CN115372499A - 一种检测替格瑞洛及其代谢物的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测替格瑞洛及其代谢物的试剂盒及方法,涉及生物检测领域。本发明提出并验证了一种新的能给对替格瑞洛及其代谢物同时进行测定的方法,避免了同一样本需要多次检测才能获得对应结果的问题;采用超高效液相色谱,较高效液相色谱而言,检测时间大大缩短,检测结果的准确度和稳定性均更高;且样本前处理方法简单,无需加稳定剂,可操作性强;无需昂贵的试剂,血样用量少,成本低,适合常规药物浓度监测及相关临床研究,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体而言,涉及一种检测替格瑞洛及其代谢物的试剂盒及方法。
背景技术
替格瑞洛是一种新型的血小板P2Y12受体拮抗剂,多部诊疗指南均推荐替格瑞洛为急性冠脉综合症患者抗血小板治疗的一线或首选药物。与氯吡格雷相比,替格瑞洛本身为活性形式可直接与P2Y12受体可逆结合。在体内替格瑞洛的主要代谢产物为AR-C124910XX和AR-C133913XX。临床研究显示,尽管替格瑞洛抗血小板效应强于氯吡格雷,其疗效存在较大个体差异,PLATO血小板亚组研究采用三种方法评价在性冠脉综合症患者中替格瑞洛的疗效,发现约有3%-27%的患者对替格瑞洛反应低下。也有研究表明亚洲ACS患者替格瑞洛的平均生物利用度较欧美人群患者高39%,其中日本患者的系统暴露量较欧美人群患者高20%。此外,随着替格瑞洛的广泛应用,其出血相关不良事件的报告也逐渐增加。一项纳入568例患者的单中心观察性队列研究发现,1年内的出血事件发生率高达30.3%,37 例患者通过降低用药剂量减少出血,由此推测替格瑞洛血药浓度可能与出血事件具有一定的相关性。但是目前尚无替格瑞洛在人群中血药浓度的报道,而且血药浓度与替格瑞洛的不良反应是否相关也尚不可知。因而一种准确、快速、稳定的同时测定替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX和 AR-C133913XX浓度方法,就十分重要。
目前国内外尚无文献发表关于超高效液相色谱-串联质谱快速技术同时且快速测定人体血浆中替格瑞洛及其代谢物AR-C124910XX和AR-C133913XX浓度的方法。已发表的方法多运用高效液相色谱或高效液相色谱-液质联用,检测方法用时较长,不适用于临床常规检测;或者只测定血浆中替格瑞洛及一个代谢物AR-C124910XX的浓度。由于 AR-C133913XX在体内的暴露量为替格瑞洛的10%-20%,其作用同样不可忽视。或者采用动物样本,导致所建方法的检测范围不适用于临床患者。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测替格瑞洛及其代谢物的试剂盒及方法。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了一种检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其包括:采用液相色谱串联质谱检测样本中的替格瑞洛及其代谢产物;所述色谱包括采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱;所述流动相 A为含甲酸的水溶液,其中,甲酸的体积分数为0.05%~0.2%;所述流动相 B包括乙腈溶液;所述洗脱的条件如下:0~1.5min,流动相A的体积百分比由80%~99%降至47%~67%,流动相B的体积百分比由1%~20%增至 33%~53%;1.5~3.8min,流动相A体积百分比维持在47%~67%,流动相B 体积百分比维持在33%~53%;3.8~3.81min,流动相A体积百分比由47%~67%降至1%~15%,流动相B体积百分比由33%~53%增至85%~99%;
3.81~4.5min,流动相A体积百分比维持在1%~15%,流动相B体积百分比维持在85%~99%;所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第二方面,本发明实施例提供了试剂组合在制备用于液相色谱串联质谱检测样本中替格瑞洛及其代谢物的试剂盒中的应用,所述试剂组合包括用于实施如前述实施例所述的试剂组合,所述试剂盒检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法如前述实施例所述。
第三方面,本发明实施例提供了一种检测样本中替格瑞洛及其代谢物的试剂盒,其包括如前述实施例所述的试剂组合,所述试剂盒检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法如前述实施例所述。
本发明具有以下有益效果:
本发明对替格瑞洛及其代谢物同时进行测定,避免同一样本需要多次检测的问题;采用超高效液相色谱,较高效液相色谱检测时间大大缩短,且检测结果的准确度和稳定性更高;样本前处理方法简单,无需加稳定剂,可操作性强;无需昂贵的试剂,血样用量少,成本低,适合常规药物浓度监测及相关临床研究,具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为替格瑞洛、AR-C124910XX、AR-C133913XX和内标的质谱图;
图2为替格瑞洛、AR-C124910XX、AR-C133913XX和内标的色谱图。 (A)服用替格瑞洛药物后的血浆(B)定量下限(C)未加标准品的空白血。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明在前人研究基础上进行创新,研究了一种采用超高效液相色谱- 串联质谱技术同时测定人体血浆中替格瑞洛及其代谢物AR-C124910XX和AR-C133913XX浓度的方法及其配套试剂盒。该方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确度、精密度、基质效应、回收率、残留、稳定性等方面的要求,具有操作简单,检测时间短,专属性好,准确度高等优点,可同时检测原药及主要代谢产物,对研究替格瑞洛血药浓度-治疗效果/不良反应的相关性,评价量效关系,乃至临床应用都具有重要的意义。
具体地,本发明实施例提供了一种检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其包括:采用液相色谱串联质谱检测样本中的替格瑞洛及其代谢产物;所述色谱包括采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱;所述流动相A 为含甲酸的水溶液,其中,甲酸的体积分数为0.05%~0.2%;所述流动相B 包括乙腈溶液。可选地,流动相A中甲酸的体积分数可以为0.05%、0.1%、 0.15%、0.2%中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述洗脱的条件如下:
0~1.5min,流动相A的体积百分比由80%~99%降至47%~67%,流动相B的体积百分比由1%~20%增至33%~53%;流动相B的体积百分比可以由1%、5%、10%、15%、20%中的任意一种或任意两种的组合增至33%、 35%、37%、39%、41%、43%、45%、47%、49%、51%、53%中的任意一种或任意两种之间的范围,流动相A对应变化。
1.5~3.8min,流动相A体积百分比维持在47%~67%,流动相B体积百分比维持在33%~53%;流动相B的体积百分比可以维持在33%、35%、37%、 39%、41%、43%、45%、47%、49%、51%、53%中的任意一种或任意两种之间的范围,流动相A对应变化。
3.8~3.81min,流动相A体积百分比由47%~67%降至1%~15%,流动相 B体积百分比由33%~53%增至85%~99%;流动相B的体积百分比可以由 33%、35%、37%、39%、41%、43%、45%、47%、49%、51%、53%中的任意一种或任意两种之间的范围增至85%、87%、89%、91%、93%、95%、 97%、99%中的任意一种或任意两种之间的范围,流动相A对应变化。
3.81~4.5min,流动相A体积百分比维持在1%~15%,流动相B体积百分比维持在85%~99%;流动相B体积百分比可以维持在85%、87%、89%、 91%、93%、95%、97%、99%中的任意一种或任意两种之间的范围,流动相A对应变化。
在一些优选实施例中,所述洗脱的条件如下:0~1.5min,流动相A的体积百分比由90%降至57%,流动相B的体积百分比由10%增至43%; 1.5~3.8min,流动相A体积百分比维持在57%,流动相B体积百分比维持在43%;3.8~3.81min,流动相A体积百分比由57%降至5%,流动相B体积百分比由43%增至95%;3.81~4.5min,流动相A体积百分比维持在5%,流动相B体积百分比维持在95%。
在一些实施例中,所述梯度洗脱的流速为0.2~0.6mL/min,具体可以为 0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min中的任意值。柱温箱温度分别设置为30℃、35℃、40℃。进样量设置为0.2μL、0.5μL、 1.0μL、2.0μL、5.0μL中的任意值。
在一些实施例中,所述色谱的条件如下:色谱柱为Waters ACQUITYTM BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)和Waters VanGuardTM预柱(1.7μm, 2.1×5mm),色谱柱的柱温为30~40℃,进样器温度为4~10℃,进样量为 0.2~5μL。
在一些实施例中,质谱采用ESI离子源,检测方式为正离子检测,扫描方式为多重反应监测,离子源温度为130~170℃,脱溶剂温度为450~550℃,脱溶剂气流速为700~900L/Hr,毛细管电压为2~4kV,锥孔反吹气流量 30~70L/Hr。在一些实施例中,质谱检测的离子对如下:替格瑞洛的离子对为523.0→153.0;AR-C124910XX的离子对为479.0→153.0;AR-C133913XX 的离子对为371.0→183.1。质谱检测的离子对还包括同位素内部的离子对: d7-替格瑞洛:530.4→153.1。
在一些实施例中,质谱的离子源参数包括:替格瑞洛的Cone电压为10-80V,优选为62V;AR-C124910XX的Cone电压为10-80V,优选为58V; AR-C133913XX的Cone电压为10-80V,优选为48V;d7-替格瑞洛的Cone 电压为10-80V,优选为46V;替格瑞洛的Collision电压为10-80V,优选为40V;AR-C124910XX的Collision电压为10-80V,优选为34V; AR-C133913XX的Collision电压为10-80V,优选为20V;d7-替格瑞洛的 Collision电压为10-80V,优选为40V;扫描时间设置为自动,即0.08s。
在一些实施例中,所述液相色谱串联质谱检测包括样本前处理步骤,所述样本前处理包括将待测样本、内标和沉淀剂混合以进行蛋白沉淀。
优选地,所述沉淀剂包括乙腈或甲醇,进行蛋白沉淀时,乙腈或甲醇的体积为200μL、300μL、400μL中的任意一种或任意两种之间的范围。
本发明实施例还提供了试剂组合在制备用于液相色谱串联质谱检测样本中替格瑞洛及其代谢物的试剂盒中的应用,所述试剂组合包括用于实施如前述任意实施例项所述的试剂组合,所述试剂盒检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法如前述任意实施例所述。
在一些实施例中,所述试剂组合包括:如前述任意实施例所述的流动相A、流动相B和沉淀剂。
在一些实施例中,所述试剂盒还包括替格瑞洛及其代谢物的校准品、质控品和内标,内标为氘代试剂。可选地,所述试剂盒还可以包括空白血浆、预柱和色谱柱中的至少一种。
在一些实施例中,所述试剂盒还包括:限定有如前述任意实施例所述方法的使用说明书。
本发明实施例还提供了一种检测样本中替格瑞洛及其代谢物的试剂盒,其包括如前述任意实施例所述的试剂组合,所述试剂盒检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法如前述任意实施例所述。
在一些实施例中,所述试剂盒还包括限定有如前述任意实施例所述方法的使用说明书。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1、材料和试剂
仪器:美国Waters公司Acquity TQD型超高效液相-串联质谱联用仪 (UPLC-MS/MS),配有Waters ACQUITYTM H-Class超高效液相色谱仪 (二元梯度泵-自动进样器-柱温箱-二极管阵列检测器),Waters SYNAPTTM G2 TQD三重四级杆电喷雾离子化电离源;
UPLC色谱柱:Waters ACQUITYTM BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7 μm),WatersVanGuardTM预柱(1.7μm,2.1×5mm);
S10P型超声波清洗器(ZEALWAY仪器有限公司);
Centrifuge 5415D型高速离心机(Eppendorf生命科学公司);
Sigma-3K15冷冻离心机(德国SIGMA公司);
XS205型十万分之一天平(METTLER TOLEDO公司);
QL-861涡旋仪(海门市其林贝尔仪器有限公司);
试剂:质谱级纯水,质谱级乙腈,质谱级甲醇购自美国赛默飞世尔科技公司;质谱级甲酸购自美国西格玛奥德里奇公司;
标准品:替格瑞洛、d7-替格瑞洛(Ticagrelor-d7)、AR-C124910XX和 AR-C133913XX均购自加拿大Toronto Research Chemicals Inc(纯度>98%)。
2、检测方法
(1)储备液的配制:分别精密称取三个标准品适量,分别置10mL量瓶内,加入甲醇溶解并定容至刻度,得到浓度约为75μg/mL(替格瑞洛),102 μg/mL(AR-C124910XX)和113μg/mL(AR-C133913XX)的各化合物储备液。以上溶液均4℃保存,备用。
(2)标准曲线溶液的配制:分别精密量取三个标准品储备液适量,混匀,用空白血浆逐级稀释,分别得到三个标准品浓度均为11.72、46.875、 93.75、187.5、750、2000、2500ng/mL的标准曲线溶液。以上溶液均-80℃保存,备用。
(3)质控溶液的配制:分别精密量取三个标准品储备液适量,混匀,用空白血浆逐级稀释,分别得到三个标准品浓度均为22.44、375、1500ng/mL 的低、中、高质控溶液。以上溶液均-80℃保存,备用。
(4)内标溶液的配制:精密称取d7-替格瑞洛适量,置10mL量瓶内,加入甲醇溶解并定容至刻度,得到浓度为50μg/mL内标储备液。用50%甲醇-水逐级稀释个内标溶液,得到1000ng/mL的稀释液。以上溶液均4℃保存,备用。
(5)沉淀剂:取10μL内标溶液(d7-替格瑞洛,1000ng/mL)加入到 200μL乙腈溶液中。以上溶液均4℃保存,备用。
(6)样本前处理:取100μL血浆样本,加入210μL沉淀剂,涡旋1min 沉淀蛋白,13000rpm离心5min,取250μL上清液,13000rpm离心5min。取150μL上清液置于仪器进样盘中待分析。
(7)超高效液相色谱柱和预柱:Waters ACQUITYTM BEH C18色谱柱 (2.1×50mm,1.7μm)和Waters VanGuardTM预柱(1.7μm,2.1×5mm)。
(8)超高效液相色谱条件:流动相为乙腈(B)-水(0.1%甲酸)(A);洗脱梯度(0~1.5min 10~43%B,1.5~3.8min 43%B,3.8~3.81min 43~95% B,3.81~4.5min 95%B);流速0.4mL/min;样本室温8℃;柱温30℃;进样量1.0L。
(9)质谱条件:电喷雾离子化电离源(ESI),正离子模式。毛细管电压3.0kV;离子源温度150℃;脱溶剂气温度500℃;氮气作为脱溶剂气和锥孔反吹气,脱溶剂气流量800L/Hr,锥孔反吹气流量50L/Hr。扫描方式为多反应监测(MRM)。用于定量分析的离子对分别为m/z523.0→153.0(替格瑞洛)、m/z 479.0→153.0(AR-C124910XX)、m/z 371.0→183.1 (AR-C133913XX)和m/z 530.4→153.1(d7-替格瑞洛);Cone电压分别为 62V(替格瑞洛)、58V(AR-C124910XX)、48V(AR-C133913XX)和46 V(d7-替格瑞洛);Collision电压分别为40V(替格瑞洛)、34V (AR-C124910XX)、20V(AR-C133913XX)和40V(d7-替格瑞洛);扫描时间均为0.08s。
替格瑞洛、AR-C124910XX、AR-C133913XX和内标的质谱图参照图 1。
(10)试剂盒主要由标准曲线溶液、质控溶液、沉淀剂、空白血浆、色谱柱、预柱和流动相组成。试剂盒的使用方法包括如下步骤:取试剂盒中的标准曲线溶液、质控溶液、沉淀剂和空白血浆,按(6)项下处理后,取色谱柱、预柱和流动相进行液质联用技术分析测定。采用加权最小二乘法(1/x2),分别以替格瑞洛及两个代谢物与内标峰面积之比为纵坐标(Y),以替格瑞洛及其活性代谢物浓度为横坐标(X),进行回归分析,获得标准曲线回归方程。
(11)方法学验证
专属性考察:取空白血浆各100μL,除内标溶液用50%甲醇-水替代外,其余按(6)项下所述方法处理,得处理后空白血浆样品。取定量下限(LLOQ) 样品。取100μL患者血浆,其余按(6)项下所述方法处理,得给药后血浆样品,分别进样分析。结果显示在设定的色谱条件下,干扰组分的响应低于分析物定量下限响应值的20%及内标物的5%,即三个分析物和内标物不受内源物的影响,有较好的分离度和选择性。结果具体见图2。
标准曲线考察:取用血浆稀释的不同浓度混标溶液100μL,其余按(6) 项下所述方法处理,得到不同浓度血浆样品。分别进样分析,连续测定3 个分析批,以待测成分的血浆浓度为横坐标,以待测成分与内标物的峰面积比再乘以内标物浓度为横坐标,经加权最小二乘法(W=1/X2)进行线性回归运算,得到标准曲线如下表所示。
表1血浆中分析物的回归数据
定量下限考察:取用血浆稀释的定量下限混标溶液100μL,其余按(6) 项下所述方法处理,得到LLOQ血浆样品,平行配制6份,并随行当天的标准曲线,计算其质量浓度、RE和RSD值,结果如下表所示。结果表明,替格瑞洛在11.72-2500ng/mL,AR-C124910XX在11.72-2000ng/mL,AR-C133913XX在11.72-2000ng/mL范围内线性良好且相对稳定,基本能够满足分析测试需要。分析物定量下限的RE均小于13.0%,RSD均小于 5.32%,符合测试要求。
表2血浆中分析物定量下限的精密度和准确度数据
精密度和准确度:取空白血浆100μL,分别加入定量下限、低、中、高三个浓度的标准对照液与内标溶液溶解,其余按(6)项下所述方法处理,每个浓度平行配置6份,计算日内精密度和准确度。连续3天测定3个批次,并随行当天标准曲线,根据当天的标准曲线计算该浓度下的QC样本的实测浓度,计算日间准确度和精密度。结果表明,在低、中、高三个浓度下,各待测物日内和日间的准确度和精密度良好,RSD均在于12.91%之内,说明该方法精密度好,准确度高。
表3血浆中分析物的批内、批间精密度和准确度
基质效应和回收率考察:取用血浆稀释的低、中、高三个浓度的混标溶液100μL,其余按(6)项下所述方法处理,每个浓度平行配置6份,分别进样分析得到的峰面积为A1。取相应浓度的混合对照品溶液及内标溶液,每个浓度平行配置6份,分别进样分析,得到的峰面积为A2。计算相同浓度的A1/A2×100%值,即为血浆样品对待测物的基质效应。各待测物的基质效应考察结果如下图所示。取空白血浆100μL,分别加入低、中、高三个浓度的标准对照液与内标溶液,按(6)项下所述方法处理,每个浓度平行配置6份,分别进样分析,得到的峰面积为A3。计算相同浓度的A3/A1× 100%值,即为待测物的提取回收率。结果表明,在低、中、高三个浓度下,各待测物的基质效应在88.06-112.68%范围内,提取回收率均在84.38%以上,且RSD值均在9.66%之内,说明该方法的基质效应不明显,回收率良好,符合生物样品测试要求。
表4血浆中分析物的基质效应和回收率
样品残留考察:取用血浆稀释的定量上限混标溶液100L,其余按(6) 项下所述方法处理,平行配置3份。连续测试3次定量上限样本,然后测试空白试剂溶液。结果显示在设定的色谱条件下,样品残留低于分析物定量下限响应值的20%及内标物的5%,即三个分析物和内标物不受样品残留的影响。
稳定性考察:室温放置稳定性考察:取低、中、高浓度QC样本,平行3份,室温下放置4小时后。按1.3项下所述方法处理,取上清液进行分析。长期保存稳定性考察:取低、中、高浓度QC样品,平行3份,放 -80℃中冷冻保存30天后,按(6)项下所述方法处理,取上清液进行分析,结果如下表所示。冻融稳定性考察:取低、中、高浓度QC样品,平行3份,-80℃中冷冻(≥12h),取出解冻,如此反复冻融3次,按(6)项下所述方法处理,取上清液进行分析。样品处理后稳定性考察:取低、中、高浓度QC样品,平行3份,按(6)项下所述方法处理,所得样品在进样器中放置24h,取上清液进行分析。结果表明三个分析物在上述条件下准确度为88.30-113.57%,RSD均小于13.51%,稳定性良好。
表5血浆中分析物的稳定性
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其特征在于,其包括:采用液相色谱串联质谱检测样本中的替格瑞洛及其代谢产物;
所述色谱包括采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱;所述流动相A为含甲酸的水溶液,其中,甲酸的体积分数为0.05%~0.2%;所述流动相B包括乙腈溶液;
所述洗脱的条件如下:
0~1.5min,流动相A的体积百分比由80%~99%降至47%~67%,流动相B的体积百分比由1%~20%增至33%~53%;
1.5~3.8min,流动相A体积百分比维持在47%~67%,流动相B体积百分比维持在33%~53%;
3.8~3.81min,流动相A体积百分比由47%~67%降至1%~15%,流动相B体积百分比由33%~53%增至85%~99%;
3.81~4.5min,流动相A体积百分比维持在1%~15%,流动相B体积百分比维持在85%~99%;
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
2.根据权利要求1所述的检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其特征在于,所述洗脱的条件如下:
0~1.5min,流动相A的体积百分比由90%降至57%,流动相B的体积百分比由10%增至43%;
1.5~3.8min,流动相A体积百分比维持在57%,流动相B体积百分比维持在43%;
3.8~3.81min,流动相A体积百分比由57%降至5%,流动相B体积百分比由43%增至95%;
3.81~4.5min,流动相A体积百分比维持在5%,流动相B体积百分比维持在95%;
优选地,所述梯度洗脱的流速为0.2~0.6mL/min;
优选地,所述色谱的条件如下:色谱柱为Waters ACQUITYTM BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)和Waters VanGuardTM预柱(1.7μm,2.1×5mm),色谱柱的柱温为30~40℃,进样器温度为4~10℃,进样量为0.1~5μL。
3.根据权利要求2所述的检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其特征在于,质谱采用ESI离子源,检测方式为正离子检测,扫描方式为多重反应监测,离子源温度为130~170℃,脱溶剂温度为450~550℃,脱溶剂气流速为700~900L/Hr,毛细管电压为2~4kV,锥孔反吹气流量30~70L/Hr。
4.根据权利要求1~3所述的检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其特征在于,所述代谢物包括AR-C124910XX和AR-C133913XX中的至少一种;
优选地,所述样本包括:含有全血样本和/或血浆样本的环境样本、全血样本以及血浆样本中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其特征在于,质谱检测的离子对如下:替格瑞洛的离子对为523.0→153.0;AR-C124910XX的离子对为479.0→153.0;AR-C133913XX的离子对为371.0→183.1。
6.根据权利要求4所述的检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法,其特征在于,所述液相色谱串联质谱检测包括样本前处理步骤,所述样本前处理包括将待测样本、内标和沉淀剂混合以进行蛋白沉淀;
优选地,所述沉淀剂包括乙腈或甲醇,进行蛋白沉淀时,乙腈或甲醇的体积为200-400μL。
7.试剂组合在制备用于液相色谱串联质谱检测样本中替格瑞洛及其代谢物的试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂组合包括用于实施如权利要求1~6任一项所述的试剂组合,所述试剂盒检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法如权利要求1~6任一项所述;
优选地,所述试剂组合包括:如权利要求1~6任一项所述的流动相A、流动相B和沉淀剂;
优选地,所述试剂盒还包括替格瑞洛及其代谢物的校准品、质控品和内标。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括:限定有如权利要求1~6任一项所述方法的使用说明书。
9.一种检测样本中替格瑞洛及其代谢物的试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求7所述的试剂组合,所述试剂盒检测样本中替格瑞洛及其代谢物的方法如权利要求1~6任一项所述。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括限定有如权利要求1~6任一项所述方法的使用说明书。
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