CN111579679A - 一种抗肿瘤药物检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤药物检测试剂盒，属于药物分析技术领域。针对5种抗肿瘤药物甲氨喋呤、7‑羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛，采用超高效液相色谱串联质谱技术利用本发明的试剂盒进行血浆含量检测，前处理过程简单、灵敏度高、特异性强，且分析时间短，5 min之内完成5种抗肿瘤药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗肿瘤药物的高通量检测，为临床上抗肿瘤药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗肿瘤药物的试剂盒及其应用。
背景技术
治疗药物监测(TDM)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种方法。通过定量测定血液中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。因此，治疗药物的监测至关重要。
传统的微生物法费时且烦琐；而免疫分析法成本昂贵，专一性差，难以实现高通量检测，关键问题由于代谢产物的存在，抗体可能交叉反应使测定结果偏高。目前，液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)因特异性强、灵敏度高、高通量等优点已经成为TDM检测的黄金标准。
甲氨蝶呤(MTX)是一种叶酸还原酶抑制剂，为叶酸类抗肿瘤药物，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，临床上广泛用于治疗急性淋巴细胞性白血病、骨肉瘤、恶性淋巴瘤等。7-羟基甲氨蝶呤(7-OHMTX)为MTX的主要代谢产物，研究表明，7-OHMTX体内浓度水平与大剂量MTX给药后的急性肝脏毒性相关，所以同时监测MTX和7-OHMTX具有重要的临床意义。
氟尿嘧啶(5-FU)是一种常用的抗代谢类抗肿瘤药物，该药需较长时间与肿瘤组织接触才能发挥抑制及杀灭肿瘤细胞的作用，确保有效的血药浓度是治疗的关键。而5-FU在杀灭肿瘤细胞的同时对机体正常细胞也具杀伤作用，若剂量使用不当，可致临床疗效不佳或发生骨髓抑制等严重毒性反应，因此，开展5-FU治疗药物浓度监测对临床合理用药有着重要的指导意义。
多西他赛(DCT)又名多烯紫杉醇，和紫杉醇(PCT)的作用相同，是一类从短叶紫杉树皮中提取的天然产物，通过与肿瘤细胞的微管蛋白结合，促进微管蛋白形成稳定的微管，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖。临床上对乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌及卵巢癌等多种实体瘤具有较好的抑制活性。
目前，以上几种抗肿瘤药物的检测方法主要有高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)和LC-MS/MS。HPLC-UV法专属性较差、灵敏度较低、样本用量大，且分析时间长，而LC-MS/MS法多采用液液萃取法处理血浆，操作繁琐和耗时。比如，专利CN 105424843A公开了一种测定多西他赛或紫杉醇的高效液相色谱-三重四级杆质谱联用方法，该发明建立了ESI(-)和APCI(-)两种电离模式的质谱方法，采用液液萃取法处理样本，经过了萃取、氮吹和复溶的步骤，极大地增加了前处理时间。再比如，专利CN 110320302A公开了一种快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，该方法虽然前处理简单，但只测定了MTX的浓度，未监测主要代谢物7-OHMTX，而同时监测MTX和7-OHMTX才具有重要的临床意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种利用超高效液相色谱串联质谱技术同时测定血浆中5种常用抗肿瘤药物的试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种抗肿瘤药物检测试剂盒，所述抗肿瘤药物包括甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(7-hydroxy Methotrexate，HMTX)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)、紫杉醇(Paclitaxel，PCT)和多西他赛(Docetaxel，DCT)，该试剂盒包括：流动相、校准品溶液、混合内标液、蛋白质沉淀剂和质控品；
所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液、流动相B为乙腈；
所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的混合溶液；
所述混合内标液为浓度已知的由甲醇水溶液配制的甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、紫杉醇-d5(PCT-d5)和多西他赛-d5(DCT-d5)的混合溶液；
所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的混合溶液。
进一步地，所述流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，优选为0.1％甲酸水溶液。
进一步地，所述蛋白质沉淀剂为异丙醇或乙腈中一种或两种的混合液。
进一步地，所述蛋白质沉淀剂为异丙醇和乙腈的混合液，异丙醇和乙腈的体积比为1:2。
进一步地，所述校准品溶液包括7种浓度配比的混合液。
进一步地，所述混合内标液中甲氨喋呤-d3、7-羟基甲氨蝶呤-d3、氟尿嘧啶-13C,15N2、紫杉醇-d5和多西他赛-d5的浓度分别为：甲氨喋呤-d3 100ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤-d3 100ng/mL、氟尿嘧啶-13C,15N2 5000ng/mL、紫杉醇-d5 500ng/mL和多西他赛-d5500ng/mL。
进一步地，所述质控品包括低、中、高三个浓度配比的混合溶液。
上述试剂盒在采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗肿瘤药物中的应用。
有益效果：
1、采用本发明的试剂盒检测血浆中抗肿瘤药物，前处理操作简单、快捷、样本用量少、分析时间短，5min之内可完成血浆中5种常见抗肿瘤药物的分离和检测。
采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量；可同时满足临床上高通量样本检测需求，为临床上联合应用提供药动学参考。
附图说明
图1为实施例1中抗肿瘤药物的标准品提取离子流色谱图。
图2为实施例1的血浆中抗肿瘤药物的提取离子流色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种血浆中抗肿瘤药物的检测试剂盒，通过超高效液相色谱串联质谱技术，实现了在短时间内对抗肿瘤药物甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(7-hydroxy Methotrexate，HMTX)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)、紫杉醇(Paclitaxel，PCT)和多西他赛(Docetaxel，DCT)的分离和检测。
上述抗肿瘤药物对应的同位素内标物分别为：甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、紫杉醇-d5(PCT-d5)和多西他赛-d5(DCT-d5)。
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)流动相：
流动相A：水(含0.05％～0.15％甲酸)；流动相B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将包含有50μg/mL MTX、50μg/mL HMTX、50μg/mL 5-FU、10μg/mL PCT和10μg/mLDCT的混合标准品溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
MTX、HMTX和5-FU的浓度相同，依次为5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
PCT和DCT的浓度相同，依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
(3)混合内标液：
包含有100ng/mL MTX-d3、100ng/mL HMTX-d3、5000ng/mL 5-FU-13C,15N2、500ng/mL PCT-d5和500ng/mL DCT-d5的混合内标液；
(4)蛋白质沉淀剂：
异丙醇、乙腈或异丙醇和乙腈的混合溶剂；
(5)质控品：
含有抗肿瘤药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为中浓度质控QC(M)用空白血浆稀释10倍；
QC(M)为空白血浆稀释混合标准溶液500倍；
QC(H)为空白血浆稀释混合标准溶液50倍。
在一种优选方案中，上述流动相A为0.05％-0.15％甲酸水溶液，优选为0.1％甲酸水溶液。
在一种方案中，蛋白沉淀剂为异丙醇和乙腈的混合溶液，优选为异丙醇和乙腈体积比1:2的混合溶剂。
本发明提及的混合标准溶液按照如下方法制备：将1mg/mL的MTX、1mg/mL的HMTX、4mg/mL的5-FU、2mg/mL的PCT和2mg/mL的DCT以80％甲醇配制成含有50μg/mL MTX、50μg/mLHMTX、50μg/mL 5-FU、10μg/mL PCT和10μg/mL DCT的混合标准溶液。
本发明提及的混合内标液按照如下方法制备：将10μg/mL MTX-d3、10μg/mL HMTX-d3、500μg/mL 5-FU-13C,15N2、50μg/mL PCT-d5和10μg/mL DCT-d5的同位素内标母液以80％甲醇配制成含有100ng/mL MTX-d3、100ng/mL HMTX-d3、5000ng/mL 5-FU-13C,15N2、500ng/mL PCT-d5和500ng/mL DCT-d5的混合内标溶液。
本发明提及的基质为人或动物的血浆。
本发明提及的空白血浆基质为无抗肿瘤药物的空白血浆。
在一种优选方案中，所述试剂盒包含如下试剂：
(1)流动相：
流动相A：为0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将1mg/mL的MTX、1mg/mL的HMTX、4mg/mL的5-FU、2mg/mL的PCT和2mg/mL的DCT以80％甲醇配制成含有50μg/mL MTX、50μg/mL HMTX、50μg/mL 5-FU、10μg/mL PCT和10μg/mLDCT的混合标准溶液；将所述混合标准溶液以无抗肿瘤药物的空白血浆配制成七个不同浓度点的校准品溶液；
所述校准品溶液的七个浓度点为：
MTX、HMTX和5-FU的浓度相同，依次为5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
PCT和DCT的浓度相同，依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
(3)混合内标液：
将10μg/mL MTX-d3、10μg/mL HMTX-d3、500μg/mL 5-FU-13C,15N2、50μg/mL PCT-d5和10μg/mL DCT-d5的同位素内标母液以80％甲醇配制成含有100ng/mL MTX-d3、100ng/mL HMTX-d3、5000ng/mL 5-FU-13C,15N2、500ng/mL PCT-d5和500ng/mL DCT-d5的混合内标溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
异丙醇与乙腈的体积比1:2；
(5)质控品：
含有抗肿瘤药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：QC(L)为中浓度质控用空白血浆稀释10倍；QC(M)为空白血浆稀释混合标准溶液500倍；QC(H)为空白血浆稀释混合标准溶液50倍。
在一种更优选方案中，所述试剂盒包含如下试剂：
(1)流动相：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将1mg/mL的MTX、1mg/mL的HMTX、4mg/mL的5-FU、2mg/mL的PCT和2mg/mL的DCT以80％甲醇配制成含有50μg/mL MTX、50μg/mL HMTX、50μg/mL 5-FU、10μg/mL PCT和10μg/mLDCT的混合标准溶液；将所述混合标准溶液以无抗肿瘤药物的空白血浆配制成七个不同浓度点的校准品溶液：MTX、HMTX和5-FU的浓度相同，依次为5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；PCT和DCT的浓度相同，依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。
(3)混合内标液：
将10μg/mL MTX-d3、10μg/mL HMTX-d3、500μg/mL 5-FU-13C,15N2、50μg/mL PCT-d5和10μg/mL DCT-d5的同位素内标母液以80％甲醇配制成含有100ng/mL MTX-d3、100ng/mL HMTX-d3、5000ng/mL 5-FU-13C,15N2、500ng/mL PCT-d5和500ng/mL DCT-d5的混合内标溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
异丙醇乙腈的体积比1:2；
(5)质控品：
取上述混合标准溶液以无抗肿瘤药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中抗肿瘤药物质控品对应浓度见表1；
表1抗肿瘤药物质控品对应浓度(单位ng/mL)
QC(L)中包含：10ng/mL MTX、10ng/mL HMTX、10ng/mL 5-FU、2ng/mL PCT、2ng/mLDCT；
QC(M)中包含：100ng/mL MTX、100ng/mL HMTX、100ng/mL 5-FU、20ng/mL PCT、20ng/mL DCT；
QC(H)中包含：1000ng/mL MTX、1000ng/mL HMTX、1000ng/mL 5-FU、200ng/mL PCT、200ng/mL DCT。
在一种更优选方案中，混合内标液按照如下方法制备：
将10μg/mL MTX-d3、10μg/mL HMTX-d3、500μg/mL 5-FU-13C,15N2、50μg/mL PCT-d5和10μg/mL DCT-d5的同位素内标母液以80％甲醇配制成含有100ng/mL MTX-d3、100ng/mL HMTX-d3、5000ng/mL 5-FU-13C,15N2、500ng/mL PCT-d5和500ng/mL DCT-d5的混合内标液。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。
在一种更优选方案中，校准品溶液按照如下方法制备：
采用梯度稀释法进行校准品的配制，从-20℃冰箱取出混合标准溶液后，涡旋10s，2min内使用混合标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后将混合标准溶液放入-80℃保存。
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗肿瘤药物的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗肿瘤药物的方法，
所述抗肿瘤药物分别为：甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(7-hydroxy Methotrexate，HMTX)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)、紫杉醇(Paclitaxel，PCT)和多西他赛(Docetaxel，DCT)；
上述抗肿瘤药物对应的同位素内标物分别为：MTX-d3、HMTX-d3、5-FU-13C,15N2、PCT-d5和DCT-d5；
血浆加入含内标的蛋白沉淀剂，离心后进样，先利用超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗肿瘤药物的含量。具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：水(含0.1％甲酸)；
流动相B：乙腈；
色谱柱：ACQUITY UPLC HSST3(2.1×100mm,1.8μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1。流速为0.3mL/min，每个样品采集时间为5min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗肿瘤药物的灵敏度更高，前处理过程简单，分析时间短，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗肿瘤药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.05％～0.15％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：ACQUITYUPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用待测物的稳定同位素作为内标，所选内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中抗肿瘤药物时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为30～50℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为0.2～10μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗肿瘤药物时，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：水(含0.1％甲酸)；
流动相B：乙腈；
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下(见表2)：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1。流速为0.3mL/min，每个样品采集时间为5min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
表2流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标；各个目标物的去簇电压和碰撞电压等参数见表3；
表3抗肿瘤药物检测质谱参数
本发明提及的血浆为人或动物血浆。
在一种方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液；其中，含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，蛋白质沉淀剂为异丙醇与乙腈的混合溶液。
优选地，蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:1～1:3，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:2。
在一种优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:1～1:3)，在12000～15000r/min，1～15℃离心4～10min后，取60μL上清液至塑料内衬管中，待进样。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂体积比为0.1～0.3：19.7～19.9。
在一种更优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂体积比为0.2：19.8，下同。
在一种方案中，混合内标液按照如下方法制备：
将10μg/mL MTX-d3、10μg/mL HMTX-d3、500μg/mL 5-FU-13C,15N2、50μg/mL PCT-d5和10μg/mL DCT-d5的同位素内标母液以80％甲醇配制成含有100ng/mL MTX-d3、100ng/mL HMTX-d3、5000ng/mL 5-FU-13C,15N2、500ng/mL PCT-d5和500ng/mL DCT-d5的混合内标溶液。
在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将1mg/mL的MTX、1mg/mL的HMTX、4mg/mL的5-FU、2mg/mL的PCT和2mg/mL的DCT以80％甲醇配制成含有50μg/mL MTX、50μg/mL HMTX、50μg/mL 5-FU、10μg/mL PCT和10μg/mLDCT的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。
所述校准品溶液的七个浓度点为：
MTX、HMTX和5-FU的浓度相同，依次为5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
PCT和DCT的浓度相同，依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
每个浓度的校准品样本取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇：乙腈(V/V)＝1:2)，高速振荡(最大振速)5min；14000r/min 4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一、实验材料与仪器
方法学研究实验的样本来自于武汉亚洲心脏病医院2019年11月份门诊收集的血浆样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；色谱柱ACQUITYUPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)。
(3)标准品：本发明涉及的抗肿瘤药物及其同位素内标均购自于TRC。
(4)质控品：含有本发明涉及的抗肿瘤药物分子的血浆溶液，分低中高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表1所示。
试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为标准液、质控品和混合内标液；右边放置25mL蛋白沉淀剂。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：水(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ACQUITYUPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表2。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)/2.5kV(ESI-)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标，各目标物的去簇电压和碰撞电压等参数见表3。
三、实验过程
(1)标准品配制：
依次取50μL 1mg/mL的MTX、50μL 1mg/mL的HMTX、12.5μL 4mg/mL的5-FU、5μL 2mg/mL的PCT和5μL 2mg/mL的DCT母液，加入877.5μL 80％甲醇，配制成1mL含有50μg/mL MTX、50μg/mL HMTX、50μg/mL 5-FU、10μg/mL PCT和10μg/mL DCT的混合标准溶液。
(2)标曲的配制：
将上述混合标准品溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。
所述校准品溶液的七个浓度点为：
MTX、HMTX和5-FU的浓度相同，依次为5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
PCT和DCT的浓度相同，依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
混合内标液配制：
将10μg/mL MTX-d3、10μg/mL HMTX-d3、500μg/mL 5-FU-13C,15N2、50μg/mL PCT-d5和10μg/mL DCT-d5的同位素内标母液以80％甲醇配制成含有100ng/mL MTX-d3、100ng/mL HMTX-d3、5000ng/mL 5-FU-13C,15N2、500ng/mL PCT-d5和500ng/mL DCT-d5的混合内标溶液。
(4)质控品的配制：
含有抗肿瘤药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：QC(L)为中浓度质控用混合血浆稀释10倍；QC(M)为混合血浆稀释混合标准溶液500倍；QC(H)为混合血浆稀释混合标准溶液50倍。
QC(L)中包含：10ng/mL MTX、10ng/mL HMTX、10ng/mL 5-FU、2ng/mL PCT、2ng/mLDCT；
QC(M)中包含：100ng/mL MTX、100ng/mL HMTX、100ng/mL 5-FU、20ng/mL PCT、20ng/mL DCT；
QC(H)中包含：1000ng/mL MTX、1000ng/mL HMTX、1000ng/mL 5-FU、200ng/mL PCT、200ng/mL DCT。
(5)样品处理
1)校准品前处理：每个浓度校准品样本取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇/乙腈＝1:2(V/V))，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
2)血浆样品前处理：
取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇/乙腈＝1:2(V/V))，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
3)质控品前处理：
分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后跟血浆样品前处理方法一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表4。
表4抗肿瘤药物分析试剂盒组分的制备(100人份)
备注：所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备，取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗肿瘤药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗肿瘤药物的提取离子流色谱图，图2为血浆中抗肿瘤药物的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。抗肿瘤药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.999以上，满足定量要求，见表5。
表5抗肿瘤药物线性回归方程及线性相关系数
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血浆样品，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果经计算如表5所示。结果显示，抗肿瘤药物的加标回收率在95.46％-104.79％之间，5次重复试验的RSD在4.82％-10.44％范围，统计结果见表6。
表6抗肿瘤药物加标回收率结果
4.精密度试验：取无干扰空白血浆样本，加入不同浓度抗肿瘤药物混合标准品，得到低、中、高三个浓度血浆质控样本，一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定抗肿瘤药物的浓度，批内精密度为4.96-10.79％，三日内分3批处理，计算批间精密度为5.04-10.03％，结果见表7。
表7批内批间精密度测试结果
本发明的试剂盒采用高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定人体血浆中的甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛5种常见的抗肿瘤药物的方法。本发明前处理简单快捷，血浆用量少、分析时间短，只需5min即可完成5种抗肿瘤药物的检测。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗肿瘤药物的加标回收率为95.46％-104.79％之间，5次重复试验的RSD为4.82％-10.44，准确度良好。重现性结果表明，抗肿瘤药物批内精密度为4.96-10.79％，批间精密度为5.04-10.03％，方法的重现性良好。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆抗肿瘤药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种抗肿瘤药物检测试剂盒，其特征在于：所述抗肿瘤药物包括甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛，该试剂盒包括：流动相、校准品溶液、混合内标液、蛋白质沉淀剂和质控品；
所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液、流动相B为乙腈；
所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的混合溶液；
所述混合内标液为浓度已知的由甲醇水溶液配制的甲氨喋呤-d3、7-羟基甲氨蝶呤-d3、氟尿嘧啶-13C,15N2、紫杉醇-d5和多西他赛-d5的混合溶液；
所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.05%~0.15%甲酸水溶液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.1%甲酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质沉淀剂为异丙醇或乙腈中一种或两种的混合液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质沉淀剂为异丙醇和乙腈的混合液，异丙醇和乙腈的体积比为1:1~1:3。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品溶液包括以下7种浓度配比的混合液：
混合液1：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤5 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤5 ng/mL、氟尿嘧啶5 ng/mL、紫杉醇1 ng/mL、多西他赛1 ng/mL；
混合液2：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤12.5 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤12.5 ng/mL、氟尿嘧啶12.5 ng/mL、紫杉醇2.5 ng/mL、多西他赛2.5 ng/mL；
混合液3：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤25 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤25 ng/mL、氟尿嘧啶25 ng/mL、紫杉醇5 ng/mL、多西他赛5ng/mL；
混合液4：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤125 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤125 ng/mL、氟尿嘧啶125 ng/mL、紫杉醇25 ng/mL、多西他赛25 ng/mL；
混合液5：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤250 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤250 ng/mL、氟尿嘧啶250 ng/mL、紫杉醇50 ng/mL、多西他赛50 ng/mL；
混合液6：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤1250 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤1250 ng/mL、氟尿嘧啶1250 ng/mL、紫杉醇250 ng/mL、多西他赛250 ng/mL；
混合液7：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤2500 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤2500 ng/mL、氟尿嘧啶2500 ng/mL、紫杉醇500 ng/mL、多西他赛500 ng/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述混合内标液中甲氨喋呤-d3、7-羟基甲氨蝶呤-d3、氟尿嘧啶-13C,15N2、紫杉醇-d5和多西他赛-d5的浓度分别为：甲氨喋呤-d3100 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤-d3 100 ng/mL、氟尿嘧啶-13C,15N2 5000 ng/mL、紫杉醇-d5500 ng/mL和多西他赛-d5 500 ng/mL。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述质控品包括以下三种混合溶液：
低浓度质控品：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤10 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤10 ng/mL、氟尿嘧啶10 ng/mL、紫杉醇5 ng/mL、多西他赛5 ng/mL；
中浓度质控品：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤100 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤100 ng/mL、氟尿嘧啶100 ng/mL、紫杉醇20 ng/mL、多西他赛20 ng/mL；
高浓度质控品：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛的浓度分别为甲氨喋呤1000 ng/mL、7-羟基甲氨蝶呤1000 ng/mL、氟尿嘧啶1000 ng/mL、紫杉醇200ng/mL、多西他赛200 ng/mL。
9.权利要求1所述的试剂盒在采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述混合内标液先和蛋白质沉淀剂混合成含内标的蛋白沉淀剂后再用于检测，混合内标液先和蛋白质沉淀剂的体积比为0.1~0.3：19.7~19.9。
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