CN111665315B

CN111665315B - 自然水体中抗癌药物的检测分析方法

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Publication number: CN111665315B
Application number: CN202010557896.9A
Authority: CN
Inventors: 张俊云; 李栋; 张芝勃
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111665315A

Abstract

本发明公开了一种自然水体中抗癌药物的检测分析方法，通过自动固相萃取仪和固相萃取小柱结合的前处理，与高效液相色谱—质谱仪连用，同时检测自然水体中抗癌药物，包括多柔比星、伊马替尼、依托泊苷、环磷酰胺、他莫昔芬及其降解产物N‑去甲基‑4‑羟基三苯氧胺。本发明方法步骤如下：先将采集的自然水体样品经过过滤，加入盐酸调节pH至2‑3，加入乙二胺四乙酸二钠和内标；再使用自动固相萃取仪和固相萃取小柱联用来提取、净化样品抗癌药物；然后通过高效液相色谱—质谱仪检测水样中目标物的含量。本发明方法对水样中抗癌药物的处理步骤简单，操作方便，稳定性好，能够快速得到适于液质联用仪检测的样品；样品预处理成本低。

Description

自然水体中抗癌药物的检测分析方法

技术领域

本发明属于药物痕量检测领域，涉及一种自然水体中抗癌药物的检测方法，利用自动固相萃取仪和固相萃取小柱联用，结合高效液相色谱—质谱的技术。

背景技术

抗癌药物主要应用在癌症治疗当中，其来源广泛，包括医院产生的废水，患者产生的家庭废水，药物制造商产生的废水以及有些药物被当成固废处理产生的废液等。随着全球癌症患者的增加，抗癌药物作为一种重要的治疗手段，其用量也随之增加。不幸的是，在治疗过程中，无论是好的细胞还是坏的细胞都会受到抗癌药物的影响。抗癌药物具有细胞毒性，遗传毒性‘三致’作用，并且能够干扰DNA的结构和功能，扰乱和抑制细胞的生长，最终导致细胞死亡。抗癌药物被解剖治疗分类(ATC)分为五大类，包括烷化剂类，抗代谢产物类，植物生物碱和其他天然产物类，细胞毒性抗生素类和其他相关物资类。其中环磷酰胺，他莫昔芬等多种抗癌药物已经被国际癌症研究机构(IARC)列为人类致癌物质。

抗癌药物首次是在上世纪70年代被发现存在于自然水体中，其在自然水体中的含量并不是很大，大多数是在微克/升到纳克/升的浓度范围内。低含量的存在对准确快速的检测干扰较大，对样品的净化富集水平要求较高。目前针对自然水体中样品的预处理方法主要是液液萃取、加速溶剂萃取法，手动固相萃取，存在耗费较多的提取溶剂，实验所需时间较长，步骤复杂等问题。本发明采用的固相小柱萃取技术可以有效分离待测组分与样品基质，克服基质效应，实验结果重现性好，回收率高，检测结果准确。

尽管抗癌药物的含量浓度较低，但是其危害性大。因此合理地制定这类物质的各种使用标准，需要一种快速、灵敏的检测出目标物的方法，开发一种预处理方法、检测方法是必要的、可行的。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种自然水体中抗癌药物的检测分析方法，能对自然水体中抗癌药物进行预处理，以改善现有处理方法的过程复杂，且成本较高的技术问题。同时，进行自然水体中抗癌药物的高效液相色谱—质谱的检测，该检测方法能够同时检测6种抗癌药物，包括多柔比星(Doxorubicin、DOX)、伊马替尼(Imatinib、IMA)、依托泊苷(Etoposide、ETP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide、CP)、他莫昔芬(Tamoxifen、TAM)及其降解产物N-去甲基-4-羟基三苯氧胺(N-Desmethyl-4-hydroxy Tamoxifen、OH-D-TAM)。检测过程快速、高效、低成本、高度自动化且便于产业化应用。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种自然水体中抗癌药物的检测分析方法，步骤如下：

a.样品的预处理：

将采集的自然水体样品经过110毫米的滤膜过滤再经过47毫米的玻璃纤维过滤膜过滤，加入盐酸调节pH至2-3，然后加乙二胺四乙酸二钠以及内标Cyclophosphamide-d4；

b.使用自动固相萃取仪和固相萃取柱进行富集净化：

具体过程为：首先将固相萃取柱用6ml甲醇和6ml超纯水活化，流速约为2ml/min；其次用3ml甲醇进行淋洗，流速约为1.5ml/min；然后用氮气气推15min；接着用6ml甲醇和6ml甲醇和甲酸的混合溶液洗脱，流速1ml/min，所述混合溶液中的甲醇和甲酸的体积比为95：5；最后再次气推15min，氮吹近干后用1ml甲醇定容，转移到高效液相色谱瓶中用于检测；

c.高效液相色谱—质谱仪测定样品中目标物的含量：

建立目标污染物的标准曲线，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标；采用内标法，在高效液相色谱—质谱仪上定量检测样品内目标物的浓度。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤a中，乙二胺四乙酸二钠的含量为所取水样体积的5％。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤a中，内标物浓度为100ppb。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，进行活化、淋洗、洗脱、氮吹过程中流速、时间均由自动化仪器精确控制。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤c中，高效液相色谱—质谱仪的检测条件为：

设置柱温为40℃，注入体积为10μL，流速为0.4mL/min；流动相采用含有体积比为0.1％甲酸的超纯水(A)和HPLC级别的甲醇(B)；梯度(％B)如下：0min，5％；2.5min，60％；12.5min，95％；16.5min，5％；干燥气体流量：8L/min，干燥气体温度：300℃，鞘气体温度：350℃，鞘层气体流量：11L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压(-)：1500V，喷嘴电压(+)：1500V，毛细管电压(-)：4500。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤c中，检测的目标待测物为多柔比星(Doxorubicin、DOX)、伊马替尼(Imatinib、IMA)、依托泊苷(Etoposide、ETP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide、CP)、他莫昔芬(Tamoxifen、TAM)及其降解产物N-去甲基-4-羟基三苯氧胺(N-Desmethyl-4-hydroxyTamoxifen、OH-D-TAM)中至少一种抗癌药物。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明使用自动固相萃取仪，固相萃取小柱，高效液相色谱质谱三者串联的技术，具有的稳定性高、重复性好、结果准确的优势；

2.方法学验证结果显示，利用本发明方法检测自然水体中抗癌药物的标准曲线线性相关程度良好，R2均大于0.99；加标回收率在75％-110％之间；定量限范围在0.005—0.02ng/mL之间；

3.日内精密度和日间精密度均满足要求，相对标准偏差(RSDs)分别小于10.8％；方法精密度较好，重复性高，结果准确灵敏、可靠，适用范围广；

4.本发明方法简单易行，成本低，适合推广使用。

附图说明

图1是本发明方法的内标物质CP-d4标准曲线方程。

具体实施方式

在下述实施例中，自动固相萃取仪是睿科集团的自动仪器，固相萃取小柱是Waters公司Oasis HLB型小柱。高效液相色谱—质谱仪型号为AB LC-MS/MS(Qtrap 5500)，色谱柱为Poroshell 120EC-C18反相柱：3×100mm，2.7μm，安捷伦。

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，内标物质CP-d4标准曲线的绘制。

图1为内标物质CP-d4的标准曲线图，标准曲线方程为y＝498.46x+9.7824，相关性系数为R2为0.9999。

实施例二：

在本实施例中，进行加标回收率实验。

采用内标法检验自然水体中抗癌药物的回收率，实验步骤为：

a、样品预处理：

设立三组平行样，每组水样400ml，在第一、第二组添加浓度为100μg/ml的内标CP-d4溶液0.5ml，第三组样品不添加混合标准液。三组样品均加适当的盐酸调节pH至2-3和水样体积5％的乙二胺四乙酸二钠；

b、使用自动固相萃取仪和固相萃取柱进行富集净化：

首先将固相萃取柱用6ml甲醇和6ml超纯水活化，流速约为2ml/min；其次用3ml甲醇进行淋洗，流速约为1.5ml/min；然后用氮气气推15min；接着用6ml甲醇和6ml甲醇和甲酸的混合溶液洗脱，流速1ml/min，所述混合溶液中的甲醇和甲酸的体积比为95：5；最后再次气推15min，氮吹近干后用1ml甲醇定容，转移到高效液相色谱瓶中用于检测；

c、高效液相色谱—质谱仪测定样品中目标物的含量：

建立目标污染物的标准曲线，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标；采用内标法，在高效液相色谱—质谱仪上定量检测样品内目标物的浓度；高效液相色谱质谱仪的检测条件为：设置柱温为40℃，注入体积为10μL，流速为0.4mL/min。流动相采用含有0.1％甲酸的超纯水(A)和HPLC级别的甲醇(B)。梯度(％B)如下：0min，5％；2.5min，60％；12.5min，95％；16.5min，5％。干燥气体流量：8L/min，干燥气体温度：300℃，鞘气体温度：350℃，鞘层气体流量：11L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压(-)：1500V，喷嘴电压(+)：1500V，毛细管电压(-)：4500。

实验测试分析：

加标回收率计算

加标回收率的计算公式为：RE％＝(C₂V₂-C₁V₁)/C₀V₀

其中：RE：加标回收率，％；C₀：混合标准液的浓度，ng/mL；V₀：混合标准液的体积，mL；C₁：空白样品的检测浓度，ng/mL；V₁：空白样品定容时的体积，mL；C₂：加入混合标准液的样品的检测浓度ng/mL；V₂:加入混合标准液的样品定容时的体积，mL。

实测结果为93.58μg/L，加标回收率为93.58％，相对标准偏差(n＝3)为3.02。由此可见，本方法检测准确性较好。

通过加标回收率实验可以对检验结果进行校正，排除人为操作误差，降低基质干扰效应。

实施例三：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，进行实际样品中6种抗癌药物的测定。

采集自然水样，使用步骤a中的方法进行预处理，再使用步骤b中固相萃取方法进行净化与富集，之后采用步骤c中高效液相色谱—质谱的方法对样品中目标物的实际浓度进行分析检测。

具体检测过程如下：

a、样品预处理：

设立三组平行样，在每组自然水体样本中均内标CP-d4，第一、二组样品中加入6种抗癌药物的混合标准液，第三组样品不添加混合标准液；

b、使用自动固相萃取仪和固相萃取柱进行富集净化：

首先将固相萃取柱用6ml甲醇和6ml超纯水活化，流速约为2ml/min；其次用3ml甲醇进行淋洗，流速约为1.5ml/min；然后用氮气气推15min，所述混合溶液中的甲醇和甲酸的体积比为95：5；接着用6ml甲醇和6ml甲醇和甲酸的混合溶液洗脱，流速1ml/min；最后再次气推15min，氮吹近干后用1ml甲醇定容，转移到高效液相色谱瓶中用于检测；

c、高效液相色谱—质谱仪测定样品中目标物的含量。建立目标污染物的标准曲线，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标。采用内标法，在高效液相色谱—质谱仪上定量检测样品内目标物的浓度。高效液相色谱质谱仪的检测条件为：设置柱温为40℃，注入体积为10μL，流速为0.4mL/min。流动相采用含有0.1％甲酸的超纯水(A)和HPLC级别的甲醇(B)。梯度(％B)如下：0min，5％；2.5min，60％；12.5min，95％；16.5min，5％。干燥气体流量：8L/min，干燥气体温度：300℃，鞘气体温度：350℃，鞘层气体流量：11L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压(-)：1500V，喷嘴电压(+)：1500V，毛细管电压(-)：4500。

实验测试分析：

检测得到自然水体样品的抗癌药物浓度如下表1所示。实验结果说明本实施例方法可以应用于自然水体中抗癌药物的测定。

表1自然水体样本中抗癌药物的浓度检测结果

本实施例能够高效、快速的同时检测自然水体中6种广泛应用的抗癌药物，包括多柔比星(Doxorubicin、DOX)、伊马替尼(Imatinib、IMA)、依托泊苷(Etoposide、ETP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide、CP)、他莫昔芬(Tamoxifen、TAM)及其降解产物N-去甲基-4-羟基三苯氧胺(N-Desmethyl-4-hydroxy Tamoxifen、OH-D-TAM)。本实施例自动固相萃取与固相小柱联用，与高效液相色谱—质谱结合的技术，同时检测自然水体中6种抗癌药物。

本发明上述实施例通过自动固相萃取仪和固相萃取小柱结合的的前处理与高效液相色谱—质谱仪连用的技术同时检测自然水体中抗癌药物，包括多柔比星(Doxorubicin、DOX)、伊马替尼(Imatinib、IMA)、依托泊苷(Etoposide、ETP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide、CP)、他莫昔芬(Tamoxifen、TAM)及其降解产物N-去甲基-4-羟基三苯氧胺(N-Desmethyl-4-hydroxy Tamoxifen、OH-D-TAM)方法。该方法包括以下步骤：(1)将采集的自然水体样品经过110毫米的滤膜过滤再经过47毫米的玻璃纤维过滤膜过滤,，加入适当量的盐酸调节PH至2-3，加入乙二胺四乙酸二钠和内标；(2)使用自动固相萃取仪和固相萃取小柱联用来提取、净化样品中的6种抗癌药物；(3)通过高效液相色谱—质谱仪检测水样中目标物的含量。本发明对水样中抗癌药物的处理步骤简单，操作方便，稳定性好，能够快速得到适于液质联用仪检测的样品；样品预处理成本低，利用实验室常见的耗材就能完成，能在各类前处理实验室完成。此方法能够同时对6种抗癌药物进行快速高效地检测，检测速度快，自动化程度高，响应灵敏，回收率能达到80％-110％，便于产业化应用，是一种简便、快捷、准确的定性定量检测方法，适于推广应用。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种自然水体中抗癌药物的检测分析方法，其特征在于，步骤如下：

a. 样品的预处理：

b. 使用自动固相萃取仪和固相萃取柱进行富集净化：

具体过程为：首先将固相萃取柱用6ml甲醇和6ml超纯水活化，流速约为2ml/min；其次用3ml甲醇进行淋洗，流速约为1.5ml/min；然后用氮气气推15min；接着用6ml甲醇和6ml甲醇和甲酸的混合溶液洗脱，流速1ml/min，所述混合溶液中的甲醇和甲酸的体积比为95：5；最后再次气推15min，氮吹近干后用1ml甲醇定容，转移到高效液相色谱瓶中用于检测；固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB型小柱；

c．高效液相色谱—质谱仪测定样品中目标物的含量：

建立目标污染物的标准曲线，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标；采用内标法，在高效液相色谱—质谱仪上定量检测样品内目标物的浓度;

在所述步骤c中，高效液相色谱—质谱仪的检测条件：

色谱柱为Poroshell 120EC-C18反相柱：3×100mm，2.7μm；流动相A采用含有体积比为0.1%甲酸的超纯水，流动相B采用HPLC级别的甲醇；梯度如下：0min，5%的B；2.5 min，60%的B；12.5 min，95%的B；16.5 min，5%的B；干燥气体流量：8L/min，干燥气体温度：300℃，鞘气体温度：350℃，鞘层气体流量：11L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：1500V，毛细管电压：-4500 V；

检测的目标待测物为多柔比星（Doxorubicin 、DOX）、伊马替尼（Imatinib、IMA）、依托泊苷（Etoposide、ETP）、环磷酰胺（Cyclophosphamide、CP）、他莫昔芬（Tamoxifen、TAM）及其降解产物N-去甲基-4-羟基三苯氧胺（N-Desmethyl-4-hydroxy Tamoxifen、OH-D-TAM）。

2.根据权利要求1所述自然水体中抗癌药物的检测分析方法，其特征在于，在所述步骤a中，乙二胺四乙酸二钠的含量为所取水样体积的5%。

3.根据权利要求1所述自然水体中抗癌药物的检测分析方法，其特征在于，在所述步骤a中，内标物浓度为100ppb。

4.根据权利要求1所述自然水体中抗癌药物的检测分析方法，其特征在于，在所述步骤b中，进行活化、淋洗、洗脱、氮吹过程中流速、时间均由自动化仪器精确控制。

5.根据权利要求1所述自然水体中抗癌药物的检测分析方法，其特征在于，在所述步骤c中，高效液相色谱—质谱仪的检测条件中：

设置柱温为40℃，注入体积为10μL，流速为0.4 mL/min。