CN109425669A - 一种液相色谱-质谱法筛选人体体液中疲劳程度相关生物标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种液相色谱‑质谱法筛选人体体液中疲劳程度相关生物标志物的方法。所述方法包括如下步骤：步骤1.分组采集人体体液样本；步骤2.对步骤1采集的样本进行预处理；步骤3.采用液相色谱‑质谱法对步骤2预处理后的样本进行检测；步骤4.对步骤3检测得到的数据进行处理及阈值设定，筛选出潜在疲劳程度相关生物标志物；步骤5.对步骤4筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物进行代谢通路检索及对潜在生物标志物进行结构确认；步骤6.对步骤5结构确认的不同组的化合物进行对比，确认与疲劳程度相关生物标志物。本发明的筛选方法普适性好，准确性和可信度高。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种液相色谱-质谱法筛选人体体液中疲劳程度相关生物标志物的方法。
背景技术
人类研究疲劳的历史最早可以追溯到百年前第一次世界大战，在大战及战后英国工业疲劳研究委员会(The Industrial Fatigue Research Board后改称为TheIndustrial Health Research Board)开展一项关于工业生产特别是军需物资生产中疲劳问题的大规模工效学研究。该研究报告影响深远，甚至许多结果已成工业界的共识。例如，报告建议缩短过长的劳动时间、改善工作环境、调整倒班系统等缓解员工疲劳，提高劳动生产率。这些建议对我们现在劳动时间设置、生产车间和办公环境的照明等设计以及倒班系统优化仍然具有指导作用。这份报告中用于检测疲劳的指标就是劳动生产率。
在第二次世界大战中，航空工业特别是军事航空业发展迅速。人们发现飞行员在驾驶航空器执行任务期间，会出现驾驶能力突然下降甚至失能的情况，人们提出以操作绩效下降来表征疲劳。战后，伴随军事航空和民用航空业发展，长距离飞行以及昼夜飞行变得越来越普遍，人们发现疲劳问题更加复杂化，疲劳可以累加，形成累积性疲劳。这一时期，仍以工效学方法研究疲劳为主。
上世纪70年代，人们开始注意到驾驶员疲劳容易导致交通安全事故和事故征候，从而将疲劳与安全事故和事故征候联系起来。疲劳研究的目标发展为预防由于疲劳引起的事故和事故征候，保障安全。随着工业自动化的高度普及，劳动强度降低，脑疲劳(mentalfatigue)成为工业生产中的主要疲劳形式。与之相对应的身体疲劳(physical fatigue)，也称为肌肉疲劳(muscle fatigue)是指发生在局部的肌肉酸痛并且肌肉变得无力。这种身体疲劳在当今社会主要发生在剧烈运动后，也称为运动疲劳。在后续论述中，我们提到的疲劳未特别标明时，均指脑疲劳。
伴随人们对社会安全关注的不断提高，对于疲劳问题的研究也由工效学研究拓展到心理学、神经科学、睡眠学、生理生化等学科。各学科建立了相应检测疲劳的方法，例如心理学基于主观感受的斯坦福嗜睡量表、视觉类比量表等，还有基于认知能力检测疲劳的威斯康星卡片分类测试(WSCT)、伦敦塔测试(TOL)等。主观量表易受到情绪及其他因素干扰，认知测试中参数指标设定比较困难，往往出现“天花板”或“地板”效应，致使这些量表或软件的信度和效度不够令人满意；又如神经和睡眠科学建立基于脑电图变化检测疲劳方法，提出delta和theta波显著增大时出现疲劳，由于脑电仪器复杂，难以应用于现场检测；再如基于人体疲劳时出现打哈欠、眼动变化如眨眼、眼睑闭合等生理反应，尝试建立相应检测方法。美国高速公路管理局汽车运输办公室于1998年10月发布一份技术报告指出，与脑电检测、头部位置检测、眨眼检测相比，眼睑闭合度(PERCLOS)检测疲劳具有更加准确和稳定的检测结果。但眼睑闭合度检测受到眼镜、环境光线角度和亮度、人眼角度等干扰，难以推广应用。目前为止，人们对疲劳生化机制了解很少，疲劳生化机制的阐释将有助于开发基于生化指标的客观、稳定、快速检测疲劳的方法。
采用生化指标检测疲劳是人们一直尝试的一种方法，如检测一些激素、肽等，研究发现胞嘧啶核苷(Cytidine)和肾上腺皮质类酯醇(Corticoid)浓度与工作压力有关；还检测糖肽(Glycopeptides)等与睡眠、生物节律有关的物质；但Borbely等指出这些化合物与疲劳具有相关性的数据缺乏一致性的证据。总之，人们虽然从工作压力、睡眠、生物节律等多角度尝试了多种化合物代谢与疲劳相关性研究，然而仍未发现任何一种人体代谢化合物与疲劳具有相关性。
代谢组学是一个系统研究体内代谢特征的新兴学科，主要采用核磁共振、气相色谱-质谱、液相色谱-质谱等检测分析手段结合化学计量学，系统地探索、寻找和发现人体受到疾病、药物等影响时其体液代谢的特征指标即生物标志物，在疾病诊断、药物研发等领域获得广泛应用。例如，美国乔治敦大学的Mapstone等采用液相色谱质谱分析(液质分析)的代谢组学方法，筛查出10种特征生物标志物，用于检测阿尔兹海默症，可以在该疾病出现临床症状前2-3年进行诊断，准确率可以到达90％以上；又如，Naviaux等采用液质分析方法研究了长期疲劳综合症代谢特征，发现男性患者有8种代谢物，女性患者13种代谢物发生显著性改变，受试者特征工作曲线(Receiver operator characteristic curve,ROC)分析结果表明诊断准确率达到94％(男性)和96％(女性)；许国旺教授等采用液质分析对抑郁症和过度疲劳模型大鼠血液和尿液进行了代谢组学研究，结果表明两组大鼠与对照组大鼠相比，代谢出现异常变化。Armstrong等采用二维核磁共振能谱仪对慢性疲劳综合症患者血清进行了代谢组学研究，结果表明病例组血清中谷氨酰胺和鸟氨酸含量显著低于对照组。
上述文献报道中，针对各种疾病均采用病例组和对照组进行分组比对，但由于疲劳是一种可以恢复的生理变化，现有文献方法不适用于疲劳程度相关生物标志物的筛选。Chen等在文献中利用液相色谱-质谱法，对民航空中交通管制员的尿液样本筛选了3种疲劳相关生物标志物，但未提出疲劳程度的概念，此外没有公开疲劳程度相关生物标志物筛选的方法。
在疲劳研究一百多年的历程中，人们认识到疲劳存在不同的强度，即疲劳程度，并且尝试对疲劳程度进行划分、表征、检测。例如心理学的史坦福嗜睡量表，其中将人由完全清醒状态到几乎在做梦，似乎下一秒就会睡着了的状态划分成7个疲劳等级，要求被试者通过主观感受进行选择划分。目前为止，尚未见到采用客观指标检测疲劳程度的报道。疲劳程度与工业生产中岗位安全执行能力相关，例如高速公路驾驶员连续驾驶2-3小时即出现轻度疲劳，需要休息恢复30-60分钟，才能继续从事这种需要高度集中注意力安全风险高的工作；而一般办公室工作职员则可以连续工作4-6小时，即使出现轻度疲劳仍不会产生安全风险。因此疲劳程度检测可以给生产安全风险管控提供有力的新技术和新手段。目前为止尚缺乏可用于人体疲劳程度相关生物标志物筛选的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，利用小分子代谢组学方法建立了一种基于液相色谱-质谱法在人体体液中筛选疲劳程度相关生物标志物的方法。基于本发明筛选方法研究筛选的疲劳程度相关生物标志物可以用于生产中工作负荷的评估、排班体系评估，上岗前检测评估是否可以上岗，岗中检测用于发现疲劳风险并及时调整，在岗后检测评估岗位工作负荷等。为工业生产中疲劳程度检测和监测、管控疲劳风险，保障安全生产提供新技术和新方法。
本发明通过如下技术方案实现：
一种采用液相色谱-质谱法筛选人体体液中疲劳程度相关生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1.分组采集人体体液样本；
步骤2.对步骤1采集的样本进行预处理；
步骤3.采用液相色谱-质谱法对步骤2预处理后的样本进行检测；
步骤4.对步骤3检测得到的数据进行处理及阈值设定，筛选出潜在疲劳程度相关的生物标志物；
步骤5.对步骤4筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物进行代谢通路检索及对潜在疲劳程度相关生物标志物进行结构确认；
步骤6.将步骤5结构确认的各组化合物进行对比，筛选出与疲劳程度相关生物标志物。
根据本发明，步骤1中，
所述人体体液样本可以为尿液和/或血液样本。优选为同时收集尿液和血液样本用于后续步骤检测。
根据本发明，所述人体体液样本来源于身体健康的志愿者，当所述志愿者为女性时，优选不在月经期的女性。
由于许多疾病本身会导致人体疲劳，例如肿瘤、抑郁症等消耗性疾病，其代谢物会干扰疲劳程度标志物的筛选。因而，本发明确定疲劳程度的筛选方法时，优选排除因疾病产生的疲劳，选择健康志愿者。
根据本发明，所述采集步骤包括采集非疲劳样本和不同的疲劳程度样本。
根据本发明，样本的采集步骤包括：在志愿者工作前或模拟操作诱发疲劳前，采集其体液样本作为非疲劳样本；根据不同疲劳程度，在志愿者工作一定时间后或模拟操作诱发不同疲劳程度后收集其体液样本作为不同的疲劳程度样本。
根据本发明，所述采集步骤包括对所述疲劳程度样本进行分组获得不同的疲劳程度组样本。
根据本发明，所述分组为根据志愿者连续工作时间长短、工作岗位、工作负荷或排班情况等设计成不同疲劳程度组，采集不同疲劳程度组样本。
根据本发明，所述工作时间可以设置成工作2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时或14小时组，按照相同岗位情况下疲劳程度随工作时间延长而增加来设计不同疲劳程度组。
根据本发明，所述工作岗位可以按照安全职责关键岗位疲劳程度大于一般岗位来设计不同疲劳程度组，如按照地面、空中和水路等驾驶员、民航空中交通管制员等，在相同工作时间情况下疲劳程度大于普通后勤管理岗位人员的疲劳程度来分组。
所述排班情况可以按照夜班人员疲劳程度大于白班人员疲劳程度来分组。
不同疲劳程度组每组人数优选不少于20人次，更优选地，当各组人数少于50人次时，可设置重复组，还可再设置对照组。
根据本发明，所述一次收集的样本量至少大于80人次；更优选大于90人次；还更优选大于100人次。可以对样本量分成至少2组，例如3组，4组或5组，每组10-20人次，注意每人次样本至少包含一个疲劳前样本和一个一定疲劳程度的样本。
根据本发明，当一次收集的样本量不足(例如不足80人次)时，可进行多次小样本量收集，按照每次收集的样本进行分组。分组以每组不少于20人次(样本数量不少于40份)，并且要求尽量集中时间采样，集中时间可以同时采集一组人员或最长不超过180日内完成。在每个不同疲劳程度样本组采集中，均应包含该组人员非疲劳样本及处于一定疲劳程度的样本，以便形成疲劳前(即非疲劳)与一定疲劳程度状态时的前后对照样本。需要说明，在多次分组采集同一疲劳程度的样本时，每组人员可以有交叉。
优选还对分组的样本进行疲劳程度不同的对照，并筛选出生物标志物。在这过程中，还可以区分疲劳和不疲劳以及不同疲劳程度的生理过程，从而剔除不相关的生物标志物，并最终确认筛选方法。
上述分组并对照的方法，通过后期单独测试各小组样本，并将各小组筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物进行比较，从而能够在有限的样本量时，仍然可以进行有效的生物标志物筛选。
当所述体液样本为血液样本时，所述血液样本可以为采用抗凝采血管采集不少于2.0mL的静脉血。
根据本发明，所述步骤1的样本采集步骤还包括在采集完体液样本后，将样本在不高于-20℃条件下进行低温保存；
例如将人体血液、尿液样本在不高于-20℃条件下低温保存；优选将血液经离心后收集血浆在不高于-20℃条件下低温保存，例如将血液进行4000-5000rpm离心3-5min，将上层血浆分装于干净无菌离心管保存于-80℃；优选将尿液样本在不高于-20℃条件下低温保存，例如将尿液样本分装于无菌离心管保存于-80℃。
在低温保存过程中还可以向样本中加入适量抗生素，避免因细菌引起部分代谢物的分解；例如向样本中加入质量浓度为0.05-0.1％的叠氮化钠。
根据本发明，所述步骤2中，
所述对样本进行预处理时，优选使步骤1低温保存后的样本在0-4℃环境中融化。优选血浆样本的融化时间为30-60分钟。
根据本发明的优选技术方案，当步骤1收集的体液样本为血液样本时，步骤2的预处理的步骤包括：对血浆中的极性组分和/或脂质组分进行处理。
待样本融化后，向血浆中加入有机溶剂如乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上层溶液便于后续步骤测试血浆中的极性组分；和/或，
待样本融化后，向血浆中加入有机溶剂如三氯甲烷与甲醇进行蛋白沉淀，离心后取下层溶液、离心浓缩，干燥后加入有机溶剂如异丙醇/乙腈后，再次离心取上清液，便于后续步骤测试血浆中的脂质组分的步骤。
具体地，对于血浆中极性组分的样本前处理方法包括：将血浆样本在4℃融化30-60分钟；取100μL血浆至标记好标签的1.5mL离心管中，加入300μL的乙腈；充分振荡15s，进行蛋白沉淀，12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μL，置于200μL内衬管中。
对于血浆中脂质组分分析的样本前处理方法包括：将血浆样本在4℃融化30-60分钟；取100μL血浆至标记好标签的1.5mL离心管中，加入500μL的三氯甲烷/甲醇(3：1)溶液；充分振荡15s，进行蛋白沉淀，12000rpm，4℃，离心5min，取下层溶液200μL，置于1.5mL离心管中；真空离心浓缩样本4小时，向干燥后的样品中加入300μL异丙醇/乙腈(1：1)，震荡混匀40s。12000rpm离心5min，取上清液100μL，置于200μL内衬管中。
例如采用如下方法对步骤1收集的血液样本进行预处理：将血浆样本在4℃融化30-60分钟；分成2份，第一份如前所述极性组分的前处理步骤后，取上层溶液100μL，置于200μL内衬管中，用于检测血浆中的极性组分；第二份如前述脂质组分的前处理步骤后，取下层溶液200μL，置于1.5mL离心管中；真空离心浓缩样本4小时，向干燥后的样品中加入300μL异丙醇/乙腈(1:1)，震荡混匀40秒。12000rpm离心5分钟，取上清液100μL，置于200μL内衬管中，用于检测血浆中的脂质组分。
根据本发明的优选技术方案，当步骤1收集的体液样本为尿液样本时，步骤2的预处理步骤包括：将尿液样本进行离心，取上清液及任选将上清液稀释成适宜后续步骤分析检测浓度的水溶液，例如使用1-3倍体积的水对样本进行稀释。
例如采用如下步骤对尿液样本进行预处理：
分析检测前将尿液样本取出放置至室温，在4℃，12000rpm离心5分钟，取上清液100μL加入100μL水稀释。
根据本发明的筛选方法，步骤3中，
所述液相色谱-质谱法为液相色谱-飞行时间质谱法。
当步骤2预处理的样本为血液样本时，所述液相色谱可以采用极性色谱柱优选HILIC柱对血液中的极性组分进行分离检测；所述液相色谱还可以采用弱极性色谱柱优选C18柱对血液中的脂质极性和非极性组分进行分离检测。
当对所述血液样本进行分离检测的液相色谱采用极性色谱柱分离检测极性组分时，质谱法优选采用正离子模式；当对所述血液样本进行分离检测的液相色谱采用弱极性色谱柱分离检测脂质极性组分时，质谱法优选采用正离子和负离子模式；当对所述血液样本进行分离检测的液相色谱采用弱极性色谱柱分离检测脂质非极性组分时，质谱法优选采用正离子模式。
优选地，采用极性HILIC色谱柱的色谱条件为：UPLC BEH Amide HILIC column[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm)]；
流动相为A相组成为含有体积分数为0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸和5-15mM乙酸铵的乙腈或甲醇溶液，B相组成为含有0.1％-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸和5-15mM乙酸铵的水溶液；
柱温20-50℃；流动相流速0.1-1.0mL/min；进样量0.3-5.0μL。
优选地，采用弱极性C18色谱柱检测脂质非极性组分的液相条件为：UPLC CSHC18column[(2.1-4.6mm)╳(100-250mm),1.5-5μm)]；
流动相A相组成为含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸和10mM乙酸铵的乙腈与水的混合溶液，其中乙腈与水的体积比为6:4，B相组成为含有0.1％甲酸或乙酸或三氟乙酸和10mM乙酸铵的乙腈与异丙醇溶液，其中乙腈与异丙醇溶液的体积比为9:1；
柱温20-50℃；流动相流速0.1-1.0mL/min；进样量0.3-5.0μL。
优选地，采用弱极性C18色谱柱检测脂质极性组分的液相条件为：UPLC CSHC18column[(2.1-4.6mm)╳(100-250mm),1.5-5μm)]；
流动相A相组成为含0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液，B相组成为含0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的甲醇或乙腈溶液。
柱温20-50℃；流动相流速0.1-0.5mL/min；进样量0.3-5.0μL。
当步骤2预处理的样本为尿液样本时，所述液相色谱可以采用极性色谱柱优选HILIC柱、弱极性色谱柱优选C18柱和非极性色谱柱优选PFPP柱分别对尿液中的极性、弱极性和非极性组分进行分离检测。
当所述液相色谱使用极性色谱柱分离检测极性组分时，质谱法优选采用检测正离子模式；当所述液相色谱使用弱极性和非极性柱分离检测弱极性和非极性组分时，采用正离子和负离子两种模式。
优选地，采用极性HILIC色谱柱的液相条件为：UPLC BEH Amide HILIC column[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm]；
流动相为A相组成为体积分数95-100％乙腈或甲醇和体积分数为0-5％含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液，B相组成为含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液；
柱温为20-40℃，进样量0.5-5.0μL，流动相流速0.3-1.0mL/min。
优选地，采用弱极性C18色谱柱的液相条件为：UPLC CSH C18column[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm)]；
流动相A相组成为含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液，B相组成为乙腈或甲醇；
柱温为20-40℃，进样量0.5-5.0μL，流动相流速0.3-1.0mL/min。
优选地，液相色谱法采用非极性PFPP色谱柱的液相条件为：UPLC HSS PFPPcolumn[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm)]；
流动相为A相组成为含有0.1-5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液，B相组成为甲醇或乙腈；
柱温为20-40℃，进样量0.3-5.0μL，流动相流速0.3-1.0mL/min。
所述质谱法的检测条件为：
当使用正离子离子化模式检测时，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器毛细管电压为2500-3500，优选3000V，cone电压为20-40V，优选30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)。
当使用正离子和负离子两种离子化模式检测时，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式；电喷雾离子化器毛细管电压为2500-3500，优选3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为20-40V，优选30V；干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-。
分离检测体液样本时，优选每10个样本插入1个空白防止交叉污染，还可以每10个样本插入一个质控样进行质量控制。
分离检测过程中优选样品室温保持在0-4℃。
根据本发明的筛选方法，步骤4中，
对步骤3分离检测的数据处理，采用数据处理软件，优选采用代谢组学数据处理相关软件进行统计分析处理。
所述分析处理方法包括数据对齐，峰提取；还包括对样本进行分组。所述分组方式以工作作为一种诱发不同疲劳程度的处理方式。
对处理前后样本进行分组，采用偏最小二乘法OPLS-DA分组分析，以P≤0.05、CV≤30％、VIP>1.0、最大变化倍数≥1.2作为筛选阈值，筛选出潜在生物标志物。例如使用数据处理专业软件Progenesis QI对数据进行分析处理。
本发明筛选阈值中，最大变化倍数的选择考虑到疲劳是一种可恢复的生理变化，此数值的设置不同于疾病或毒性研究中设置为2.0甚至达到3.0或4.0。如前文所述，由于疾病也可能产生疲劳，若设置成2.0以上，则无法区分是由于疾病导致的代谢物改变还是工作引起生理性疲劳导致的代谢物改变，因而经过大量的试验数据的总结，发现将筛选阈值设置成较小数值1.2，该数值既能够与疾病或毒性相区别，又能够实现疲劳程度标志物的筛选，具有判据意义。
本发明发现，对各组人次少于50人次，具有重复组和对照组的潜在生物标志物筛选时，可能存在许多假阳性生物标志物，因而还可以通过重复组和对照组筛选出来的潜在生物标志物之间进行比对，以进行进一步的筛选和确认。
根据本发明的筛选方法，步骤5中，
利用液相色谱-质谱检测潜在生物标志物的精确分子量确定其分子式，利用色谱保留时间所表现的色谱特性和质谱特征，结合HMDB(www.hmdb.ca)、METLIN(Metlin.scripps.edu)、Chemspider、MZedDB或KEGG中的一个或多个数据库中人体血液和尿液组分数据库比对，推测潜在生物标志物可能的结构及化合物名称。优选地，将质量偏差设置为5ppm。
利用MetaboAnalyst在线数据库(www.MetaboAnalyst.ca)进行上述标志物代谢通路查询，并与标准品进行比对。代谢通路与人体睡眠相关，并且在液相色谱-质谱联用仪检测与标准品保留时间和质量数测量结果一致，可以作为潜在疲劳程度相关生物标志物。
优选地，在多个疲劳程度组重现并且变化趋势一致，但在HMDB(www.hmdb.ca)和METLIN(Metlin.scripps.edu)、Chemspider、MZedDB或KEGG中的一个或多个数据库中未检索到的未知潜在生物标志物时，可以通过纯化出纯品，并采集纯品的质谱、紫外、红外和/或核磁数据，进行结构鉴定和确证。
根据本发明的筛选方法，步骤6中，
根据步骤1中的分组，将步骤5中结构确认的化合物进行对比，若结构确认的化合物在相同程度疲劳组中均出现，则可以确认该化合物为疲劳程度相关生物标志物。
本发明的筛选方法可根据疲劳程度组的分类，确认疲劳程度相关生物标志物属于轻度疲劳还是中度疲劳相关生物标志物或重度疲劳相关生物标志物。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明的筛选方法全面且普适性广。对于疲劳人体的生物化学过程，人们虽然从工作压力、睡眠、生物节律等多角度尝试了多种化合物代谢与疲劳相关性研究，然而仍未发现任何一种人体代谢化合物与疲劳具有相关性，尤其是能够发现代谢化合物与疲劳程度的相关性。本发明考虑到人们对于疲劳的人体生化过程完全未知，在筛选检测生物标志物时，使用不同极性的色谱柱，对样本进行全面检测和分析，以避免漏检，进而影响筛选方法，从而提高了本方法的普适性。
2)本发明采用全扫描色谱方法避免漏检，并提高筛选方法的准确性。由于本发明使用多种不同极性的色谱柱全扫描，并对同一样本进行多次检测，一方面可以避免漏检，另一方面可以根据不同色谱柱同时检出相同组分的结果对色谱柱的检测方法进行验证。避免某一色谱柱出现误差，从而提高筛选方法的准确性。
3)本发明首次将小分子代谢组学的方法应用于疲劳程度检测中。现有技术中小分子代谢组学主要应用于人体疾病的诊断、治疗以及药物研发等应用，尚未见到将其应用于人体正常生理变化的研究中。
疲劳是人体应对工作负荷、压力负荷、和/或生物节律变化而产生的一种生理变化，伴随负荷强度及节律变化程度疲劳程度也随之变化。本发明考虑到人体生理变化是自身可以调节并通过休息如睡眠能够得以恢复的一种变化，因此生理变化导致代谢物水平改变必将不同于疾病或药物毒理引起的人体病理导致代谢物水平的改变，即生理变化引起代谢物水平改变小于病理变化引起的改变。
通过本发明的检测方法，真正实现了小分子代谢组学的方法应用于疲劳程度检测中。能够实现轻度、中度和重度的准确检测，提供了疲劳程度检测的客观依据。
同时，本发明将代谢物变化倍数的阈值下限设定为1.2倍，小于疾病和毒理学研究中通常设定的2.0倍或更大数值。本发明的筛选方法可避免因疾病或其他因素造成的检测误差，因而方法的准确性更高。
4)本方法的筛选方法采用疲劳前后对照的分组方式，这种分组方式可以扣除食物饮食、环境等因素引入的干扰，同时避免了由于疲劳定义不一致而引入的歧义和误差。本方法中以工作时间作为诱发疲劳的表征指标，如连续模拟驾驶3小时，可以诱发轻度疲劳。
5)此外，本方法中对于代谢组学研究中常见样本量一次采样不足时，也提出了解决方案。当样本量不足时，可采用小样本量分组，单独测试，然后各小组单独检测筛选潜在生物标志物，并将各小组筛选出潜在生物标志物进行比较，进一步筛选出在各组重现的作为生物标志物。该分组方案的优势在于，对于有限的样本量，仍然可以进行有效的生物标志物筛选。
6)最后，本发明的筛选方法还考虑到人体正常生物节律的影响，设置了对照组，从而使检测结果的可信度更高。
附图说明
图1是模拟驾驶志愿者血浆样本的极性HILIC柱正离子模式检测极性组分典型总离子流图。
图2是模拟驾驶志愿者血浆样本HILIC柱正离子检测极性组分数据主成分分析得分图。
图3是模拟驾驶志愿者血浆样本弱极性C18柱正离子模式检测极性脂质组分典型总离子流图。
图4是是模拟驾驶志愿者血浆样本弱极性C18柱正离子模式检测极性脂质组分数据主成分分析得分图。
图5是模拟驾驶志愿者血浆样本的弱极性C18柱负离子模式检测极性脂质组分典型总离子流图。
图6是模拟驾驶志愿者血浆样本弱极性C18柱负离子模式检测极性脂质组分数据主成分分析得分图。
图7是模拟驾驶志愿者血浆样本的弱极性C18柱正离子模式检测非极性脂质组分典型总离子流图。
图8是模拟驾驶志愿者血浆样本弱极性C18柱正离子模式检测非极性脂质组分数据主成分分析得分图。
图9是模拟驾驶志愿者尿液样本的极性HILIC柱正离子模式检测极性组分典型总离子流图。
图10是模拟驾驶志愿者尿液样本HILIC柱正离子检测极性组分数据主成分分析得分图。
图11是模拟驾驶志愿者尿液样本的弱极性C18柱正离子模式检测弱极性组分典型总离子流图。
图12是模拟驾驶志愿者尿液样本弱极性C18柱正离子模式检测弱极性组分数据主成分分析得分图。
图13是模拟驾驶志愿者尿液样本的弱极性C18柱负离子模式检测弱极性组分典型总离子流图。
图14是模拟驾驶志愿者尿液样本弱极性C18柱负离子模式检测弱极性组分数据主成分分析得分图。
图15是模拟驾驶志愿者尿液样本的非极性PFPP柱正离子模式检测非极性组分典型总离子流图。
图16是模拟驾驶志愿者尿液样本非极性PFPP柱正离子模式检测非极性组分数据主成分分析得分图。
图17是模拟驾驶志愿者尿液样本的非极性PFPP柱负离子模式检测非极性组分典型总离子流图。
图18是模拟驾驶志愿者尿液样本非极性PFPP柱负离子模式检测非极性组分数据主成分分析得分图。
图19是尿刊酸的结构鉴定。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1模拟民航航空器驾驶员操作3.5小时体液中疲劳程度生物标志物的筛选方法
1.1志愿者招募及样本采集：
招募志愿者99人，入组条件：身体健康，无服药，年龄在20-55岁，其中男性55人，女性44人，女性志愿者需要不在月经期。
安排志愿者进行模拟航空器驾驶操作，连续操作3.5小时，诱发轻度疲劳。
血液和尿液样本的采集：在志愿者进行模拟驾驶操作前后分别采集血液和尿液样本，血液样本采用抗凝采血管采集不少于2.0mL静脉血，尿液样本使用无菌尿杯收集尿液并分装于无菌管中保存。
人体血液、尿液样本保存，血液经4000-5000rpm离心3-5min，将上层血浆分装于干净无菌离心管保存于-80℃；尿液样本分装于无菌离心管保存于-80℃。
1.2人体血浆和尿液样本的预处理：
(1)血浆样本的前处理步骤为：将血浆样本在4℃融化30-60分钟；分成2份，第一份取100μL血浆至标记好标签的1.5mL离心管中，加入300μL的乙腈；充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4℃，离心10分钟，取上层溶液100μL，置于200μL内衬管中，用于检测血浆中的极性组分；第二份取100μL血浆至标记好标签的1.5mL离心管中，加入500μL的三氯甲烷/甲醇(3:1)溶液；充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4℃，离心5分钟，取下层溶液200μL，置于1.5mL离心管中；真空离心浓缩样本4小时，向干燥后的样品中加入300μL异丙醇/乙腈(1:1)，震荡混匀40秒。12000rpm离心5分钟，取上清液100μL，置于200μL内衬管中，用于检测血浆中的脂质组分。(2)尿液样本预处理步骤为：分析检测前将尿液样本取出放置至室温，在4℃，12000rpm离心5分钟，取上清液100μL加入100μL水稀释。
1.3采用液相色谱-飞行时间质谱法对血浆和尿液样本进行分析检测：
(1)血浆样本的检测分别采用极性色谱柱HILIC、弱极性色谱柱C18对血液中的极性组分和脂质组分分别进行分离检测。
采用极性HILIC色谱柱的液相条件为：UPLC BEH Amide HILIC column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相为A相组成为含有0.1％甲酸和1.0mM甲酸铵的乙腈溶液，B相组成为含有0.1％甲酸和1.0mM甲酸铵的水溶液；柱温40℃；流动相流速0.3mL/min；进样量1.0μL。质谱条件为：正离子离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)。
采用弱极性C18色谱柱检测血浆脂质非极性组分的液相条件为：UPLC CSHC18column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相A相组成为含有0.1％甲酸和1.0mM甲酸铵的乙腈/水为6:4的溶液，B相组成为含有0.1％甲酸和1.0mM甲酸铵的乙腈/异丙醇为9:1的溶液；柱温50℃；流动相流速0.3mL/min；进样量1.0μL。质谱条件为：正离子离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)
采用弱极性C18色谱柱检测血浆脂质极性组分的液相条件为：UPLC CSH C18column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相A相组成为含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为含有0.1％甲酸的甲醇溶液。质谱条件为：正离子和负离子两种离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)。
每个血浆样本均采用2种色谱柱分别检测其中的极性和脂质极性及非极性组分，其中极性组分只检测正离子模式；脂质极性组分检测正离子和负离子模式；脂质非极性组分检测正离子模式，即每个血浆样本检测4次，以便尽可能检测到血浆中全部的代谢化合物。检测中每10个样本插入一个空白防止交叉污染，并插入一个质控样进行质量控制。分析检测过程中样品室温度保持4℃。
(2)尿液样本的检测分别采用极性色谱柱HILIC、弱极性色谱柱C18和非极性色谱柱PFPP对尿液中的极性、弱极性和非极性组分分别进行分离检测。
采用极性HILIC色谱柱的液相条件为：UPLC BEH Amide HILIC column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相为A相组成为95％乙腈和5％含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为含有0.1％甲酸的水溶液；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)。
采用弱极性C18色谱柱的液相条件为：UPLC CSH C18column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相A相组成为含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为乙腈；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子和负离子两种离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)。
采用非极性PFPP色谱柱的液相条件为：UPLC HSS PFPP column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相为A相组成为含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为甲醇；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子和负离子两种离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)。
每个尿液样本均采用3种色谱柱分别检测其中的极性、弱极性和非极性组分，其中极性组分只检测正离子模式，弱极性和非极性组分检测正离子和负离子模式，即每个尿液样本检测5次，以便尽可能检测到尿液中全部的代谢化合物。检测中每10个样本插入一个空白防止交叉污染，并插入一个质控样进行质量控制。分析检测过程中样品室温度保持4℃。
1.4数据处理和初步筛选出生物标志物
采用液相色谱-质谱联用仪分析检测样本获得435GB的检测数据，采用代谢组学数据处理专业软件Progenesis QI进行统计分析处理，包括数据对齐，峰提取，分组方式以模拟航空器驾驶作为一种诱发轻度疲劳的处理方式，对处理前后样本进行配对分组，采用偏最小二乘法OPLS-DA分组分析，以P≤0.05、CV≤30％、VIP>1.0、最大变化倍数≥1.2作为筛选阈值，初步筛选出潜在生物标志物。其中最大变化倍数的选择考虑到疲劳是一种可恢复的生理变化，此数值的设置不同于疾病研究中设置为2.0甚至达到3.0或4.0，设置成较小数值为1.2。
按照上述步骤处理血浆样本检测数据，在利用极性HILIC柱正离子模式检测血浆中极性组分8625个化合物、利用弱极性C18柱正离子模式检测血浆中极性组分19646个化合物和非极性脂质组分8625个化合物、利用弱极性C18柱负离子模式检测血浆中极性脂质组分13648个化合物的数据中，均未能筛选出符合条件的生物标志物。
按照上述步骤处理尿液样本检测数据，在利用弱极性C18柱正离子模式检测尿液中弱极性组分12282个化合物的数据中，分析筛选出1种化合物为潜在生物标志物；在利用极性HILIC柱正离子模式检测尿液中极性组分9490个化合物、利用弱极性C18柱负离子模式检测尿液中弱极性组分24363个化合物、利用非极性PFPP柱正离子模式检测尿液中非极性组分13054个化合物和利用非极性PFPP柱负离子模式检测尿液中非极性组分7702个化合物的数据中，均未能筛选出符合条件的生物标志物。
1.5生物标志物代谢通路检索和结构确认
在步骤1.4中初步筛选出的1种潜在生物标志物在C18柱保留时间为：3.0min，精确质量数m/z为139.0508。将质量偏差设置为5ppm，利用HMDB(www.hmdb.ca)数据库检索比对，推测该潜在生物标志物的可能的结构为C6H6N2O2及化合物名称尿刊酸(Urocanic acid)。进一步购买尿刊酸纯品在液相色谱-质谱联用仪上进行确认，通过标准品添加比对，标准品与待测化合物保留时间一致，测得精确质量数一致，从而确定该潜在生物标志物为尿刊酸。
利用MetaboAnalyst在线数据库(www.MetaboAnalyst.ca)进行尿刊酸代谢通路查询，结果表明尿刊酸属于组胺代谢通路，进一步检索组胺与睡眠相关性，结果表明组胺与人体睡眠高度相关。
由此得出结论：人体轻度疲劳时组胺代谢通路中尿刊酸含量上调1.4倍，即尿刊酸含量的升高可以反应出人体处于轻度疲劳状态。由于人体出现轻度疲劳的同时，检测到尿刊酸上调1.4倍，因此我们将尿刊酸上调1.4倍来表征轻度疲劳的出现。
实施例2民航空中交通管制员体液中疲劳生物标志物的筛选方法
2.1志愿者招募及样本采集：
志愿者招募：在国内某国际机场招募民航空中交通管制员志愿者45人，入组条件：身体健康，男性，无服药，年龄20-35岁，分为2组，第一组(ATC1)20人，第二组(ATC2)25人。同时招募该机场行政后勤人员志愿者23人为对照组(CON)，入组条件：身体健康，男性，无服药，年龄20-35岁。
民航空中交通管制员，负责指挥空中交通航路上飞机安全运行，通俗地说就是指挥飞机，参考雷达等信息统筹管理整个空域的所有航空器。在工作中管制员往往同时指挥多架飞机的运行，需要精力集中、准确判断及应急处理等能力，因此非常容易疲劳，民航局相关规定明确每名管制员在席位指挥飞机最长时间不超过2小时。其工作中产生疲劳主要是脑力劳动引起的。
本次研究主要针对白班管制员疲劳程度相关生物标志物进行筛选研究。将志愿者白班从事空中交通指挥工作作为诱发中度疲劳的一种处理。
尿液样本的采集：在白班管制员志愿者上班上岗前采集一次尿液样本作为非疲劳样本，在管制员志愿者白班下岗后下班前采集一次尿液样本作为中度疲劳样本；同样，对于行政后勤人员志愿者也在其上班前后分别采集2次尿液样本。以行政后勤人员作为对照样本，排除人体正常生理代谢的干扰。
ATC1组样本采集是在2014年12月冬季，ATC2和CON组样本采集是在2016年10月秋季进行。
尿液样本使用无菌尿杯收集尿液并分装于无菌管中保存。
尿液样本分装于无菌离心管保存于-80℃。
2.2尿液样本的预处理：
尿液样本预处理步骤为：分析检测前将尿液样本取出放置至室温，在4℃，12000rpm离心5分钟，取上清液100μL加入100μL水稀释。
2.3采用液相色谱-飞行时间质谱法对尿液样本进行分析检测：
尿液样本的检测分别采用极性色谱柱HILIC、弱极性色谱柱C18和非极性色谱柱PFPP对尿液中的极性、弱极性和非极性组分分别进行分离检测。
采用极性HILIC色谱柱的液相条件为：UPLC BEH Amide HILIC column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相为A相组成为95％乙腈和5％含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为含有0.1％甲酸的水溶液；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)。
采用弱极性C18色谱柱的液相条件为：UPLC CSH C18column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相A相组成含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为乙腈；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子和负离子两种离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)。
采用非极性PFPP色谱柱的液相条件为：UPLC HSS PFPP column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相为A相组成为含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为甲醇；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子和负离子两种离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)。
每个尿液样本均采用3种色谱柱分别检测其中的极性、弱极性和非极性组分，其中极性组分只检测正离子模式，弱极性和非极性组分检测正离子和负离子模式，即每个尿液样本检测5次，以便尽可能检测到尿液中全部的代谢化合物。检测中每10个样本插入一个空白防止交叉污染，并插入一个质控样进行质量控制。分析检测过程中样品室温度保持4℃。
2.4数据处理和初步筛选出生物标志物
采用液相色谱/质谱联用仪分析检测样本获得261GB的检测数据，采用代谢组学数据处理专业软件Progenesis QI进行统计分析处理，包括数据对齐，峰提取，分组方式以执行工作任务作为一种诱发中度疲劳的处理方式，对处理前后样本进行配对分组，采用偏最小二乘法OPLS-DA分组分析，以P≤0.05、CV≤30％、VIP>1.0、最大变化倍数≥1.2作为筛选阈值，初步筛选出潜在生物标志物。其中最大变化倍数的选择考虑到疲劳是一种可恢复的生理变化，此数值的设置不同于疾病研究中设置为2.0甚至达到3.0或4.0，设置成较小数值为1.2。
按照上述步骤处理第一组管制员ATC1尿液样本检测数据(参见表1)，在利用极性HILIC柱正离子模式检测尿液中极性组分9490个化合物的数据中，分析筛选出5种化合物为潜在生物标志物；在利用弱极性C18柱正离子模式检测尿液中弱极性组分10809个化合物的数据中，分析筛选出12种化合物为潜在生物标志物；利用弱极性C18柱负离子模式检测尿液中弱极性组分5247个化合物的数据中，未能分析筛选出符合条件的潜在生物标志物；在利用非极性PFPP柱正离子模式检测尿液中非极性组分11414个化合物的数据中，分析筛选出6种化合物为潜在生物标志物；在利用非极性PFPP柱负离子模式检测尿液中非极性组分6176个化合物的数据中，分析筛选出2种化合物为潜在生物标志物。
按照上述步骤处理第二组管制员ATC2尿液样本检测数据(参见表2)，在利用极性HILIC柱正离子模式检测尿液中极性组分7903个化合物的数据中，分析筛选出4种化合物为潜在生物标志物；在利用弱极性C18柱正离子模式检测尿液中弱极性组分10463个化合物的数据中，分析筛选出5种化合物为潜在生物标志物；利用弱极性C18柱负离子模式检测尿液中弱极性组分6014个化合物的数据中，分析筛选出1种化合物为潜在生物标志物；在利用非极性PFPP柱正离子模式检测尿液中非极性组分9739个化合物的数据中，分析筛选出4种化合物为潜在生物标志物；在利用非极性PFPP柱负离子模式检测尿液中非极性组分5996个化合物的数据中，未能分析筛选出符合条件的潜在生物标志物。
按照上述步骤处理对照组CON组尿液样本检测数据(参见表3)，在利用极性HILIC柱正离子模式检测尿液中极性组分8315个化合物的数据中，分析筛选出10种化合物为潜在生物标志物；在利用弱极性C18柱正离子模式检测尿液中弱极性组分10645个化合物的数据中，分析筛选出17种化合物为潜在生物标志物；利用弱极性C18柱负离子模式检测尿液中弱极性组分6966个化合物的数据中，分析筛选出7种化合物为潜在生物标志物；在利用非极性PFPP柱正离子模式检测尿液中非极性组分10318个化合物的数据中，分析筛选出10种化合物为潜在生物标志物；在利用非极性PFPP柱负离子模式检测尿液中非极性组分6571个化合物的数据中，未能分析筛选出符合条件的潜在生物标志物。
表1第一组管制员尿液样本中筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物
表2第二组管制员尿液样本中筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物
表3.对照组尿液样本中筛选出的相关生物标志物
2.5生物标志物代谢通路检索和结构确认
比较三组尿液样本中筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物，结果表明(参见表4)，有3种潜在疲劳程度相关生物标志物尿刊酸、5-羟色氨酸、乙酰胞嘧啶在三组均出现，此外还有3种潜在疲劳程度相关生物标志物二甲基鸟苷、乙酰苯胺和Alpha-CEHC仅在管制员组出现。
将上述6种化合物在Metaboanalyst数据库检索(表4)，检索结果显示化合物二甲基鸟苷属于酪氨酸代谢通路，乙酰苯胺属于芳香胺代谢通路，5-羟色氨酸属于色氨酸代谢通路，尿刊酸属于组胺酸代谢通路，alpha-CEHC和乙酰胞嘧啶未检索到相应的代谢通路。进一步文献查询结果表明，上述检索到的4条代谢通路均与人的睡眠有关。
上述结果表明，与行政后勤人员(对照组)相比，经过一天工作，空中交通管制员(疲劳组)增加了3条与睡眠有关的代谢通路被打开。
表4尿液中筛选出的疲劳程度相关生物标志物
实施例3模拟民航航空器驾驶员操作1小时体液中疲劳程度生物标志物的筛选方法
3.1志愿者招募及样本采集：
招募志愿者20人，入组条件：身体健康，无服药，年龄在20-40岁，其中男性10人，女性10人，女性志愿者需要不在月经期。
安排志愿者进行模拟航空器驾驶操作，连续操作1小时，未出现疲劳感。
尿液样本的采集：在志愿者进行模拟驾驶操作前后采集尿液样本，尿液样本使用无菌尿杯收集尿液并分装于无菌管中保存。
人体尿液样本保存，尿液样本分装于无菌离心管保存于-80℃。
2.2人体尿液样本的预处理：
尿液样本预处理步骤为：分析检测前将尿液样本取出放置至室温，在4℃，12000rpm离心5分钟，取上清液100μL加入100μL水稀释。
2.3采用液相色谱-飞行时间质谱法对尿液样本进行分析检测：
分别采用极性色谱柱HILIC、弱极性色谱柱C18和非极性色谱柱PFPP对尿液中的极性、弱极性和非极性组分分别进行分离检测。
采用极性HILIC色谱柱的液相条件为：UPLC BEH Amide HILIC column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相为A相组成为95％乙腈和5％含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为含有0.1％甲酸的水溶液；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)。
采用弱极性C18色谱柱的液相条件为：UPLC CSH C18column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相A相组成为含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为乙腈；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子和负离子两种离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)。
采用非极性PFPP色谱柱的液相条件为：UPLC HSS PFPP column(2.1mm╳100mm,1.7μm)，流动相为A相组成为含有0.1％甲酸的水溶液，B相组成为甲醇；柱温为40℃，进样量2.0μL，流动相流速0.3mL/min。质谱条件为：正离子和负离子两种离子化模式检测，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式。电喷雾离子化器最佳毛细管电压为3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃。采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)。
每个尿液样本均采用3种色谱柱分别检测其中的极性、弱极性和非极性组分，其中极性组分只检测正离子模式，弱极性和非极性组分检测正离子和负离子模式，即每个尿液样本检测5次，以便尽可能检测到尿液中全部的代谢化合物。检测中每10个样本插入一个空白防止交叉污染，并插入一个质控样进行质量控制。分析检测过程中样品室温度保持4℃。
1.4数据处理和初步筛选出生物标志物
采用液相色谱-质谱联用仪分析检测样本获得35GB的检测数据，采用代谢组学数据处理专业软件Progenesis QI进行统计分析处理，包括数据对齐，峰提取，分组方式以模拟航空器驾驶作为一种诱发轻度疲劳的处理方式，对处理前后样本进行配对分组，采用偏最小二乘法OPLS-DA分组分析，以P≤0.05、CV≤30％、VIP>1.0、最大变化倍数≥1.2作为筛选阈值，初步筛选出潜在生物标志物。其中最大变化倍数的选择考虑到疲劳是一种可恢复的生理变化，此数值的设置不同于疾病研究中设置为2.0甚至达到3.0或4.0，设置成较小数值为1.2。
按照上述步骤处理尿液样本检测数据，在利用极性HILIC柱正离子模式检测血浆中极性组分4847个化合物、利用弱极性C18柱正离子模式检测尿液中弱极性组分6916个化合物、利用弱极性C18柱负离子模式检测血浆中极性脂质组分4012个化合物的数据中，利用非极性PFPP柱正离子模式检测尿液中非极性组分9221个化合物，利用非极性PFPP柱负离子模式检测尿液中非极性组分5074个化合物，均未能筛选出符合条件的生物标志物。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种采用液相色谱-质谱法筛选人体体液中疲劳程度相关生物标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.分组采集人体体液样本；
步骤2.对步骤1采集的样本进行预处理；
步骤3.采用液相色谱-质谱法对步骤2预处理后的样本进行检测；
步骤4.对步骤3检测得到的数据进行处理及阈值设定，筛选出潜在疲劳程度相关生物标志物；
步骤5.对步骤4筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物进行代谢通路检索及对潜在疲劳程度相关生物标志物进行结构确认；
步骤6.将步骤5结构确认的各组的化合物进行对比，筛选出与疲劳程度相关生物标志物。
2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1中，
所述人体体液样本可以为尿液和/或血液样本，优选为同时收集尿液和血液样本用于后续步骤检测；
优选地，所述人体体液样本来源于身体健康的志愿者，当所述志愿者为女性时，优选不在月经期的女性；
优选地，所述采集步骤包括采集非疲劳样本和不同疲劳程度样本；优选地，样本的采集步骤包括：在志愿者上班工作前或模拟操作诱发疲劳前，采集其体液样本作为非疲劳样本；根据不同疲劳程度，在志愿者工作一定时间后或模拟操作诱发不同的疲劳程度后收集其体液样本作为不同的疲劳程度样本；
优选地，所述采集步骤包括对所述疲劳程度样本进行分组获得不同的疲劳程度组样本；
优选地，所述根据疲劳程度分组为根据志愿者连续工作时间长短、工作岗位、工作负荷或排班情况等设计成不同疲劳程度组，采集不同的疲劳程度组样本；
优选地，所述工作时间可以设置成工作2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时或14小时组，按照相同岗位情况下疲劳程度随工作时间延长而增加来设计不同疲劳程度组；
优选地，所述工作岗位可以按照安全职责关键岗位疲劳程度大于一般岗位来设计不同疲劳程度组，如按照地面、空中和水路等驾驶员、民航空中交通管制员等，在相同工作时间情况下疲劳程度大于普通后勤管理岗位人员的疲劳程度来分组；
优选地，所述根据排班可以按照夜班人员疲劳程度大于白班人员疲劳程度来分组；
优选地，不同疲劳程度组每组人数不少于20人次，更优选地，当各组人数少于50人次时，可设置重复组，还可再设置对照组；
优选地，所述一次收集的样本量至少大于80人次；更优选大于90人次；还更优选大于100人次；可以对样本量分成至少2组，例如3组，4组或5组，每组10-20人次，注意每人次样本至少包含一个疲劳前样本和一个一定疲劳程度的样本；
优选地，当一次收集的样本量不足时(例如不足80人次)，可进行多次小样本量收集，按照每次收集的样本进行分组，所述分组以每组不少于20人次(样本数量不少于40份)，并且要求尽量集中时间采样，集中时间可以同时采集一组人员或最长不超过180日内完成，在每个不同疲劳程度样本组采集中，均应包含该组人员非疲劳样本及处于一定疲劳程度的样本，以便形成疲劳前(即非疲劳)与一定疲劳程度状态时的前后对照样本。需要说明，在多次分组采集同一疲劳程度的样本时，每组人员可以有交叉；
优选还对分组的样本进行疲劳程度不同的对照，并筛选出生物标志物；在这过程中，还可以区分疲劳和不疲劳以及不同疲劳程度的生理过程，从而剔除不相关的生物标志物，并最终确认筛选方法；
上述分组并对照的方法，通过后期单独测试各小组样本，并将各小组筛选出的潜在疲劳程度相关生物标志物进行比较，从而能够在有限的样本量时，仍然可以进行有效的生物标志物筛选。
3.如权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，当所述体液样本为血液样本时，所述血液样本为采用抗凝采血管采集不少于2.0mL的静脉血；
优选地，所述步骤1的样本采集步骤还包括在采集完体液样本后，将样本在不高于-20℃条件下进行低温保存；
例如将人体血液、尿液样本在不高于-20℃条件下低温保存；优选将血液经离心后收集血浆在不高于-20℃条件下低温保存，例如将血液进行4000-5000rpm离心3-5min，将上层血浆分装于干净无菌离心管保存于-80℃；优选将尿液样本在不高于-20℃条件下低温保存，例如将尿液样本分装于无菌离心管保存于-80℃；
在低温保存过程中还可以向样本中加入适量抗生素，避免因细菌引起部分代谢物的分解；例如向样本中加入质量浓度为0.05-0.1％的叠氮化钠。
4.如权利要求1-3任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2中，
所述对样本进行预处理时，优选使步骤1低温保存的样本在0-4℃环境中融化；
优选血浆样本的融化时间为30-60分钟；
优选地，当步骤1收集的体液样本为血液样本时，步骤2的预处理的步骤包括：对血浆中的极性组分和/或脂质组分进行处理；待样本融化后，向血浆中加入有机溶剂如乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上层溶液便于后续步骤测试血浆中的极性组分；和/或
待样本融化后，向血浆中加入有机溶剂如三氯甲烷与甲醇进行蛋白沉淀，离心后取下层溶液、离心浓缩，干燥后加入有机溶剂如异丙醇/乙腈后，再次离心取上清液，便于后续步骤测试血浆中的脂质组分的步骤；
优选地，对于血浆中极性组分的样本前处理方法包括：将血浆样本在4℃融化30-60分钟；取100μL血浆至标记好标签的1.5mL离心管中，加入300μL的乙腈；充分振荡15s，进行蛋白沉淀，12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μL，置于200μL内衬管中；
优选地，对于血浆中脂质组分分析的样本前处理方法包括：将血浆样本在4℃融化30-60分钟；取100μL血浆至标记好标签的1.5mL离心管中，加入500μL的三氯甲烷/甲醇(3：1)溶液；充分振荡15s，进行蛋白沉淀，12000rpm，4℃，离心5min，取下层溶液200μL，置于1.5mL离心管中；真空离心浓缩样本4小时，向干燥后的样品中加入300μL异丙醇/乙腈(1：1)，震荡混匀40s，12000rpm离心5min，取上清液100μL，置于200μL内衬管中；
例如采用如下方法对步骤1收集的血液样本进行预处理：将血浆样本在4℃融化30-60分钟；分成2份，第一份如前所述极性组分的前处理步骤后，取上层溶液100μL，置于200μL内衬管中，用于检测血浆中的极性组分；
第二份如前所述极性组分的前处理步骤后，取下层溶液200μL，置于1.5mL离心管中；真空离心浓缩样本4小时，向干燥后的样品中加入300μL异丙醇/乙腈(1:1)，震荡混匀40秒，12000rpm离心5分钟，取上清液100μL，置于200μL内衬管中，用于检测血浆中的脂质组分；
优选地，当步骤1收集的体液样本为尿液样本时，步骤2的预处理步骤包括：将尿液样本进行离心，取上清液及任选将上清液稀释成适宜后续步骤分析检测浓度的水溶液，例如使用1-3倍体积的水对样本进行稀释；
例如采用如下步骤对尿液样本进行预处理：
分析检测前将尿液样本取出放置至室温，在4℃，12000rpm离心5分钟，取上清液100μL加入100μL水稀释。
5.如权利要求1-4任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤3中，
所述液相色谱-质谱法为液相色谱-飞行时间质谱法；
优选地，当步骤2预处理的样本为血液样本时，所述液相色谱可以采用极性色谱柱优选HILIC柱对血液中的极性组分进行分离检测；还可以采用弱极性色谱柱优选C18柱对血液中的脂质极性和非极性组分进行分离检测；当所述液相色谱采用极性色谱柱分离检测极性组分时，质谱法优选采用正离子模式；当所述液相色谱采用弱极性色谱柱分离检测脂质极性组分时，质谱法优选采用正离子和负离子模式；当所述液相色谱采用弱极性色谱柱分离检测脂质非极性组分时，质谱法优选采用正离子模式；
优选地，采用极性HILIC色谱柱的色谱条件为：BEH Amide HILIC column[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm)]；
流动相为A相组成为含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸和5-15mM甲酸铵的乙腈或甲醇溶液，B相组成为含有0.1％-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸和5-15mM甲酸铵的水溶液；
柱温20-50℃；流动相流速0.1-1.0mL/min；进样量0.3-5.0μL；
优选地，采用弱极性C18色谱柱检测血浆脂质非极性组分的液相条件为：CSH C18column[(2.1-4.6mm)╳(100-250mm),1.5-5μm)]；
流动相A相组成为含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸和1.0mM甲酸铵的乙腈与水的混合溶液，其中乙腈与水的体积比为6:4，B相组成为含有0.1％甲酸或乙酸或三氟乙酸和1.0mM甲酸铵的乙腈与异丙醇的混合溶液，其中乙腈与异丙醇的体积比为9:1的溶液；
柱温20-50℃；流动相流速0.1-1.0mL/min；进样量0.3-5.0μL；
优选地，采用弱极性C18色谱柱检测血浆脂质极性组分的液相条件为：UPLC CSHC18column[(2.1-4.6mm)╳(100-250mm),1.5-5μm)]；
流动相A相组成为含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸水溶液，B相组成为含有0.1％甲酸或乙酸或三氟乙酸的甲醇或乙腈溶液；
柱温20-50℃；流动相流速0.1-1.0mL/min；进样量0.3-5.0μL。
6.如权利要求1-5任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤3中，
当步骤2预处理的样本为尿液样本时，所述液相色谱可以采用极性色谱柱优选HILIC柱、弱极性色谱柱优选C18柱和非极性色谱柱优选PFPP柱分别对尿液中的极性、弱极性和非极性组分进行分离检测；
当所述液相色谱使用极性色谱柱分离检测极性组分时，质谱法优选采用检测正离子模式；当所述液相色谱使用弱极性和非极性柱分离检测弱极性和非极性组分时，采用正离子和负离子两种模式；
优选地，采用极性HILIC色谱柱的液相条件为：BEH Amide HILIC column[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm]；
流动相为A相组成为体积分数95-100％乙腈或甲醇和体积分数为0-5％含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液，B相组成为含有0.1-0.5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液；
柱温为20-40℃，进样量0.5-5.0μL，流动相流速0.3-1.0mL/min；
优选地，采用弱极性C18色谱柱的液相条件为：UPLC CSH C18column[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm)]；
流动相A相组成为0.1-5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液，B相组成为甲醇或乙腈；
柱温为20-40℃，进样量0.5-5.0μL，流动相流速0.3-1.0mL/min；
优选地，液相色谱法采用非极性PFPP色谱柱的液相条件为：HSS PFPP column[(2.1-4.6)mm╳(100-250)mm,1.5-5μm)]；
流动相为A相组成为含有0.1-5％甲酸或乙酸或三氟乙酸的水溶液，B相组成为甲醇或乙腈；
柱温为20-40℃，进样量0.3-5.0μL，流动相流速0.3-1.0mL/min。
7.如权利要求1-6任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤3中，所述质谱法的检测条件为：
当使用正离子离子化模式检测时，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式，电喷雾离子化器毛细管电压为2500-3500，优选3000V，cone电压为20-40V，优选30V。干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃；采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)；
当使用正离子和负离子两种离子化模式检测时，质量范围设置为50-1200m/z全扫描模式；电喷雾离子化器毛细管电压为2000-3500，优选3000V(正离子)或2200V(负离子)，cone电压为20-40V，优选30V；干燥气为氮气，去溶剂化流速为800L/h，cone气流速为30L/h。去溶剂化温度为400℃，离子源温度为100℃；采用浓度为0.2ng/mL的leucineenkephalin(亮氨酸脑啡肽)作为质量数校准内标，校准离子质量为556.2771Da([M+H]+)或554.2615Da([M-H]-)；
分离检测体液样本时，优选每10个样本插入1个空白防止交叉污染，还可以每10个样本插入一个质控样进行质量控制；
分离检测过程中优选样品室温保持在0-4℃。
8.如权利要求1-7任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤4中，
对步骤3分离检测的数据处理，采用数据处理软件，优选采用代谢组学数据处理相关软件进行统计分析处理；
所述分析处理方法包括数据对齐，峰提取；还包括对样本进行分组，分组方式以工作作为一种诱发不同疲劳程度的处理方式，对处理前后样本进行配对分组，采用偏最小二乘法OPLS-DA分组分析，以P≤0.05、CV≤30％、VIP>1.0、最大变化倍数≥1.2作为筛选阈值，筛选出潜在生物标志物；
例如使用数据处理专业软件Progenesis QI对数据进行分析处理；
对各组人次少于50人次，具有重复组和对照组的潜在生物标志物筛选时，可能存在许多假阳性生物标志物，因而还可以通过重复组和对照组筛选出来的潜在生物标志物之间进行比对，进行进一步的筛选和确认。
9.如权利要求1-8任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤5中，
利用液相色谱-质谱检测潜在生物标志物的精确分子量确定其分子式，利用色谱保留时间所表现的色谱特性和质谱特征，结合HMDB(www.hmdb.ca)、METLIN(Metlin.scripps.edu)、Chemspider、MZedDB或KEGG中的一个或多个数据库中人体血液和尿液组分数据库比对，推测潜在生物标志物可能的结构及化合物名称；
优选地，质量偏差设置为5ppm；
利用MetaboAnalyst在线数据库(www.MetaboAnalyst.ca)进行上述标志物代谢通路查询，并与标准品进行比对；代谢通路与人体睡眠相关，并且在液相色谱-质谱联用仪检测与标准品保留时间和质量数测量结果一致，可以作为潜在疲劳程度相关生物标志物；
优选地，在多个疲劳程度组重现并且变化趋势一致，但在HMDB(www.hmdb.ca)和METLIN(Metlin.scripps.edu)、Chemspider、MZedDB或KEGG中的一个或多个数据库中未检索到的未知潜在生物标志物时，可以通过纯化出纯品，并采集纯品的质谱、紫外、红外和/或核磁数据，进行结构鉴定和确证。
10.如权利要求1-9任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤6中，根据步骤1中的分组，将步骤5中结构确认的化合物进行对比，若结构确认的化合物在相同程度疲劳组中均出现，则可以确认该化合物为疲劳程度相关生物标志物。
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