CN114740127A - 一种基于lc-ms/ms检测5种抗肿瘤药物的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LC‑MS/MS检测生物样本中抗肿瘤药物的试剂盒及方法，属于LC‑MS/MS检测技术领域。所述试剂盒包括外标溶液和内标溶液，所述外标溶液包括甲氨蝶呤、7‑羟基甲氨蝶呤、伊立替康、紫杉醇和多烯紫杉醇，所述内标溶液包括紫杉醇。本发明可用于进行药物监测，制备药物时间监测曲线，通过谷浓度和峰浓度两个时间点进行药物浓度监测，从而能够在提升方法灵敏度和选择性的同时，缩短分析时间以提升分析的通量。

Description

一种基于LC-MS/MS检测5种抗肿瘤药物的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测技术领域，具体地，涉及一种基于LC-MS/MS检测5种抗肿瘤药物的试剂盒和方法。

背景技术

目前全球各个国家或地区已批准上市的抗癌药物大约有130～150种。用这些药物配制成的各种抗癌药物制剂大约有1300～1500种。抗肿瘤药物浓度监测技术广泛应用于临床药物毒理研究，观察药物效果与作用及诊断犯罪。特别是临床毒理研究，通常利用药物浓度监测寻找最佳治疗浓度，同时避免过度剂量的毒性风险。

由于抗肿瘤药物在药代动学上的个体差异明显(年龄，性别，遗传学，身体状况及疾病状况等)，体内血药浓度与临床疗效和不良反应密切相关，检测其血药浓度从而调整剂量，减少不良反应，在临床用药中具有重大意义。

传统方法一般为酶免法或高效液相色谱法，前者存在交叉干扰问题，不能得到准确定量结果，后者存在前处理复杂，最低定量下限较大，分析时间长，消耗大量有机溶剂等问题。并且，传统方法不适用于多种肿瘤药物的同时测量，并且前处理过程比较繁琐复杂，费时费力，以及色谱运行时间较长，不利于大批量临床研究样品的测定。

目前，同时检测多种药物通常采用LC-MS/MS方法，然而，大多数LC-MS/MS方法都采用氘代等内标用来校正基质效应等影响，此类内标成本较高，会直接导致整个方法的成本较高，在同时检测多种药物时，总是会存在多种目标物灵敏度相对较低的问题。另外，现有技术多为一种或2种药物同时测定，通量低，影响了检测的效率。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在将高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)与外标法和内标法相结合，建立一种快速、灵敏的同时测定5种抗肿瘤药物血清的检测试剂盒和方法。为了达到该目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种基于LC-MS/MS检测生物样本中抗肿瘤药物的试剂盒，包括外标溶液和内标溶液，所述外标溶液包括甲氨蝶呤、7-羟基甲氨蝶呤、伊立替康、紫杉醇和多烯紫杉醇，所述内标溶液包括紫杉醇。

进一步地，所述外标溶液中各标准品的浓度(mg/mL)分别为0.0505～0.101、0.03995～0.0799、0.02815～0.0563、0.0208～0.0416和0.02035～0.0407，所述内标溶液中紫杉醇的浓度为0.0585～0.117μg/mL。

在本发明的一些实施方案中，所述外标溶液中各标准品的浓度(mg/mL)分别为0.101、0.0799、0.0563、0.0416和0.0407，所述内标溶液中紫杉醇的浓度为0.117μg/mL。

本发明的第二方面提供一种基于LC-MS/MS检测生物样本中抗肿瘤药物的方法，包括以下步骤：

S1，利用权利要求1所述的试剂盒中的外标溶液制备标准曲线工作液和质控样品；

S2，在待测生物样本中加入沉淀剂，离心后吸取上清液进行LC-MS/MS检测，

其中，所述沉淀剂为甲醇。

进一步地，步骤S2中，进行LC-MS/MS检测的参数为：

(1)色谱条件：

流动相A：0.01％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：0.01％～0.2％甲酸的乙腈：甲醇(1：1，v/v)溶液；

流速0.2～0.4mL/min，柱温为30℃，进样2μL，梯度洗脱程序为：0～0.5min，流动相B液10％；0.5～1.5min，流动相B液升高到90％；1.5～2.0min，流动相B液维持90％；2.2min，流动相B液降到10％；2.2min～3.0min，流动相B液维持10％，

(2)质谱条件：

离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：1.0～3.5KV；脱溶剂气温度：400～500℃；脱溶剂气流速：800～1000L/Hr；离子源温度：130～150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar；扫描模式：多。

在本发明中，所述方法为基于非诊断和治疗目的的方法。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下技术效果：

本发明基于通过三重四级杆质谱联用，通过检测二级质谱按照质荷比(m/z)检测碎裂离子，从而实现两次更高灵敏度和特异性地检测。

利用本发明进行检测，各本发明的各化合物色谱干扰峰较少，可得到基线分离，专属性强、重现性高，选择性优。

利用本发明进行检测，速度快，检测时间为3.0min，适合大批量临床研究样品分析。

利用本发明进行检测，紫杉醇和多烯紫杉醇采用内标法定量，其他外标法定量，减少了有机溶剂的用量进而降低对环境的污染。

本发明通过两点取样药时曲线AUC的监测，实现更准确地定量。

利用本发明的试剂盒和方法，可以监测筛选人体血液中抗肿瘤药物浓度。药物监测的意义重大，广泛应用于临床药物毒理研究，观察药物效果与作用。特别是临床毒理研究，利用药物浓度监测寻找最佳治疗浓度，同时避免过度剂量的不良反应风险。

附图说明

图1示出了本发明一个实施例中甲氨蝶呤的检测谱图。

图2示出了本发明一个实施例中7-羟基甲氨蝶呤的检测谱图。

图3示出了本发明一个实施例中伊立替康的检测谱图。

图4示出了本发明一个实施例中紫杉醇的检测谱图。

图5示出了本发明一个实施例中多烯紫杉醇的检测谱图。

图6示出了本发明一个实施例中紫杉醇内标的检测谱图。

图7示出了本发明一个实施例中甲氨蝶呤的标准曲线图。

图8示出了本发明一个实施例中7-羟基甲氨蝶呤的标准曲线图。

图9示出了本发明一个实施例中伊立替康的标准曲线图。

图10示出了本发明一个实施例中紫杉醇的标准曲线图。

图11示出了本发明一个实施例中多烯紫杉醇的标准曲线图。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1标准工作液和质控样品准备

1.标准工作液制备

本发明拟对5种抗肿瘤药物进行检测，选择标准品分别为：甲氨蝶呤、7-羟基甲氨蝶呤、伊立替康、紫杉醇和多烯紫杉醇。其中，紫杉醇和多烯紫杉醇利用内标法定量，其他利用外标法定量，紫杉醇和多烯紫杉醇2种抗肿瘤药物共用一个内标溶液——[2H5]-紫杉醇内标溶液，将5种标准品和内标分别制备成单标储备液，如表1所示，单标储备液用后密封保存于-80℃冰箱。

表1单标储备液的配制

对于外标标准品，利用单标储备液配制混标储备液(M0)，配制方法见表2，配制后密封保存于-80℃冰箱备用。

表2混标储备液(M0)的配制

内标溶液中[2H5]-紫杉醇的浓度为0.117μg/mL。

利用混标储备液配制混合标准工作液即外标溶液(W1)，配制方法如表3所示：

表3外标溶液(W1)的配制

空白基质为过滤人血清。

将外标溶液W1逐级稀释得到8个浓度的标准曲线工作液样品，配制方法见表4，50μL分装后密封保存于-80℃冰箱。

表4标准曲线工作液的配制

2.质控样品制备

用空白基质稀释外标溶液W1，分别得到高浓度质控(HQC)、中浓度质控(MQC)和低浓度质控(LQC)样品，配制方法见表5。配制后按照每个样品50μL分装于1.5mL离心管中，现用现配。

表5质控样品配制

实施例2待测样本的处理

1.检测血液的离心

获得的血液必须在2h内采用离心沉淀法(4000rpm，10min)分离血浆，分装。

2.样本的前处理

(1)精密移取样本(除待测样本外，还包括实施例1中标准曲线工作液样品、质控样品和空白基质)200μL置于洁净的1.5mL离心管中；

(2)加入0.2～1mL沉淀剂溶液(含[2H5]-紫杉醇内标浓度为0.117μg/mL的甲醇溶液)，使用MTV-100多管漩涡混合器2000rpm条件下涡旋震荡5min；

(3)使用Sigma离心机(24/48孔)在8℃且转速不低于13000rpm条件下离心5min；

(4)使用移液器转移150μL上清液到96孔进样板内(注意移液器吸头没入溶液深度，防止吸入沉淀)，置于-20℃冷冻供质谱进样。

实施例3标准曲线的制备

将实施例1中5种不同浓度的标准曲线工作液20～100μL分别和300～1900μL过滤人血清混合制成标准工作血药溶液，按照实施2的步骤进行前处理后进仪器进行检测，得出上述5种标准品的混合标准液和紫杉醇内标色谱图，在色谱图中分别得到标准品目标物峰面积和内标物峰面积。紫杉醇、多烯紫杉醇以标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以标准工作液配制后血浆中待测目标物血药浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，甲氨蝶呤、7-羟基甲氨蝶呤和伊立替康，以标准品目标物峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以标准工作液配制后血浆中待测目标物血药浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝a×x+b，并且得出权重系数a和b。

实施例4待测样品的测定

1.色谱条件

仪器设备：Sciex 4500MD三重四级杆质谱仪(美国，Sciex公司)，包括岛津高效液相色谱系统(日本，Shimadzu Scientific公司)。

色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)；

流动相A：0.01％甲酸水溶液；

流动相B：0.01％甲酸的乙腈：甲醇(1：1，v/v)溶液；

流速0.3mL/min，柱温为30℃，进样2μL，梯度洗脱程序为：0～0.5min，流动相B液10％；0.5～1.5min，流动相B液升高到90％；1.5～2.0min，流动相B液维持90％；2.2min，流动相B液降到10％；2.2min～3.0min，流动相B液维持10％。

2.质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子模式；

毛细管电压：1.0～3.5KV；

脱溶剂气温度：400～500℃；

脱溶剂气流速：800～1000L/Hr；

离子源温度：130～150℃；

脱溶剂气压力：8bar；

碰撞气压力：0.7bar；

扫描模式：多。

反应监测，在3分钟内分离甲氨蝶呤，7-羟基甲氨蝶呤，伊立替康，紫杉醇，多烯紫杉醇。甲氨蝶呤定量分析离子对m/z 455.4→308.2(如图1所示)，7-羟基甲氨蝶呤定量分析离子对m/z 471.2→191.16(如图2所示)，伊立替康定量分析离子对m/z587.2→167.11(如图3所示)，紫杉醇定量分析离子对m/z 876.5→308.3(如图4所示)，多烯紫杉醇定量分析离子对m/z 830.5→304.14(如图5所示)。紫杉醇内标定量分析离子对m/z 881.5→591.2(如图6所示)。

按上述方法得到标准曲线，结果表明，各标准品的线性范围如下：

(1)线性范围：甲氨蝶呤在50.500ng/mL到5050.000ng/mL线性良好，相关系数R2>0.99(如图7所示)；7-羟基甲氨蝶呤在39.978ng/mL到3997.833ng/mL线性良好，相关系数R2>0.99(如图8所示)；伊立替康在28ng/mL到2800ng/mL线性良好，相关系数R2>0.99(如图9所示)；紫杉醇和多烯紫杉醇在20ng/mL到2000ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2>0.99(如图10、图11所示)。

实施例5方法的准确度和精密度验证

利用质控样品(HQC、MQC、LQC)进行准确度和精密度实验，按实施例2进行前处理，按实施例4的方法进行测定，重复测定3个批次，其在高、中、低3个浓度水平内的批内准确度(偏差为-5.0％～8.7％)，批内精密度(CV为1.4％～7.6％)均<15％，满足要求。

实施例6血液样本的检测

利用本发明建立的检测方法，对不同样本进行检测，检测结果如表6所示。

检测结果均在线性范围内。

综合所述，本发明建立了一种快速、灵敏的同时测定5种抗肿瘤药物的检测技术方案。本发明在满足准确度和精密度等各项技术指标的前提下，仅需3min即可完成检测。本发明可用于进行药物监测，制备药物时间监测曲线，通过谷浓度和峰浓度两个时间点进行药物浓度监测，从而能够在提升方法灵敏度和选择性的同时，缩短分析时间以提升分析的通量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种基于LC-MS/MS检测生物样本中抗肿瘤药物的试剂盒，其特征在于，包括外标溶液和内标溶液，所述外标溶液包括甲氨蝶呤、7-羟基甲氨蝶呤、伊立替康、紫杉醇和多烯紫杉醇，所述内标溶液包括紫杉醇。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述外标溶液中各标准品的浓度(mg/mL)分别为0.0505～0.101、0.03995～0.0799、0.02815～0.0563、0.0208～0.0416和0.02035～0.0407，所述内标溶液中紫杉醇的浓度为0.0585～0.117μg/mL。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述外标溶液中各标准品的浓度(mg/mL)分别为0.101、0.0799、0.0563、0.0416和0.0407，所述内标溶液中紫杉醇的浓度为0.117μg/mL。

4.一种基于LC-MS/MS检测生物样本中抗肿瘤药物的方法，包括以下步骤：

S1，利用权利要求1所述的试剂盒中的外标溶液制备标准曲线工作液和质控样品；

S2，在待测生物样本中加入沉淀剂，离心后吸取上清液进行LC-MS/MS检测，

其中，所述沉淀剂为甲醇。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，进行LC-MS/MS检测的参数为：

(1)色谱条件：

流动相A：0.01％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：0.01％～0.2％甲酸的乙腈：甲醇(1：1，v/v)溶液；

流速0.2～0.4mL/min，柱温为30℃，进样2μL，梯度洗脱程序为：0～0.5min，流动相B液10％；0.5～1.5min，流动相B液升高到90％；1.5～2.0min，流动相B液维持90％；2.2min，流动相B液降到10％；2.2min～3.0min，流动相B液维持10％，

(2)质谱条件：

离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：1.0-3.5KV；脱溶剂气温度：400-500℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar；扫描模式：多。

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