CN111812223A - 超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法 - Google Patents

超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗血小板药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗血小板药物的定量分析，为临床上抗血小板药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

Description

超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的 方法
技术领域
本发明属于血浆检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，具体药物为：替格瑞洛(Ticagrelor，TIC)、去羟乙氧基替格瑞洛(Deshydroxyethoxy Ticagrelor，DHTIC)、阿司匹林(Acetylsalicylic acid，ASA)、水杨酸(Salicylic acid，SA)、氯吡格雷(Clopidogrel，CLOP)和氯吡格雷羧酸代谢物(Clopidogrel Carboxylic Acid，CLOPC)。
背景技术
阿司匹林是一种常用的非甾体类药物，最初被用于解热镇痛，后来研究发现小剂量使用阿司匹林可以对血小板的聚集产生抑制作用，使血小板的粘附率降低，从而阻止血栓的形成，口服阿司匹林75mg被作为预防用药，被广泛用于缺血性心血管疾病的预防，同时低剂量使用时可用于心梗患者。作为预防用药常常需要长期使用，研究发现长期使用阿司匹林会增加出血、减少中性粒细胞等风险。阿司匹林在体内可以迅速代谢为水杨酸，导致体内阿司匹林含量较低，两种化合物浓度相差太大也给同时检测两种化合物造成很大的困难。传统的LC-MS方法和LC-UV的方法均不能同时检测两种物质。LC-MS/MS方法可以同时检测到体内的两种化合物。
替格瑞洛(TIC)是一种环戊基三唑嘧啶类药物，是一种独特的血小板聚集抑制剂，对P2Y12受体具有强效抑制作用，对ADP(二磷酸腺苷)诱导的血小板聚集反应能产生可逆的抑制作用，且具有一定的浓度依赖性。常被用于治疗抗血小板、降低胆固醇、控制血糖、控制血压等。TIC及其主要代谢物去氧乙基替格瑞洛(DHTIC)均表现出抗血小板特性，30-40％的吸收剂量的主要代谢物多为患者耐受良好，常被报道不良反应包括头晕、恶心、胸痛、呼吸困难和出血。与他汀类药物联用时可能会导致肌肉相关不良事件的风险增加。但是，与其他药物联合应用可能会有一定的效果导致危及生命的相互作用。因此,调查这些化合物的浓度在临床样本是必要的，因此需要开发一种同时测定TIC、及其代谢物的足够精确的方法。
氯吡格雷(CLOP)是一种噻吩并吡啶类衍生物，可以选择性的抑制二磷酸腺苷(ADP)与血小板受体的结合及继发ADP介导的糖蛋白GPI-Ib/IIIa复合物的活化，还能阻断其他种类胡激动剂通过释放ADP引起胡血小板活性的增强，最终达到抑制血小板聚集的目的。常被应用于中风近期发作的患者，以及心肌梗死肯确诊外周动脉疾病的患者，最终减少动脉粥样硬化事件的发生。氯吡格雷是一种前体药物，原形药物没有活性，前体药物主要经过肝脏进行代谢，其羧酸类代谢物(CLOPC)在血浆中药物相关化合物的85％，最高浓度出现时间约为在服药后1h出现，氯吡格雷及其代谢物在不同个体间浓度差异较大，因此需要进行准确的药物浓度监测。
目前综合分析国内外文献和专利，对这几种抗血小板药物的检测只是同时检测一种或者两种化合物，尚无同时检测这六种化合物的报道。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法。
本发明的技术方案如下：
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，
所述抗血小板药物分别为：替格瑞洛(TIC)、去羟乙氧基替格瑞洛(DHTIC)、阿司匹林(ASA)、水杨酸(SA)、氯吡格雷(CLOP)和氯吡格雷羧酸代谢物(CLOPC)；
上述抗血小板药物对应的同位素内标物分别为：替格瑞洛-d7(TIC-d7)、去羟乙氧基替格瑞洛-d7(DHTIC-d7)、阿司匹林-d4(ASA-d4)、水杨酸-d4(SA-d4)和氯吡格雷-d4(CLOP-d4)；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗血小板药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗血小板药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至40:60；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至95:5；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗血小板药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗血小板药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.001％～0.005％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.004％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.001％～0.01％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：WatersBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用替格瑞洛-d7(TIC-d7)、去羟乙氧基替格瑞洛-d7(DHTIC-d7)、阿司匹林-d4(ASA-d4)、水杨酸-d4(SA-d4)和氯吡格雷-d4(CLOP-d4)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中抗血小板药物时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为1～5μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物时，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.004％甲酸-水溶液；
流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL；
表1 流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B Curve
0.0 0.3 95 5 -
1.0 0.3 40 60 6
2.0 0.3 2 98 6
3.0 0.3 2 98 6
5.0 0.3 95 5 1
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了抗血小板药物及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
表2 抗血小板药物质谱参数
化合物 母离子 子离子 去簇电压(V) 碰撞电压(V) ESI(+/-)
CLOPC 308.0 198.0 4 14 ESI+
CLOP 322.1 212.0 4 9 ESI+
CLOP-d4 326.1 187.9 6 20 ESI+
DHTIC 479.2 126.9 12 24 ESI+
DHTIC-d7 486.2 126.9 56 56 ESI+
TIC 523.2 127.0 20 54 ESI+
TIC-d7 530.2 126.9 56 54 ESI+
ASA 136.7 93.0 34 14 ESI-
ASA-d4 140.6 97.0 24 14 ESI-
SA 136.9 93.0 38 14 ESI-
SA-d4 141.0 97.0 44 16 ESI-
本发明提及的血浆为人或动物血浆。
在一种方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液。
优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:4。
在一种优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:1～5)，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取60μL上清液。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为0.1～0.3:19.9～19.7。
在一种更优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为0.2:19.8。
在一种方案中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
将150μg/mL替格瑞洛-d7同位素内标母液、150μg/mL去羟乙氧基替格瑞洛-d7同位素内标母液、200μg/mL阿司匹林-d4同位素内标母液、200μg/mL水杨酸-d4同位素内标母液和2μg/mL氯吡格雷-d4同位素内标母液以乙腈水溶液配制成包含有1500ng/mL替格瑞洛-d7、1500ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛-d7、2000ng/mL阿司匹林-d4、2000ng/mL水杨酸-d4和20ng/mL氯吡格雷-d4的混合内标溶液；
取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
进一步地，制备混合内标溶液时，采用的乙腈水溶液为50％～95％乙腈水溶液；优选为70％～90％乙腈水溶液；更优选为80％乙腈水溶液。
在一种优选方案中，混合内标溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的抗血小板药物同位素内标母液，加入950μL 80％乙腈水溶液，混匀得到1mL混合内标溶液，浓度参下表3。
表3 混合内标溶液配制
组分 母液浓度(μg/mL) 移取体积(μL) 总体积(μL) 混合内标溶液浓度(ng/mL)
TIC-d7 150 10 1000 1500
DHTIC-d7 150 10 1000 1500
ASA-d4 200 10 1000 2000
SA-d4 200 10 1000 2000
CLOP-d4 2 10 1000 20
取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将2000μg/mL替格瑞洛标准品母液、1000μg/mL去羟乙氧基替格瑞洛标准品母液、2000μg/mL阿司匹林标准品母液、5000μg/mL水杨酸标准品母液、100μg/mL氯吡格雷标准品母液和100μg/mL氯吡格雷羧酸代谢物标准品母液以乙腈水溶液配制成包含有50000ng/mL替格瑞洛、50000ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、50000ng/mL阿司匹林、50000ng/mL水杨酸、1000ng/mL氯吡格雷和1000ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物的混合标准溶液；
将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
替格瑞洛、去羟乙氧基替格瑞洛、阿司匹林和水杨酸的浓度相同，七个浓度依次为：2500ng/mL、1250ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL和5ng/mL；
氯吡格雷和氯吡格雷羧酸代谢物的浓度相同，七个浓度依次为：50ng/mL、25ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL和0.1ng/mL。
进一步地，制备标准品溶液时，采用的乙腈水溶液为50％～95％乙腈水溶液；优选为70％～90％乙腈水溶液；更优选为80％乙腈水溶液。
更进一步地，制备标准品溶液时，空白血浆基质为无抗血小板药物的空白血浆。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的抗血小板药物标准母液，加入870μL 80％乙腈水溶液，充分混匀得到1mL混合标准溶液，浓度参下表4。
表4 混合标准溶液配制
Figure BDA0002518240970000061
Figure BDA0002518240970000071
采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出混合标准溶液后，涡旋10s，2min内使用混合标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存。配制过程如下：
取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点(S7)；取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度(S6)点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表5(单位：ng/mL)：
表5 标曲配制
标曲 移取溶液(μL) 空白血浆(μL) CLOP/CLOPC TIC/DHTIC/ASA/SA
S7 混合标准溶液10 190 50 2500
S6 S7 100 100 25 1250
S5 S7 20 180 5 250
S4 S6 20 180 2.5 125
S3 S5 20 180 0.5 25
S2 S4 20 180 0.25 12.5
S1 S3 50 200 0.1 5
每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
本发明提及的乙腈水溶液的浓度一般指体积浓度。
本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有抗血小板药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，
QC(L)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至5000倍(1:4999)；
QC(M)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至500倍(1:499)；
QC(H)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至50倍(1:49)。
优选地，空白血浆基质为无抗血小板药物的空白血浆。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准溶液以无抗血小板药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表6所示。
表6 抗血小板药物质控品对应浓度(单位ng/mL)
编号 组分 QC(L) QC(M) QC(H)
1 TIC 10 100 1000
2 DHTIC 10 100 1000
3 ASA 10 100 1000
4 SA 10 100 1000
5 CLOP 0.2 2 20
6 CLOPC 0.2 2 20
QC(L)中包含：10ng/mL替格瑞洛、10ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、10ng/mL阿司匹林、10ng/mL水杨酸、0.2ng/mL氯吡格雷和0.2ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物。
QC(M)中包含：100ng/mL替格瑞洛、100ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、100ng/mL阿司匹林、100ng/mL水杨酸、2ng/mL氯吡格雷和2ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物。
QC(H)中包含：1000ng/mL替格瑞洛、1000ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、1000ng/mL阿司匹林、1000ng/mL水杨酸、20ng/mL氯吡格雷和20ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物时，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗血小板药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗血小板药物的定量分析，为临床上抗血小板药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为抗血小板药物标准品的提取离子流色谱图；
图2为血浆样本中抗血小板药物的提取离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
方法学研究实验的样本来自南京鼓楼医院2019年12月份门诊收集的血浆样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表7。
序号 中文名称 厂家
1 替格瑞洛 TRC
2 替格瑞洛-d7 TRC
3 去羟乙氧基替格瑞洛 TRC
4 去羟乙氧基替格瑞洛-d7 TRC
5 阿司匹林 TRC
6 阿司匹林-d4 TRC
7 氯吡格雷 TRC
8 氯吡格雷-d4 TRC
9 氯吡格雷羧酸代谢物 TRC
10 水杨酸 TRC
11 水杨酸-d4 TRC
(4)质控品：含有抗血小板药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表6所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.004％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：WatersBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。各目标待测物的质谱采集参数见表2。
三、实验过程
(1)标准品配制：
将2000μg/mL替格瑞洛标准品母液、1000μg/mL去羟乙氧基替格瑞洛标准品母液、2000μg/mL阿司匹林标准品母液、5000μg/mL水杨酸标准品母液、100μg/mL氯吡格雷标准品母液和100μg/mL氯吡格雷羧酸代谢物标准品母液以80％乙腈水溶液配制成包含有50000ng/mL替格瑞洛、50000ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、50000ng/mL阿司匹林、50000ng/mL水杨酸、1000ng/mL氯吡格雷和1000ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物的混合标准溶液(详见表4)。
将上述混合标准溶液以空白血浆基质(无抗血小板药物的空白血浆)配制成七个不同浓度点的校准品溶液(详见表5)，各标曲点的浓度如表5中所列。所述校准品溶液的七个浓度点为：
替格瑞洛、去羟乙氧基替格瑞洛、阿司匹林和水杨酸的浓度相同，七个浓度依次为：2500ng/mL、1250ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL和5ng/mL；
氯吡格雷和氯吡格雷羧酸代谢物的浓度相同，七个浓度依次为：50ng/mL、25ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL和0.1ng/mL。
(2)含内标的蛋白沉淀剂配制
将150μg/mL替格瑞洛-d7同位素内标母液、150μg/mL去羟乙氧基替格瑞洛-d7同位素内标母液、200μg/mL阿司匹林-d4同位素内标母液、200μg/mL水杨酸-d4同位素内标母液和2μg/mL氯吡格雷-d4同位素内标母液以80％乙腈水溶液配制成包含有1500ng/mL替格瑞洛-d7、1500ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛-d7、2000ng/mL阿司匹林-d4、2000ng/mL水杨酸-d4和20ng/mL氯吡格雷-d4的混合内标溶液(详见表3)。取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
(3)质控品配制：
取上述混合标准溶液以空白血浆基质(无抗血小板药物的空白血浆)配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，详见表6。
QC(L)中包含：10ng/mL替格瑞洛、10ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、10ng/mL阿司匹林、10ng/mL水杨酸、0.2ng/mL氯吡格雷和0.2ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物。
QC(M)中包含：100ng/mL替格瑞洛、100ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、100ng/mL阿司匹林、100ng/mL水杨酸、2ng/mL氯吡格雷和2ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物。
QC(H)中包含：1000ng/mL替格瑞洛、1000ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、1000ng/mL阿司匹林、1000ng/mL水杨酸、20ng/mL氯吡格雷和20ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
2)血浆样品前处理：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4),高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血浆样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗血小板药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗血小板药物标准品的提取离子流色谱图；图2为血浆样本中抗血小板药物的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。抗血小板药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表8。
表8 抗血小板药物线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002518240970000111
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗血小板药物的加标回收率在87.64％-112.50％之间，5次重复试验的RSD在1.81％-8.01％范围，统计结果见表9。
表9 抗血小板药物加标回收率结果
Figure BDA0002518240970000121
4.精密度试验：取无干扰空白血浆样本，加入不同浓度抗血小板药物标准品，得到低、中、高三个浓度血浆样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗血小板药物的浓度，批内精密度为2.50-9.32％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.43-14.32％，结果见表10。
表10 批内批间精密度测试结果(浓度单位：ng/mL)
Figure BDA0002518240970000122
Figure BDA0002518240970000131
Figure BDA0002518240970000141
Figure BDA0002518240970000151
五、讨论
本发明建立了UPLC-MS/MS同时测定人体血浆中抗血小板药物的方法。血浆用量少(仅需50μL)且前处理简单，且一针分析多种物质只需5min，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗血小板药物的加标回收率为87.64％-112.50％之间，5次重复试验的RSD在1.81％-8.01，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗血小板药物批内精密度为2.50-9.32％，批间精密度为2.43-14.32％，方法的重现性良好。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆抗血小板药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗血小板药物的方法，
所述抗血小板药物分别为：替格瑞洛、去羟乙氧基替格瑞洛、阿司匹林、水杨酸、氯吡格雷和氯吡格雷羧酸代谢物；
上述抗血小板药物对应的同位素内标物分别为：替格瑞洛-d7、去羟乙氧基替格瑞洛-d7、阿司匹林-d4、水杨酸-d4和氯吡格雷-d4；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗血小板药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗血小板药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Waters BEH C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至40:60；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至95:5；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.001％～0.005％甲酸水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为35～45℃；进样体积为1～5μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.004％甲酸水溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物血浆。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5；更优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:4。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取60μL上清液；所述蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，
所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
将150μg/mL替格瑞洛-d7同位素内标母液、150μg/mL去羟乙氧基替格瑞洛-d7同位素内标母液、200μg/mL阿司匹林-d4同位素内标母液、200μg/mL水杨酸-d4同位素内标母液和2μg/mL氯吡格雷-d4同位素内标母液以乙腈水溶液配制成包含有1500ng/mL替格瑞洛-d7、1500ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛-d7、2000ng/mL阿司匹林-d4、2000ng/mL水杨酸-d4和20ng/mL氯吡格雷-d4的混合内标溶液；
取200μL混合内标溶液，加入19.8mL蛋白沉淀剂，混合均匀得含内标的蛋白沉淀剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述标准品按照如下方法制备：
将2000μg/mL替格瑞洛标准品母液、1000μg/mL去羟乙氧基替格瑞洛标准品母液、2000μg/mL阿司匹林标准品母液、5000μg/mL水杨酸标准品母液、100μg/mL氯吡格雷标准品母液和100μg/mL氯吡格雷羧酸代谢物标准品母液以乙腈水溶液配制成包含有50000ng/mL替格瑞洛、50000ng/mL去羟乙氧基替格瑞洛、50000ng/mL阿司匹林、50000ng/mL水杨酸、1000ng/mL氯吡格雷和1000ng/mL氯吡格雷羧酸代谢物的混合标准溶液；
将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
替格瑞洛、去羟乙氧基替格瑞洛、阿司匹林和水杨酸的浓度相同，七个浓度依次为：2500ng/mL、1250ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL和5ng/mL；
氯吡格雷和氯吡格雷羧酸代谢物的浓度相同，七个浓度依次为：50ng/mL、25ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL和0.1ng/mL。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，
所述乙腈水溶液为50％～95％乙腈水溶液；优选为70％～90％乙腈水溶液；更优选为80％乙腈水溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述空白血浆基质为无抗血小板药物的空白血浆。
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