CN110927297A - 一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，采用超高效液相色谱串联质谱法(HPLC‑MS/MS)对前处理后的待测样品进行检测；所述前处理的过程为：将血清加入至甲醇与乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出，干燥，将干燥后的粉末溶于甲醇水溶液中，过滤获得待测样品。本发明能够对血液中的甲氨蝶呤、5‑氟尿嘧啶、阿帕替尼、百消安、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊马替尼、伊利替康、来那度胺、奥沙利铂和紫杉醇等13种多种抗肿瘤药物进行同时检测。

Description

一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法

技术领域

本发明属于血药浓度的检测领域，涉及一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

大部分临床抗肿瘤药的药效和毒性与体液或组织中的母体药物或其代谢物的浓度有关,因此监测临床抗肿瘤药物的药代动力学特征(absorption-distribution-metabolism-elimination,ADME)，即吸收、分布、代谢和排泄，进而指导临床合理用药变得非常重要。此外，抗肿瘤药物治疗谱窄,且患者自身和患者问的药物代谢动力学参数的变异性高，为了达到安全有效治疗肿瘤，对使用临床常规抗肿瘤药物的患者进行定量监测尤为必要。液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS)是将分离性能优异的液相色谱法，与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法相结合的现代分离分析技术。近年来，在临床抗肿瘤药物检测中得到了广泛应用，与气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)相比，液相色谱不受蒸汽压及汽化样品的较高限制，可分离高极性的和热不稳定的化合物，使得LC-MS技术比液相色谱-紫外检测器、液相色谱-荧光检测器、液相色谱-电化学检测器具有更广阔的应用前景，已经成为许多临床抗肿瘤药定量分析的首选。随着LC-MS技术的发展，其被用于临床抗肿瘤药物定量分析的研究逐年增加。

治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring，TDM)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种很有效的方法。使用TDM指导精神药物治疗的主要原因是患者在药代动力学方面所存在的显著个体差异。在药物剂量几乎相同的情况下，不同个体的体内稳态药物浓度可以相差20倍以上，其原因可能是患者在共患疾病、年龄、合并用药和遗传特性方面的不同导致的药物在吸收、分布、代谢、排泄方面的差异。同一药物的不同剂型，也会因吸收程度和吸收方式不同，造成体内药物浓度不同。TDM采用定量测定血浆或血清中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低中毒的风险。通过TDM还可以及时发现病人在治疗过程中是否停药、减量或超量服药，帮助病人正确认识服用药物。

基于免疫的检测法是最常用的TDM方法，具有准确、快速、方便的特点。其采用待测物抗原与抗体的特异反应，通过酶与底物或荧光标记等方法产生可供检测的化学反应来进行定量测定。然而，当临床待测药物与其他具有类似结构的干扰物一起进行检测时，免疫法则具有一定的局限性。因为药物之间化学结构相似，且有着类似的抗原表区，均可发生抗原抗体反应，采用免疫法较难将其完全区分开，从而导致检测出的药物浓度与实际情况存在偏差，无法较好地预测疗效和评估不良反应。近年来，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)在TDM中被广泛使用，其特异性高、运行时间短并可以同时测定分析多种化学结构。目前液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)已逐渐被用于抗癫痫药物、抗精神病药物、免疫抑制剂和抗感染药物监测。

发明内容

经过本发明的发明人研究发现，目前还没有一种能够用于同时检测甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种以上抗肿瘤药物的有效方法。

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，能够对甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种以上抗肿瘤药物进行有效检测。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，采用超高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)对前处理后的待测样品进行检测；

所述前处理的过程为：将血清加入至甲醇与乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出，干燥，将干燥后的粉末溶于甲醇水溶液中，过滤获得待测样品；

同时配制含有待检测药物的已知浓度的质控样品(低、中、高三个浓度)，与血清样品同时进行前处理，通过质控样品的检测结果以确定此次检测是否准确。

所述多种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种或两种以上。

本发明针对血清中存在的甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种或两种以上的抗肿瘤药物进行前处理，可以去除样品杂质，降低基质效应，从而对这些抗肿瘤药物进行同时检测。

另一方面，一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，采用超高效液相色谱串联质谱法对前处理后的待测样品进行检测；

所述前处理的过程为：将血清加入至甲醇与乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出，干燥，将干燥后的粉末溶于甲醇水溶液中，过滤获得待测样品；

所述多种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿帕替尼、百消安、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊马替尼、伊利替康、来那度胺、奥沙利铂和紫杉醇。

经过本发明的进一步研究发现，该方法能够同时对甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿帕替尼、百消安、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊马替尼、伊利替康、来那度胺、奥沙利铂和紫杉醇等13种抗肿瘤药物进行同时检测。

本发明的有益效果为：

本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-串联质谱方法结合，建立了一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，采用本发明可以同时检测人血清中甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿帕替尼、白消安、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊马替尼、伊利替康、来那度胺、奥沙利铂、紫杉醇，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。

本发明中使用的提取方法，可以去除样品杂质，降低基质效应，且操作简单快捷，检测结果精确。通过定量测定血清或血浆药物浓度指导用药剂量优化，已经成为对患者进行精神药物治疗的很有价值的工具。在患者用药依从性难以判断、药物耐受性不佳、治疗剂量下无效以及可能存在药代动力学药物－药物相互作用等情况下，测定药物浓度是很有用的。在肿瘤科，有可能明显获益于TDM的主要患者群体包括儿童、孕妇、老年患者、已知或怀疑携带药代动力学相关基因变异的患者，以及合并躯体疾病影响药代动力学的患者。

本发明首次实现了应用液相色谱串联质谱技术对一份血清样本中的十三种抗肿瘤药物同时检测的目的，用两对离子分别进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速分析，通量高、成本低，可实现对人体血药水平的实时监测。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例的甲氨蝶呤色谱图；

图2为本发明实施例的5-氟尿嘧啶色谱图；

图3为本发明实施例的阿帕替尼色谱图；

图4为本发明实施例的白消安色谱图；

图5为本发明实施例的卡铂色谱图；

图6为本发明实施例的环磷酰胺色谱图；

图7为本发明实施例的多西他赛色谱图；

图8为本发明实施例的吉西他滨色谱图；

图9为本发明实施例的伊马替尼色谱图；

图10为本发明实施例的伊利替康色谱图；

图11为本发明实施例的来那度胺色谱图；

图12为本发明实施例的奥沙利铂色谱图；

图13为本发明实施例的紫杉醇色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于目前还没有一种能够用于同时检测甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种以上抗肿瘤药物的有效方法，本发明提出了一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，采用超高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)对前处理后的待测样品进行检测；

所述前处理的过程为：将血清加入至甲醇与乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出，干燥，将干燥后的粉末溶于甲醇水溶液中，过滤获得待测样品；

同时配制含有待检测药物的已知浓度的质控样品(低、中、高三个浓度)，与血清样品同时进行前处理，通过质控样品的检测结果以确定此次检测是否准确。

所述多种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种或两种以上。

本发明针对血清中存在的甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种或两种以上的抗肿瘤药物进行前处理，可以去除样品杂质，降低基质效应，从而对这些抗肿瘤药物进行同时检测。

该实施方式的一种或多种实施例中，甲醇与乙腈的混合液中，甲醇、乙腈的体积比为1:0.9～1.1。

该系列实施例中，血清、甲醇、乙腈的体积比为0.9～1.1:1:0.9～1.1。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述干燥为氮气或惰性气体(氦气、氩气等)吹干。

该实施方式的一种或多种实施例中，甲醇水溶液中甲醇的体积分数为65～75％。

该实施方式的一种或多种实施例中，血清与甲醇水溶液的体积比为1:0.9～1.1。

该实施方式的一种或多种实施例中，采用0.2μm滤膜过滤。

该实施方式的一种或多种实施例中，色谱条件为：流动相A：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸的HPLC级水；流动相B：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸的甲醇；梯度洗脱。

该系列实施例中，色谱条件具体为：色谱柱：C18柱(Waters ACQUITY HPLC BEHC18 100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：39～41℃；流动相A：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸、0.9～1.1mM甲酸铵的HPLC级水；流动相B：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸、0.9～1.1mM甲酸铵的甲醇；梯度洗脱条件：0～3min，35％B，3～6min，95％B，6～8min，95％B，8～9min，35％B，流速250μL/min，进样量，19～21μL。

该实施方式的一种或多种实施例中，质谱条件为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：59～61kPa，加热气：49～51kPa，气帘气：19～21kPa，喷雾电压：4990～5010V，去溶剂温度：540～560℃。

该实施方式的一种或多种实施例中，MRM质谱参数如下表：

该实施方式的一种或多种实施例中，抗肿瘤药物还包括阿帕替尼、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊利替康、紫杉醇中的一种或多种。

本发明的另一种实施方式，提供了一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，采用超高效液相色谱串联质谱法对前处理后的待测样品进行检测；

所述前处理的过程为：将血清加入至甲醇与乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出，干燥，将干燥后的粉末溶于甲醇水溶液中，过滤获得待测样品；

同时配制含有待检测药物的已知浓度的质控样品(低、中、高三个浓度)，与血清样品同时进行前处理，通过质控样品的检测结果以确定此次检测是否准确。

所述多种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿帕替尼、百消安、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊马替尼、伊利替康、来那度胺、奥沙利铂和紫杉醇。

经过本发明的进一步研究发现，该方法能够同时对甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿帕替尼、百消安、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊马替尼、伊利替康、来那度胺、奥沙利铂和紫杉醇等13种抗肿瘤药物进行同时检测。

该实施方式的一种或多种实施例中，甲醇与乙腈的混合液中，甲醇、乙腈的体积比为1:0.9～1.1。

该系列实施例中，血清、甲醇、乙腈的体积比为0.9～1.1:1:0.9～1.1。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述干燥为氮气或惰性气体(氦气、氩气等)吹干。

该实施方式的一种或多种实施例中，甲醇水溶液中甲醇的体积分数为65～75％。

该实施方式的一种或多种实施例中，血清与甲醇水溶液的体积比为1:0.9～1.1。

该实施方式的一种或多种实施例中，采用0.2μm滤膜过滤。

该实施方式的一种或多种实施例中，色谱条件为：流动相A：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸的HPLC级水；流动相B：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸的甲醇；梯度洗脱。

该系列实施例中，色谱条件具体为：色谱柱：C18柱(Waters ACQUITY HPLC BEHC18 100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：39～41℃；流动相A：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸、0.9～1.1mM甲酸铵的HPLC级水；流动相B：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸、0.9～1.1mM甲酸铵的甲醇；梯度洗脱条件：0～3min，35％B，3～6min，95％B，6～8min，95％B，8～9min，35％B，流速250μL/min，进样量，19～21μL。

该实施方式的一种或多种实施例中，质谱条件为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式和/或采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：59～61kPa，加热气：49～51kPa，气帘气：19～21kPa，喷雾电压：4990～5010V，去溶剂温度：540～560℃。

该实施方式的一种或多种实施例中，MRM质谱参数如下表：

本发明的方法针对每种药物分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种药物的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

(1)制备待测样本

向血清样本和质控样品中加入甲醇：乙腈(体积比为1:1)溶液，涡旋震荡后离心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于70％v/v甲醇水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本。

其中，所述的血清、甲醇、乙腈体积比为1:1:1，血清与70％甲醇水溶液的体积比为1:1。

(2)超高效液相色谱-质谱检测

待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离，液相色谱参考条件：

色谱柱：C18柱(Waters ACQUITY HPLC BEH C18 100mm×2.1mm，1.7μm)

柱温：40℃

进样体积：20μl

流速：250μl/min

流动相A：含0.1％甲酸的HPLC级水

流动相B：含0.1％甲酸的甲醇

梯度洗脱条件：

质谱参数参考条件：

采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式(其中仅5-氟尿嘧啶使用负离子模式)；

雾化气：60kPa

加热气：50kPa

气帘气：20kPa

喷雾电压：5000V

去溶剂温度：550℃

MRM质谱参数：

(3)计算结果

标准工作液的配制：以水配制100μg/mL各标准品储备液，然后以经活性炭净化的血清空白样本制备7个梯度的混合标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用，标准品需参与样本提取。

应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中十三种抗肿瘤药物的浓度。

甲氨蝶呤色谱图如图1所示，用本发明方法测定5～1000ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本甲氨蝶呤含量为748.2ng/mL。

5-氟尿嘧啶色谱图如图2所示，用本发明方法测定5～1000ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本5-氟尿嘧啶含量为619.5ng/mL。

阿帕替尼色谱图如图3所示，用本发明方法测定10～2000ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本阿帕替尼含量为988.6ng/mL。

白消安色谱图如图4所示，用本发明方法测定17.5～3500ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本白消安含量为1050.5ng/mL。

卡铂色谱图如图5所示，用本发明方法测定0.125～50μg/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本卡铂含量为20.6μg/mL。

环磷酰胺色谱图如图6所示，用本发明方法测定0.5～100ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本环磷酰胺含量为82.4ng/mL。

多西他赛色谱图如图7所示，用本发明方法测定10～2000ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本多西他赛含量为1540.5ng/mL。

吉西他滨色谱图如图8所示，用本发明方法测定2.5～500ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本吉西他滨含量为451.8ng/mL。

伊马替尼色谱图如图9所示，用本发明方法测定0.05～10μg/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本伊马替尼含量为7.6μg/mL。

伊利替康色谱图如图10所示，用本发明方法测定25～5000ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本伊利替康含量为4180.7ng/mL。

来那度胺色谱图如图11所示，用本发明方法测定5～1000ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本来那度胺含量为815.5ng/mL。

奥沙利铂色谱图如图12所示，用本发明方法测定16～3200ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本奥沙利铂含量为2406.5ng/mL。

紫杉醇色谱图如图13所示，用本发明方法测定2～400ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本紫杉醇含量为237.6ng/mL。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，采用超高效液相色谱串联质谱法对前处理后的待测样品进行检测；

所述前处理的过程为：将血清加入至甲醇与乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出，干燥，将干燥后的粉末溶于甲醇水溶液中，过滤获得待测样品；

同时配制含有待检测药物的已知浓度的质控样品，与血清样品同时进行前处理，通过质控样品的检测结果以确定此次检测是否准确；

所述多种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、白消安、伊马替尼、来那度胺、奥沙利铂中两种或两种以上。

2.如权利要求1所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，抗肿瘤药物还包括阿帕替尼、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊利替康、紫杉醇中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，MRM质谱参数如下表：

4.一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，采用超高效液相色谱串联质谱法对前处理后的待测样品进行检测；

所述前处理的过程为：将血清加入至甲醇与乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出，干燥，将干燥后的粉末溶于甲醇水溶液中，过滤获得待测样品；

所述多种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿帕替尼、百消安、卡铂、环磷酰胺、多西他赛、吉西他滨、伊马替尼、伊利替康、来那度胺、奥沙利铂和紫杉醇。

5.如权利要求1或4所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，甲醇与乙腈的混合液中，甲醇、乙腈的体积比为1:0.9～1.1；

优选的，血清、甲醇、乙腈的体积比为0.9～1.1:1:0.9～1.1。

6.如权利要求1或4所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，所述干燥为氮气或惰性气体吹干。

7.如权利要求1或4所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，甲醇水溶液中甲醇的体积分数为65～75％；

或，血清与甲醇水溶液的体积比为1:0.9～1.1。

8.如权利要求1或4所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，色谱条件为：流动相A：含体积分数为0.09～0.11％甲酸的HPLC级水；流动相B：含体积分数为0.09～0.11％甲酸的甲醇；梯度洗脱；

优选的，色谱条件具体为：色谱柱：C18柱，Waters ACQUITY HPLC BEH C18 100mm×2.1mm，1.7μm；柱温：39～41℃；流动相A：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸、0.9～1.1mM甲酸铵的HPLC级水；流动相B：含0.09～0.11％(体积分数)甲酸、0.9～1.1mM甲酸铵的甲醇；梯度洗脱条件：0～3min，35％B，3～6min，95％B，6～8min，95％B，8～9min，35％B，流速250μL/min，进样量，19～21μL。

9.如权利要求1或4所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，质谱条件为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式和/或采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：59～61kPa，加热气：49～51kPa，气帘气：19～21kPa，喷雾电压：4990～5010V，去溶剂温度：540～560℃。

10.如权利要求4所述的同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法，其特征是，MRM质谱参数如下表：

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