CN107807178B - 血液中毒品和抗精神疾病类药物液相色谱‐质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种超高效液相‐质谱法检测血液中23种毒品和抗精神疾病类药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)样品处理：采用有机溶剂沉淀蛋白法处理样品；(2)初筛检测：采用超高效液相色谱‐串联质谱法(UPLC‐MS/MS)的多反应监测(MRM)模式进行初筛检测；(3)对步骤(2)中初筛检测阳性样本采用超高效液相色谱‐串联质谱法(UPLC‐MS/MS)的多反应监测(MRM)模式进行复检。本发明根据9种毒品和14种抗精神疾病类药物的理化性质，在复核检测中，采用了与初筛检测不同的UPLC‐MS/MS检测条件，以及不同的样品预处理方法，使得本发明检测方法既能满足初筛检测快速、灵敏和准确的要求，又能降低假阳性结果的误判。

Description

血液中毒品和抗精神疾病类药物液相色谱‐质谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种超高效液相色谱‐质谱法检测血液中毒品和抗精神疾病类药物的方法，属于医学检验技术领域。

背景技术

飞行安全是关系国计民生的重大问题，飞行员属于特殊的职业群体，行业安全性要求高，他们的精神和心理健康是保证民航运输安全的重要前提之一。

毒品、违禁药物危害民航安全敏感岗位人员的身心健康，影响飞行安全。2015年4月，国家禁毒办通报一起货运飞行员吸毒案件，要求民航局开展相关禁毒工作，防止发生重大飞行安全事故。2015年3月，德之翼民航飞机坠机事件，给全世界民航敲响了机组成员心理健康问题带来安全隐患的警钟。

为了保障民航航空运输安全，掌握飞行员毒品、违禁药物使用情况，需要对中国民航飞行员进行毒品、违禁药物专项检查。另外，为了掌握飞行员的精神状况，掌握其是否存在未在健康体检中声明的抗精神疾病类药物的服用情形，需要对飞行员进行抗精神疾病类药物的补充检查。

目前中国有3万多现役飞行员，还有大量飞行学生、外籍飞行员和军转民飞行员，面对如此大规模的检测对象，航空医学检验就需要针对其受检对象多，检测时间有限(过长的检测周期会影响体检合格证的发放效率，也会扩大检测结果出来前空白期的潜在危险性)，生物样本量少，检测目标化合物多的特点，建立快速易行、灵敏可靠的检测方法。

2010年中华人民共和国司法部司法鉴定管理局发布了《血液、尿液中154种毒(药)物的检测液相色谱‐串联质谱法》(SF/Z JD0107005‐2010)的司法鉴定技术规范，该规范中样品预处理采用有机溶剂提取法，操作上复杂，需要较大量的血液或尿液量，不适合大样本检测，无法满足民航空勤人员安全用药监管检测快速灵敏的需要。2011年孙英英等(“液相色谱‐串联质谱法测定头发中11种阿片类生物碱”，药学学报，2011，46(12)：1501‐1506)提出了一种能同时检测头发中11种阿片类生物碱的液相色谱‐串联质谱检测法，该方法采用头发作为生物样本，其样品处理方法复杂，可推广性不高；并且该文献的检测方法不涉及抗精神疾病类药物的检测，同时也难以用于大样本的快速检测。中国专利申请CN101750458A公开了一种检测人体中毒品残留的方法，该方法可用于人体毛发、尿液、汗液或唾液中毒品残留检测，尤其是毛发中毒品残留检测，所检测毒品选自氯胺酮、美沙酮、吗啡、海洛因、可卡因、苯甲酰基爱康宁、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA。该方法灵敏度高、特异性强，但由于被检对象中不含抗精神疾病类药物，且生物样品以毛发为主，样品处理方法复杂，同样无法适用大样本的快速检测，不能满足民航空勤人员安全用药监管的需要。2010年张秀尧等(“超高效液相色谱‐串联质谱法同时快速确证检测血浆和尿液中的42种精神药物及其代谢产物”，色谱，2010，28(1)：23‐33)提出了一种同时快速检测血浆和尿液中的42种精神药物及其代谢产物的超高效液相色谱‐串联质谱法，所述42种药物包括抗抑郁药、抗癫痫药、解热镇痛药等，但不涉及毒品，该方法无法满足民航空勤人员毒品和违禁药物的检查需要。

目前还未发现文献报道能同时快速灵敏地检测多种常见毒品和抗精神疾病类药物的有效方法，更缺乏可用于飞行员用药情况的快速易行，灵敏可靠，具有良好重现性和准确性的检测血液中毒品和抗精神疾病类药物的方法。

因此，本发明人旨在建立一种样品处理简便、高灵敏、高准确性的超高效液相色谱质谱联用方法，该方法能够同时快速灵敏地测定人血浆中常见的9种毒品、14种临床上常用的抗精神疾病类药物，用来满足飞行员体内毒品和抗精神疾病类药物的筛查检测需要。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，旨在提供一种采用超高效液相色谱‐质谱法检测血液中常见毒品、抗精神疾病类药物的方法，以快速准确掌握飞行员是否存在违禁药物或抗精神疾病类药物的使用，提前进行干预，避免机组成员心理健康问题带来安全隐患。

本发明通过如下技术方案实现：

一种超高效液相色谱‐质谱法检测血液中毒品和抗精神疾病类药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

采用超高效液相色谱‐串联质谱法(UPLC‐MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，针对所选定的毒品和抗精神疾病类药物进行初筛检测。

根据本发明，所述方法还优选包括对上述步骤中初筛检测阳性样本进行复核的步骤，其中，所述复核步骤针对筛查检测阳性样本，采用超高效液相色谱‐串联质谱法(UPLC‐MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，进行超高效液相色谱‐串联质谱法检测。

根据本发明，所述初筛检测步骤中，以化合物保留时间、一对或者两对母离子/子离子对进行筛查分析。

根据本发明，优选的初筛检测的液相色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为甲酸的水溶液，甲酸的甲醇溶液，或者其组合。

根据本发明，所述的色谱通过梯度洗脱的方式进行。优选地，流速为0.1‐0.5mL/min；柱温：30‐60℃。

根据本发明，优选的色谱条件为：流动相A为含0.001％‐0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％‐0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；流速：0.1‐0.5mL/min；柱温：30‐60℃。

根据本发明，优选质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度100‐150℃；去溶剂化温度250‐450℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速550‐750L/hr，毛细管电压(capillary)1.0‐5.0KV。

根据本发明，优选23种毒品和抗精神疾病类药物的母离子/子离子对如下表1所示。

表1 23种毒品和抗精神疾病类药物初筛检测的母离子/子离子对

优选，所述初筛检测分时间段检测。

根据本发明，所述初筛检测步骤中的分时间段检测根据化合物的保留时间进行分时间段检测，例如可以分为2个时间段，3个时间段，4个时间段，5个时间段，6个时间段或者7个时间段。

根据本发明，上述步骤中的复核步骤，以化合物的两对或者三对母离子/子离子对进行复核，优选还进一步结合保留时间和/或离子丰度比进行复核。

优选，所述复核步骤分时间段质谱扫描分析。

根据本发明，所述复核步骤，分时间段质谱扫描分析是将毒品和抗精神疾病类药物分开进行。

根据本发明，对毒品的复核检测步骤中，根据初筛检测的分析参数，将毒品中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。

根据本发明，对抗精神疾病类药物的复核检测步骤中，根据初筛检测的分析参数，将抗精神疾病类药物中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。

根据本发明，所述毒品和抗精神疾病类药物选自如下的23种化合物中的一种、多种或其全部：

9种毒品：吗啡(Morphine)、可待因(Codeine)、6‐单乙酰吗啡(6‐MAM)、苯丙胺(Amphetamine)、甲基苯丙胺(Methamphetamine)、3,4‐甲二氧基苯异丙胺(MDA)、3,4‐亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、氯胺酮(Ketamine)、海洛因(Heroin)；

14种抗精神疾病类药物：西酞普兰(Citalopram)、文拉法辛(Venlafaxine)、帕罗西汀(Paroxetine)、氯丙嗪(Chlorpromazine)、氯硝西泮(Clonazepam)、氟西汀(Fluoxetine)、舍曲林(Sertraline)、艾司唑仑(Estazolam)、阿米替林(Amitriptyline)、地西泮(Diazepam)、米安色林(Mianserine)、氟伏沙明(Fluvoxamine)、阿普唑仑(Alprazolam)、马普替林(Maprotiline)。

上述毒品和抗精神疾病类药物的选择是根据《民用航空人员体检合格证管理规则》(CCAR‐67FS‐R2)和《空勤人员和空中交通管制员体检鉴定》(AP‐67FS‐002)中有关毒品、违禁药物规定，并通过对北京大学第六医院临床医生以及航空公司航医的咨询和调研，同时结合《中国精神病防治指南》等情况后确定的。

在本发明的优选实施方式中，提供一种超高效液相色谱‐质谱法检测血液中上述23种毒品和抗精神疾病类药物的一种或几种或全部的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)血液样品预处理；

2)采用超高效液相色谱‐串联质谱法(UPLC‐MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，对预处理后血液样品，针对所选定的化合物进行初筛检测；

3)任选进一步包括对步骤2)中初筛检测阳性的样本进行复核检测的步骤，其中，所述复核检测步骤针对筛查检测阳性样本，采用超高效液相色谱‐串联质谱法(UPLC‐MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，进行超高效液相色谱‐串联质谱法检测。

根据本发明，优选步骤1)血液样品预处理采用有机溶剂沉淀蛋白法，优选所述有机溶剂为三氯乙酸。优选血液样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，将三氯乙酸加入上清混合，再离心分离，取上清备检。

在本发明的一个具体实施方式中，血液样品预处理方法为：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ(内标)，混匀，再加入80μL10％三氯乙酸，涡旋混合1min，12000rpm离心15min，取上清备检。

根据本发明，优选步骤2)中，初筛检测以化合物的保留时间、一对或两对母离子/子离子对进行筛查分析。

根据本发明，步骤2)中UPLC‐MS/MS检测条件如下：液相色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相A为含0.001％‐0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％‐0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；流速：0.1‐0.5mL/min；柱温：30‐60℃。质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度100‐150℃；去溶剂化温度250‐450℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速550‐750L/hr，毛细管电压(capillary)1.0‐5.0KV。

根据本发明，优选23种毒品和抗精神疾病类药物的母离子/子离子对如上表1所示。

其中，色谱柱优选为ACQUITY UPLC HSS C18柱或相当者，更优选为ACQUITY UPLCHSS C18柱，1.8μm×2.1mm×150mm。

优选，流动相A为含0.005％‐0.015％甲酸的水溶液，流动相B为含0.005％‐0.015％甲酸的甲醇溶液；更优选，流动相A为含0.01％甲酸的水溶液，流动相B为含0.01％甲酸的甲醇溶液。

优选，流速为0.2‐0.4mL/min；更优选流速为0.3mL/min。

优选，柱温：45‐55℃；更优选柱温为50℃。

优选流动相梯度洗脱的条件如下表2所示：

表2 23种毒品和抗精神疾病类药物UPLC‐MS/MS初筛检测的色谱流动相条件

进一步优选，样品室温度10℃。

优选，质谱条件中离子源温度为110‐130℃；更优选离子源温度为120℃。

优选，去溶剂化温度300‐400℃；更优选去溶剂化温度为350℃。

优选，液氮气体流速600‐700L/hr；更优选，液氮气体流速为650L/hr。

优选，毛细管电压(capillary)2.0‐4.0KV；更优选为3.0KV。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤2)的UPLC‐MS/MS分析条件为：ACQUITYUPLC HSS C18柱(1.8μm×2.1mm×150mm)；流动相A：含0.01％甲酸的水溶液，流动相B：含0.01％甲酸的甲醇溶液，流动相条件如表2所示；流速0.3mL/min；柱温50℃；进样量：3μL；样品室温度10℃；离子源：ESI+，离子源温度120℃；去溶剂化温度350℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速650L/hr，毛细管电压(capillary)3.0KV。

根据该实施方式，步骤2)中所述23种药物初筛检测的保留时间如表3所示。

根据该实施方式，步骤2)中所述23种药物初筛检测的一对或两对母离子/子离子对的数值如表3所示。

根据该实施方式，步骤2)中所述23种药物的血液中检出限如表3中所示。

表3 23种毒品和抗精神疾病类药物的UPLC‐MS/MS定性分析参数

优选，所述初筛检测分时间段检测。

根据本发明，所述初筛检测步骤中的分时间段检测根据化合物的保留时间进行分时间段检测，例如可以分为2个时间段，3个时间段，4个时间段，5个时间段，6个时间段或者7个时间段。

根据本发明，所述检测时间段分为2个时间段：0‐6.5分钟，6.5‐11.0分钟。

或者检测时间段分为3个时间段：0‐4分钟，4‐6.5分钟，6.5‐11.0分钟。

或者检测时间段分为4个时间段：0‐4分钟，4‐6.5分钟，6.5‐8.5分钟，8.1‐11.0分钟。

或者检测时间段分为5个时间段：0‐4分钟，4‐6.5分钟，6.5‐8.5分钟，8.1‐9.7分钟，9.4‐11.0分钟。

或者检测时间段分为6个时间段：0‐3.5分钟，3.3‐4.0分钟，4.0‐6.5分钟，6.5‐8.5分钟，8.1‐9.7分钟，9.4‐11.0分钟。

或者检测时间段分为7个时间段：0‐2.5分钟，2.3‐3.5分钟，3.3‐4.0分钟，4.0‐6.5分钟，6.5‐8.5分钟，8.1‐9.7分钟，9.4‐11.0分钟。

根据本发明，为了避免检测结果中假阳性结果的出现，优选在初筛检测后对阳性样品做复核检测。优选所述复核检测步骤，更换色谱柱和流动相条件，以化合物的两对或者三对母离子/子离子对进行复核，优选还进一步结合保留时间和/或离子丰度比进行复核。

根据本发明，为了准确、灵敏地对初筛时出现的阳性样品进行复核检测，优选所述的复核检测步骤分时间段质谱扫描分析。

优选所述的分时间段质谱扫描分析是将9种毒品和14种抗精神疾病类药物分开进行。

优选对9种毒品的复核检测步骤中，根据初筛检测的分析参数，将9种毒品中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内，例如，两组、三组、四组等。

优选将9种毒品分为两组，例如，

第一组：MDA、吗啡、6‐单乙酰吗啡、海洛因、苯丙胺，第二组：甲基苯丙胺、MDMA、氯胺酮、可待因；

或者，第一组：甲基苯丙胺、吗啡、6‐单乙酰吗啡、海洛因、苯丙胺，第二组：MDA、MDMA、氯胺酮、可待因；

或者，第一组：MDA、吗啡、6‐单乙酰吗啡、氯胺酮、苯丙胺，第二组：甲基苯丙胺、MDMA、海洛因、可待因；

或者，第一组：甲基苯丙胺、吗啡、6‐单乙酰吗啡、氯胺酮、苯丙胺，第二组：MDA、MDMA、海洛因、可待因。

上述分组实例不是穷举，只要能将9种毒品中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内都适用于本发明。

优选对9种毒品用三对母离子/子离子对进行复核，不足三对母离子/子离子对的则使用两对母离子/子离子对，并结合离子丰度比，化合物保留时间来进行复核。

优选在复核检测血液中是否含有毒品的步骤中，对血液样品预处理方法与初筛检测时的血液样品预处理方法相同。

在本发明的一个具体实施方式中，在复核检测步骤中，对含有毒品的血液样品预处理方法为：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ(内标)，混匀，再加入80μL 10％三氯乙酸，涡旋混合1min，12000rpm离心15min，取上清备检。

优选对9种毒品的复核检测步骤中，UPLC‐MS/MS检测条件如下：液相色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相A为含0.001％‐0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％‐0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；流速：0.1‐0.5mL/min；柱温：30‐60℃。质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度100‐150℃；去溶剂化温度250‐450℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速550‐750L/hr，毛细管电压(capillary)1.0‐5.0KV。

根据本发明，优选9种毒品复核检测的母离子/子离子对如下表4所示。

表4 9种毒品复核检测的母离子/子离子对

其中，色谱柱优选为CORTECS UPLC C18柱或相当者，更优选为CORTECS UPLC C18，1.6μm×2.1mm×100mm。

优选，流动相A为含0.005％‐0.015％甲酸的水溶液，流动相B为含0.005％‐0.015％甲酸的甲醇溶液；更优选，流动相A为含0.01％甲酸的水溶液，流动相B为含0.01％甲酸的甲醇溶液。

优选，流速为0.2‐0.4mL/min；更优选流速为0.3mL/min。

优选，柱温：35‐45℃；更优选柱温为40℃。

优选流动相条件如下表5所示：

表5 9种毒品UPLC‐MS/MS复核检测的色谱流动相条件

进一步优选，样品室温度10℃。

优选，质谱条件中离子源温度为110‐130℃；更优选离子源温度为120℃。

优选，去溶剂化温度300‐400℃；更优选去溶剂化温度为350℃。

优选，液氮气体流速600‐700L/hr；更优选，液氮气体流速为650L/hr。

优选，毛细管电压(capillary)2.0‐4.0KV；更优选为3.0KV。

在本发明的一个具体实施方式中，9种毒品的复核检测步骤的UPLC‐MS/MS分析条件为：色谱柱为CORTECS UPLC C18 1.6μm×2.1mm×100mm；流动相A：含0.01％甲酸的水溶液，流动相B：含0.01％甲酸的甲醇溶液，流速0.3mL/min；流动相条件如表5所示；柱温：40℃；进样量：3μL；样品室温度10℃；离子源：ESI+，离子源温度120℃；去溶剂化温度350℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速650L/hr，毛细管电压(capillary)3.0KV。

根据该实施方式，所述9种毒品复核检测步骤的保留时间如表6‐7所示。

根据该实施方式，所述9种毒品复核检测步骤的三对或两对母离子/子离子对的数值如表6‐7所示。

根据该实施方式，所述9种毒品复核检测步骤的血液中检出限如表6‐7所示。

表6 5种毒品UPLC‐MS/MS定性分析参数

表7 4种毒品UPLC‐MS/MS定性分析参数

优选对14种抗精神疾病类药物的复核检测步骤中，根据初筛检测的分析参数，将14种抗精神疾病类药物中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内，例如，两组、三组、四组、五组等等。

优选将14种抗精神疾病类药物分为四组，例如，

第一组：帕罗西汀、艾司唑仑、氯硝西泮、米安色林、地西泮；

第二组：氟伏沙明、舍曲林、马普替林、文法拉辛；

第三组：氟西汀、阿普唑仑、西酞普兰；

第四组：阿米替林、氯丙嗪；

或者：

第一组：马普替林、艾司唑仑、氯硝西泮、米安色林、地西泮；

第二组：氟伏沙明、舍曲林、帕罗西汀、文法拉辛；

第三组：氟西汀、阿普唑仑、西酞普兰；

第四组：阿米替林、氯丙嗪；

或者：

第一组：帕罗西汀、艾司唑仑、氯硝西泮、米安色林、地西泮；

第二组：氟伏沙明、舍曲林、阿米替林、文法拉辛；

第三组：氟西汀、阿普唑仑、西酞普兰；

第四组：马普替林、氯丙嗪；

或者：

第一组：帕罗西汀、艾司唑仑、氯硝西泮、米安色林、地西泮；

第二组：氟伏沙明、氯丙嗪、阿米替林、文法拉辛；

第三组：氟西汀、阿普唑仑、西酞普兰；

第四组：马普替林、舍曲林。

上述分组实例不是穷举，只要能将14种抗精神疾病类药物中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内都适用于本发明。

优选对14种抗精神疾病类药物用三对母离子/子离子对进行复核，不足三对母离子/子离子对的则使用两对母离子/子离子对，并结合化合物保留时间来进行复核。

在复核检测血液中是否含有抗精神疾病类药物的步骤中，对血液样品预处理方法可以与初筛检测时的血液样品预处理方法相同。

但，为了提高14种抗精神疾病类药物的相对提取率，提高目标化合物色谱峰的响应值，从而提高复核检测的准确性和灵敏性，优选在复核检测血液中是否含有抗精神疾病类药物的步骤中改进血液样品的预处理方法，所述血液样品预处理方法为用甲醇提取血液样品，浓缩提取液。优选为，将待测抗凝血液离心分离上清，上清中加入甲醇混合，再离心分离上清，浓缩上清液，残渣用甲酸甲醇‐甲酸水溶液溶解离心，取上清备检。

在本发明的一个具体实施方式中，所述血液样品预处理方法为：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ(内标)，混匀，再加入600μL甲醇沉淀，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液于65℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL80％0.01％甲酸甲醇‐0.01％甲酸水溶液溶解，12000rpm离心5min，取上清液备检。

优选对14种抗精神疾病类药物的复核步骤中，UPLC‐MS/MS分析条件为：液相色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相A为含0.001％‐0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％‐0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；流速：0.1‐0.5mL/min；柱温：30‐60℃。质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度100‐150℃；去溶剂化温度250‐450℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速550‐750L/hr，毛细管电压(capillary)1.0‐5.0KV。

根据本发明，优选14种抗精神疾病类药物复核检测的母离子/子离子对如下表8所示：

表8 14种抗精神疾病类药物复核检测的母离子/子离子对

其中，色谱柱优选为CORTECS UPLC C18柱或相当者，更优选为CORTECS UPLC C18，1.6μm×2.1mm×100mm。

优选，流动相A为含0.005％‐0.015％甲酸的水溶液，流动相B为含0.005％‐0.015％甲酸的甲醇溶液；更优选，流动相A为含0.01％甲酸的水溶液，流动相B为含0.01％甲酸的甲醇溶液。

优选，流速为0.2‐0.4mL/min；更优选流速为0.3mL/min。

优选，柱温：35‐45℃；更优选柱温为40℃。

优选流动相条件如下表9所示：

表9 14种抗精神疾病类药物的UPLC‐MS/MS复核检测的色谱流动相条件

进一步优选，样品室温度10℃。

优选，质谱条件中离子源温度为110‐130℃；更优选离子源温度为120℃。

优选，去溶剂化温度300‐400℃；更优选去溶剂化温度为350℃。

优选，液氮气体流速600‐700L/hr；更优选，液氮气体流速为650L/hr。

优选，毛细管电压(capillary)2.0‐4.0KV；更优选为3.0KV。

在本发明的一个具体实施方式中，14种抗精神疾病类药物的复核检测步骤的UPLC‐MS/MS分析条件为：色谱柱为CORTECS UPLC C18 1.6μm×2.1mm×100mm；流动相A：含0.01％甲酸的水溶液，流动相B：含0.01％甲酸的甲醇溶液，流动相条件如表9所示；流速0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：3μL；样品室温度10℃；离子源：ESI+，离子源温度120℃；去溶剂化温度350℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速650L/hr，毛细管电压(capillary)3.0KV。

根据该实施方式，所述14种抗精神疾病类药物复核检测步骤的保留时间如表10‐13所示。

根据该实施方式，所述14种抗精神疾病类药物复核检测步骤的三对或两对母离子/子离子对的数值如表10‐13所示。

根据该实施方式，所述14种抗精神疾病类药物复核检测步骤的血液中检出限如表10‐13所示。

表10 5种抗精神疾病类药物UPLC‐MS/MS复核定性分析参数

表11 4种抗精神疾病类药物UPLC‐MS/MS复核定性分析参数

表12 3种抗精神疾病类药物UPLC‐MS/MS复核定性分析参数

表13 2种抗精神疾病类药物UPLC‐MS/MS复核定性分析参数

本发明的复核检测步骤也可以独立于本发明的初检步骤和方法，用于复检采用其他检测方法判断为阳性的血液样品。对于采用其他检测方法判断为阳性的血液样品，可以参照本发明前述的复核检测步骤和方法，进行复检。

此外，本发明还提供了一种血液中23种毒品和抗精神疾病类药物的UPLC‐MS/MS检测方法的确认方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)专属性考察

特异性：(a)选择多个(优选6个)不同来源的人空白血浆样品，确定内源性物质是否对目标化合物检测有干扰；(b)确定不同化合物间是否存在相互干扰。

(2)检出限：依据信噪比S/N≥3判定。

(3)精密度：于1日内测定得日内精密度；连续3天测定得日间精密度。

(4)样品稳定性：分别考察室温(3h、6h)、冷藏(4℃，8小时)、冷冻(‐20℃，15天)、冷冻(‐80℃，30天)和处理后的样品于液质进样室温度10℃12h的稳定性。

本发明具有如下技术效果：

1.本发明通过超高效液相色谱‐串联质谱仪对上述23种化合物进行研究，对保留时间、分子离子峰(母离子/子离子对)和分子离子峰丰度比这些参数进行确认后，能够实现23种药物的同时检测，提高准确性，大大节约检测时间。

2.本发明采用超高效液相色谱‐串联质谱仪对以上23种化合物进行研究，建立了《血液中常见毒品和抗精神疾病类药物的液相色谱‐质谱检测方法》，并对方法进行了确证研究，包括专属性、基质效应、精密度、检出限、样品稳定性等的研究，结果表明该检测方法满足《中华人民共和国药典》、《分析方法目的适宜性‐方法确认指南》、《血液、尿液中154种毒(药)物的检测液相色谱‐串联质谱法》(SF/Z JD0107005‐2010)的相关要求。

3.为提高检测效率，并解决实际检测中存在的问题，本发明方法将整个检测工作分成初筛检测步骤，和任选的对初筛检测阳性样本的复核检测步骤。

其中初筛检测步骤中，血液样品预处理方法简便、快速、灵敏，UPLC‐MS/MS的检测条件能在短时间内一次性地同时灵敏、准确的对上述23种化合物进行检测，满足实际检测的时效性要求。如果实际工作中，通过初筛检测就足以满足检测目的所需，无需再进行复核检测步骤。

如果为了避免假阳性的检测结果，可以增加复核检测步骤。本发明的复核检测步骤，在充分研究了23种化合物的理化性质之后，对9种毒品和14种抗精神疾病类药物的血液样品采用了不同的预处理方法，提高了14种抗精神疾病类药物的提取率。

将9种毒品和14种抗精神类药物按照保留时间相近的化合物或者理化性质相似的化合物分在不同的时间段进行分时间段检测，避免了化合物间相互影响，提高检测的准确度和灵敏度；进一步，在复核检测步骤中以保留时间、两对或者三对母离子/子离子对、分子离子丰度比为判别指标，提高了检测结果准确性。

4.自方法建立以来，本实验室5名不同的检测人员对血浆盲样进行了检测，检测结果证明本发明方法重现性良好；并对1318名空勤人员血液样本进行了检测，经与《民用航空人员体检合格证管理系统》核对，并对其病史进行医学调查，检测结果与空勤人员患病情况、或服药情况相符合。

5.本发明方法快速易行，灵敏可靠，具有良好的重现性和准确性，可作为实验室检测标准执行，用于空勤人员的违禁药物使用情况检测。

附图说明

图1血浆浓度为0.1ng/mL的MDA、MDMA、苯丙胺、甲基苯丙胺提取特征离子色谱图(TIC)

图2血浆浓度为0.5ng/mL的氯胺酮、氟伏沙明提取特征离子色谱图(TIC)

图3血浆浓度为1.0ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮提取特征离子色谱图(TIC)

图4血浆浓度为2.0ng/mL的吗啡、6‐MAM、西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮提取特征离子色谱图(TIC)

图5血浆浓度为5.0ng/mL的米安色林、帕罗西汀提取特征离子色谱图(TIC)

图6血浆浓度为10.0ng/mL的可待因、海洛因、舍曲林提取特征离子色谱图(TIC)

图7人空白血浆样品总离子流图(TIC)

图8样品稳定性实验结果，其中左图为质控样品在初始0h的检测总离子流图(TIC)；右图为质控样品在室温25℃3h后的检测总离子流图(TIC)。

图9样品稳定性实验结果，其中左图为质控样品在初始0h的检测总离子流图(TIC)；右图为质控样品在室温25℃6h后的检测总离子流图(TIC)。

图10样品稳定性实验结果，其中左图为质控样品在初始0h的检测总离子流图(TIC)；右图为处理好的质控样品在液质进样室温度10℃12h后的检测总离子流图(TIC)。

图11样品稳定性实验结果，其中左图为质控样品在初始0h的检测总离子流图(TIC)；右图为质控样品在4℃冷藏8h后的检测总离子流图(TIC)。

图12样品稳定性实验结果，其中左图为质控样品在初始0h的检测总离子流图(TIC)；右图为质控样品在‐20℃冷藏15天后的检测总离子流图(TIC)。

图13样品稳定性实验结果，其中左图为质控样品在初始0h的检测总离子流图(TIC)；右图为质控样品在‐80℃冷藏30天后的检测总离子流图(TIC)。

图14特异性实验结果，其中右图为人空白血浆样品总离子流图；左图为苯丙胺的提取离子对色谱图(TIC)

图15特异性实验结果，其中右图为人空白血浆样品总离子流图；左图分别为海洛因、6‐MAM、吗啡、MDA的提取离子对色谱图(TIC)

图16特异性实验结果，其中左图为人空白血浆样品总离子流图；右图分别为可待因、氯胺酮、MDMA、甲基苯丙胺的提取离子对色谱图(TIC)

图17特异性实验结果，其中A为空白血浆样品总离子流图；B分别为内标SMZ、米安色林、帕罗西汀、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮的特征离子色谱图(TIC)

图18特异性实验结果，其中A为空白血浆样品总离子流图；B分别为内标SMZ、文拉法辛、氟伏沙明、马普替林、舍曲林的特征离子色谱图(TIC)

图19特异性实验结果，其中A为空白血浆样品总离子流图；B分别为内标SMZ、西酞普兰、氟西汀、阿普唑仑的特征离子色谱图(TIC)

图20特异性实验结果，其中A为空白血浆样品总离子流图；B分别为内标SMZ、阿米替林、氯丙嗪的特征离子色谱图(TIC)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。

实施例1 检测目标化合物的确立及化合物的基本性质

根据《民用航空人员体检合格证管理规则》(CCAR‐67FS‐R2)和《空勤人员和空中交通管制员体检鉴定》(AP‐67FS‐002)中有关毒品、违禁药物规定，并通过对北京大学第六医院临床医生以及航空公司航医的咨询和调研，同时结合《中国精神病防治指南》，最终筛选出23种常见毒品和抗精神疾病类药物为目标化合物，这23种常见毒品和抗精神疾病类药物及其相关的化学特性见下表。

表14 目标化合物化学特性列表

实施例2 试剂和仪器

1.试剂

除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。吗啡、可待因、6‐单乙酰吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4‐甲二氧基苯异丙胺(MDA)、3,4‐亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、氯胺酮、海洛因、西酞普兰、帕罗西汀、氯硝西泮、舍曲林、阿米替林、文法拉辛、氯丙嗪、氟西汀、艾司唑仑、地西泮、米安色林、氟伏沙明、阿普唑仑、马普替林对照品，纯度≥97％。甲醇(GR)；三氯乙酸(GR)；甲酸(优级纯)；去离子水由超纯水仪(Millipore纯水系统)制备。

2.仪器

超高效液相色谱/三重四级杆质谱仪(TQD UPLC‐MS，美国沃特斯有限公司)；可调移液器(eppendorf)；SIGMA 3‐18K型台式高速冷冻离心机(德国)；赛多利斯BT25S十万分之一天平(德国)；漩涡混匀器。

3.对照品储备液和工作液配制

分别精密称取西酞普兰、帕罗西汀、舍曲林、文法拉辛、氟西汀、米安色林、氟伏沙明、马普替林、氯胺酮、吗啡、可待因、6‐单乙酰吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4‐甲二氧基苯异丙胺(MDA)、3,4‐亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、海洛因、氯硝西泮、阿米替林、氯丙嗪、艾司唑仑、地西泮、阿普唑仑的对照品各10mg，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，得1mg/mL的对照品储备溶液，置于‐18℃低温冰箱保存，其保存期能为1年。再精密量取1mL储备液稀释至10mL，得上述各种药物约100μg/mL的对照品工作溶液，置于‐18℃低温冰箱保存，其保存期能为3个月。

实施例3 血液样品预处理

待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ(内标)，混匀，再加入80μL 10％三氯乙酸，涡旋混合1min，12000rpm离心15min，取上清备检。

实施例4 血液样品的UPLC‐MS/MS初筛检测方法

1、血液样品预处理，同实施例3

2、质谱条件优化

配制23种化合物0.5μg/mL的甲醇溶液，在质谱进样口直接连续进样，使用质谱自动优化功能，分别优化23种化合物的锥孔电压、碰撞电压、氩气压强、筛选离子对等。质谱参数结果如表3所示。

3、色谱条件优化

选用Waters公司色谱柱ACQUITY UPLC HSS C18柱(1.8μm×2.1mm×150mm)。在优化液相条件时，曾选择0.1％的甲酸水‐乙腈、0.1％的甲酸水‐甲醇、5mM乙酸铵水溶液‐乙腈作为流动相，结果部分待测化合物峰形差，拖尾严重，出现分叉现象，而改为甲酸水溶液‐含甲酸的甲醇溶液，化合物峰形得到较好的改善。

通过不断调节流动相组成比例后，待测化合物的峰形和分离度均较好。最终，23种化合物超高效液相色谱‐质谱/质谱分析检测条件如下：ACQUITY UPLC HSS C18柱(1.8μm×2.1mm×150mm)；流动相：含0.01％甲酸水溶液‐含0.01％甲酸的甲醇溶液(87:13)，流速0.3mL/min；柱温50℃；样品室温度10℃；离子源：ESI+，离子源温度120℃；去溶剂化温度350℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速650L/hr，毛细管电压(capillary)3.0KV；色谱流动相条件如下表。

表15 23种毒品和抗精神疾病类药物UPLC‐MS/MS检测的色谱流动相条件

进样量：3μL。在此条件下，23种化合物的保留时间如表3所示。

4、检出限

200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆若干份，添加23种化合物对照品工作液，分别制备成质量浓度为10、5、2、1、0.5、0.2、0.1ng/mL的质控样品(n＝3)，按实施例3的样品预处理方法处理样品后，作UPLC‐MS/MS检测。按信噪比S/N≥3计，并考虑到色谱柱以及质谱仪器未来随样品量增加灵敏度下降的可能性，所以最终将23种化合物检出限确定为表3中所列的检出限。这23种化合物的检出限浓度图谱见附图1～6。充分说明本发明的检测方法检出限很低，非常灵敏。

5、特异性

各取6个不同来源的含氟化钠抗凝剂的人空白血浆样品200μL，按实施例3的样品预处理方法处理后，作UPLC‐MS/MS检测，得到人空白血浆样品总离子流图。结果与第4步“检出限”中获得的检测限图谱比较，未发现内源性物质对目标化合物检测有干扰(见附图7)。

6、基质效应

取200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆，按实施例3的样品预处理方法处理后得到空白血浆提取液；用移液器各移取170μL该提取液，分别向其加入适量体积23种化合物对照品溶液，制备成含质量浓度为1ng/mL的MDA、MDMA、苯丙胺和甲基苯丙胺；2ng/mL的氯胺酮、氟伏沙明；5ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮；10ng/mL的吗啡、6‐MAM、西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮；25ng/mL的米安色林、帕罗西汀；50ng/mL的可待因、海洛因、舍曲林的生物样品(每个浓度点4份)，作UPLC‐MS/MS分析，得到目标化合物峰面积，与内标峰面积比值记为A1；另取相同体积23种化合物对照品溶液，分别加入170μL初始比例的流动相溶液，混匀后作UPLC‐MS/MS分析，得到目标化合物峰面积，与内标峰面积比值记为A2；两者比值A1/A2即为基质效应。结果见下表，表明这23种化合物的UPLC‐MS/MS检测不受血液基质的影响。

表16 基质效应测定结果

7、精密度

200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆若干份，添加23种化合物对照品工作液，制备成含质量浓度为1ng/mL的MDA、MDMA、苯丙胺和甲基苯丙胺；2ng/mL的氯胺酮、氟伏沙明；5ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮；10ng/mL的吗啡、6‐MAM、西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮；25ng/mL的米安色林、帕罗西汀；50ng/mL的可待因、海洛因、舍曲林的生物样品(n＝5)，分别于1日内测定，得日内精密度；于连续3天测定，得日间精密度。用各目标化合物的峰面积计算。研究发现，23种化合物的日内、日间精密度均良好，RSD％小于20％，满足方法学要求，结果见下表。

表17 UPLC‐MS/MS检测23种化合物日内、日间精密度考察

8、稳定性

取多份含氟化钠抗凝剂的空白血浆200μL，分别添加上述23种化合物的对照品工作液适量，制备成含质量浓度为1ng/mL的MDA、MDMA、苯丙胺和甲基苯丙胺；2ng/mL的氯胺酮、氟伏沙明；5ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮；10ng/mL的吗啡、6‐MAM、西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮；25ng/mL的米安色林、帕罗西汀；50ng/mL的可待因、海洛因、舍曲林的质控样品。将质控样品分别放置在冰箱冷冻温度‐20℃15天，‐80℃30天，室温25℃3小时、6小时，冷藏温度4℃8h，处理后的样品于液质进样室温度10℃12h，考察其稳定性(n＝4)。

用目标化合物的峰面积与内标峰面积比值计算，与0小时的初始值比较，计算各自的RE％。结果发现，氟伏沙明、海洛因在室温放置6小时后不太稳定，但仍能检测出，且重复性较良好；另外，生物样本在冰箱冷冻温度‐20℃15天后，海洛因有所降解，稳定性较差，表明含海洛因的血液样本保存时间不宜过长；而其余待测化合物在上述不同温度环境下均能检测出(见附图8～13)，且重复性良好，RE％均小于20％。

表18 23种化合物在不同温度环境下的稳定性考察结果

实施例5 9种毒品的阳性样品UPLC‐MS/MS复核检测方法

1、血液样品预处理，对于初筛检测阳性样本，按照实施例3的样品预处理方法处理样品后，进行UPLC‐MS/MS检测。

2、色谱条件优化

更换了色谱柱和流动相条件，色谱柱为CORTECS UPLC C18 1.6μm×2.1mm×100mm；柱温：40℃；进样量：3μL；色谱流动相条件见下表。

表19 复核检测9种毒品的UPLC‐MS/MS色谱流动相条件

3、质谱条件优化

对目标化合物的质谱检测离子对进行了进一步优化，尽量用三对母离子/子离子对进行判别，没有的则使用两对母离子/子离子对，并结合离子丰度比，化合物保留时间来进行复核。复核方法分两组，同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。9种化合物的质谱参数及保留时间见表6‐7。

第一组：MDA，吗啡，6‐MAM，海洛因，苯丙胺

第二组：甲基苯丙胺，MDMA，氯胺酮，可待因

4、特异性

各取6个不同来源的含氟化钠抗凝剂的人空白血浆样品200μL，按实施例3的样品预处理方法处理后，作UPLC‐MS/MS检测，得到人空白血浆样品总离子流图；另外，各取这6个不同来源的含氟化钠抗凝剂的人空白血浆样品200μL，分别添加9种化合物的对照品工作液，制备成含质量浓度为1ng/mL的MDA、MDMA、苯丙胺和甲基苯丙胺；2ng/mL的氯胺酮；10ng/mL的吗啡、6‐MAM；50ng/mL的可待因、海洛因的质控样品，同法处理后作UPLC‐MS/MS检测，得到各化合物提取特征离子色谱图。两者比对，未发现内源性物质对目标化合物检测有干扰(见附图14～16)。

5、不同浓度下的化合物离子丰度比考察

由于阳性判定标准中用到离子丰度比，为了检验各目标化合物在不同浓度下的离子丰度比是否各自一致，为此我们进行了低、中、高3个浓度下的化合物离子丰度比考察。用目标化合物的质谱响应信号值最低的离子对峰面积与质谱响应信号值最高的离子对峰面积相比来计算，结果表明，各目标化合物在3个浓度下的离子丰度比趋于一致，考虑到色谱柱以及质谱仪器未来随样品量增加灵敏度下降的可能性，以及避免高浓度的质控样品污染仪器，我们选择中浓度的质控样品作为以后的随行质控样品。

表20 不同浓度下各目标化合物的离子丰度比考察

6、精密度

取200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆若干份，添加9种化合物对照品工作液，制备成含质量浓度为1ng/mL的MDA、MDMA、苯丙胺和甲基苯丙胺；2ng/mL的氯胺酮；10ng/mL的吗啡、6‐MAM；50ng/mL的可待因、海洛因的生物样品(n＝5)，分别于1日内测定，得日内精密度；于连续3天测定，得日间精密度。用各目标化合物的峰面积计算。研究发现，9种化合物的日内、日间精密度均良好，RSD％小于20％，满足方法学要求，结果见下表。

表21 UPLC‐MS/MS检测9种化合物日内、日间精密度考察

实施例6 14种抗精神疾病类药物的阳性样品UPLC‐MS/MS复核方法

1、血液样品预处理

待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ(内标)，混匀，再加入600μL甲醇沉淀，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液于65℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL80％0.01％甲酸甲醇‐0.01％甲酸水溶液溶解，12000rpm离心5min，取上清液备检。

2、色谱条件

更换色谱柱和流动相，色谱柱为CORTECS UPLC C18 1.6μm×2.1mm×100mm；柱温：40℃；进样量：3μL；色谱流动相条件见下表。

表22 14种抗精神疾病类药物UPLC‐MS/MS复核检测色谱流动相条件

3、质谱条件优化

复核方法分四组，同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。14种化合物的质谱参数及保留时间见表10‐13。

第一组：帕罗西汀，艾司唑仑，氯硝西泮，米安色林，地西泮

第二组：氟伏沙明，舍曲林，马普替林，文法拉辛

第三组：氟西汀，阿普唑仑，西酞普兰

第四组：阿米替林，氯丙嗪

4、特异性

各取6个不同来源的含氟化钠抗凝剂的人空白血浆样品200μL，按本实施例第1项样品预处理方法处理后，作UPLC‐MS/MS检测，得到人空白血浆样品总离子流图；另外，各取这6个不同来源的含氟化钠抗凝剂的人空白血浆样品200μL，分别添加14种化合物的对照品工作液，制备成含质量浓度为0.1ng/mL的氟伏沙明；0.25ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮；0.5ng/mL的西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮；1.25ng/mL的米安色林、帕罗西汀；2.5ng/mL的舍曲林的质控样品，同法处理后作UPLC‐MS/MS检测，得到各化合物特征离子色谱图。两者比对，未发现内源性物质对目标化合物检测有干扰(见附图17～20)。

5、检出限

200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆若干份，添加14种化合物对照品工作液适量，分别制备成一系列浓度的质控样品(n＝3)，按本实施例第1项样品预处理方法处理样品后，作UPLC‐MS/MS检测。按信噪比S/N≥3计，并考虑到色谱柱以及质谱仪器未来随样品量增加灵敏度下降的可能性，所以复核方法中14种化合物的检出限确定为表10‐13所列的检出限。充分说明14种化合物的复检方法的检出限非常低，灵敏度进一步提高。

6、基质效应

取200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆，加入600μL甲醇沉淀，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，得到空白血浆提取液；用移液器各移取170μL该提取液，分别向其加入适量体积14种化合物对照品溶液，制备成含质量浓度为2ng/mL的氟伏沙明；5ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮；10ng/mL的西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮；25ng/mL的米安色林、帕罗西汀；50ng/mL的舍曲林的生物样品(每个浓度点3份)，按本实施例第1项样品预处理方法处理后，作UPLC‐MS/MS分析，得到目标化合物峰面积，与内标峰面积比值记为A1；另取相同体积14种化合物对照品溶液和内标，涡旋混合0.5min，于65℃水浴中氮气吹干，剩下步骤按本实施例第1项样品预处理方法处理后，作UPLC‐MS/MS分析，得到目标化合物峰面积，与内标峰面积比值记为A2；两者比值A1/A2即为基质效应。结果见下表，表明14种抗精神疾病类药物的UPLC‐MS/MS检测不受血浆基质的影响。

表23 基质效应测定结果

7、精密度

取200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆若干份，添加14种化合物对照品工作液，制备成含质量浓度为2ng/mL的氟伏沙明；5ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮；10ng/mL的西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮；25ng/mL的米安色林、帕罗西汀；50ng/mL的舍曲林的生物样品(n＝3)，分别于1日内测定，得日内精密度；于连续3天测定，得日间精密度。用各目标化合物的峰面积与内标峰面积比值计算。研究发现，14种化合物的日内、日间精密度均良好，RSD％小于20％，满足方法学要求，结果见下表。

表24 UPLC‐MS/MS检测14种化合物日内、日间精密度考察

8、提取率

取200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆若干份，添加14种化合物对照品工作液，制备成含质量浓度为2ng/mL的氟伏沙明；5ng/mL的文法拉辛、阿普唑仑、艾司唑仑、阿米替林、地西泮；10ng/mL的西酞普兰、氟西汀、马普替林、氯丙嗪、氯硝西泮；25ng/mL的米安色林、帕罗西汀；50ng/mL的舍曲林的生物样品(n＝3)，按本实施例第1项样品预处理方法处理后，作UPLC‐MS/MS分析，得到目标化合物峰面积，记为A1；另取200μL含氟化钠抗凝剂的空白血浆，加入600μL甲醇沉淀，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，得到空白血浆提取液；用移液器各移取170μL该提取液，分别向其加入相同体积的14种化合物对照品溶液，混匀，作UPLC‐MS/MS分析，得到目标化合物峰面积，记为A2；两者比值A1/A2即为相对提取率。研究发现，14种化合物的相对提取率均大于50％，且RSD％小于15％，满足方法学要求，结果见下表，表明改进的样品处理方法能获得满意的提取率。

表25 提取率测定结果

由此可见，我们建立了23种常见毒品和抗精神疾病类药物的液相色谱质谱检测方法，并考察了方法的特异性、检出限、基质效应、精密度、稳定性等，结果表明所建方法满足药典指导原则的要求，简单易行、科学稳定可靠，可作为实验室开展常见毒品和抗精神疾病类药物筛查检测的准则。

Claims (62)

1.一种超高效液相色谱-质谱法检测血液中毒品和抗精神疾病类药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

血液样品预处理；

采用超高效液相色谱-串联质谱法UPLC-MS/MS的多反应监测MRM模式，对预处理后血液样品，针对所选定的化合物进行初筛检测；

任选，进一步包括对初筛检测阳性的样本进行复核检测的步骤，其中，所述复核检测步骤针对筛查检测阳性样本，采用超高效液相色谱-串联质谱法UPLC-MS/MS的多反应监测MRM模式，进行超高效液相色谱-串联质谱法检测；

所述毒品和抗精神疾病类药物为如下23种化合物：

9种毒品：吗啡、可待因、6-单乙酰吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-甲二氧基苯异丙胺、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺、氯胺酮、海洛因；

14种抗精神疾病类药物：西酞普兰、文拉法辛、帕罗西汀、氯丙嗪、氯硝西泮、氟西汀、舍曲林、艾司唑仑、阿米替林、地西泮、米安色林、氟伏沙明、阿普唑仑、马普替林；

所述初筛检测以化合物保留时间、一对或两对母离子/子离子对进行初筛检测分析；初筛检测步骤中液相色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶柱；所述色谱通过梯度洗脱的方式进行，其中，流动相A为含0.001％-0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％-0.1％甲酸的甲醇溶液；流速为0.1-0.5mL/min；柱温：30-60℃；质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度100-150℃；去溶剂化温度250-450℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测MRM；液氮气体流速550-750L/hr，毛细管电压1.0-5.0KV；

所述23种毒品和抗精神疾病类药物的母离子/子离子对如下表所示：

；

所述复核检测步骤中以化合物的两对或者三对母离子/子离子对进行复核检测；复核检测时分时间段质谱扫描分析，将9种毒品和14种抗精神疾病类药物分开进行；

对9种毒品复核检测时，液相色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相A为含0.001％-0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％-0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；流速：0.1-0.5mL/min；柱温：30-60℃；质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度100-150℃；去溶剂化温度250-450℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测MRM；液氮气体流速550-750L/hr，毛细管电压1.0-5.0KV；

9种毒品的母离子/子离子对如下表所示：

；

对14种抗精神疾病类药物复核检测时，液相色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相A为含0.001％-0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％-0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；流速：0.1-0.5mL/min；柱温：30-60℃；质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度100-150℃；去溶剂化温度250-450℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测MRM；液氮气体流速550-750L/hr，毛细管电压1.0-5.0KV；

14种抗精神疾病类药物的母离子/子离子对如下表所示：

。

2.如权利要求1所述的方法，所述初筛检测的流动相A为含0.005％-0.015％甲酸的水溶液，流动相B为含0.005％-0.015％甲酸的甲醇溶液。

3.如权利要求2所述的方法，所述初筛检测的流动相A为含0.01％甲酸的水溶液，流动相B为含0.01％甲酸的甲醇溶液。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的流动相流速为0.2-0.4mL/min。

5.如权利要求4所述的方法，所述初筛检测的流动相流速为0.3mL/min。

6.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的柱温：45-55℃。

7.如权利要求6所述的方法，所述初筛检测的柱温为50℃。

8.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的色谱柱为ACQUITY UPLC HSSC18柱。

9.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的流动相梯度洗脱的条件如下表所示：

。

10.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的离子源温度为110-130℃。

11.如权利要求10所述的方法，所述初筛检测的离子源温度为120℃。

12.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的去溶剂化温度300-400℃。

13.如权利要求12所述的方法，所述初筛检测的去溶剂化温度为350℃。

14.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的液氮气体流速600-700L/hr。

15.如权利要求14所述的方法，所述初筛检测的液氮气体流速为650L/hr。

16.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述初筛检测的毛细管电压2.0-4.0KV。

17.如权利要求16所述的方法，所述初筛检测的毛细管电压为3.0KV。

18.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，初筛检测分时间段检测，所述分时间段检测分为2个时间段，3个时间段，4个时间段，5个时间段，6个时间段或者7个时间段。

19.如权利要求18所述的方法，所述2个时间段为：0-6.5分钟，6.5-11.0分钟；3个时间段为：0-4分钟，4-6.5分钟，6.5-11.0分钟；4个时间段为：0-4分钟，4-6.5分钟，6.5-8.5分钟，8.1-11.0分钟；5个时间段为：0-4分钟，4-6.5分钟，6.5-8.5分钟，8.1-9.7分钟，9.4-11.0分钟；6个时间段为：0-3.5分钟，3.3-4.0分钟，4.0-6.5分钟，6.5-8.5分钟，8.1-9.7分钟，9.4-11.0分钟；7个时间段为：0-2.5分钟，2.3-3.5分钟，3.3-4.0分钟，4.0-6.5分钟，6.5-8.5分钟，8.1-9.7分钟，9.4-11.0分钟。

20.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，复核检测步骤中还进一步结合保留时间和/或离子丰度比进行复核检测。

21.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，根据初筛检测的分析参数，将9种毒品中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。

22.如权利要求21所述的方法，将9种毒品分为两组：第一组：MDA、吗啡、6-单乙酰吗啡、海洛因、苯丙胺，第二组：甲基苯丙胺、MDMA、氯胺酮、可待因。

23.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，根据初筛检测的分析参数，将14种抗精神疾病类药物中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。

24.如权利要求23所述的方法，将14种抗精神疾病类药物分为四组：第一组：帕罗西汀、艾司唑仑、氯硝西泮、米安色林、地西泮；第二组：氟伏沙明、舍曲林、马普替林、文法拉辛；第三组：氟西汀、阿普唑仑、西酞普兰；第四组：阿米替林、氯丙嗪。

25.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，流动相A为含0.005％-0.015％甲酸的水溶液，流动相B为含0.005％-0.015％甲酸的甲醇溶液。

26.如权利要求25所述的方法，对9种毒品进行复核检测的流动相A为含0.01％甲酸的水溶液，流动相B为含0.01％甲酸的甲醇溶液。

27.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，流速为0.2-0.4mL/min。

28.如权利要求27所述的方法，对9种毒品进行复核检测的流速为0.3mL/min。

29.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，柱温：35-45℃。

30.如权利要求29所述的方法，对9种毒品进行复核检测的柱温为40℃。

31.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，色谱柱为CORTECSUPLC C18柱。

32.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，流动相条件如下表所示：

。

33.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，离子源温度为110-130℃。

34.如权利要求33所述的方法，对9种毒品进行复核检测的离子源温度为120℃。

35.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，去溶剂化温度300-400℃。

36.如权利要求35所述的方法，对9种毒品进行复核检测的去溶剂化温度为350℃。

37.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，液氮气体流速600-700L/hr。

38.如权利要求37所述的方法，对9种毒品进行复核检测的液氮气体流速为650L/hr。

39.如权利要求1-3任一项所述的方法，对9种毒品进行复核检测时，毛细管电压2.0-4.0KV。

40.如权利要求39所述的方法，对9种毒品进行复核检测的毛细管电压为3.0KV。

41.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，流动相A为含0.005％-0.015％甲酸的水溶液，流动相B为含0.005％-0.015％甲酸的甲醇溶液。

42.如权利要求41所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测的流动相A为含0.01％甲酸的水溶液，流动相B为含0.01％甲酸的甲醇溶液。

43.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，流速为0.2-0.4mL/min。

44.如权利要求43所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测的流速为0.3mL/min。

45.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，柱温：35-45℃。

46.如权利要求45所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测的柱温为40℃。

47.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，色谱柱为CORTECS UPLC C18柱。

48.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，流动相条件如下表所示：

。

49.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，离子源温度为110-130℃。

50.如权利要求49所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测的离子源温度为120℃。

51.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，去溶剂化温度300-400℃。

52.如权利要求51所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测的去溶剂化温度为350℃。

53.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，液氮气体流速600-700L/hr。

54.如权利要求53所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测的液氮气体流速为650L/hr。

55.如权利要求1-3任一项所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测时，毛细管电压2.0-4.0KV。

56.如权利要求55所述的方法，对14种抗精神疾病类药物进行复核检测的毛细管电压为3.0KV。

57.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在初筛检测前对血液样品进行预处理，采用有机溶剂沉淀蛋白法，所述有机溶剂为三氯乙酸。

58.如权利要求57所述的方法，所述样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，将三氯乙酸加入上清混合，再离心分离，取上清备检。

59.如权利要求58所述的方法，所述血液样品预处理方法为：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ作为内标，混匀，再加入80μL 10％三氯乙酸，涡旋混合1min，12000rpm离心15min，取上清备检。

60.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在复核检测阳性血液样品是否含毒品之前，进行血液样品预处理，所述处理方法为采用有机溶剂沉淀蛋白法，所述有机溶剂为三氯乙酸；

或者，在复核检测阳性血液样品是否含抗精神疾病类药物之前，血液样品预处理的方法为用甲醇提取血液样品，浓缩提取液。

61.如权利要求60所述的方法，在复核检测阳性血液样品是否含毒品之前，进行血液样品预处理，所述样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，将三氯乙酸加入上清混合，再离心分离，取上清备检；

或者，在复核检测阳性血液样品是否含抗精神疾病类药物之前，血液样品预处理的方法为将待测抗凝血液离心分离上清，上清中加入甲醇混合，再离心分离上清，浓缩上清液，残渣用甲酸甲醇-甲酸水溶液溶解离心，取上清备检。

62.如权利要求61所述的方法，在复核检测阳性血液样品是否含毒品之前，进行血液样品预处理，所述样品预处理方法为：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ作为内标，混匀，再加入80μL 10％三氯乙酸，涡旋混合1min，12000rpm离心15min，取上清备检；

或者，在复核检测阳性血液样品是否含抗精神疾病类药物之前，血液样品预处理的方法为待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.1μg/mL的磺胺甲噁唑SMZ作为内标，混匀，再加入600μL甲醇沉淀，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液于65℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL80％0.01％甲酸甲醇-0.01％甲酸水溶液溶解，12000rpm离心5min，取上清液备检。

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