CN111239303B - 一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学检验技术领域，具体是一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法，采用液相质谱联用技术同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度，该方法包括：A、同时测定血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度。B、所有待测样品可在同一色谱和质谱条件下出峰测定。C、样品中不同极性待测物同时提取。优点：准确、简便、快速地评价患者体内血浆中腺苷浓度变化及其与服用抗血小板药物替格瑞洛后血浆中替格瑞洛及其活性代谢物浓度之间的关系。此外，本发明对预处理及色谱、质谱条件进行优化，使得测定方法操作简单、快速、灵敏、专属性强、重复性好。

Description

一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和 内源性腺苷浓度的方法

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体地说，是一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法。

背景技术

替格瑞洛对血小板聚集具有双重作用机制，一方面可以通过抑制P2Y12受体，从而阻断磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集，另一方面它可以抑制红细胞上ENT-1对腺苷再摄取而抑制血小板聚集。替格瑞洛除原型药物本身以外其活性代谢物AR-C124910XX同样可以有效抑制血小板聚集。这些药物特点，使得替格瑞洛在临床使用过程中，相对于阿司匹林和氯比格雷等其他抗血小板药物，可以明显降低心血管的死亡率，以及心血管事件导致的中风和死亡。腺苷对心血管产生的作用，包括血管舒张，抑制血小板聚集，抑制炎症，增加对缺血和再灌注的抵抗力。虽然腺苷对心血管产生很多有益作用，有研究报道静脉注射腺苷会诱导呼吸困难并有效抑制房室传导。[Riksen NP,Rongen GA.Targeting adenosine receptorsin the development of cardiovascular therapeutics.Expert Rev ClinPharmacol.2012；5:199–218.Burki NK,Dale WJ,Lee LY.Intravenous adenosine anddyspnea in humans.J Appl Physiol(1985:).2005；98:180–185.]。因而越来越多研究开始关注替格瑞洛及其活性代谢物对腺苷作用，是其导致呼吸困难的重要原因。因而一种准确、快速、稳定的同时测定替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX和内源性腺苷浓度方法，就十分重要。

目前国内外尚无文献发表关于液质联用技术同时测定人体中替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX和内源性腺苷浓度的方法。已发表测定体内中替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX的液质联用方法，多运用液质联用中质谱APCI源下负离子模式或ESI源下负离子模式。测定内源性腺苷的主要检测方法主要包括高效液相紫外检测法和高效液相色谱荧光检测方法，使用液质谱联用测定内源性腺苷浓度的方法使用的是ESI下正离子模式，该离子模式与上述测定替格瑞洛等的不同，因而为应用液质联用技术同时测定替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX和内源性腺苷浓度方法增加了难度。腺苷在体内快速生成又快速降解，半衰期仅为0.7s，采血后立即添加稳定剂是有必要的，以增加血样标本中腺苷的稳定性。稳定剂采用生理盐水溶解，此外，本发明中三个待测物极性不同，对同时测定样品的前处理极具有强的挑战性。(参考文献：1.Sillén H,Cook M,Davis P.Determination o fticagrelor and two metabolites in plasma samples by liquid chromatography andmass sp ectrometry.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2010,878(25):2299-306.2.Si llén H,Cook M,Davis P.Determination of unbound ticagrelorand its active metabolite(A R-C124910XX)in human plasma by equilibriumdialysis and LC–MS/MS.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2011,879(23):2315-22.3.Zhong W,Wang X,Tang L,Mai L,Chen XP,He G,Zheng Z,ZhongS.Simultaneous Determination of Ticagrelor and Its Metabolites in HumanPlasma and Urine Using Liquid Chromatography–Tandem Mas sSpectrometry.J AnalToxicol.2016,40(6):445-53.4.Sharma K,Singh R,Giri S,Rajagopal S,MullangiR.Highly sensitive method for the determination of adenosine by LC-MS/MS-ESI:method validation and scope of application toa pharmacokinetic/pharmacodynamic st udy.Biomed Chromatogr.2012，26(1):81-88.5.Hui Y,Zhao SS,Love JA,Ansley DM,Che n DD.Development and application of a LC-MS/MS methodto quantifybasal adenosine conce ntration in human plasma frompatientsundergoing on-pump CABG surgery.J Chromatogr B A nalyt Technol BiomedLife Sci.2012,885-886:30-36.6.Murakami H,Otani E,Iwata T,Esa ka Y,Aoyama T,Kawasaki M,Tanaka T,Minatoguchi S,Uno B.Simple Pretreatment and HI LICSeparation for LC-ESI-MS/MSDetermination ofAdenosine in Human Plasma.AnalSci.2015；31(11):1189-1192).

本发明在前人研究基础上进行创新，对生物样品添加稳定剂后采用反相色谱C₁₈柱和液质联用ESI正离子模式实现替格瑞洛及其活性代谢(AR-C124910XX)和内源性腺苷浓度同时测定，同时本发明对样本的前处理采用50％的乙腈溶解高氯酸，用于解决不同极性多种待测物质提取回收率，保证了测定方法灵敏、特异、稳定。本发明提供了一种简单、迅速和灵敏，且稳定性好的LC-ESI-MS/MS方法同时测定人血浆中腺苷和外源性替格瑞洛及其活性代谢AR-C124910XX的方法，用于评价服用替格瑞洛后，该药及其活性代谢AR-C124910XX与内源性腺苷体内浓度之间的相互关系。关于本发明一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法目前还未见有相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法，可用于准确、简便、快速地评价体内替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX和内源性腺苷的浓度之间的影响规律。

本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述方法的用途。

本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供一种应用高效液相色谱技术同时检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的试剂盒。

本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述试剂盒的使用方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法，包括如下步骤：

(1)标准样品制备：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷配制成腺苷浓度为110、55、11、5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛1600、800、160、80、48、32ng/mL；替格瑞洛活性代谢物1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2ng/mL的标准样品，所有溶液在4℃下保存，备用；

(2)标准曲线血浆样本的制备：取空白人正常血浆，先加入稳定剂赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四乙酸，然后分别加入步骤(1)制得的标准样品，混匀，制成相应浓度的校正标样；

(3)待测血浆样本的制备：取全血样本加入含有肝素抗凝剂的样品管，立即加入稳定剂：赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四乙酸，涡旋混匀，离心，分离血浆，得待测血浆样本；

(4)血浆样品预处理：血浆样本加入内标D⁷-替格瑞洛和¹⁵N-腺苷，加入用50％-70％乙腈溶解的30％高氯酸，涡旋后加入缓冲液调节pH，离心处理后取上清液；

(5)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正标样、步骤(4)得到的上清液样品提取物进行液质联用技术分析测定，分别以替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷浓度为横坐标，替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线；

(6)定量分析：取待测全血样本，按照步骤(3)、(4)的方法处理，并按照步骤(5)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度。

优选地，所述方法包括：A：同一质谱离子源下同时测定待测血浆样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度；B：同一色谱条件下同时测定待测样品中上述三种待测物色谱峰；C：同一样品预处理实现血浆药品中上述三种不同极性待测物的提取。

优选地，如上所述A的测定方法为：用质谱中ESI源正离子MRM模式，用于定量分析的离子对分别为m/z 523.4→153.2(替格瑞洛)、m/z 479.4→153.2(替格瑞洛活性代谢物)和m/z 268.2→136.2(腺苷)；所述A的测定条件为：质谱条件为：喷雾电压为5.5kV，离子传输毛细管温度为650℃；Gas1(N₂)压力为90Arb,Gas2(N₂)压力为60Arb，帘气(N₂)压力为28Arb；碰撞气(Ar)压力为Medium；DP电压分别为38eV(腺苷)、15eV(¹⁵N-腺苷)和70eV(替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛)；CE电压分别为25eV(腺苷)、15eV(¹⁵N-腺苷)和50eV(替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛)；CXP电压分别为2.3eV；EP电压分别为4eV；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)；用于定量分析的离子对分别为：m/z523.4→153.2(替格瑞洛)、m/z 479.4→153.2(替格瑞洛活性代谢物)、、m/z 530.7→153.2(D⁷-替格瑞洛,IS)、m/z 268.2→136.2(腺苷)和m/z269.1→137.1(¹⁵N-腺苷,IS)；扫描时间为0.2s。

优选地，所述B的测定方法为：用C₁₈分析柱和梯度洗脱，条件为：Zorbax SB-AqC₁₈column 250×4.6mmI.D.,5μm色谱柱；流动相为甲醇-水含0.1％甲酸：0-4min：5：95(V/V)，4.1-10min：80：20(V/V)，10.1-20min：5：95(V/V)；流速为1ml/min，柱温为30℃。

优选地，所述C的测定方法为：肝素抗凝的全血样本，立即加入稳定剂：赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四乙酸，混匀，加入用50％-70％乙腈溶解的30％高氯酸，涡旋后加入缓冲液调节pH，离心后取上清液进样。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的方法在同时检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的应用及在制备上述方法的试剂盒中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种应用高效液相色谱技术同时检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的试剂盒，主要由：标准样品、校正标样、质控样品、稳定剂、沉淀剂、内标溶液、空白人正常血浆及色谱柱、流动相组成。

所述标准样品的制备方法为：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷，分别配制成腺苷浓度为110、55、11、5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛1600、800、160、80、48、32ng/mL；替格瑞洛活性代谢物1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2ng/mL的标准样品，所有溶液在4℃下保存，备用；

所述校正标样的制备方法为：取空白人正常血浆，加入稳定剂分别加入上述的标准样品，混匀，制成相应浓度的校正标样；

所述质控样品的制备方法为：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷，分别配制成腺苷浓度为5.5、11、55ng/mL；替格瑞洛为63、630、1260ng/mL；替格瑞洛活性代谢物为49.5、495、990ng/mL的质控样品，所有溶液在4℃下保存，备用；

所述稳定剂的制备方法为：含赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四乙酸的混合溶液，在4℃下保存，备用；

所述沉淀剂的制备方法为：50％-70％乙腈溶解30％高氯酸溶液；

所述内标溶液的制备方法为：一定浓度的D⁷-替格瑞洛和¹⁵N-腺苷混合溶液，在4℃下保存，备用；

所述色谱柱为：Zorbax SB-Aq C₁₈ column 250×4.6mmI.D.,5μm色谱柱；

所述流动相的制备方法为：甲醇、0.1％甲酸水溶液。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：取试剂盒中的标准样品、校正标样、质控样品、稳定剂、沉淀剂、内标溶液、空白人正常血浆及色谱柱、流动相进行液相色谱和液质联用技术分析测定，分别以以替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度为横坐标，替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线；待测样品按照上述相同方法处理，并按所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度。

优选地，还包括A：同一质谱离子源下同时测定待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度；B：同一色谱条件下同时测定待测样品中上述三种待测物；C：同一样品预处理实现血浆药品中上述三种不同极性待测物的提取；

所述A的测定方法为：用质谱中ESI源正离子MRM模式，用于定量分析的离子对分别为m/z 523.4→153.2(替格瑞洛)、m/z 479.4→153.2(替格瑞洛活性代谢物)和m/z 268.2→136.2(腺苷)；测定条件为：质谱条件为：喷雾电压为5.5kV，离子传输毛细管温度为650℃；Gas1(N₂)压力为90Arb,Gas2(N₂)压力为60Arb，帘气(N₂)压力为28Arb；碰撞气(Ar)压力为Medium；DP电压分别为38eV(腺苷)、15eV(¹⁵N-腺苷)和70eV(替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛)；CE电压分别为25eV(腺苷)、15eV(¹⁵N-腺苷)和50eV(替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛)；CXP电压分别为2.3eV；EP电压分别为4eV；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)；用于定量分析的离子对分别为：替格瑞洛：m/z 523.4→153.2、替格瑞洛活性代谢物：m/z 479.4→153.2、m/z 530.7→153.2(D⁷-替格瑞洛,IS)、m/z268.2→136.2(腺苷)和m/z 269.1→137.1(¹⁵N-腺苷,IS)；扫描时间为0.2s；

所述B的测定方法为：用C₁₈分析柱和梯度洗脱，条件为：Zorbax SB-Aq C₁₈ column250×4.6mmI.D.,5μm色谱柱；流动相为甲醇-水含0.1％甲酸：0-4min：5：95(V/V)，4.1-10min：80：20(V/V)，10.1-20min：5：95(V/V)；流速为1ml/min，柱温为30℃；

所述C的测定方法为：肝素抗凝的全血样本，立即加入稳定剂，混匀，加入沉淀剂，涡旋后加入缓冲液调节pH，离心后取上清液进样。

本发明优点在于：

1、本发明的主要技术方案是：采用液相质谱联用仪来同时测定替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX和内源性腺苷在体内浓度的方法，鉴于目前液质联用质谱仪测定三种待测物难于在同一离子模式下分别测定待测物。因而本发明创新点之一：解决同一离子模式下三种待测物的同时测定；本发明创新点之二：解决血液样本三个极性不同待测物在同一色谱柱下出峰以及离子抑制；本发明创新点之三：解决三个极性不同待测物在同一提取条件下的提取率。

2、本发明通过反复实践和摸索提供一种同时测定三种待测物的液质联用方法，并对极性不同待测物同时进行有效提取。此外，本发明对色谱条件进行优化，以解决前处理过程中加入的盐对待测物的离子干扰，使得所测定的方法操作简单、快速、灵敏、专属性强、重复性好，适合临床患者体内血样中腺苷浓度的及其与替格瑞洛及替格瑞洛活性代谢物浓度相互关系的研究。

3、本发明的方法无需昂贵的设备和试剂，血样用量少，三种成分同时测定，效率高，成本低，适合常规治疗药物监测及相关临床研究，具有很好的应用前景。

附图说明

附图1是健康志愿者空白基质血浆色谱图(I:腺苷；II：N¹⁵-腺苷；III：替格瑞洛活性代谢物；IV：替格瑞洛；V：D⁷-替格瑞洛)。

附图2是健康志愿者空白基质添加标准品血浆色谱图(I:腺苷；II：N¹⁵-腺苷；III：替格瑞洛活性代谢物；IV：替格瑞洛；V：D⁷-替格瑞洛)。

附图3是健康志愿者服用替格瑞洛后血浆色谱图(I:腺苷；II：N¹⁵-腺苷；III：替格瑞洛活性代谢物；IV：替格瑞洛；V：D⁷-替格瑞洛)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1预实验

1、实验材料

30％高氯酸、30％乙腈、50％乙腈、80％乙腈、100％乙腈、替格瑞洛、AR-C124910XX

2、实验方法

待测样品中腺苷不稳定，因而本发明选择30％高氯酸沉淀蛋白，有效除去生物样品中的酶，保证腺苷浓度经过前处理后稳定。

3、实验结果

本发明中腺苷待测物是极性很强化合物，替格瑞洛及其活性代谢物极性很弱，因而本发明考察了不同比例有机溶剂配比，溶解高氯酸后，其提取回收率差异，见表1。

表1、不同比例乙腈-水溶液溶解高氯酸对待测物提取率考察

从表中可以看出，30％高氯酸用纯水溶解，对于替格瑞洛及其活性代谢物提取率低，增加乙腈比例，替格瑞洛及其活性代谢物的提取回收率会明显改善，提高灵敏度，降低其定量检测下限。从表中同时可以看出，随着有机溶剂比例增加，腺苷的提取回收率会降低。本发明通过摸索发现50-70％的乙腈溶解30％高氯酸，能够较理想地平衡待测样品的提取率。

实施例2选择性和线性试验

1、实验方法

生物空白基质处理：血浆样品放至一段时间，直至腺苷消失干净后(2小时腺苷可消失干净)，按血浆1ml加入50μl稳定剂比例，混匀血浆待用。

线性试验：

配置系列标准曲线血浆样本，包含腺苷浓度为110、55、11、5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛1600、800、160、80、48、32ng/mL；替格瑞洛活性代谢物1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2ng/mL。按血浆样品预处理操作。以待测物浓度(C，ng/mL)为横坐标，待测物峰面积(As)与内标峰面积(Ai)的比值(As/Ai)为纵坐标，用加权(权重系数：1/C²)最小二乘法进行线性回归运算，回归方程相关系数(r)均大于0.99定量下限(信噪比>10)。

血浆样品预处理：分别取配置后系列标准曲线血浆样本200μL加入10μL内标，加入30％高氯酸200μl(用50％乙腈溶解高氯酸)，涡旋后加入10ul缓冲液调节pH，后于11000rpm离心90秒，转移上清液后转移至自动进样器小瓶中，自动进样器内20℃下等待进样(每个血样前处理过程均在1h内完成)。

选择性：取不同来源的6位健康志愿者的血样经过空白基质处理，其按照上述样品制备和测定方法进行测定。

2、实验结果

经过空白基质处理健康志愿者血浆色谱图如图1所示；经过空白基质处理健康志愿者血浆加入待测物后色谱图如图2所示；立即采集后健康志愿者空白血浆的典型色谱图如图3所示。

表2、腺苷AD、替格瑞洛Y1和替格瑞洛代谢物Y2的标准曲线回归方程

实施例3提取回收率和基质效应

1、实验方法

取经过空白基质处理的空白血浆除不加标准系列溶液和内标溶液外，按实施例2中“血浆样品预处理方法”操作，制备上清液。向上清液中加入相应浓度标准系列溶液和内标，每浓度进行5样本分析，获得相应峰面积值A。取经过空白基质处理的空白血浆200μL，制备相应浓度标准系列溶液和内标溶液外，按实施例2中“血浆样品预处理方法”操作，每浓度进行5样本分析，获得相应峰面积值B。制备相应浓度标准系列溶液和内标溶液外，每浓度进行5样本分析，获得相应峰面积值C。以每一浓度三种处理方法操作的峰面积比值B/A计算回收率，B/C计算基质效应。

2、实验结果

回收率均大于90％，基质效应约为90％。

表3、待测物及其内标回收率和基质效应

实施例4准确度和精密度

1、实验方法

取经过空白基质处理的空白血浆分别配置系列待测物浓度，每一浓度六样本，按损失率中“血浆样品预处理方法”操作，进行分析，以待测物的实测值计算日内相对标准偏差和日间相对标准偏差(RSD)表示。

表4、待测物及其内标的日内和日间精密度

实施例5进样器24h稳定性

1、实验方法

空白基质处理后对加入相应浓度的待测物。每个浓度5个样本考察。

2、实验结果见表5。

表5、空白基质处理后对加入相应浓度的待测物。每个浓度5个样本考察

本发明通过反复实践和摸索提供一种同时测定三中待测物的液质联用方法，并对极性不同待测物提取回收率同时进行有效提取。此外，本发明对色谱条件进行优化，以解决前处理过程中加入的盐对待测物的离子干扰，使得所测定的方法操作简单、快速、灵敏、专属性强、重复性好，适合临床患者体内血样腺苷浓度的测定及其受替格瑞洛及替格瑞洛活性代谢物影响的研究。本发明的方法无需昂贵的设备和试剂，血样用量少，三种成分同时测定，效率高，成本低，适合常规治疗药物监测及相关临床研究，具有很好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）标准样品制备：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷，配制成腺苷浓度为110、55、11、5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛浓度为1600、800、160、80、48、32 ng/mL；替格瑞洛活性代谢物浓度为1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2 ng/mL的标准样品，所有溶液在4℃下保存，备用；

（2）标准曲线血浆样本的制备：取空白人正常血浆，先加入稳定剂：赤-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤, 双密达膜, 外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP , 乙二胺四乙酸，然后分别加入步骤（1）制得的标准样品，混匀，制成相应浓度的校正标样；

（3）待测血浆样本的制备：取全血样本加入含有肝素抗凝剂的样品管，立即加入稳定剂：赤-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤, 双密达膜, 外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP , 乙二胺四乙酸，涡旋混匀，离心，分离血浆，得待测血浆样本；

（4）血浆样品预处理：取步骤（2）或（3）制得的血浆样本先加入内标D⁷-替格瑞洛和15N-腺苷，然后加入用50%-70%乙腈溶解的30%高氯酸，涡旋后再加入缓冲液调节pH，离心处理后取上清液；

（5）标准曲线制作：将步骤（2）得到的校正标样按照步骤（4）制备上清液样品提取物进行液质联用技术分析测定，分别以替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷浓度为横坐标，替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线；

（6）定量分析：取待测全血样本，按照步骤（3）、（4）的方法处理后进行液质联用技术分析测定，并按照步骤（5）所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度；

所述活性代谢物为AR-C124910XX；

所述的方法，包括：A：同一质谱离子源下同时测定待测血浆样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度；B：同一色谱条件下同时测定待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷色谱峰；C：同一样品预处理方法实现血浆样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷不同极性待测物的提取；

所述A的测定方法为：用质谱中ESI源正离子MRM多反应监测模式，用于定量分析的离子对分别为m/z 523.4→153.2替格瑞洛、m/z 479.4 →153.2替格瑞洛活性代谢物和m/z268.2 → 136.2腺苷；所述A的测定条件为：质谱条件为：喷雾电压为5.5 kV，离子传输毛细管温度为650℃；Gas1N₂压力为90Arb,Gas2 N₂压力为60Arb，帘气N₂压力为 28Arb；碰撞气Ar 压力为 Medium；DP电压分别为38 eV腺苷、15eV¹⁵N-腺苷和70 eV替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛；CE电压分别为 25 eV腺苷、 15eV¹⁵N-腺苷和50 eV替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛；CXP电压分别为 2.3 eV; EP 电压分别为4eV;正离子方式检测；扫描方式为多反应监测 MRM；用于定量分析的离子对分别为： m/z 523.4→ 153.2替格瑞洛、m/z 479.4 → 153.2替格瑞洛活性代谢物、m/z 530.7→153.2D⁷-替格瑞洛, IS、m/z 268.2 →136.2腺苷和m/z 269.1→ 137.1¹⁵N-腺苷, IS；扫描时间为0.2 s；

所述B的测定方法为：用C₁₈分析柱和梯度洗脱，条件为：Zorbax SB-Aq C₁₈ column 250× 4.6 mmI.D.,5μm 色谱柱；流动相为甲醇-水含0.1%甲酸：0-4min：体积比5：95，4.1-10min：体积比80：20，10.1-20min：体积比5：95；流速为1 ml/min，柱温为30℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C的测定方法为：肝素抗凝的全血样本，立即加入稳定剂：赤-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤, 双密达膜 , 外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP , 乙二胺四乙酸，混匀，加入用50%-70%乙腈溶解的30%高氯酸，涡旋后加入缓冲液调节pH，离心后取上清液进样。

3.一种应用高效液相色谱技术同时检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的试剂盒，其特征在于，主要由：标准样品、校正标样、质控样品、稳定剂、沉淀剂、内标溶液、空白人正常血浆及色谱柱、流动相组成；

所述标准样品的制备方法为：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷，分别配制成腺苷浓度为110、55、11、 5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛1600、800、160、80、48、32 ng/mL；替格瑞洛活性代谢物1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2 ng/mL的标准样品，所有溶液在4℃下保存，备用；

所述校正标样的制备方法为：取空白人正常血浆，先加入稳定剂：赤-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤, 双密达膜, 外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP , 乙二胺四乙酸，然后分别加入上述的标准样品，混匀，制成相应浓度的校正标样；

所述质控样品的制备方法为：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷，分别配制成腺苷浓度为5.5、11、55 ng/mL；替格瑞洛为63、630、1260 ng/mL；替格瑞洛活性代谢物为49.5、495、990 ng/mL的质控样品，所有溶液在4℃下保存，备用；

所述稳定剂的制备方法为：含赤-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤, 双密达膜, 外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP , 乙二胺四乙酸的混合溶液，在4℃下保存，备用；

所述沉淀剂的制备方法为：50%-70%乙腈溶解30%高氯酸溶液；

所述内标溶液的制备方法为：一定浓度的D⁷-替格瑞洛和¹⁵N-腺苷混合溶液，在4℃下保存，备用；

所述色谱柱为：Zorbax SB-Aq C₁₈ column 250 × 4.6 mmI.D.,5μm 色谱柱；

所述流动相的制备方法为：甲醇、0.1%甲酸水溶液。

4.权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：取试剂盒中的标准样品、校正标样、质控样品、稳定剂、沉淀剂、内标溶液、空白人正常血浆及色谱柱、流动相进行液相色谱-质谱联用技术分析测定，分别以替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度为横坐标，替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线；待测样品按照权利要求1中步骤（3）和（4）相同方法处理后进样测定，并按所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度。

5.根据权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括A：同一质谱离子源下同时测定待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度；B：同一色谱条件下同时测定待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷三种待测物；C：同一样品预处理方法实现血浆样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷三种不同极性待测物的提取；

所述A的测定方法为：用质谱中ESI源正离子MRM模式，用于定量分析的离子对分别为m/z 523.4→ 153.2替格瑞洛、m/z 479.4 → 153.2替格瑞洛活性代谢物和 m/z 268.2 →136.2腺苷；测定条件为：质谱条件为：喷雾电压为 5.5 kV，离子传输毛细管温度为650℃；Gas1N₂压力为90Arb,Gas2N₂压力为60Arb，帘气N₂压力为 28Arb；碰撞气 Ar 压力为Medium；DP电压分别为38 eV腺苷、15eV¹⁵N-腺苷和70 eV替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛；CE电压分别为 25 eV腺苷、 15eV¹⁵N-腺苷和50 eV替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D⁷-替格瑞洛；CXP电压分别为 2.3 eV; EP 电压分别为4eV;正离子方式检测；扫描方式为多反应监测MRM；用于定量分析的离子对分别为：替格瑞洛：m/z 523.4→ 153.2、替格瑞洛活性代谢物：m/z 479.4 → 153.2、m/z 530.7→153.2D⁷-替格瑞洛, IS、m/z 268.2→136.2腺苷和m/z 269.1→ 137.1¹⁵N-腺苷, IS；扫描时间为0.2 s；

所述B的测定方法为：用C₁₈分析柱和梯度洗脱，条件为：Zorbax SB-Aq C₁₈ column 250× 4.6 mmI.D.,5μm 色谱柱；流动相为甲醇-水含0.1%甲酸：0-4min：体积比5：95，4.1-10min：体积比80：20，10.1-20min：体积比5：95；流速为1 ml/min，柱温为30℃；

所述C的测定方法为：肝素抗凝的全血样本，立即加入稳定剂，混匀，加入沉淀剂，涡旋后加入缓冲液调节pH，离心后取上清液进样。

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