差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库，与对照组的倍数大于1找出了15个有意义的差异性化合物。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，筛选并鉴定与乙型肝炎病毒相关的特异性血清代谢标志物为：
Creatinine、L-Proline、L-Arginine、PC(P-16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PE(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z))、PC(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))、PC(P-16:0/18:1(11Z))、PE(18:2(9Z,12Z)/18:0)、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))、PE(18:0/18:1(11Z))、LysoPE(18:0/0:0)、PE(16:0/18:1(11Z))、或PE(18:2(9Z,12Z)/16:0)中的一种或多种。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110850074B (zh) * 2019-11-08 2023-04-11 郑州大学第一附属医院 肝硬化阴离子标志物的筛选方法和应用
CN111060607B (zh) * 2019-11-11 2021-08-31 浙江大学 一种用于心脏死亡后捐献供体术前预警移植肾延迟复功的代谢物组合及其筛选方法
CN111208223B (zh) * 2020-01-13 2023-01-17 浙江大学 心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢物
CN111413431B (zh) * 2020-04-17 2022-03-01 中国药科大学 一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法
CN111721862B (zh) * 2020-06-12 2022-03-18 山西大学 一种基于稳定同位素示踪代谢组学鉴定抑郁症能量代谢异常通路的方法
CN112305119B (zh) * 2020-10-30 2021-08-17 河北医科大学第二医院 动脉粥样硬化性脑梗死的生物标志物及其应用
CN112305124B (zh) * 2020-10-30 2022-03-04 河北医科大学第二医院 一种生物标志物及其在疾病诊断中的应用
CN112305121B (zh) * 2020-10-30 2021-09-10 河北医科大学第二医院 代谢标志物在动脉粥样硬化性脑梗死中的应用
CN112230003B (zh) * 2020-11-05 2022-06-21 江苏省中医院 三种血清脂质联合用于糖尿病肾病诊断的用途
CN112599238A (zh) * 2020-12-08 2021-04-02 河北医科大学第二医院 与脑梗死相关的代谢标志物及其在诊疗中的应用
CN112599237B (zh) * 2020-12-08 2022-05-27 河北医科大学第二医院 一种生物标志物及其在脑梗死诊断中的应用
CN114283877A (zh) * 2021-04-29 2022-04-05 厦门市迈理奥科技有限公司 一种建立代谢物模型及其代谢组学数据库的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102207496A (zh) * 2010-08-19 2011-10-05 上海聚类生物科技有限公司 一种基于uplc-ms技术诊断乙型肝炎的模型
CN102445512A (zh) * 2010-10-09 2012-05-09 中国人民解放军第二军医大学 鉴别肝癌、肝炎或肝硬化的小分子代谢物图谱及其制作方法
WO2012143514A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Asociación Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias-Cic Biogune Method for the diagnosis of liver injury based on a metabolomic profile
CN105980861A (zh) * 2013-12-10 2016-09-28 加利福尼亚大学董事会 肝病的区分性诊断
CN107607641A (zh) * 2017-09-01 2018-01-19 中国民用航空总局第二研究所 民航空中交通管制员班组轻度和中度疲劳程度的检测方法
CN109425669A (zh) * 2017-09-01 2019-03-05 中国民用航空局民用航空医学中心 一种液相色谱-质谱法筛选人体体液中疲劳程度相关生物标志物的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060062859A1 (en) * 2004-08-05 2006-03-23 Kenneth Blum Composition and method to optimize and customize nutritional supplement formulations by measuring genetic and metabolomic contributing factors to disease diagnosis, stratification, prognosis, metabolism, and therapeutic outcomes

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102207496A (zh) * 2010-08-19 2011-10-05 上海聚类生物科技有限公司 一种基于uplc-ms技术诊断乙型肝炎的模型
CN102445512A (zh) * 2010-10-09 2012-05-09 中国人民解放军第二军医大学 鉴别肝癌、肝炎或肝硬化的小分子代谢物图谱及其制作方法
WO2012143514A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Asociación Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias-Cic Biogune Method for the diagnosis of liver injury based on a metabolomic profile
CN105980861A (zh) * 2013-12-10 2016-09-28 加利福尼亚大学董事会 肝病的区分性诊断
CN107607641A (zh) * 2017-09-01 2018-01-19 中国民用航空总局第二研究所 民航空中交通管制员班组轻度和中度疲劳程度的检测方法
CN109425669A (zh) * 2017-09-01 2019-03-05 中国民用航空局民用航空医学中心 一种液相色谱-质谱法筛选人体体液中疲劳程度相关生物标志物的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A metabonomic study of hepatitis B-induced liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma by using RP-LC and HILIC coupled with mass spectrometry;Peiyuan Yin et al;《Mol. BioSyst.》;20090617;第5卷;868-876 *
Establishment of local searching methods for orbitrap-based high throughput metabolomics analysis;Haiping Tang et al;《Talanta》;20160426;第156-157卷;163-171 *
Peiyuan Yin et al.A metabonomic study of hepatitis B-induced liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma by using RP-LC and HILIC coupled with mass spectrometry.《Mol. BioSyst.》.2009,第5卷 *
乙型肝炎代谢组学研究及加压毛细管电色谱质谱联用平台的搭建;侯玉洁;《万方学术论文数据库》;20170104;30-45 *

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