CN113917049A - 临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药检测技术领域，具体公开了一种临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，采用LC‑MS/MS法测定人血浆中氯丙嗪及代谢物7‑羟基氯丙嗪浓度。本发明采用甲醇蛋白沉淀，确认首选同位素盐酸氯丙嗪‑d 6/7‑羟基氯丙嗪‑d 6为内标，解决了血浆基质干扰多的问题，灵敏度高，结果准确可靠，基质效应、高血脂基质效应和溶血基质效应均无干扰，准确度和精密度高，用量小，可用于临床大批量样品分析需求。

Description

临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法。
背景技术
盐酸氯丙嗪片，分子式为：C17H19ClN2S·HCl；分子量：355.33；化学名称：N, N-二甲基-2-氯-10H-吩噻嗪-10-丙胺盐酸盐，是一种吩噻嗪类抗精神病药，其作用机制主要与其阻断中脑边缘系统及中脑皮层通路的多巴胺受体（DA2）有关。对多巴胺（DA1）受体、5-羟色胺受体、M-型乙酰胆碱受体、α-肾上腺素受体均有阻断作用，作用广泛。此外，本品小剂量时可抑制延脑催吐化学感受区的多巴胺受体，大剂量时直接抑制呕吐中枢，产生强大的镇吐作用。抑制体温调节中枢，使体温降低，体温可随外环境变化而改变，其阻断外周α-肾上腺素受体作用，使血管扩张，引起血压下降，对内分泌系统也有一定影响。
CN201910769993.1涉及一种液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，包括以下步骤：a、待测样品采用乙腈沉淀蛋白；b、采用高效液相色谱-串联质谱法的多反应监测MRM模式针对所选药物进行检测，以化合物保留时间、两对或三对母离子/子离子对分段进行质谱筛查分析。
CN201911125291.6公开了一种检测人血清中阿立哌唑、氯丙嗪、氯氮平、利培酮、9-OH利培酮含量的方法，其检测方法包括如下步骤：标准溶液制备、检测血液的离心、待测样本处理及样品的测定，通过对高效液相色谱-串联质谱法条件进行选择及限定使得分析时间缩短为7min。
现有技术有以下缺点：无法兼顾灵敏度和分析速度，检测限不够低，具有一定的局限性，且不适合大批量样品的检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，采用LC-MS/MS法测定人血浆中氯丙嗪及代谢物7-羟基氯丙嗪浓度。本发明采用甲醇蛋白沉淀法，确认首选同位素盐酸氯丙嗪-d 6和7-羟基氯丙嗪-d 6为内标，有效解决了血浆基质干扰多的问题，检测效率大大提高，灵敏度高，结果准确可靠。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供一种临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，包括：
步骤一：标准溶液配制：
取标准品氯丙嗪，加入甲醇配制成浓度为1 mg/mL的氯丙嗪标准品溶液；
取氯丙嗪标准品储备液，加入浓度为50%的甲醇水溶液配制成浓度在2~100000ng/mL的氯丙嗪标准曲线工作溶液；
取标准品7-羟基氯丙嗪，加入甲醇配制成浓度为1 mg/mL的7-羟基氯丙嗪标准品溶液；
取7-羟基氯丙嗪标准品储备液，加入浓度为50%的甲醇水溶液配制成浓度在2~50000 ng/mL的7-羟基氯丙嗪标准曲线工作溶液；
将氯丙嗪标准曲线工作溶液和7-羟基氯丙嗪标准曲线工作溶液等比例混合后加入浓度为50%的甲醇水溶液配制成混合标准曲线工作溶液；其中，氯丙嗪的浓度范围为1~600 ng/mL，7-羟基氯丙嗪的浓度范围为1~300 ng/mL；
向混合标准曲线工作溶液加入解冻后的空白血浆，配制成标准曲线血浆样品，其中，氯丙嗪的浓度范围为0.05~30 ng/mL，7-羟基氯丙嗪的浓度范围为0.05~15 ng/mL；
取氯丙嗪-d 6和7-羟基氯丙嗪-d 6用甲醇分别配制成浓度为1 mg/mL的内标储备溶液；将氯丙嗪-d 6和7-羟基氯丙嗪-d 6内标储备溶液混合后经50%甲醇水溶液分两次稀释得到氯丙嗪-d 6/-羟基氯丙嗪-d 6混合内标工作溶液，其中氯丙嗪的浓度为5 ng/mL，7-羟基氯丙嗪的浓度为5 ng/mL；
步骤二：预处理：在黄光灯下，取50 µL标准曲线血浆样品至96孔板的样品孔中，依次加入50 µL氯丙嗪-d 6/7-羟基氯丙嗪-d 6内标工作溶液、200 µL沉淀剂甲醇，封板，涡旋3min，离心10 min，4℃，2450 g；
取100 μL上清液至另一96孔板的样品孔中，加入200 μL超纯水，封板涡旋3 min，上清液待进样；
步骤三：标准曲线的制备：取预处理所得上清液，采用高效液相色谱串联质谱法的多反应监测模式，对标准品进行检测分析，记录每个浓度的氯丙嗪对应的峰面积，利用同位素内标法定量，以标准溶液中标准品氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的浓度比为X1轴，标准溶液中标准品氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的峰面积比为Y1轴，建立标准回归曲线方程I；记录每个浓度的7-羟基氯丙嗪对应的峰面积，利用同位素内标法定量，以标准溶液中标准品7-羟基氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的浓度比为X2轴，标准溶液中标准品7-羟基氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的峰面积比为Y2轴，建立标准回归曲线方程II，所述标准曲线回归方程I为Y1=0.186X1+0.00132；所述标准曲线回归方程II为Y2=0.171X2+2.98e-005；
步骤四：以待测物氯丙嗪与内标物峰面积比对标准回归曲线方程中标准品与内标物的理论浓度比进行线性最小二乘法回归计算，以所得标准回归曲线方程计算人血浆样品中氯丙嗪的实测浓度；以待测物7-羟基氯丙嗪与内标物峰面积比对标准回归曲线方程中标准品与内标物的理论浓度比进行线性最小二乘法回归计算，以所得标准回归曲线方程计算人血浆样品中7-羟基氯丙嗪的实测浓度。
通过图11-15可以看出，不同色谱柱、流动相和质谱参数检测的峰形和干扰峰分开程度完全不同。图11中采用流动相：A相：0.1%甲酸水溶液， B相： 0.2% 甲酸乙腈溶液，色谱柱为phenomenex NX-C18 3μm,50×3mm，检测的峰形存在严重拖尾情况；将流动相A相改成5mm 乙酸铵0.1甲酸水溶液；图12的色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18 3.5-Micron 3.0×100mm，从图可以看出检测的峰形更宽，且分叉；图13色谱柱采用waters Xselect HSS T33.5μm，2.1×100mm，峰形可以；图14 色谱柱选择 Agilent EC-C18 3.5-Micron 3.0×100mm ，峰形较好，但后期验证中发现在此保留时间处有个小干扰峰没有分开，调整并修改液相的梯度洗脱方式，干扰峰仍没有分开；图15色谱柱选择Waters Acquity UPLC HSS T31.8μm（2.1×50mm） 然后更换此色谱柱后，再继续优化液相梯度，将干扰峰分开。本发明申请人在确定色谱柱、流动相、液质条件后，发现7-OH 氯丙嗪有18%左右针残留，后续验证测样存在很大误差，故进一步优化处理条件，在“预处理”添加一步稀释，也就是“取100 μL上清液至另一96孔板的样品孔中，加入200 μL超纯水，封板涡旋3 min，上清液待进样”增加进样体积后进样，针残留明显变小，变为8%。
进一步地，所述氯丙嗪检测范围为0.050~30.00 ng/mL；7-羟基氯丙嗪检测范围为0.050~15.00 ng/mL。
进一步地，所述高效液相色谱串联质谱法的液相色谱条件包括：
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μm（2.1×50mm）；流动相A：5 mM 乙酸铵-0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.2%甲酸乙腈溶液；流速：0.35 mL/min；停止时间：5.6 min；采用梯度洗脱，Max Pressure为1000 bar，洗针液冲洗：3 s；进样量：20 μL；柱温：40℃；
所述梯度洗脱的程序为：
0.00~1.60 min内，流动相A和流动相B的体积比为：67:33；
1.60~4.20 min内，流动相A和流动相B的体积比为：45:55；
4.20~4.21 min内，流动相A和流动相B的体积比为：10:90；
4.21~4.90 min内，流动相A和流动相B的体积比为：10:90；
4.90~4.91 min内，流动相A和流动相B的体积比为：67:33；
4.91~5.60 min内，流动相A和流动相B的体积比为：67:33。
本发明选择的色谱柱对血浆中的氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪的响应值最高，峰形较好，对称且不拖尾，出峰时间时间不会太靠前，也不会太靠后，刚好合适。
相比现有技术的流动相，本发明选择的流动相A和流动相B，本发明流动相A中含有的乙酸铵有益于降低基线，0.1%甲酸水溶液对氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪的响应值更高，能提高信噪比。考虑流速、流动相和进样量以及梯度洗脱的条件，不仅可保证药物出峰效果和响应值，也能使药物完全洗脱干净，避免对色谱柱的污染，同时也利于回收率的提升和后续质谱检测的灵敏度的提升。本发明采用梯度洗脱的方式对血浆中的氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪进行检测，流动相的洗脱比例在不同时间进行变化，综合考虑血浆基质效应等问题，使得药物出峰峰形对称完美，不仅可将药物充分洗脱下来，且回收率也高，干扰性小。
进一步地，所述高效液相色谱串联质谱的质谱条件包括：采用ESI源，正离子MRM模式检测；Dwell为100.00 msec，正离子模式优化去簇电压（DP）为100.00，射入电压（EP）为10.00，碰撞电压（CE）为24.00，碰撞室射出电压（CXP）为13.00，极性为正离子；氯丙嗪的参数设置如下：Q1 Mass：319.300 Da，Q3 Mass：86.300 Da；氯丙嗪-d6的参数设置如下：Q1Mass：325.300 Da，Q3 Mass：92.300 Da；7-羟基氯丙嗪的参数设置如下：Q1 Mass：335.300Da，Q3 Mass：86.300 Da；7-羟基氯丙嗪-d6的参数设置如下：Q1 Mass：341.300 Da，Q3Mass：92.300 Da；
质谱切换阀设置如下：1）总时间：0.5 min，切换阀：切质谱；2）总时间：4.5 min，切换阀：切废液；
离子源参数设置如下：喷雾电压（IS）为5500.00，Gas 1为55.00，Gas 2为55.00，碰撞气（CAD）为6.00，气帘气（CUR）为40.00，温度为550.00 °C。
相比现有技术的质谱条件，本发明方法的响应值合理，质谱参数合适，气帘气压利于质谱液体的汽化，可持续检测。本发明采用的喷雾气压力和辅助加热气压力均设置合理，不容易损坏仪器，可持续长期检测，方法耐用性更优。通过质谱仪很强的组分鉴别能力，能够有效分离和鉴别血浆中氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪，并进行定量检测。从图7-10可以看出，氯丙嗪、7-羟基氯丙嗪及其氘代物均随着CE能量的增大，相应逐步增大；当CE值增到到24左右后，随着CE进一步增大，响应值开始下降，故均选择CE为24。
本发明采用96孔板，可实现一次同时对96个样品进行处理，效率高。本发明通过实际生物分析检测项目检测，能在短时间内处理并检测大量样品。通过在黄光灯下进行预处理，解决氯丙嗪光不稳定的问题。
本发明方法可获得高回收率且有效降低杂质峰的干扰，避免传统方法由于溶剂效应带来的影响，避免传统方法的繁琐和条件不受控的情况。本发明方法具有系统适用性，对不同来源空白血浆无选择性，能够专一性测定，分离度好。
本实验对LC-MS/MS法测定人血浆中的氯丙嗪及代谢物7-羟基氯丙嗪浓度进行了验证。本方法采用50 µL EDTA-K2抗凝的血浆样本采取甲醇蛋白沉淀提取后，取上清液20 µL进样，氯丙嗪及代谢物7-羟基氯丙嗪定量范围分别为0.05000~30.00 ng/mL、0.05000~15.00 ng/mL，定量下限均为0.05000 ng/mL，其中批量样品检测过程的残留，精密度与准确度、选择性、干扰、基质效应、回收率、稀释验证、稳定性通过验证结果均符合接受标准；综上所述，本方法可用于测定人血浆中的氯丙嗪及代谢物7-羟基氯丙嗪浓度。
本发明方法灵敏度高，结果准确可靠，基质效应、高血脂基质效应和溶血基质效应均无干扰，准确度和精密度高，用量小，可用于临床大批量样品分析需求。本发明方法能够满足人体药代动力学要求，可应用与临床药代动力学研究。
附图说明
图1 LC-MS/MS法测得的人血浆中氯丙嗪的标准曲线图；
图2 LC-MS/MS法测得的人血浆中7-羟基氯丙嗪的标准曲线图；
图3 氯丙嗪正离子多反应检测扫描质谱图；
图4 氯丙嗪-d 6 正离子多反应检测扫描质谱图；
图5 7-羟基氯丙嗪正离子多反应检测扫描质谱图；
图6 7-羟基氯丙嗪-d 6 正离子多反应检测扫描质谱图；
图7 优化氯丙嗪的质谱CE参数检测图；
图8 优化7-羟基氯丙嗪的质谱中CE参数检测图；
图9 优化氯丙嗪-d 6 的质谱中CE参数检测图；
图10 优化7-羟基氯丙嗪-d 6 的质谱中CE参数检测图；
图11选择色谱柱phenomenex NX-C18 3μm,50×3mm优化条件检测的色谱图；
图12 选择色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18 3.5-Micron 3.0×100mm优化条件检测的色谱图；
图13 选择色谱柱waters Xselect HSS T3 3.5μm 2.1×100mm优化条件检测的色谱图；
图14 选择色谱柱Agilent EC-C18 3.5-Micron 3.0×100mm优化条件检测的色谱图；
图15选择色谱柱Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μm 2.1×50mm优化条件检测的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
1. 主要仪器
AB 5500型三重四极杆液质联用仪（AB Sciex公司），配有电喷雾电离源及Analys（Version1.6.3）数据处理系统，配有 AB Sciex ExionLC AD液相色谱仪（含自动进样器、柱温箱等）；METTLER TOLEDO AB135-S型十万分之一天平（METTLER，瑞士）；METTLER TOLEDOXPR2/A型百万分之一天平（METTLER，瑞士）；Sartorius BS224S型万分之一天平（北京赛多利斯）。
2. 色谱条件
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μm（2.1×50mm）；流动相A：5 mM 乙酸铵-0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.2%甲酸乙腈；流速：0.35 mL/min；停止时间：5.6 min；洗针液冲洗：3 s；进样量：20 μL；柱温：40℃；流动相比例设置如下表1：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
3.质谱条件：采用ESI源，正离子MRM模式检测，参数设置如下表2：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
质谱切换阀设置如下表3：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
离子源参数设置如下表4：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
4.抗凝剂：EDTA-K2；
5. 内标：7-OH LBQ-d 6 和LBQ-d 6
6.数据处理
色谱保留时间及色谱峰面积由Analyst（Version1.6.3）采集处理与定量分析。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物浓度与内标浓度比进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。 样品中分析物的实测浓度由仪器采用以下回归方程计算：
y = ax + b
其中，y = 分析物/内标峰面积比；a = 标准曲线之斜率； x = 药物浓度/内标浓度；b = 标准曲线之截距，（权重因子为1/x2）
实施例1
1. 溶液配制
流动相A（5 mM 乙酸铵-0.1%甲酸水溶液）：称取385.4 mg乙酸铵置于1L超纯水中，加入1 mL甲酸，混匀，超声。
流动相B（0.2%甲酸乙腈）：量取1L的乙腈（Merck）转移至适当的溶剂瓶中，加入2mL甲酸，混匀，超声。
洗针溶液（50%甲醇水溶液）：分别取500 mL甲醇和500 mL的超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀。
稀释溶液（50%甲醇水溶液）：分别取500 mL甲醇和500 mL的超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀。
沉淀剂（甲醇）：量取200 mL甲醇至适当的溶剂瓶中。
2. 标准溶液配制：
氯丙嗪（LBQ）标准对照品储备液的配制 ( LBQ STD Stock，1.000 mg/mL)
称取一定量氯丙嗪对照品，置于自制杯状铝箔纸中，记录重量，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，根据实际称量值及氯丙嗪含量计算分析物实际重量，加入适量甲醇，最终配制成的氯丙嗪浓度为1.000 mg/mL，摇匀。置于-20℃条件下保存。
7-羟基氯丙嗪（7-OH LBQ）标准对照品储备液的配制 (7-OH LBQ STD Stock，1.000 mg/mL)
称取一定量7-羟基氯丙嗪对照品，置于自制杯状铝箔纸中，记录重量，将铝箔纸置于20 mL棕色广口玻璃瓶中，根据实际称量值及7-羟基氯丙嗪含量计算分析物实际重量，加入适量甲醇，最终配制成的7-羟基氯丙嗪浓度为1.000 mg/mL，摇匀。置于-20℃条件下保存。
标准系列工作溶液的配制：
取标准对照品储备液适量，用甲醇稀释，得到氯丙嗪工作溶液为：100000、4000、1200、960、400、200、100、20、4、2 ng/mL。
标准系列工作溶液的配制如下表5-1：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
取标准对照品储备液适量，用甲醇稀释，得到7-羟基氯丙嗪工作溶液为：50000、2000、600、480、300、100、40、20、4、2 ng/mL。
标准系列工作溶液的配制如下表5-2：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
取氯丙嗪工作溶液和7-羟基氯丙嗪工作溶液适量，用甲醇稀释，得到氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合工作溶液为：600/300、480/240、200/150、100/50、50/20、10/10、2/2、1/1 ng/mL。
标准系列混合工作溶液的配制如下表5-3：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
标准曲线血浆样品的配制
取标准系列混合工作溶液各10 µL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2 mL，配制的标准曲线血浆样品中氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合工作溶液为：30/15、24/12、10/7.5、5/2.5、2.5/1、0.5/0.5、0.1/0.1、0.05/0.05 ng/mL。
标准曲线血浆样品的配制如下表6：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
3. 内标标准溶液配制
氯丙嗪-d 6内标储备溶液配制(LBQ-d 6 IS Stock, 1.000 mg/mL)
直接加入931 µL甲醇，溶解规格为1.04 mg的对照品，摇匀，即得浓度为1.000 mg/mL的此内标储备溶液，置于-20℃条件下保存。
7-羟基氯丙嗪-d 6内标储备溶液配制(7-OH LBQ-d 6 IS Stock, 1.000 mg/mL)
直接加入994 µL甲醇，溶解规格为1.01 mg的对照品，摇匀，即得浓度为1.000 mg/mL的此内标储备溶液，置于-20℃条件下保存。
氯丙嗪-d 6/7-羟基氯丙嗪-d 6内标工作溶液配制(IS Spike, 5 ng/mL)
取LBQ/7-OH LBQ IS Stock 20 μL至960 μL 50%甲醇水中，混匀得IS Spike-1（20/20 μg/mL）
取IS Spike-1（20/20 μg/mL）25μL至100 mL容量瓶中，用50%甲醇水稀释至刻度，混匀得到IS Spike（5/5 ng/mL）。
4. 质控标准溶液配制
氯丙嗪质控对照品储备液的配制 (LBQ QC Stock，1.000 mg/mL)
称取一定量氯丙嗪，置于自制杯状铝箔纸中，记录重量，将铝箔纸置于20 mL棕色广口玻璃瓶中，根据实际称量值及氯丙嗪含量计算分析物实际重量，加入适量甲醇，最终配制成的氯丙嗪浓度为1.000 mg/mL，摇匀。
7-羟基氯丙嗪质控对照品储备液的配制(7-羟基氯丙嗪QC Stock, 1.000 mg/mL)
称取一定量7-羟基氯丙嗪，置于自制杯状铝箔纸中，记录重量，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，根据实际称量值及7-羟基氯丙嗪含量计算分析物实际重量，加入适量甲醇，最终配制成的7-羟基氯丙嗪浓度为1.000 mg/mL，摇匀。置于-20℃条件下保存。
氯丙嗪质控工作溶液的配制：取氯丙嗪质控对照品储备液，稀释到甲醇中，配制成的氯丙嗪质控工作液的浓度为100000、9000、4000、900、480、120、6、2 ng/mL
氯丙嗪质控工作溶液的配制如下表7-1：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
7-羟基氯丙嗪质控工作溶液的配制：取7-羟基氯丙嗪质控对照品储备液，稀释到甲醇中，配制成的7-羟基氯丙嗪质控工作液的浓度为25000、4500、1000、450、200、30、6、2ng/mL。7-羟基氯丙嗪质控工作溶液的配制如下表7-2：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
取氯丙嗪质控工作溶液和7-羟基氯丙嗪质控工作溶液适量，用甲醇稀释，得到氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合质控工作溶液为：4500/2250、450.0/225.0、240.0/100.0、60.00/15.00、3.000/3.000、1.000/1.000 ng/mL。
标准系列混合质控工作溶液的配制如下表7-3：
Figure DEST_PATH_IMAGE022
质控血浆样品的配制：取质控工作溶液，稀释到空白血浆中，配制成的氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合质控血浆样品液的浓度为225/112.5、22.5/11.25、12/5、3/0.75、0.15/0.15、0.05/0.05 ng/mL；对应AQL、HOQ QC、M2OQ QC、M1OQ QC、LOQ QC、LLOQ。
质控血浆样品的配制如下表8：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
样品进行检测前的预处理方法（所有步骤在黄光灯下完成）：
取全血，加入抗凝剂EDTA-K2，通过离心后制得空白血浆，冷藏用于样品稀释或配制，使用前解冻。
取出空白血浆解冻后，并按照“标准溶液配制、质控标准溶液配制”的程序配制标准曲线标准血浆样品和质控血浆样品；取分析批所需样品涡旋1 min；取空白血浆50 µL至Double blank、blank、carryover样品孔中，取超纯水50 µL至RB样品孔中，取各验证项样品各50 µL至对应样品孔中；取IS Spike稀释液50 µL至RB、Double blank、carryover样品孔中，取IS Spike 50 µL至其它对应样品孔中；取沉淀剂200 µL至对应样品孔中；封板，涡旋3min；离心，4℃，2450 g，10 min；吸取100 μL上清液加200 μL超纯水至另一块干净的96孔板中，封板，涡旋3 min；20 μL进样到色谱系统分析。
备注：Double blank为双空白样品、carryover为残留考察用双空白样品、blank为只加内标的单空白样品、RB（Reagent and Materials blank）为试剂耗材验收空白样品。
5. 方法学验证
5.1线性范围和定量下限
取标准曲线血浆样品，配制的标准曲线血浆样品中氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合工作溶液为：30/15、24/12、10/7.5、5/2.5、2.5/1、0.5/0.5、0.1/0.1、0.05/0.05 ng/mL，经预处理后运用LC-MS/MS法检测，平行测定6份。取一份空白血浆，另一份空白血浆并加入内标标准溶液，分别记录空白人血浆色谱图，用于评价空白血浆的干扰情况。
结论：所得标准曲线样品的线性曲线图如1-2所示，其中LC-MS/MS法测得的氯丙嗪在人血浆中的标准曲线方程为：y=0.186x+0.00132，R为0.9992；LC-MS/MS法测得的7-羟基氯丙嗪在人血浆中的标准曲线方程为：y=0.171x+2.98e-005，R为0.9996；氯丙嗪的线性范围为0.05 ng/mL~30 ng/mL，平均测定6次，R的SD为0.0007，CV为0.1%；斜率的SD为0.024，CV为13.3%，氯丙嗪的血药浓度的最低定量下限为0.05 ng/mL，在线性范围内线性关系良好；7-羟基氯丙嗪的线性范围为0.05 ng/mL~15 ng/mL，平均测定6次，R的SD为0.0009，CV为0.1%；斜率的SD为0.007，CV为4.2%，7-羟基氯丙嗪的血药浓度的最低定量下限为0.05 ng/mL，在线性范围内线性关系良好。
5.2精密度与准确度
取五个不同浓度的质控血浆样品，氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合质控血浆样品液的浓度为225/112.5、22.5/11.25、12/5、3/0.75、0.15/0.15、0.05/0.05 ng/mL；对应AQL、HOQQC、M2OQ QC、M1OQ QC、LOQ QC、LLOQ，并将其进行检测。作为批内及批间准确度和精密度的考察。每一个浓度平行制备6份，至少测试三次。采用平均值来评估批间准确度和精密度。
批内、批间的精密度和准确度如下表9：
Figure DEST_PATH_IMAGE026
Figure DEST_PATH_IMAGE028
Figure DEST_PATH_IMAGE030
Figure DEST_PATH_IMAGE032
Figure DEST_PATH_IMAGE034
Figure DEST_PATH_IMAGE036
Figure DEST_PATH_IMAGE038
Figure DEST_PATH_IMAGE040
结果表明：氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪的混合血浆样品批内、批间精密度、准确度偏差均小于15%。低、中、高浓度水平标准血浆样品测得值应为标示值的15%范围内，批间精密度（RSD）范围为0.00663~1.36，小于15%；批内精密度（RSD）范围为0.00321~0.65，小于15%；批内准确度偏差范围为-6.1~15.7%。说明本发明方法对血浆中的氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪浓度的检测具有良好的精密度和准确度。
5.3系统适用性：
取经预处理过的氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪混合质控血浆样品，浓度为0.05/0.05ng/mL；20 μL进样检测，重复分析5次；记录待测物与内标的色谱峰面积值及保留时间，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值及色谱峰保留时间的变异系数。
结论：待测物信噪比（S/N不小于5），5次重复分析所得待测物与内标色谱峰面积比值的变异系数应小于5%；5次重复分析所得待测物与内标色谱峰保留时间的变异系数应小于15%。待测物氯丙嗪保留时间变异系数0-0.7%、内标保留时间变异系数0.1-0.5%、面积比的变异系数0.5-7.7%；待测物7-羟基氯丙嗪保留时间变异系数0.1-1.8%、内标保留时间变异系数0-1.7%、面积比的变异系数0.2-8.5%；说明本发明方法对血浆中药物的检测方法适用测定氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪浓度。
5.4 选择性
选择性是指色谱方法测定分析物时，区分生物基质中干扰的能力。方法验证之前，需要至少筛选6个不同批次的空白基质用于方法验证。取6个中国人群不同来源的空白血浆50µL，不加内标分别进行测定，20 μL进样到色谱系统分析。取50 µL 6份来自不同来源的空白血浆，配制成的氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合质控血浆样品液的浓度为0.05/0.05 ng/mL，经预处理后，20 μL进样到色谱系统分析；记录各份空白样品及定量下限浓度水平的标准血浆样品的结果。
分析物、内标的选择性考察对比(LBQ)如下表10：
Figure DEST_PATH_IMAGE042
分析物、内标的选择性考察对比(7-OH LBQ)如下表11：
Figure DEST_PATH_IMAGE044
备注：不在待测物保留时间与内标保留时间的干扰用0表示。
结论：至少6份不同来源空白基质样品中的分析物保留时间处色谱峰峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度待测物峰面积的20.0%，且内标保留时间处内标峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度内标峰面积的5.0%。6份不同来源空白基质配制的LLOQ浓度测得值在理论值的80.0%~120.0%范围内。本发明方法针对不同来源空白基质样品中的分析物的干扰范围为0.0~2.0%，内标干扰响应值为0。可见，不同人体的空白血浆对氯丙嗪及7-羟基氯丙嗪的检测结果没有造成干扰，该方法可以用于检测不同人体血浆中氯丙嗪及7-羟基氯丙嗪，不同人群的血浆对本发明检测方法无影响。
5.5 回收率
5.5.1分析物的提取回收率
分析物回收样品：取浓度为22.5/11.25、12/5、3/0.75、0.15/0.15 ng/mL氯丙嗪/7-羟基氯丙嗪混合质控血浆样品液，平行制备6份，经预处理后，20μL进样到色谱系统分析。
回收率参比样品：提取过程与提取回收率样品的提取操作相同，但是分析物和内标溶液不参与提取过程。在此分析批中，提取回收率样品和回收率参比样品的浓度相同。
5.5.2内标物的提取回收率
内标的提取回收率考察与分析物同时进行，操作一致。
结论：1）本发明方法的待测物氯丙嗪在高、中、低三个浓度范围内的提取平均回收率为107.1%、123.8%、139.3%，对应的变异系数CV值为2.5%、2.2%、2.3%；总回收率为123.4%，总体回收率变异CV值为11.2%。本发明方法的待测物7-羟基氯丙嗪在高、中、低三个浓度范围内的提取平均回收率为120.1%、111.9%、136.2%，对应的变异系数CV值为2.2%、2.9%、2.0%；总回收率为122.7%，总体回收率变异CV值为8.7%。2）本发明方法的内标物氯丙嗪-d 6的提取平均回收率为123.8%，回收率CV值为2.2%。本发明方法的内标物7-羟基氯丙嗪-d 6的提取平均回收率为111.9%，回收率CV值为2.9%。
5.6基质效应
1）基质效应系指生物基质中存在的组分对分析物的离子化所产生的抑制或增强作用。取6个不同批次的空白人血浆，每个批次配制一份，经前处理后加入与处理后的低浓度和高浓度质控样品浓度相当的标准品溶液及内标溶液进行分析。无基质存在的与低浓度和高浓度质控样品浓度相当的纯溶液，平行6份，进行分析。
2）溶血基质的配制：取100 µL空白全血，将其超声破坏血细胞，取其20µL加入980µL正常空白血浆，混匀，即为2%经超声破坏的溶血血浆，视为严重溶血。使用模拟的溶血血浆制备待测物两个浓度水平（LOQ QC、HOQ QC）样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。
3）验证方法时使用模拟的高脂血血浆样品进行评估（配制5.0%的中长链脂肪乳注射液高脂血血浆样品），使用模拟高血脂血浆样品制备待测物低、高浓度水平（LOQ QC、HOQQC）样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。
结论：氯丙嗪的溶血基质效应的平均准确度偏差范围：4.3~ 9.6%；高血脂基质效应的平均准确度偏差范围：6.5 ~ 12.6%；说明本发明方法没有明显的基质效应，也没有明显的溶血和高血脂基质效应。7-羟基氯丙嗪的溶血基质效应的平均准确度偏差范围：-0.7~7.6%；高血脂基质效应的平均准确度偏差范围：2.1 ~ 9.5%；说明本发明方法没有明显的基质效应，也没有明显的溶血和高血脂基质效应。
5.7稳定性
将待测物低、高（LOQ QC、HOQ QC）两个浓度的人血浆质控样品，在如下条件下进行稳定性考察：
1）-70℃反复冻融5次稳定。2）室温放置20h稳定。3）-20℃条件下28d稳定；-70℃条件下57d稳定。4）全血稳定性（冰水浴中放置2h）：分别考察加入含低、高（LOQ QC、HOQ QC）两个浓度水平分析物在全血中冰水浴下放置（0h）、（2h）峰面积之比的变化，在放置相应考察时间点后，将全血样品离心分离血浆，加入内标按照相应血浆样品处理操作方法处理，每个浓度水平平行6份。通过稳定性考察后的样品与现配制的样品同时检测，每个浓度对比结果如下：
室温放置20h稳定-短期稳定性结果如下表12：
Figure DEST_PATH_IMAGE046
-20℃条件下28d稳定-长期稳定性结果（LBQ）如下表13：
Figure DEST_PATH_IMAGE048
-70℃反复冻融5次稳定性结果如下表14：
Figure DEST_PATH_IMAGE050
全血稳定性结果如下表15：
Figure DEST_PATH_IMAGE052
本发明的方法检测的血浆中各药物的浓度在上述考察条件下得出的CV值均小于10%，提示在上述考察条件下本发明方法对全血和血浆中氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪的检测具有较强的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：标准溶液配制：
取标准品配制氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪的标准曲线工作溶液，取氯丙嗪和7-羟基氯丙嗪的标准曲线工作溶液混合配制成混合标准曲线工作溶液，进一步配制成标准曲线血浆样品；
配制氯丙嗪-d 6/7-羟基氯丙嗪-d 6内标工作溶液；
步骤二：预处理：
在黄灯下，取标准曲线血浆样品至96孔板的样品孔中，依次加入氯丙嗪-d 6/7-羟基氯丙嗪-d 6内标工作溶液、沉淀剂，封板，涡旋，离心得上清液；
取上清液至另一96孔板的样品孔中，加入超纯水，封板涡旋，所得上清液待进样；
步骤三：标准曲线的制备：
采用高效液相色谱串联质谱法的多反应监测模式检测上清液，对待标准品进行检测分析，建立标准回归曲线方程I和II；
步骤四：待测血浆样本按步骤一至三进行处理后，以待测物与内标物峰面积比对标准回归曲线方程中标准品与内标物的理论浓度比进行线性最小二乘法回归计算，以所得标准回归曲线方程计算人血浆样品中待测物的实测浓度；
其中，所述高效液相色谱串联质谱法的液相色谱条件包括：色谱柱：Waters AcquityUPLC HSS T3；流动相A：乙酸铵甲酸水溶液；流动相B：甲酸乙腈溶液；采用梯度洗脱方式。
2.根据权利要求1所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述标准溶液配制过程如下：
取标准品氯丙嗪，加入甲醇配制氯丙嗪标准品溶液；
取氯丙嗪标准品储备液，加入甲醇水溶液配制成浓度在2~100000 ng/mL的氯丙嗪标准曲线工作溶液；
取标准品7-羟基氯丙嗪，加入甲醇配制成7-羟基氯丙嗪标准品溶液；
取7-羟基氯丙嗪标准品储备液，加入甲醇水溶液配制成浓度在2~50000 ng/mL的7-羟基氯丙嗪标准曲线工作溶液；
将氯丙嗪标准曲线工作溶液和7-羟基氯丙嗪标准曲线工作溶液按比例混合后加入甲醇水溶液配制成混合标准曲线工作溶液；其中，氯丙嗪的浓度范围为1~600 ng/mL，7-羟基氯丙嗪的浓度范围为1~300 ng/mL。
3.根据权利要求1所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述标准曲线血浆样品的制备过程如下：向混合标准曲线工作溶液加入解冻后的空白血浆，配制成标准曲线血浆样品，其中，氯丙嗪的浓度范围为0.05~30 ng/mL，7-羟基氯丙嗪的浓度范围为0.05~15 ng/mL。
4.根据权利要求1所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述氯丙嗪-d 6/-羟基氯丙嗪-d 6内标工作溶液配制过程如下：取氯丙嗪-d 6和7-羟基氯丙嗪-d 6用甲醇分别配制成内标储备溶液；将氯丙嗪-d 6和7-羟基氯丙嗪-d 6内标储备溶液混合后经甲醇水溶液稀释得到氯丙嗪-d 6/-羟基氯丙嗪-d 6内标工作溶液，其中氯丙嗪的浓度为5 ng/mL，7-羟基氯丙嗪的浓度为5 ng/mL。
5.根据权利要求1所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述预处理过程为：在黄光灯下，取标准曲线血浆样品至96孔板的样品孔中，依次加入氯丙嗪-d 6/7-羟基氯丙嗪-d 6内标工作溶液、沉淀剂，封板，涡旋，离心得上清液；
取上清液至另一96孔板的样品孔中，加入超纯水，封板涡旋，上清液待进样。
6.根据权利要求5所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述沉淀剂为甲醇。
7.根据权利要求1所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法的液相色谱条件包括：
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3，1.8 μm，2.1×50 mm；
流动相A：1~5 mM 乙酸铵-0.1~0.5%甲酸水溶液；流动相B：0.1~0.5%甲酸乙腈溶液；
流速：0.1~0.5 mL/min；停止时间：5.6 min；采用梯度洗脱，最大压力为1000 bar，
洗针液冲洗：3 s；进样量：20 μL；柱温：30~40℃；
所述梯度洗脱的程序为：
0.00~1.60 min内，流动相A和流动相B的体积比为：67:33；
1.60~4.20 min内，流动相A和流动相B的体积比为：45:55；
4.20~4.21 min内，流动相A和流动相B的体积比为：10:90；
4.21~4.90 min内，流动相A和流动相B的体积比为：10:90；
4.90~4.91 min内，流动相A和流动相B的体积比为：67:33；
4.91~5.60 min内，流动相A和流动相B的体积比为：67:33。
8.根据权利要求1所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱的质谱条件包括：采用ESI源，正离子MRM模式检测；Dwell为100.00 msec，正离子模式优化去簇电压为100.00，射入电压为10.00，碰撞电压为24.00，碰撞室射出电压为13.00，极性为正离子；氯丙嗪的参数设置如下：Q1 Mass：319.300Da，Q3 Mass：86.300 Da；氯丙嗪-d 6的参数设置如下：Q1 Mass：325.300 Da，Q3 Mass：92.300 Da；7-羟基氯丙嗪的参数设置如下：Q1 Mass：335.300 Da，Q3 Mass：86.300 Da；7-羟基氯丙嗪-d 6的参数设置如下：Q1 Mass：341.300 Da，Q3 Mass：92.300 Da；
质谱切换阀设置如下：1）总时间：0.5 min，切换阀：切质谱；2）总时间：4.5 min，切换阀：切废液；
离子源参数设置如下：喷雾电压为5500.00，Gas 1为55.00，Gas 2为55.00，碰撞气为6.00，气帘气为40.00，温度为550.00 °C。
9.根据权利要求1所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，标准回归曲线方程I和II的建立过程如下：以标准溶液中标准品氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的浓度比为X1轴，标准溶液中标准品氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的峰面积比为Y1轴，建立标准回归曲线方程I；记录每个浓度的7-羟基氯丙嗪对应的峰面积，利用同位素内标法定量，以标准溶液中标准品7-羟基氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的浓度比为X2轴，标准溶液中标准品7-羟基氯丙嗪和内标工作溶液中内标物的峰面积比为Y2轴，建立标准回归曲线方程II。
10.根据权利要求9所述临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法，其特征在于，所述标准曲线回归方程I为Y1=0.186X1+0.00132；所述标准曲线回归方程II为Y2=0.171X2+2.98e-005，所述氯丙嗪检测范围为0.050~30.00 ng/mL；7-羟基氯丙嗪检测范围为0.050~15.00 ng/mL。
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